Magnetyczny rezonans jądrowy z czystym przesunięciem: nowe narzędzie do metabolomiki roślin

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia zastosowanie PSYCHE i SAPPHIRE-PSYCHE w profilowaniu metabolicznym roślin i zawiera szczegółowe procedury przygotowania próbek i optymalnego zapisu widm NMR Pure Shift. Omówiono przykłady, dzięki którym przyrost rozdzielczości osiągnięty przez rozprzęganie homojądrowe pozwala na pełniejsze zrozumienie systemu.

Streszczenie

Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) jest jednym z najpotężniejszych narzędzi używanych w metabolomice. Jest to bardzo dokładna i odtwarzalna metoda, która nie tylko dostarcza danych ilościowych, ale także umożliwia identyfikację strukturalną metabolitów obecnych w złożonych mieszaninach.

Profilowanie metaboliczne za pomocą ¹H NMR okazało się przydatne w badaniu różnych typów scenariuszy roślin, które obejmują między innymi ocenę warunków upraw, zabiegi po zbiorach i po zbiorach, fenotypowanie metaboliczne, szlaki metaboliczne, regulację genów, identyfikację biomarkerów, chemotaksonomię, kontrolę jakości, nazwę pochodzenia. Jednak nakładanie się na sygnał dużej liczby rezonansów z rozszerzonymi wielokrotnościami sprzężenia J komplikuje analizę widm i jej interpretację oraz stanowi ograniczenie dla klasycznego profilowania ¹H NMR.

W ostatniej dekadzie opracowano nowatorskie techniki szerokopasmowego rozprzęgania homojądrowego NMR, dzięki którym sygnały wielokrotne zapadają się w pojedyncze linie rezonansowe - powszechnie nazywane metodami Pure Shift - w celu przezwyciężenia problemu rozdzielczości widm charakterystycznego dla klasycznych widm ¹H NMR.

Tutaj przedstawiono krok po kroku protokół przygotowania ekstraktu roślinnego i procedurę zapisu optymalnych widm Pure Shift PSYCHE i SAPPHIRE-PSYCHE w trzech różnych matrycach roślinnych - liście wanilii, bulwy ziemniaka (S. tuberosum) i agrest przylądkowy (P. peruviana). Omówiono wpływ przyrostu rozdzielczości w identyfikacji metabolicznej, analizie korelacji i analizach wielowymiarowych w porównaniu z widmami klasycznymi.

Wprowadzenie

Kompletny zestaw metabolitów, które składają się na organizm - substraty, produkty pośrednie i końcowe produkty procesów biologicznych - został ukuty w 1998 roku pod nazwą metabolom. Powszechnie wiadomo, że metabolom jest ściśle związany z fenotypem i jest szczególnie interesujący dla roślin, ponieważ odzwierciedla bezpośrednią interakcję między genotypem a środowiskiem^1,2. W związku z tym charakterystyka profilu metabolomicznego stała się niezwykle ważna dla roślin. Dzięki identyfikacji i kwantyfikacji biomarkerów (kluczowych metabolitów) i wzorców metabolicznych możliwe stało się między innymi rozróżnienie m....

Protokół

1. Przygotowanie próbki

1. Agrest przylądkowy
   1. Umieść 100-200 g świeżych owoców w wazonie blendera. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 30 minut, a następnie homogenizować w blenderze laboratoryjnym.
   2. Natychmiast przenieś sok do plastikowych probówek o pojemności 50 ml, zamroź je w ciekłym azocie i liofilizuj do sucha przez 4 do 5 dni.
   3. Zmiel liofilizowany materiał na drobny proszek za pomocą młynka elektrycznego.
      UWAGA: Obchodzenie się z suchym materiałem musi być szybkie, ponieważ proszek jest wysoce higroskopijny.
   4. Odważyć 1 g zmielonego materiału i dodać 10 ml ultraczystej wody. Wirować przez 1 min.
   ....

Wyniki

Analiza widma NMR
Eksperymenty PSYCHE zwiększają rozdzielczość widm poprzez sprowadzanie rezonansów sprzężonych do singletów²¹, co z kolei zmniejsza nakładanie się sygnałów i ułatwia przypisanie oraz analizę danych. Metoda Pure Shift NMR może być stosowana do ekstraktów roślinnych. W niniejszej pracy demonstrujemy jej zastosowanie w trzech różnych matrycach: liściach wanilii, bulwach ziemniaka oraz owocach Physalis peruviana. Poprawa rozdzielczości uzyskana w widmach .......

Dyskusja

Identyfikacja strukturalna i kwantyfikacja metabolitów są kluczowymi kwestiami w charakterystyce metabolomu, danych, które po poddaniu analizom wieloczynnikowym pozwalają lepiej zrozumieć badany system biologiczny. Przygotowanie próbki i pozyskiwanie danych to krytyczne aspekty, które wymagają optymalizacji, aby zapewnić wiarygodne wyniki.

W tym artykule opisujemy i ilustrujemy przygotowanie próbki do analizy NMR trzech różnych matryc roślinnych. Podobnie jak w przypadku każdej procedury ekstr.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Seria 77500 Freezone 4,5-litrowy stół stołowy	Labconco	77500
Bruker Avance III 500 MHz wyposażony w sondę kriogeniczną 5 mm TCI Z-gradient	Centrivap
Centrivap z chłodzeniem Koncentratory odśrodkowe Labconco Seria 7310000	Labconco	7310000
Tlenek deuteru	Sigma-Aldrich	151882
Młynek MKM6003	Bosch	MKM6003
Licuadora Blender 8011S model Hgb2wts3	Waring	Hgb2wts3
Metanol-d4	Sigma-Aldrich	151947