Artykuł metodologiczny

Pomiar obrotu lipidów w błonie za pomocą wrażliwego na pH fluorescencyjnego analogu lipidowego ND6

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62717

⸱

29 lipca 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Brain Institute at Florida Atlantic University, 2Department of Biomedical Sciences, Florida Atlantic University, 3Department of Chemistry and Biochemistry, Florida Atlantic University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania fluorescencyjnego, która wykorzystuje klasę wrażliwych na pH fluoroforów lipidowych do monitorowania transportu błony lipidowej podczas egzocytozy komórkowej i cyklu endocytozy.

Streszczenie

Egzo-/endocytoza to powszechny proces pośredniczący w wymianie biomolekuł między komórkami a ich otoczeniem oraz między różnymi komórkami. Wyspecjalizowane komórki wykorzystują ten proces do wykonywania ważnych funkcji organizmu, takich jak wydzielanie insuliny z komórek β i uwalnianie neuroprzekaźników z synaps chemicznych. Ze względu na swoje znaczenie fizjologiczne, egzo-/endocytoza jest jednym z najczęściej badanych tematów w biologii komórki. Opracowano wiele narzędzi do badania tego procesu na poziomie genów i białek, dzięki czemu wiele wiadomo o maszynerii białkowej uczestniczącej w tym procesie. Jednak opracowano bardzo niewiele metod pomiaru obrotu lipidów błonowych, który jest fizyczną podstawą egzo-/endocytozy.

Ten artykuł przedstawia klasę nowych fluorescencyjnych analogów lipidów wykazujących fluorescencję zależną od pH i demonstruje ich zastosowanie do śledzenia recyklingu lipidów między błoną plazmatyczną a pęcherzykami wydzielniczymi. Wspomagane prostymi manipulacjami pH, analogi te umożliwiają również ilościowe określenie rozmieszczenia lipidów na powierzchni i przedziałach błony wewnątrzkomórkowej, a także pomiar szybkości obrotu lipidów podczas egzo-/endocytozy. Te nowatorskie reportery lipidowe będą bardzo interesujące dla różnych dziedzin badań biologicznych, takich jak biologia komórki i neuronauka.

Wprowadzenie

Dwuwarstwa lipidowa jest jednym z najpowszechniejszych zespołów biomolekuł i jest niezbędna dla wszystkich komórek. Na zewnątrz komórek tworzy błonę plazmatyczną łączącą komórki i ich środowisko; Wewnątrz komórek dzieli się na przedziały różnych organelli wyspecjalizowanych w określonych funkcjach. Błony lipidowe są raczej dynamiczne niż nieruchome, ponieważ nieustannie doświadczają fuzji i rozszczepienia, co pośredniczy w transporcie biomateriału, reformie organelli, zmianie morfologii i komunikacji komórkowej. Niewątpliwie błona lipidowa jest fizyczną podstawą prawie wszystkich procesów komórkowych, a jej dysfunkcja odgrywa kluczową rolę w różnych zaburzeniach, począwszy od raka1 po chorobę Alzheimera2. Chociaż cząsteczki lipidów są znacznie mniej zróżnicowane niż białka, dotychczasowe badania nad błonami koncentrowały się głównie na białkach. Na przykład o wiele więcej wiadomo o maszynerii białkowej niż o lipidach w egzocytozie3,4,5. Co więcej, organizacja, dystrybucja, dynamika i homeostaza lipidów na błonach powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych w dużej mierze pozostają niezbadane w porównaniu z białkami błonowymi6.

To nie jest zaskakujące, ponieważ nowoczesne techniki biologii molekularnej, takie jak mutageneza, zapewniają metodologiczną przewagę w badaniu białek, a nie lipidów. Na przykład, transgeniczne znakowanie wrażliwego na pH białka zielonej fluorescencji (znanego również jako pHluorin) do białek pęcherzykowych ułatwia ilościowy pomiar ilości i szybkości obrotu białek pęcherzykowych podczas egzo-/endocytozy7,8,9. Jednak genetyczna modyfikacja lipidów błonowych in vivo jest prawie niemożliwa. Co więcej, jakościowe, a nawet ilościowe manipulacje ilością i dystrybucją białek są znacznie bardziej wykonalne niż w przypadku lipids10. Niemniej jednak, natywne i syntetyczne lipidy fluorescencyjne zostały wyizolowane i opracowane w celu symulacji endogennych lipidów błonowych in vitro i in vivo11. Jedną z grup szeroko stosowanych lipidów fluorescencyjnych są barwniki styrylowe, np. FM1-43, które wykazują fluorescencję wzmocnioną błoną i są potężnym narzędziem w badaniu uwalniania pęcherzyków synaptycznych (SV) w neuronach12. Ostatnio wynaleziono wrażliwe na środowisko barwniki lipidowe i są one szeroko stosowane jako nowa klasa reporterów do badania różnych właściwości błony komórkowej, w tym potencjału błonowego11, phase order13 i secretion14.

Nowa klasa mimetyki lipidów, których fluorescencja jest zarówno wrażliwa na pH (np. pHluorin), jak i na błonę (np. FM1-43), została opracowana do bezpośredniego pomiaru dystrybucji lipidów w błonie plazmatycznej i endosomach/lizosomach oraz ruchu lipidów podczas egzo-/endocytozy. W tym celu wybrano dobrze znane fluorofory solwatochromowe wykazujące charakterystykę push-pull ze względu na wewnątrzcząsteczkową wymianę ładunku. Spośród istniejących fluoroforów solwatochromowych, rusztowanie 1,8-naftalimidowe (ND) jest stosunkowo łatwe do modyfikacji, wszechstronne do znakowania i jest unikalne w fotofizyce15 i dlatego było używane w interkalatorach DNA, organicznych diodach elektroluminescencyjnych i czujnikach biomolekuł16,17,18.

Dołączenie grupy oddającej elektrony do pozycji C4 rusztowania ND generuje strukturę push-pull, która prowadzi do zwiększenia momentu dipolowego poprzez redystrybucję gęstości elektronów w stanie wzbudzonym19,20. Takie wewnątrzcząsteczkowe przeniesienie ładunku powoduje duże uzysk kwantowy i przesunięcia Stokesa, co skutkuje jasną i stabilną fluorescencją21. Grupa ta opracowała ostatnio serię solwatochromowych analogów lipidowych opartych na rusztowaniu ND i uzyskała je z dobrą wydajnością syntetyczną20.

Charakterystyka spektroskopowa pokazuje, że spośród tych produktów, ND6 posiada najlepsze właściwości fluorescencyjne (Rysunek 1)20. Po pierwsze, ma dobrze oddzielone piki wzbudzenia i emisji (tj. odpowiednio ~400 nm i ~520 nm, w Rysunek 2A,B) w porównaniu z popularnymi fluoroforami, takimi jak izotiocyjanian fluoresceiny, rodamina lub GFP, dzięki czemu jest od nich spektralnie oddzielalny, a tym samym przydatny do obrazowania wielobarwnego. Po drugie, fluorescencja ND6 wykazuje ponad ośmiokrotny wzrost fluorescencji w obecności miceli (Rysunek 2C), co sugeruje silną zależność od błony. Wcześniejsze badania obrazowania fluorescencji żywych komórek z różnymi typami komórek wykazały doskonałe barwienie błony przez ND620. Po trzecie, gdy pH roztworu zmniejsza się z 7,5 (powszechnie występujące w środowiskach zewnątrzkomórkowych lub cytozolowych) do 5,5 (powszechnie występujące w endosomach i lizosomach), ND6 wykazuje około dwukrotny wzrost fluorescencji (Rysunek 2D), co pokazuje jego wrażliwość pH. Co więcej, symulacja dynamiki molekularnej wskazuje, że ND6 łatwo integruje się z dwuwarstwą lipidową z rusztowaniem ND skierowanym na zewnątrz błony i resztą piperazyny, wykazując silne interakcje z grupami głów fosfolipidów (Rysunek 3). Podsumowując, te cechy sprawiają, że ND6 jest idealnym fluorescencyjnym analogiem lipidów do wizualizacji i pomiaru obrotu lipidów w błonie podczas egzo-/endocytozy.

Ten artykuł przedstawia metodę badania szybkości obrotu i dynamiki lipidów SV przy użyciu hodowanych mysich neuronów hipokampa. Stymulując neurony roztworami Tyrode'a o wysokiej zawartości K+, SV i błonę plazmatyczną załadowano ND6 (Figura 4A,B). Następnie neurony zostały ponownie stymulowane różnymi bodźcami, a następnie roztworami NH4Cl i pH 5,5 Tyrode (Ryc. 4D). Protokół ten ułatwia ilościowy pomiar złożonych wskaźników egzocytozy i endocytozy w różnych okolicznościach (Rysunek 4C).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Poniższy protokół obejmuje (1) uproszczoną procedurę tworzenia kultur hipokampa i kory mysiej opartą na dobrze udokumentowanym protokole2, (2) krótki wstęp do konfiguracji mikroskopu epifluorescencyjnego do badania żywych neuronów, (3) szczegółowy opis wprowadzania i obrazowania ND6 w neuronach mysich oraz (4) dyskusję na temat ilościowego określania transportu błonowego za pomocą sygnału ND6. Wszystkie procedury są zgodne z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego oraz IACUC na Uniwersytecie Florydy Atlantyckiej. Synteza ND6 została opisana we wcześniejszej publikacji20.

1. Przygotowanie kultur hipokampa i kory mózgu myszy

UWAGA: Jeśli nie określono inaczej, wszystkie etapy należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza o 2. poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Należy wysterylizować wszystkie narzędzia i materiały.

  1. Użyj pęsety rozmiaru 5, aby umieścić szkiełka nakrywki w wielodobowych płytkach hodowlanych.
    UWAGA: Na przykład płytka 24-dołkowa jest idealna dla rozmiaru 12 mm figure-protocol-1 szkiełka nakrywkowe
  2. Dodaj odpowiednią objętość macierzy zewnątrzkomórkowych, aby pokryć powierzchnię hodowli komórkowej (np. 75 μL roztworu macierzy błony podstawnej na 12 mm figure-protocol-2 lamella; patrz na Tabela materiałów)
  3. Umieść przygotowane płytki w inkubatorze do kultur tkankowych (5% CO22, 10% wilgotności i 37 °C) przez 1–4 h, aby umożliwić sieciowanie macierzy błony podstawnej.
  4. Uśmierć zwierzęta, otwórz czaszkę i przenieś cały mózg do 35 mm szalki Petriego zawierającej 3 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) z dodatkiem 20% płodowej surowicy bydlęcej (H+20). Przetnij mózg wzdłuż linii środkowej, a następnie oddziel korę i hipokampy w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu ograniczenia kontaminacji.
  5. Za pomocą mikronożyczek potnij tkanki na małe fragmenty (~1 mm)3). Przenieś te tkanki do probówki stożkowej o objętości 15 ml zawierającej 5 ml H+20.
  6. Przemyj tkanki trzykrotnie 5 ml H2O oraz trzykrotnie 5 ml HBSS.
  7. Dodać 1,5 ml 1% trypsyny z kwasem etylenodiaminotetraoctowym i inkubować w 37 °C przez 10 min w celu trawienia enzymatycznego.
  8. Powtórz krok 1.6, a na koniec odessać HBSS za pomocą próżni.
  9. Rozdziel tkanki mechanicznie w 1 ml HBSS zawierającego 2,95 g/L MgSO44•7H2przy użyciu wypalanej pipety szklanej.
  10. Odwirować zawiesinę komórkową przy 40 × g, 4 °C przez 5 min.
  11. Odssać supernatant i resuspendować komórki w odpowiedniej objętości pożywki hodowlanej. aby uzyskać stężenie ok. 10 00 0 komórek/ml.
  12. Wysiać komórki w zagęszczeniu ok. 1 0 0 komórek/cm²2 i umieścić kulturę w inkubatorze (5% CO2)2, 100% wilgotności oraz 37 °C) przez 1–4 h, aby ułatwić przywieranie komórek do szkiełek nakrywkowych.
  13. Dodaj odpowiednią objętość pożywki hodowlanej (np. 1 ml na studzienkę w przypadku płytki 24-dołkowej). Po 1 tygodniu dodaj taką samą objętość pożywki hodowlanej. Po 2 tygodniach wymień połowę istniejącej pożywki na świeżą. co tydzień.

2. Konfiguracja mikroskopu do obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek

UWAGA: Przykładowy zestaw do obrazowania (Rysunek 5) obejmuje co najmniej odwrócony mikroskop fluorescencyjny (patrz Tabela materiałów), źródło światła fluorescencyjnego z automatyczną migawką, zestawy filtrów fluorescencyjnych (np. do obrazowania ND6 należy użyć filtra 405/10 BP do wzbudzenia, 495 LP jako dichroicznego oraz 510/20 BP do emisji) oraz kamerę o wysokiej czułości (Tabela materiałów); wszystkie te elementy są sterowane przez oprogramowanie do akwizycji obrazu (Tabela materiałów).

  1. Przygotować komorę obrazującą, która umożliwia kontrolę temperatury oraz dopływ i odpływ roztworów do obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek.
    UWAGA: W niniejszym protokole wykorzystano na przykład zmodyfikowaną otwartą komorę obrazującą zamocowaną na platformie grzewczej (Rysunek 6).
  2. Skonfigurować programowalne urządzenie do przełączania roztworów perfuzyjnych i podawania stymulacji elektrycznej w określonych punktach czasowych podczas obrazowania.
    UWAGA: Synchronizacja sprzętowa i programowa jest niezbędna do analiz ilościowych (Rysunek 7). Na przykład w tym protokole wykorzystano sygnał wyzwalający (trigger) z kamery obrazującej do uruchomienia programu komputerowego sterującego automatycznym przełącznikiem, który z kolei steruje wielokanałowym systemem perfuzji oraz stymulatorem impulsowym o przebiegu prostokątnym.
  3. Aby obrazować jednocześnie dwa lub więcej reporterów fluorescencyjnych, przeprowadzić wielokanałowe obrazowanie fluorescencyjne poprzez sekwencyjne przełączanie zestawów filtrów lub jednoczesne rozszczepianie różnych emisji fluorescencji i rzutowanie ich na tę samą kamerę.

3. Obciążanie i obrazowanie ND6 w kulturach neuronalnych

  1. Odważ odpowiednią ilość ND6, rozpuść ją w dimetylosulfotlenku (DMSO) i pozostaw do rozpuszczenia w temperaturze pokojowej; poddaj krótko sonikacji (np. przez 3 min). Przefiltruj surowy roztwór zapasowy za pomocą 0.22 μm przefiltrować, aby usunąć duże agregaty barwnika. Po filtracji oznaczyć stężenie barwnika metodą spektroskopii absorpcyjnej przy 405 nm, wykorzystując konwencjonalny spektrofotometr lub spektrofotometr mikroobjętościowy przy użyciu ε = 10 70 M-1 cm-1.
  2. Przed aplikacją rozcieńczyć roztwór zapasowy do stężenia 1 μM przy użyciu roztworu kąpielowego. Przechowywać roztwór zapasowy w temperaturze pokojowej, w ciemności.
  3. Znakowanie endosomów i pęcherzyków synaptycznych
    1. Aby powszechnie znakować endocytowane przedziały błonowe, takie jak endosomy, należy dodać roztwór zapasowy ND6 (np. 1 mM w DMSO) do pożywki hodowlanej do stężenia końcowego wynoszącego 1 µMi inkubować w 5% CO22, 10% wilgotności oraz 37 °C przez 30 min. Aby ograniczyć zakres znakowania pęcherzyków synaptycznych (SV), należy farmakologicznie zahamować spontaniczną aktywność neuronalną. Można w tym celu zastosować np. tetrodotoksynę w celu zablokowania potencjałów czynnościowych lub 2,3-diokso-6-nitro-1,2,3,4-tetrahydrobenzo[f]chinoksalinowy kwas 7-sulfonowy (NBQX) oraz kwas D-(-)-2-amino-5-fosfonopentanowy (D-AP5) w celu zahamowania przekazywania pobudzającego.23.
    2. Aby selektywnie znakować pęcherzyki synaptyczne (SV), należy zastosować krótką, ale silną stymulację w celu wywołania presynaptycznej egzocytozy i endocytozy. Najpierw należy przenieść szkiełko przedmiotowe z kulturą do naczynia o średnicy 35 mm figure-protocol-3 szalka Petriego zawierająca 2 ml standardowego roztworu Tyroda w temperaturze pokojowej. Następnie rozcieńczyć roztwór zapasowy ND6 w wysokim stężeniu K-+ roztwór Tyroda (90 mM KCl) w stężeniu końcowym 1 μMPo trzecie, zastąpić standardowy roztwór Tyrode'a w szalce Petri wysokopotasowym roztworem wysokopotasowym zawierającym ND6.+ roztwór Tyrode'a i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 min.
  4. Przenieś hodowlę komórkową znakowaną ND6 do komory obrazowania wypełnionej podgrzanym roztworem Tyrode’a zawierającym 10 μM NBQX i 10 μM D-AP5.
  5. Dostosuj prędkość perfuzji do wartości ok. 0,2 mL/s (tj. 1 kropla na sekundę) i rozpocznij perfuzję podgrzanego wcześniej standardowego roztworu Tyrode’a zawierającego NBQX i D-AP5, aby usunąć nadmiar ND6 z hodowli.
  6. Dostosuj ostrość i zlokalizuj odpowiednie pole widzenia zawierające zdrowe i dobrze rozprzestrzenione neurony z połączonymi neurytami. Unikaj obszarów zawierających nieprzereagowane koloidy barwnika.
  7. Wykonaj obrazowanie komórek obciążonych ND6 z zastosowaniem różnych czasów ekspozycji, aby zidentyfikować optymalne ustawienia obrazowania.
    UWAGA: Aby uzyskać optymalny czas ekspozycji, najwyższa intensywność fluorescencji piksela na otrzymanym obrazie powinna wynosić około połowy zakresu bitowego (np. dla obrazu 16-bitowego zakres ten wynosi od 0 do 65 535), co pozwoli na dalszy wzrost fluorescencji po zastosowaniu kwasowego roztworu kąpielowego. Wybrany czas ekspozycji należy stosować we wszystkich obrazowaniach ND6.
  8. Skonfiguruj protokół stymulacji i perfuzji, odstępy między klatkami oraz całkowity czas trwania. Na przykład w poniższym protokole zastosuj 30 s baseline'u, 10 s stymulacji polem elektrycznym o częstotliwości 30 Hz, 50 s regeneracji oraz 120 s aplikacji 90 mM K++, 60 s regeneracji, 60 s w roztworze Tyrode'a z 50 mM NH4+4Cl, 60 s roztworu Tyroidego o pH 5,5 oraz odstęp między klatkami wynoszący 3 s.
  9. Rozpocznij akwizycję obrazów równocześnie ze zsynchronizowaną stymulacją i perfuzją. Monitoruj stymulację oraz wymianę roztworów podczas obrazowania.
  10. Po zakończeniu obrazowania należy przerwać perfuzję, zdjąć szkiełko przykrywcze i oczyścić komorę obrazowania przed następną próbą.

4. Ilościowe określenie transportu błonowego na podstawie zmiany fluorescencji ND6

  1. Utwórz kopię zapasową i/lub elektroniczną kopię wszystkich plików obrazów.
  2. Wybierz program analityczny do ekstrakcji danych, np. oprogramowanie do analizy obrazów typu open-source, takie jak ImageJ24 i/lub FIJI25.
  3. Otwórz lub zaimportuj stos obrazów do programu analizy.
  4. Ustaw pierwszy obraz jako referencyjny i wyrównaj pozostałe do niego, korzystając z funkcji lub wtyczek takich jak Rejestracja sztywna26, co pozwoli zminimalizować artefakty wynikające z dryfu w osiach xy. Należy odnieść się do Rysunek 8 na przykład obrazy.
  5. Obliczyć średnią ze wszystkich obrazów zarejestrowanych podczas 30-sekundowego okresu przedbazowego (pre-baseline), aby uzyskać obraz referencyjny. Zapisać kopię tego obrazu do późniejszego wykorzystania.
  6. Ustaw próg intensywności, aby wygenerować obraz binarny z obrazu uśrednionego do linii bazowej.
  7. Użyj funkcji Watershed w programie ImageJ lub analogicznych funkcji w innym programie, aby rozdzielić połączone neuryty lub komórki.
  8. Użyj Analiza cząsteczek funkcja z odpowiednią wielkością obszaru i kolistością w celu wyznaczenia regionów zainteresowania (ROI) odpowiadających błonom komórkowym, endosomom, lizosom lub guzkom synaptycznym. Zapisz wszystkie wybrane ROI.
  9. Wybierz cztery obszary zainteresowania (ROI) dla tła w regionach wolnych od komórek w obrębie pola widzenia.
  10. Zmierz średnią intensywność pikseli dla każdego ROI w każdej klatce stosu obrazów, a następnie wyeksportuj wyniki do analizy statystycznej.
  11. Oblicz średnią intensywność obszarów zainteresowania (ROI) tła jako szum bazowy, który zostanie odjęty od średnich intensywności pikseli dla każdego ROI.
  12. Oblicz średnią z trzech najwyższych wartości średnich intensywności dla każdego wybranego ROI podczas aplikacji roztworu Tyrode'a o pH 5,5, aby uzyskać maksymalną intensywność fluorescencji, która służy jako 10% do normalizacji.
  13. Oblicz średnią z trzech najniższych średnich intensywności dla każdego wybranego ROI podczas aplikacji 50 mM NH4Cl.4Cl służy do ustawienia minimalnej intensywności fluorescencji, która jest definiowana jako 0% w celu normalizacji.
  14. Obliczyć względne zmiany fluorescencji dla każdego ROI na podstawie jego własnych intensywności dla 0% i 100%. Wyznaczyć średnie zmiany fluorescencji, kinetykę zmian oraz inne wartości/wykresy na podstawie danych z poszczególnych ROI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pęcherzyki synaptyczne (SV) są wyspecjalizowane w uwalnianiu neuroprzekaźników poprzez wywołaną egzo- i endocytozę.27Pęcherzyki wydzielnicze (SV) mają silnie zakwaszone światło (tj. pH 5,5), co jest optymalne dla ND6. Użyliśmy wysokiego K+ stymulacja w celu wywołania egzo- i endocytozy pęcherzyków synaptycznych (SV), aby umożliwić dostęp ND6 do SV. Zgodnie z oczekiwaniami, po załadunku pojawiły się jasne, zielone fluorescencyjne punkty wzdłuż wypustek neuronalnych (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Barwniki na bazie lipidów, takie jak 1,1′-dioktadecylo-3,3,3′,3′-tetrametyloindokarbocyjanina (DiI) i nadchloran 3,3′-dioktadecyloksakarbocyjaniny (DiO), od dawna są używane do ilustrowania morfologii komórek i śledzenia procesów komórkowych, takich jak projekcje aksonów neuronów. Barwniki styrylowe, takie jak FM1-43, zostały wynalezione i z powodzeniem stosowane do badania egzocytozy34. Ze względu na ich niskie powinowactwo do błony, selektywnie znakują pęcherzyki endocytozowane w miejscu, w któr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Florida Atlantic University Office of Undergraduate Research and Inquiry grant (M.J.S.), Florida Department of Health Ed and Ethel Moore Pilot Grant 20A17 (Q.Z.), Alzheimer's Association grant AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) oraz NIA R21 grant AG061656-01A1 (Q.Z.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Digidata 1440A Data Acquistion SystemUrządzenia molekularneDigidata 1440ADo zsynchronizowanej stymulacji i wymiany roztworów
Dwukanałowy regulator temperaturyWarner InstrumentsTC-344BDo obrazowania żywych komórek
Surowica bydlęcapłodu OMEGA ScientificFB-01Do sporządzania roztworu H+20 stosowanego w sekcjach i hodowlach tkankowych
Hamamatsu Flash4.0 sCOMS kameraHamamatsu Inc.Kamera C13440-20CUwysokiej czułości
Zrównoważony roztwór soliHanka SigmaH6648Do wytwarzania roztworu H+20 stosowanego w sekcjach i hodowlach tkankowych
Podgrzewana platformaWarner InstrumentsPH-1Do obrazowania żywych komórek
MatrigelBD Biosciences354234Do hodowli tkankowej
Stół do izolacji drgań Micro-GTMC63-564Do obrazowania żywych komórek
Micro-managerhttps://micro-manager.org/NADo kontroli akwizycji obrazu
Wieloliniowy podgrzewacz roztworuWarner InstrumentsSHM-6Do obrazowania żywych komórek
Neurobasal Plus MediumTHermoFisher ScientificA3582901Do hodowli tkankowych
Mikroskop odwrócony Nikon Ti-ENikonTi-E/BDo obrazowania żywych komórek
ORCA-Flash4.0 Cyfrowa kamera CMOSHamamatsuC1340-20CUDo obrazowania żywych komórek
Komora perfuzyjnaWarner InstrumentsRC-26GDo obrazowania żywych komórek
Sześciokanałowy system perfuzji sterowania zaworemWarner InstrumentsVC-6Do wymiany roztworu
Kwadratowy stymulator impulsówInstrument do trawySD9Do stymulacji pola elektrycznego
o

Bibliografia

  1. Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P. Endocytosis and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 16 (2), 156-161 (2004).
  2. Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection. Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010).
  3. Augustine, G. J., Burns, M. E., DeBello, W. M., Pettit, D. L., Schweizer, F. E. Exocytosis: proteins and perturbations. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 659-701 (1996).
  4. Ammar, M. R., Kassas, N., Chasserot-Golaz, S., Bader, M. F., Vitale, N. Lipids in regulated exocytosis: what are they doing. Frontiers in Endocrinology. 4, 125(2013).
  5. Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112 (4), 519-533 (2003).
  6. Chabanon, M., Stachowiak, J. C., Rangamani, P. Systems biology of cellular membranes: a convergence with biophysics. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 9 (5), 1386(2017).
  7. Prosser, D. C., Wrasman, K., Woodard, T. K., O'Donnell, A. F., Wendland, B. Applications of pHluorin for quantitative, kinetic and high-throughput analysis of endocytosis in budding yeast. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54587(2016).
  8. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nature Protocols. 1 (6), 2970-2978 (2006).
  9. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  10. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  11. Demchenko, A. P., Mély, Y., Duportail, G., Klymchenko, A. S. Monitoring biophysical properties of lipid membranes by environment-sensitive fluorescent probes. Biophysical Journal. 96 (9), 3461-3470 (2009).
  12. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).
  13. Gaus, K., Zech, T., Harder, T. Visualizing membrane microdomains by Laurdan 2-photon microscopy. Molecular Membrane Biology. 23 (1), 41-48 (2006).
  14. Kahms, M., Klingauf, J. Novel pH-sensitive lipid based exo-endocytosis tracers reveal fast intermixing of synaptic vesicle pools. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 18(2018).
  15. Zhou, L., Xie, L., Liu, C., Xiao, Y. New trends of molecular probes based on the fluorophore 4-amino-1,8-naphthalimide. Chinese Chemical Letters. 30 (10), 1799-1808 (2019).
  16. Tomczyk, M. D., Walczak, K. Z. l,8-Naphthalimide based DNA intercalators and anticancer agents. A systematic review from 2007 to 2017. European Journal of Medicinal Chemistry. 159, 393-422 (2018).
  17. Ulla, H., et al. Blue emitting 1,8-naphthalimides with electron transport properties for organic light emitting diode applications. Journal of Molecular Structure. 1143 (5), 344-354 (2017).
  18. Duke, R. M., Veale, E. B., Pfeffer, F. M., Kruger, P. E., Gunnlaugsson, T. Colorimetric and fluorescent anion sensors: An overview of recent developments in the use of 1,8-naphthalimide-based chemosensors. Chemical Society Reviews. 39 (10), 3936-3953 (2010).
  19. Panja, S. K., Dwivedi, N., Saha, S. Tuning the intramolecular charge transfer (ICT) process in push-pull systems: Effect of nitro groups. RSC Advances. 6 (107), 105786-105794 (2016).
  20. Thomas, D., et al. Solvatochromic and pH-sensitive fluorescent membrane probes for imaging of live cells. ACS Chemical Neuroscience. 12 (4), 719-734 (2021).
  21. Leslie, K. G., Jacquemin, D., New, E. J., Jolliffe, K. A. Expanding the breadth of 4-amino-1,8-naphthalimide photophysical properties through substitution of the naphthalimide core. Chemistry - A European Journal. 24 (21), 5569-5573 (2018).
  22. Liu, G. S., Tsien, R. W. Properties of synaptic transmission at single hippocampal synaptic boutons. Nature. 375 (6530), 404-408 (1995).
  23. Zhang, Q., Cao, Y. -Q., Tsien, R. W. Quantum dots provide an optical signal specific to full collapse fusion of synaptic vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 104 (45), 17843-17848 (2007).
  24. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  27. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annual Review of Neuroscience. 27, 509-547 (2004).
  28. Lazarenko, R. M., DelBove, C. E., Strothman, C. E., Zhang, Q. Ammonium chloride alters neuronal excitability and synaptic vesicle release. Scientific Reports. 7 (1), 5061(2017).
  29. Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344 (6187), 1023-1028 (2014).
  30. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (1), 57-69 (2005).
  31. DelBove, C. E., et al. Reciprocal modulation between amyloid precursor protein and synaptic membrane cholesterol revealed by live cell imaging. Neurobiology of Disease. 127, 449-461 (2019).
  32. Dason, J. S., Smith, A. J., Marin, L., Charlton, M. P. Vesicular sterols are essential for synaptic vesicle cycling. Journal of Neuroscience. 30 (47), 15856-15865 (2010).
  33. Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms. Journal of Neuroscience. 39 (42), 8209-8216 (2019).
  34. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200(1992).
  35. Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins. Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sonda ND6lipid wra liwy na pHegzocytozaendocytozatransport lipid wobrazowanie ywych kom rekb ona p cherzyka synaptycznegomikroskopia fluorescencyjnarecykling lipid w

Powiązane artykuły