Artykuł metodologiczny

Nadpobudliwa transformacja linii zarodkowej za pośrednictwem transpozy piggyBac u jesiennego robaka wojskowego, Spodoptera frugiperda

DOI:

10.3791/62714

⸱

23 września 2021

 , 
1Department of Entomology, College of Agriculture, Food and Environment, University of Kentucky

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udana transformacja linii zarodkowej u jesiennego robaka wojskowego, Spodoptera frugiperda, została osiągnięta przy użyciu mRNA nadpobudliwej transposazy piggyBac.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stabilne wprowadzanie ładunku genetycznego do genomów owadów za pomocą elementów transpozycyjnych jest potężnym narzędziem do funkcjonalnych badań genomicznych i opracowywania genetycznych strategii zwalczania szkodników. Najczęściej stosowanym elementem transpozycyjnym w transformacji owadów jest piggyBac, a transformacja linii zarodkowej oparta na piggyBac została z powodzeniem przeprowadzona u owadów modelowych. Jednak nadal trudno jest zastosować tę technologię w przypadku owadów niemodelowych, do których należą szkodniki rolnicze. W artykule przedstawiono transformację linii zarodkowej globalnego szkodnika rolniczego, armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, przy użyciu nadpobudliwej transpozazy piggyBac (hyPBazy).

W tej pracy mRNA hyPBazy zostało wyprodukowane i użyte zamiast plazmidu pomocniczego w mikroiniekcjach zarodkowych. Ta zmiana doprowadziła do udanego wytworzenia transgenicznego FAW. Ponadto opisano metody badań przesiewowych zwierząt transgenicznych, szybkie wykrywanie insercji transgenu za pomocą PCR oraz termiczne oznaczanie miejsca integracji metodą PCR z przeplotem (tail-pcr). W związku z tym w niniejszej pracy przedstawiono protokół produkcji transgenicznego FAW, który ułatwi transgenezę opartą na piggyBac u FAW i innych owadów z rzędu Lepidoptera.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesienny robak wojenny (FAW), Spodoptera frugiperda, pochodzi z tropikalnych i subtropikalnych regionów Ameryki. Obecnie jest to niszczycielski owad roślinożerca w ponad 100 krajach na całym świecie1. Larwy FAW żywią się ponad 350 roślinami żywicielskimi, w tym niektórymi ważnymi podstawowymi roślinami spożywczymi2. Silna zdolność migracyjna dorosłych FAW przyczynia się do jej niedawnego szybkiego rozprzestrzeniania się z obu Ameryk do innych miejsc1,2. W rezultacie owad ten zagraża obecnie bezpieczeństwu żywnościowemu na całym świecie. Zastosowanie nowych technologii może ułatwić zaawansowane badania nad FAW i dostarczyć nowych strategii zwalczania tego szkodnika.

Transformacja linii zarodkowej owadów została wykorzystana do badania funkcji genów i generowania transgenicznych owadów do wykorzystania w kontroli genetycznej3,4. Spośród różnych metod stosowanych do osiągnięcia transformacji genetycznej u owadów, najczęściej stosowaną metodą jest metoda oparta na elementach piggyBac5. Jednak ze względu na niski współczynnik transpozycji, przeprowadzenie transgenezy u owadów niemodelowych jest nadal trudne. Niedawno opracowano nadpobudliwą wersję transpozazy piggyBac (hyPBazy)6,7. Transformacja linii zarodkowej została osiągnięta w FAW niedawno8, co jest pierwszym raportem, w którym użyto hyPBazy u owadów z rzędu Lepidoptera. W niniejszym raporcie opisano szczegółowe informacje na temat wykorzystania mRNA hyPBazy do generowania transgenicznego FAW. Opisana tutaj metoda może być zastosowana do osiągnięcia transformacji innych owadów z rzędu Lepidoptera.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza mRNA hyPBazy in vitro

UWAGA: Kompletna sekwencja kodująca sekwencji hyPBazy została zsyntetyzowana i wstawiona do wektora pTD1-Cas9 (patrz Tabela Materiałów) w celu wytworzenia konstruktu pTD1-hyPBazy, który zawiera kasetę eksprymującą hyPBazę, promotor T7: polihedryna-5' UTR: hyPBaza: polihedryna-3' UTR: poli (A). Pełna sekwencja konstruktu pTD1-hyPBazy znajduje się w materiale uzupełniającym.

  1. Przygotowanie matrycy do syntezy in vitro
    1. Przeprowadzić reakcję PCR w celu amplifikacji kasety z ekspresją hyPBazy za pomocą startera do przodu, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3' i startera odwrotnego 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', polimerazy o wysokiej wierności i plazmidu pTD1-hyPBazy jako matrycy.
      UWAGA: Reakcja PCR (końcowa objętość 50 μL) zawiera 5,0 μL 10x buforu reakcyjnego, 4,0 μL 10 mM trifosforanu deoksynukleozydu (dNTP), 1,0 μL plazmidu (50 μg/μL), 1,0 μl polimerazy o wysokiej wierności, po 10 μM starterów do przodu i do tyłu oraz 33 μL wody wolnej od nukleaz. Ustawienia były następujące: początkowa inkubacja w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, a następnie 35 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 s, 60 °C przez 15 s i 68 °C przez 2 minuty.
    2. Sprawdź produkt PCR na 1% żelu agarozowym przy 120 V w świeżym buforze kwasu tris-octanowo-etylenodiaminowego (TAE) przez 30 minut i oczyść produkt za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.
      UWAGA: Nie używaj zestawu do oczyszczania produktu PCR. Nawet śladowa ilość plazmidu pTD1-hyPBazy znacznie obniża efektywność syntezy in vitro.
  2. Synteza in vitro mRNA hyPBazy przy użyciu komercyjnego zestawu
    1. Całkowicie rozmrozić zamrożone odczynniki, utrzymać enzym i 2x roztwór NTP/CAP na lodzie i pozostawić rozmrożony 10-krotny bufor reakcyjny w temperaturze pokojowej.
    2. Przeprowadzić reakcję w temperaturze pokojowej, dodając następujące składniki: 2x roztwór NTP/CAP: 10 μL; 10x Bufor reakcyjny: 2 μL; Matryca DNA: 0,1-0,2 μg; Mieszanina enzymów: 2 μL; Woda wolna od nukleaz do 20 μl.
    3. Odczynniki dokładnie wymieszać, delikatnie pipetując mieszaninę w górę i w dół, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-4 godziny.
  3. Odzyskiwanie zsyntetyzowanego mRNA przez wytrącanie chlorku litu
    1. Dodać 30 μl roztworu strącającego LiCl, dokładnie wymieszać, przesuwając probówkę, a następnie utrzymywać w temperaturze -20 °C przez ≥ 30 minut.
    2. Wirować w temperaturze 4 °C przez 15 minut z maksymalną prędkością i ostrożnie usunąć supernatant.
    3. Umyj osad raz 1 ml 70% etanolu, ponownie odwiruj i ostrożnie usuń supernatant.
    4. Wysuszyć osad w temperaturze pokojowej przez 1-2 minuty, a następnie ponownie zawiesić osad w 20-40 μl wody wolnej od nukleaz.
    5. Rozcieńczyć 1 μl roztworu mRNA w 9 μl wody wolnej od nukleaz. Weź 2 μl, aby oznaczyć stężenie mRNA i użyj 8 μl, aby sprawdzić jakość mRNA na 1% żelu agarozowym przy 100 V w świeżym buforze TAE przez 40 minut.
    6. Podwielokrotnić roztwór mRNA i przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -70 °C przez okres do jednego roku.
      UWAGA: Nie susz całkowicie granulki mRNA; Może być trudniej rozpuścić go w wodzie.

2. Mikroiniekcja

  1. Kolekcja jaj
    1. Umieść 12 poczwarek płci męskiej i 12 poczwarek żeńskich w pudełku o wymiarach 15 cm x 15 cm x 10 cm. Przykryj pudełko ręcznikiem papierowym. Umieść 10% roztwór sacharozy w pudełku do karmienia dorosłych.
    2. W 2 dniu po eklacji wystaw dorosłe osobniki na intensywne światło przez noc.
    3. W 3 dniu po ewakuacji przenieś dorosłe osobniki z kroku 2.1.2 do ciemnego miejsca. Zbierz zarodki w ciągu 2 godzin po złożeniu jaj
      4. .
    4. Dodaj krople wody do kawałka ręcznika papierowego ze świeżymi jajkami trzymanymi na szalce Petriego na lodzie. Delikatnie przenieś jajka na szklane szkiełko za pomocą cienkiego pędzelka i wyrównaj je jedno po drugim na szklanym szkiełku. Szklane szkiełka z wyrównanymi jajami należy przechowywać na lodzie przed mikrowstrzyknięciem.
  2. Konfiguracja mikroiniekcji
    1. Wstrzyknąć do jaj mieszaninę transgenicznego plazmidu eksprymującego białko zielonej fluorescencji (EGFP) (200 ng / μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, mRNA hyPBazy (200 ng / μL) i sterylnej wody destylowanej, stosując ciśnienie kompensacyjne automatycznego mikrowstrzykiwacza (patrz Tabela materiałów).
    2. Przechowywać wstrzyknięte jaja w temperaturze 27 ± 1 °C, wilgotności względnej 60 ± 10% aż do wyklucia.
    3. Nakarm wyklute larwy sztuczną dietą i przenieś każdą larwę do jednego małego kubka na początku 3. stadium rozwojowego (~6 mm długości, a kolor ciała zmienia kolor na).

3. Badania przesiewowe fluorescencji i krzyżowanie genetyczne

  1. Zbierz poczwarki i umieść ~150 poczwarek żeńskich i ~150 poczwarek męskich w klatce o wymiarach 35 cm x 35 cm x 35 cm. Zawieś kilka kawałków ręczników papierowych (~30 cm x 15 cm) w klatce, aby zebrać jaja.
  2. Codziennie zbieraj ręczniki papierowe z jajkami i przechowuj jaja w temperaturze 27 ± 1 °C, wilgotności względnej 60 ± 10% aż do wyklucia.
  3. Utrzymuj larwy noworodków w temperaturze 4 °C przez 5 minut, aby je unieruchomić, a następnie przenieś je na lodowatą płytkę.
  4. Przebadaj unieruchomione larwy noworodków pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Wybrać noworodki z dodatnim wynikiem EGFP, podnieść je do stadium poczwarki w ciągu ~2 tygodni w temperaturze 27 ± 1 °C i rozdzielić według płci zgodnie z różnicami fenotypowymi w brzusznych segmentach brzucha.
    UWAGA: Poczwarka samicy ma szczelinowy otwór narządów płciowych na ósmym segmencie brzusznym, a brzegi głowowe dziewiątego i dziesiątego segmentu zakrzywiają się w kierunku otworu narządów płciowych. Otwór narządów płciowych poczwarki samca ma niewielkie uniesienie na dziewiątym segmencie brzucha.
  5. Poczwarki EGFP-dodatnie i poczwarki typu dzikiego płci przeciwnej umieścić w klatce w stosunku samiec do samicy 1:1. Sib-krzyżuj dorosłe osobniki wykazujące ekspresję EGFP, aby wytworzyć kolejne pokolenia.

4. Wykrywanie insercji transgenicznej metodą PCR

  1. Ekstrahować genomowe DNA z pojedynczych larw typu dzikiego i EGFP za pomocą dowolnego dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji genomowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Przeprowadzić reakcję PCR, używając genomowego DNA jako matrycy; starter do przodu, 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttc-3' zlokalizowany w regionie promotora ie1; i starter odwrotny, 5'- aagcactgcgccgtaggtcag' zlokalizowany w regionie EGFP wektora transformacji.
  3. Ustaw każdą reakcję PCR (końcowa objętość 40 μl) tak, aby zawierała 20 μl mieszaniny polimerazy, 1,0 μl genomowego DNA (40 μg/μl), po 1,0 μl starterów do przodu i do tyłu po 10 μM oraz 17 μl wody wolnej od nukleaz. Stosować następujące ustawienia: początkowa inkubacja w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, a następnie 35 cykli w temperaturze 95 °C przez 20 s, 56 °C przez 20 s i 68 °C przez 40 sekund.
  4. Sprawdzaj produkty PCR na 1% żelu agarozowym przy 120 V przez 30 minut.

5. Określenie miejsca insercji transgenicznej

  1. Wykonaj wysokowydajny TAIL-PCR przy użyciu genomowego DNA jako matrycy w celu określenia miejsca integracji insercji transgenu u owadów z dodatnim wynikiem EGFP.
    1. Wykonaj reakcje PCR, postępując zgodnie z krokami opisanymi w innym miejscu9.
      1. Użyj trzech starterów, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3' i P3: 5'-atgtcctaaatgcacacagcgacgcct-3', które są specyficzne dla wektora piggyBac, odpowiednio w 3 rundach reakcji PCR.
  2. Sekwencjonowanie końcowych produktów PCR w celu określenia miejsca integracji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konstrukt do ekspresji promotora T7 zawierającego hyPBazę: polihedryna-5'UTR: hyPBaza: polihedryna-3'UTR: sygnał poli (A) został wygenerowany (Rysunek 1A) i wzmocniony jako ~2,2 kb fragmentu PCR do syntezy mRNA hyPBazy in vitro (Figura 1B). Następnie wyprodukowano mRNA hyPBazy i poddano elektroforezie w żelu agarozowym. mRNA o oczekiwanej wielkości (pasmo ~1,1 kb) wykryto na 1% żelu agarozowym (Rysunek 1C).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niska szybkość transpozycji i trudności w dostarczaniu składników transgenicznych do świeżych zarodków ograniczają powodzenie transformacji linii zarodkowej u wielu owadów niemodelowych, zwłaszcza tych z rzędu Lepidoptera. Aby zwiększyć szybkość transformacji linii zarodkowej, opracowano nadpobudliwą wersję najpowszechniej stosowanej transpozazy piggyBac (hyPBazy) 7,10. Do tej pory udane przekształcenie linii zarodkowej u owadów z rzędu Lepidoptera odnot...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione badania są wspierane przez National Science Foundation I/UCRC, Center for Arthropod Management Technologies, w ramach grantu nr IIP-1821936 oraz przez partnerów przemysłowych, Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant nr 2019-67013-29351 oraz National Institute of Food and Agriculture, Departament Rolnictwa USA (2019-67013-29351 i 2353057000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5-calowe bawełniane rolki dentystycznePlastCare USA8542025591REARING
1 uncja pokrywek do kubków sufletowychDARTPL1N
1 uncja kubków sufletowychDARTP100NHODOWLA
48 uncji Plastikowe pojemniki delikatesoweGenpackAD48REARING
Dodatkowy zestaw filtrów (zielony)NightSea LLCSFA-BLFS-GRSCREENING
Szkło borokrzemianoweInstrumenty SutterBF100-50-10WTRYSK
Szkło borokrzemianoweSUTTER INSTRUMENTBF-100-50-10
Luneta sekcyjnaNikonSMZ745T SCREENING
Kleszcze piórkoweBioQuip4750HODOWLA
Osłona rynnyThermWell ProductsVX620HODOWLA
Odwrócona MikroskopOlympusIX71INIEKCJA
MikrowtryskiwaczNarishigeIM-300INIEKCJA
Ściągacz do mikropipetSutter InstrumentsP-1000WTRYSK
Szkiełka mikroskopoweVWR16004-22WTRYSK
NightSea Pełny systemNightSeaSFA-RB-DIMSCREENING
Azot gazowyAWG/ Scott-GrossNI 225INJECTION
Ręczniki papieroweBounty  43217-45074HODOWLA
Spodoptera frugiperda Artificial DietSouthland Products, IncNie dotyczy [zapytaj o gatunek/ilość]HODOWLA
em>Spodoptera frugiperda JajaBenzon Research, IncN/A [Zapytaj o gatunek/ilość]HODOWLA Mieszanina
polimerazyTaq MasterMix
<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
  2. Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
  3. Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513(2015).
  4. Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
  5. Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
  6. Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534(2018).
  7. Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
  8. Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
  9. Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
  10. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  11. Xu, H., O'Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487(2015).
  12. Wu, S. C. -Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  13. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
  14. Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
  15. Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Owady transgenicznemikroiniekcja zarodk wekspresja EGFPprzesiew fluorescencyjnygenomika funkcjonalnagenetyczna kontrola szkodnik w

Powiązane artykuły