Method Article

Wytwarzanie, utrzymanie i charakterystyka ludzkich organoidów jelitowych i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/62721

⸱

July 9th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisano szczegółowe metody generowania, utrzymywania i charakteryzowania ludzkich organoidów jelita cienkiego i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metody te mają na celu poprawę odtwarzalności, rozszerzenie skalowalności i skrócenie czasu pracy wymaganego do posiewu i pasażowania organoidów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Specyfikacja regionu jelitowego opisuje proces, w którym unikalna morfologia i funkcja są przekazywane określonym obszarom rozwijającego się przewodu pokarmowego (GI). Specyfikacja regionalna w jelicie jest napędzana przez wiele szlaków rozwojowych, w tym szlak białka morfogenetycznego kości (BMP). W oparciu o normalną specyfikację regionalną opracowano metodę generowania ludzkich organoidów okrężnicy (HCO) z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), które obejmują ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hES) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Trzydniowa indukcja sygnalizacji BMP w wystarczającym stopniu kształtuje hodowle rurki środkowej / tylnej w specjalne HCO z białkiem wiążącym sekwencję AT (SATB2) eksprymującym białko 2 (AT), zawierające wszystkie główne typy komórek nabłonkowych obecnych w ludzkiej okrężnicy, a także współtworzące się komórki mezenchymalne. Pominięcie BMP (lub dodanie inhibitora BMP NOGGIN) w tym krytycznym okresie wzorcowania spowodowało powstanie ludzkich organoidów jelitowych (HIO). HIO i HCO morfologicznie i molekularnie przypominają odpowiednio ludzkie rozwijające się jelito cienkie i okrężnicę. Pomimo użyteczności HIO i HCO do badania rozwoju jelit człowieka, generowanie HIO i HCO jest wyzwaniem. W artykule przedstawiono metody generowania, utrzymywania i charakteryzowania HIO i HCO. Ponadto przedstawiono krytyczne kroki w protokole i zalecenia dotyczące rozwiązywania problemów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie rozwoju jelita grubego u człowieka jest trudne ze względu na ograniczenia dotyczące stosowania ludzkich tkanek płodowych. Modele zwierzęce były nieocenione i historycznie wykorzystywane w podejściach genetycznych u myszy w celu badania rozwoju jelit. Jednak różnice między rozwojem jelit myszy i człowieka ograniczają możliwość zastosowania myszy jako systemu modelowego. Na przykład, chociaż tworzenie się krypt w jelicie cienkim i okrężnicy myszy następuje po urodzeniu, ludzie rodzą się z w pełni uformowanymi kryptami1. Ponadto ludzkie jelito cienkie i okrężnica zawierają typy komórek, które nie występują u myszy, w tym komórki enteroendokrynne wykazujące ekspresję motyliny (MLN) w jelicie cienkim2 i komórki kubkowe wykazujące ekspresję mucyny 5B (MUC5B) w okrężnicy 3,4. Z tego powodu ważne jest, aby mieć system hodowli komórkowych, który dokładnie modeluje dynamiczne zdarzenia molekularne, które definiują wczesne etapy rozwoju okrężnicy. W związku z tym skierowanie hPSC do generowania komórek o charakterystyce jelita grubego stanowi potężny model do badania rozwoju jelita grubego u człowieka.

Protokoły zostały opracowane w celu ułatwienia powtarzalnego, synchronicznego i wydajnego tworzenia organoidów podobnych do jelita6 i okrężnicy7 z hPSC. Protokoły te wykorzystują krokową procedurę różnicowania, która naśladuje rozwój jelita płodowego i okrężnicy (ryc. 1). Po pierwsze, ostateczna endoderma jest generowana z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przez leczenie Activin A, mimetykiem węzłowym. Narażenie ostatecznej endodermy na wysokie poziomy WNT i czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) indukuje morfogenezę do sferoidów rurki środkowej / tylnej CDX2 + . Sferoidy jelita środkowego / tylnego są następnie osadzane w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i przekształcane w HIO lub HCO poprzez przejściową manipulację sygnalizacją BMP. Hamowanie sygnalizacji BMP za pomocą NOGGIN lub dodanie samej pożywki wzrostowej powoduje powstawanie HIO, które przypominają ludzkie proksymalne jelito cienkie.

Poprzez aktywację sygnalizacji BMP za pomocą BMP2, sferoidy jelita środkowego / tylnego są modelowane w HCO, które zachowują wzór w nabłonku i mezenchymie7. HCO zawierają wzbogacone w okrężnicę, komórki kubkowe wykazujące ekspresję MUC5B i są zdolne do wytwarzania komórek enteroendokrynnych eksprymujących specyficzne dla jelita grubego komórki jelita grubego typu insulinopodobnego 5 (INSL5). Wyizolowana mezenchyma z HCO wyraża homeobox A13 (HOXA13) i HOXD13, które są również wyrażane w ludzkim pierwotnym mezenchymieokrężnicy 8. Ważne jest, aby pamiętać, że etap tworzenia wzorca występuje w dniach 7-10 protokołu różnicowania. Ten trzydniowy okres jest wystarczający do wywołania wzorca okrężnicy, który utrzymuje się po przedłużonej hodowli in vitro .

Opisane poniżej protokoły są przeznaczone dla badaczy, którzy są zaznajomieni z hodowlą hPSC bez karmienia. Dla badaczy, którzy nie są zaznajomieni z tym typem hodowli hPSC, zaleca się szkolenie na temat hPSC, takie jak te oferowane przez Stem Cell Technologies lub Pluripotent Stem Cell Facility (PSCF) w Cincinnati Children's Hospital. Jakość początkowych hPSC ma kluczowe znaczenie i może mieć wpływ na wszystkie dalsze etapy. Poniższy protokół rozpocznie się od hPSC, które były hodowane przez 4 dni i są gotowe do podziału.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wytwarzanie organoidów jelitowych i okrężnicy człowieka

  1. Przygotowanie płyt pokrytych ECM
    1. Dodaj 50 ml zimnego podłoża DMEM do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    2. Wyjąć podwielokrotność 4 ECM z kwalifikacją hESC (patrz tabela materiałów) z zamrażarki w temperaturze -80 °C i rozmrozić na lodzie.
      UWAGA: Zapoznaj się z certyfikatem analizy produktu, aby określić objętość ECM z kwalifikacją ESC wymaganą do przygotowania 4x zapasu.
    3. Jeśli ECM z kwalifikacją hESC nie jest w pełni rozmrożony, należy pobrać 750 μl DMEM z probówki stożkowej o pojemności 50 ml i wymieszać go z ECM.
    4. Przenieść mieszaninę ECM z kwalifikacją DMEM/hESC do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z DMEM i dobrze wymieszać. Dodaj 0,5 ml na studzienkę do każdej z 4 x 24-dołkowych płytek do hodowli komórkowych.
    5. Potrząśnij płytkami, aby równomiernie rozprowadzić ECM w całej studzience, aby upewnić się, że cała powierzchnia jest pokryta. Za pomocą parafilmu uszczelnić płytki pokryte ECM i pozostawić je w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego na co najmniej 1 godzinę. Płytki z powłoką ECM należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni lub do momentu, gdy będą potrzebne.
  2. Posiewanie pojedynczych komórek hPSC
    1. Umieścić 24-dołkową płytkę pokrytą ECM w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 30 minut, aby mogła osiągnąć temperaturę pokojową.
    2. Umieść mTeSR1 complete medium, roztwór do oddzielania komórek i zaawansowany DMEM w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i pozwól im się rozgrzać przez 30 minut.
    3. Sprawdź, czy hPSC są zlewające się w co najmniej 85% z minimalnym zróżnicowaniem. W razie potrzeby usuń wszystkie zróżnicowane komórki.
    4. Przygotować pożywkę galwaniczną w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w następujący sposób: 13 ml mTeSR1 i 13 μl 10 mM inhibitora kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK).
      UWAGA: Y-27632 hamuje anoikis i zwiększa przeżywalność pojedynczych komórek.
    5. Aby zebrać komórki z płytki 6-dołkowej, odessać pożywkę z 3 do 4 dołków i przemyć raz 2 ml zaawansowanego DMEM na studzienkę.
    6. Odessać zaawansowany DMEM i dozować 1 ml roztworu do dysocjacji komórek do każdej studzienki. Inkubować płytkę przez 5-7 minut w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są w zawiesinie.
    7. Oddziel wszelkie pozostałe grudki komórek, pipetując w górę i w dół 4-5 razy za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
    8. Dodaj 2 ml zaawansowanego DMEM do każdej studzienki, delikatnie pipetuj w górę i w dół 4-5 razy i przenieś do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wiruj komórki na 300 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    9. Odessać pożywkę z probówki bez zasysania osadu komórkowego i dodać 6 ml przygotowanej pożywki mTeSR1 plus inhibitor ROCK. Delikatnie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół 3-4 razy, a następnie przenieść zawiesinę do reszty pożywki inhibitora mTeSR1/ROCK wewnątrz probówki o pojemności 50 ml. Zawiesić energicznie 4-5 razy i policzyć komórki za pomocą hemekytometru.
    10. Odessać ECM z płytki 24-dołkowej tuż przed posianiem komórek. Ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół 2-3 razy i dozować 0,5 ml zawiesiny komórek do każdej studzienki.
      UWAGA: Optymalna gęstość posiewu musi zostać określona przez eksperymentatora. Tutaj optymalna liczba komórek wynosi 80 000-200 000 komórek na studzienkę.
    11. Delikatnie kołysz płytką 3 razy zgodnie z ruchem wskazówek zegara, 3 razy przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, 3 razy do przodu i do tyłu oraz 3 razy na boki, aby równomiernie rozproszyć komórki.
    12. Przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i inkubować przez 24 godziny.
      UWAGA: Nie należy naruszać płytki przez pierwsze kilka godzin, aby zapewnić prawidłowe rozproszenie komórek w studzienkach.
    13. Po 24 godzinach (Rysunek 2A) odessać zużytą pożywkę, dodać 0,5 ml mTeSR1 na studzienkę, ponownie inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny (Rysunek 2B), a następnie przejść do następnego kroku.
  3. Różnicowanie ostatecznej endodermy (DE) od hPSC
    1. W stożkowej probówce o pojemności 15 ml dodaj 13 ml pożywki Activin Day 1 (patrz tabela materiałów), 13 μl 100 μg/ml aktywiny A i 1,95 μl 100 μg/ml BMP4. Ogrzać podłoże w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Odessać pożywkę mTeSR1 z płytki 24-dołkowej i dodać 0,5 ml pożywki Activin Day 1 do dołka. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i inkubować przez 24 godziny. Sprawdź ogniwa po 24 godzinach.
      UWAGA: Rozległa śmierć komórki powinna być widoczna, jak pokazano na rysunku 2C. Chociaż monowarstwa będzie wydawać się rzadka, kolonie komórek rozszerzą się.
    3. Przygotuj kompletną pożywkę Activin Day 2, dodając 12,5 μl 100 μg/ml Activiny A do 12,5 ml pożywki Activin Day 2 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    4. Wyjąć 24-dołkową płytkę różnicującą z inkubatora CO2 i usunąć zużyte podłoże. Dozować 0,5 ml podgrzanej pożywki Activin Day 2 do dołka i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze CO2 na 24 godziny.
      UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas dozowania pożywki. Nie dozuj pożywki bezpośrednio na środku studzienki, ponieważ spowoduje to oderwanie komórek w monowarstwie. Ostrożnie dozuj pożywkę po ścianie studzienki. Następnego dnia tworzy się monowarstwa komórek przy znikomej śmierci komórki. Komórki powinny teraz zlewać się w ~90 do 95% (rysunek 2D).
    5. Przygotuj kompletną pożywkę Activin Day 3, dodając 12,5 μl 100 μg/ml Activin A do 12,5 ml pożywki Activin Day 3 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    6. Usuń zużytą pożywkę i dozuj 0,5 ml pożywki Activin Day 3 do dołka.
      UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas dozowania pożywki. Nie dozuj pożywki bezpośrednio na środku studzienki, ponieważ spowoduje to oderwanie komórek w monowarstwie. Ostrożnie dozuj pożywkę po ścianie studzienki. Następnego dnia monowarstwa powinna osiągnąć pełną konfluencję z niewielką lub żadną śmiercią komórki na tym etapie. Nie próbuj generować sferoid środkowego odcinka jelita grubego, jeśli monowarstwa nie zlewa się 24 godziny po dodaniu pożywki Activin Day 3. Patrz rysunek 2E , aby zapoznać się z idealną morfologią monowarstwy DE przed przystąpieniem do generowania sferoid środkowego jelita tylnego.
    7. Przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne (IF) monowarstwy w celu ekspresji białka A2 w pudełku widłowym (FOXA2) i czynnika transkrypcyjnego 17 w regionie determinującym płeć (SRY) podczas optymalizacji różnicowania DE.
  4. Różnicowanie DE na sferoidy środkowego jelita tylnego
    1. Do stożkowej probówki o pojemności 50 ml dodać 25 ml pożywki indukcyjnej dla jelita środkowego z FGF4 (bez CHIR99021) i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut.
    2. Aby przygotować kompletną pożywkę indukcyjną dla środkowego odcinka jelita grubego, dodaj 7,5 μl CHIR99021 po ogrzaniu pożywki.
    3. Usunąć zużytą pożywkę, dozować 0,5 ml pożywki indukcyjnej dla środkowego jelita grubego na dołek i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.
    4. Po tym, jak następnego dnia nastąpiła kondensacja komórek w monowarstwie (ryc. 3A), zastąp zużytą pożywkę świeżą pożywką indukcyjną dla środkowego odcinka jelita grubego i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 24 godziny.
      UWAGA: Struktury rurkowe będą zauważalne po 48 godzinach indukcji jelita środkowego tylnego, jak pokazano na rysunku 3B. Sferoidy środkowego odcinka jelita tylnego zaczną pączkować z monowarstwy w 3 dniu, jak pokazano na rysunku 3C.
    5. Aby uniknąć wyrzucenia pływających sferoid podczas zmiany pożywki, przenieś starą pożywkę do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj przy 300 × g przez 1 minutę. Ponownie zawiesić sferoidy w 12,5 ml świeżej pożywki indukcyjnej dla środkowego jelita grubego, dodać 0,5 ml na studzienkę do tej samej 24-dołkowej płytki i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.
    6. W 4 dniu indukcji jelita grubego (ryc. 3D) należy zebrać pływające sferoidy z dołków płytkowych, zbierając pożywkę do probówki o pojemności 15 ml, a następnie odwirować w temperaturze 300 × g przez 1 minutę. Przejdź do następnego kroku, aby osadzić sferoidy środkowego jelita tylnego w ECM.
  5. Poszycie i wzór sferoid jelita środkowego/tylnego w ECM
    1. Rozmrozić matrycę membrany podstawnej ECM w temperaturze 4 °C przez noc przed osadzeniem.
      UWAGA: Ten moduł ECM różni się od ECM z kwalifikacją hESC. Moduł ECM należy umieścić na lodzie, a odpowiednią objętość ECM można podzielić na wstępnie schłodzone probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml na lodzie. Tabela 1 zawiera informacje na temat objętości ECM. Upewnij się, że objętość ECM wynosi co najmniej 75% w kropli, w której zostaną osadzone sferoidy.
    2. Rozgrzać 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    3. Zebrać pływające sferoidy ze wszystkich 24 dołków za pomocą pipety o pojemności 1000 μl i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wiruj sferoidy z prędkością 300 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Odessać większość pożywki, ale pozostawić objętość wymaganą do posiewu (Tabela 1).
    4. Przygotuj końcówki do pipet o pojemności 1000 μl i 200 μl, odcinając ich końce. Wyjmij podgrzaną płytkę 24-dołkową.
    5. Wymieszać pływające sferoidy, przenieść odpowiednią objętość do rurki ECM umieszczonej na lodzie, a następnie ponownie zawiesić sferoidy i ECM przez pipetowanie, aby dobrze je wymieszać.
    6. Weź 65 μl mieszaniny sferoid i ECM z naciętymi końcówkami do pipet o pojemności 200 μl i załaduj do środka każdej studzienki na płytce 24-dołkowej. Aby upewnić się, że tworzy się dobra kropla ECM, należy delikatnie i powoli podnosić pipetę podczas dozowania mieszaniny.
      UWAGA: Płytka 30-100 sferoid na studzienkę.
    7. Delikatnie przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i inkubować przez 5 minut.
    8. Odwróć płytkę do góry nogami i inkubuj przez 15-25 minut, co pomoże kropelkom ECM utrzymać strukturę przypominającą kopułę.
    9. Podczas inkubacji przygotuj wymagane podłoże i rozgrzej je. Po zestaleniu ECM dodać 0,5 ml pożywki wzorcowej HIO lub HCO do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Rysunek 3E przedstawia obraz sferoid w ECM.
    10. Hoduj sferoidy w pożywce modelowej przez 3 dni.
    11. Po 3 dniach zmienić pożywkę wzorcową HIO lub HCO na normalną pożywkę wzrostową i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
      UWAGA: Organoidy w tym punkcie czasowym (dzień 10) są organoidami we wczesnym stadium. W oparciu o cel projektu, niektóre organoidy we wczesnym stadium rozwoju mogą być wykorzystane do wczesnej analizy wzorców, jak szczegółowo opisano w sekcji 2.
  6. Przerost i pasażowanie ludzkich organoidów jelitowych i okrężnicy
    1. Po 10 dniach zmieniaj podłoże co 3 dni.
      UWAGA: W zależności od gęstości posiewu i wzrostu organoidów mogą być wymagane częstsze zmiany pożywki. Zmiany podłoża należy wykonać, zanim czerwień fenolowa (wskaźnik pH) w pożywce zmieni kolor na żółty.
    2. Inkubować organoidy do dnia 21 (ryc. 3F).
      UWAGA: Leczenie BMP2 spowoduje zmniejszenie liczby organoidów (~ 3 razy mniej niż HIO), które wyrastają ze sferoidów. W związku z tym do wytworzenia HCO konieczne jest pokrycie większej liczby sferoid.
  7. Podział organoidów w dniu 21
    1. Zbadaj organoidy.
      UWAGA: Organoidy muszą zostać podzielone w dniu 21, ponieważ ECM jest prawie zdegradowany do dnia 21 z powodu wzrostu i ekspansji organoidów.
    2. Przygotuj końcówki do pipet o pojemności 1000 μl i 200 μl, odcinając ich końce.
    3. Rozgrzać 24-dołkową płytkę Nunc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    4. Umieścić odpowiednią objętość ECM w wstępnie schłodzonych probówkach o pojemności 1,5 ml (tabela 1).
    5. Delikatnie zeskrobać kropelkę ECM z organoidami za pomocą końcówki pipety o pojemności 1000 μl i kilkakrotnie odpipetować mieszaninę w górę i w dół, aby rozbić ECM.
    6. Przenieść mieszaninę na szalkę Petriego o średnicy 60 mm i sprawdzić organoidy pod mikroskopem. W razie potrzeby oddzielić organoidy od siebie za pomocą sterylnych kleszczy. Upewnij się, że oddzielenie nie uszkodzi nabłonka organoidów.
    7. Przenieść organoidy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 × g przez 30 s. Odessać supernatant i pozostawić ~1 ml pożywki w probówce.
      UWAGA: Objętość podłoża można zmieniać w zależności od celu eksperymentu. Jeśli wymagana jest większa liczba organoidów na kroplę ECM, objętość podłoża można zmniejszyć. Jeśli jednak wymagana jest mniejsza liczba organoidów, objętość podłoża można zwiększyć.
    8. Dobrze wymieszać organoidy, przenieść odpowiednią objętość do probówki ECM umieszczonej na lodzie, a następnie ponownie zawiesić organoidy i ECM przez pipetowanie, aby dobrze je wymieszać.
    9. Dodać 65 μl mieszaniny sferoid i ECM do środka każdego dołka płytki 24-dołkowej, używając naciętych końcówek pipet o pojemności 200 μl.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby podczas pipetowania najpierw pobrać organoidy, a następnie ECM. Tak więc, podczas dozowania mieszaniny, organoidy znajdują się w górnej części kropli ECM.
    10. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 5 minut.
    11. Odwróć płytkę do góry nogami na kolejne 15-25 minut, aby kropelki ECM utrzymały strukturę przypominającą kopułę.
    12. Dodać 0,5 ml pożywki HIO/HCO do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
      UWAGA: Pożywka wzrostowa jest taka sama zarówno dla HIO, jak i HCO po utworzeniu wzoru.
    13. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni aż do 35 dnia (ryc. 3G).

2. Weryfikacja wzorca organoidów za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR)

  1. Przed pobraniem RNA należy przygotować 1x bufor do lizy RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Wyrzuć zużytą pożywkę i dodaj 350 μl buforu do lizy do każdego dołka na 24-dołkowej płytce. Poddać organoidy lizie, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Aby uzyskać lepszą lizę, wiruj krótko z maksymalną prędkością przez 5 s.
  3. Wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będą gotowe do ekstrakcji RNA. Po przygotowaniu wyjmij próbki RNA z zamrażarki o temperaturze -80 °C i rozmrażaj je na lodzie przez 10 minut. Energicznie wirować probówki w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut, aby zapewnić całkowitą lizę próbek.
  4. Ponownie umieść próbki na lodzie i przystąp do ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcją producenta. Przenieś próbki RNA do zamrażarki o temperaturze -80 °C, jeśli nie są gotowe do przejścia do następnego etapu.
  5. Wykonaj ekstrakcję RNA, leczenie DNAzy, syntezę cDNA i RT-qPCR przy użyciu standardowej metodologii. Zapoznaj się z tabelą 2 , aby uzyskać listę nazw i sekwencji starterów.

3. Weryfikacja wzorca organoidów za pomocą immunofluorescencji

  1. Pobieranie i utrwalanie organoidów
    1. Odessać pożywkę HIO lub HCO z odpowiednich studzienek i dodać 1 ml lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do każdej studzienki. Oddzielić organoidy od ECM za pomocą naciętej końcówki pipety o pojemności 200 μl. Pipetować w górę i w dół, aby oddzielić duże kawałki ECM od organoidów.
    2. Przenieść organoidy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i napełnić resztę probówki lodowatym PBS i delikatnie wymieszać, odwracając probówkę. Pozwól organoidom osiąść grawitacyjnie i zassać PBS.
      UWAGA: Jeśli organoidy nie osiądą grawitacyjnie, odwirować przy 300 × g przez 1 minutę.
    3. Odessać PBS i dodać 1 ml lodowatego roztworu rozkładającego ECM. Trzymaj rurkę na lodzie przez 10-15 minut na obrotowej platformie, delikatnie potrząsając.
      UWAGA: Przechyl probówkę pod kątem 45°, aby umożliwić prawidłowe wymieszanie organoidów i roztworu do odzyskiwania komórek. Po 10-15 minutach organoidy powinny osiąść na dnie probówki, wskazując na całkowite trawienie ECM.
    4. Dodaj zimny PBS do probówki do 15 ml; Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę. Gdy organoidy osiądą na dnie probówki, odessać PBS i dodać 1 ml wstępnie schłodzonego 4% paraformaldehydu, aby utrwalić organoidy. Inkubować organoidy z 4% paraformaldehydem na lodzie przez 1 godzinę.
    5. Napełnij pozostałą część probówki lodowatym PBS i umieść ją poziomo na platformie bujanej w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia wyrzucić paraformaldehyd/PBS do określonego pojemnika na odpady i przemyć raz 15 ml lodowatego PBS, jak opisano w kroku 3.1.2.
    6. Odessać PBS i napełnić probówkę 30% sacharozą w PBS. Umieść rurkę poziomo na platformie bujanej w temperaturze 4 °C przez noc.
    7. Następnego dnia należy osadzić organoidy w modelu podstawowym o wymiarach 7 mm x 7 mm x 5 mm z pożywką OCT i błyskawicznie zamrozić przy użyciu kąpieli suchego lodu/etanolu.
    8. Osusz bloki chusteczkami laboratoryjnymi, zawiń je w ręcznik papierowy i przechowuj przez noc w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Następnego dnia wytnij skrawki 5 μm na szkiełkach mikroskopowych za pomocą kriostatu. Przechowywać szkiełka w temperaturze -80 °C.
  2. Barwienie immunofluorescencyjne organoidów
    1. Przetwarzaj szkiełka z zamrażarki w temperaturze -80 °C i wykonaj barwienie IF przy użyciu standardowych protokołów.
    2. Nałóż szkiełka nakrywkowe na szkiełka i wysusz je w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem przez co najmniej 2 godziny lub przez noc przed obrazowaniem.
    3. Zobrazuj szkiełka za pomocą obiektywu 25x mikroskopu konfokalnego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomyślne generowanie sferoid w fazie indukcji jelita środkowego / tylnego wskazuje na udane wzorcowanie. Wykonaj barwienie IF dla CDX2 na pływających sferoidach i na monowarstwie, aby potwierdzić, że wzór jest prawidłowy. Chociaż barwienie na ostatecznym etapie endodermy (DE) może wskazywać na skuteczność indukcji DE, wytwarzanie sferoidów nie jest możliwe bez skutecznej indukcji DE. Aby przetestować skuteczność indukcji DE, należy przeprowadzić barwienie IF i/lub RT-qPCR dla FOXA2 i SOX17.

Po...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różnicowanie hPSC na HIO i HCO jest złożonym procesem wymagającym kontroli jakości na każdym etapie. Początkowe hPSC muszą mieć minimalne zróżnicowanie przed zainicjowaniem różnicowania w DE. Optymalizacja gęstości hPSC powlekanych w celu różnicowania DE ma kluczowe znaczenie dla powodzenia protokołu. Aby zapewnić jakość różnicowania DE, należy wykonać IF dla FOXA2 i SOX17 w celu określenia skuteczności różnicowania DE. Różnicowanie DE powinno spowodować, że ponad 80% leczonych komórek będzie miało dodatnie barwienie na ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratorium Múnera jest finansowane przez NIH/NCI 5U54CA210962-02 South Carolina Cancer Disparities Research Center (SC CADRE), NIH/NIGMS P20 GM130457-01A1 COBRE in Digestive and Liver Disease oraz NIH/NIDDK 1P30 DK123704-01 MUSC Digestive Disease Research Core Center.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1% roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA)N/AN/AN/A
Probówka Corning 15 mlSokół21008-918N/A
30% sacharozyN/AN/AWyprodukowano w PBS.
5% normalna surowica osłaLaboratorium Badawcze Jacksona ImmunoResearch017-000-121N/A
50 ml probówka CorningSokół21008-951N/A
DokładnościThermo ScientificA1110501Roztwór do odłączania komórek; podamy 5 ml Accutase do 10 ml probówek zawierających łącznie 20 probówek i przechowujemy w temperaturze -20 stopni; C przez okres do 6 miesięcy. Miejsce na 4 & stopni; C na noc przed użyciem.
Aktywina ASystemy prowadzenia komórekGFH6-100x10Rozpuść liofilizowany proszek w stężeniu 100 &mikro; g/ml w sterylnym PBS zawierającym 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Porcja 38 &mikro; L aktywiny A do wstępnie schłodzonych probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -80 & deg; C (Probówki tracą ważność 12 miesięcy od daty otrzymania).
Activin Dzień 1 pożywka (RPMI 1640)CorningMT10041CVUżywaj aminokwasów endogennych (NEAA, Corning 11140050) i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Pożywka podstawowa dnia 1: 500 ml RPMI 1640 i 500 ml NEAA. Przygotowując pożywkę Activin Day 1, dodaj 13 ml basic day 1 medium, 13 µ l Activiny A (100 &mikro; g/ml) oraz 2 &mikro; l BMP4 (100 &mikro; g/ml). Pożywka bazowa jest stabilna do 3 tygodni, ale powinna być stosowana natychmiast po dodaniu czynników wzrostu.
Pożywka Activin Day 2 (RPMI 1640, 0,2% FBS obj. / obj.)KlonSH30070.03TUżywaj aminokwasów endogennych (Corning 11140050) i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Pożywka podstawowa dnia 2: 500 ml RPMI 1640, 500 ml NEAA i 1 ml 0,2% surowicy. Przygotowując pożywkę Activin Day 2, dodaj 12,5 ml podstawowej pożywki dnia 2 i 12,5 &mikro; L Activiny A (100 &mikro; g/ml). Pożywka bazowa jest stabilna do 3 tygodni, ale powinna być stosowana natychmiast po dodaniu czynników wzrostu.
Activin Dzień 3 pożywka (RPMI 1640, 2% FBS obj./obj.)KlonSH30070.03TUżywaj aminokwasów endogennych (Corning 11140050) i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Pożywka podstawowa dnia 3: 500 ml RPMI 1640, 500 ml NEAA i 10 ml 2% surowicy. Przygotowując pożywkę Activin Day 3, dodaj 12,5 ml basic Day 3 oraz 12,5 µ L Activiny A (100 &mikro; g/ml). Pożywka bazowa jest stabilna do 3 tygodni, ale powinna być stosowana natychmiast po dodaniu czynników wzrostu.
Alexa Fluor 488 Osioł anty-KozaThermo ScientificA11055Rozcieńczenie 1:500 (przeciwciało drugorzędowe)
Alexa Fluor 488 Osioł anty-KrólikThermo ScientificNr kat. A21206Rozcieńczenie 1:500 (przeciwciało drugorzędowe)
Alexa Fluor 546 Osioł anty-MyszThermo ScientificA10036Rozcieńczenie 1:500 (przeciwciało drugorzędowe)
Alexa Fluor 647 Osioł anty-MyszThermo ScientificA31571Rozcieńczenie 1:500 (przeciwciało drugorzędowe)
Forma bazowaRybak22-363-552N/A
Podstawowe podłoże jelitowe (zaawansowany DMEM)Gibco (firma Gibco)12491015  Przygotowując podstawowe podłoże jelitowe, dodaj 500 ml DMEM, 500 ml N2 (Gibco 17-502-048), 500 ml witaminy B27 (Gibco), 500 ml L-glutaminy, aby uzyskać 2 mM L-glutaminy (Corning A2916801), 5 ml 100 U/ml penicyliny-streptomycyny (Gibco 15-140-122) i 7,5 ml 1 M HEPES, aby uzyskać 15 mM HEPES.  Pożywka bazowa jest stabilna do 3 tygodni, ale powinna być stosowana natychmiast po dodaniu czynników wzrostu.
Biorad CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistymBioradN/AMożna stosować inne systemy qRT-PCR.
Rozwiązanie do odzyskiwania komórekCorning354253Rozwiązanie degradujące ECM
CHIR99021Reprocell (reprokomórka)4000410Rozpuścić przez dodanie 2,15 ml DMSO w stężeniu 10 mM. Przygotuj 50 &mikro; L porcji i przechowywać w temperaturze -20 & stopni C.  Przechowywać proszek w temperaturze 4 stopni; C, chroniony przed światłem.
Wzorzec CTRL HIO średniN/AN/AZasadowe podłoże jelitowe i 100 ng/ml EGF.
DAPI (interfejs DAPI)Sigma-AldrichZobacz materiał D9542Rozcieńczenie 1:100 (przeciwciało drugorzędowe)
Monowarstwa DEN/AN/AMonowarstwa została wygenerowana w poprzednich krokach (sekcja 4.4).
RozpuśćGibco (firma Gibco)17105041Zawiesić liofilizowany proszek w Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) do końcowego stężenia 1 mg / ml. Przefiltruj roztwór do sterylizacji, odkurzając go za pomocą rurki sterylizacyjnej z filtrem Millipore. Przygotować 10 ml porcji (1 mg/ml) i przechowywać w temperaturze -20 & deg; C przez okres do 6 miesięcy. Miejsce na 4 & stopni; C na noc przed użyciem.
EFG (EFG)Thermo Scientific236-EG-01MPrzygotowując 100 ng/ml EGF rozpuścić 500 &mikro; g/ml w sterylnym PBS. Następnie dodać 2 ml sterylnego PBS do 1 mg EGF i zrobić 500 &mikro; g/ml roztworu EGF. Podwielokrotność 100 &mikro; L EGF w 20 probówkach.
Fisherbrand 6 cm szalki Petriego z przezroczystą pokrywkąRybakFB0875713AN/A
Podnośnik komórkowy FisherbrandRybak08-100-240N/A
Fiolki z gwintem z przezroczystego szkła klasy B Fisherbrand z dołączonymi zamknięciamiRybak03-338 mldN/A
Fisherbrand Jednorazowa pipeta Pasteura ze szkła borokrzemianowegoRybakNumer katalogowy: 13-678-2D0N/A
Fluoromount G Medium do montażu ślizgowegoFirma VWR100241-874N/A
Zaawansowany DMEM GibcoGibco (firma Gibco)12-491-023N/A
Kozia anty-E-KadherynaR& Systemy DAF648 powiedział:Rozcieńczenie 1:400 (przeciwciało pierwszorzędowe)
Kozioł anty-SOX17R& Systemy DAF1924 powiedział:Rozcieńczenie 1:500 (przeciwciało pierwszorzędowe)
Medium do wzorzystków HCON/AN/AZasadowe podłoże jelitowe, 100 ng/ml EGF i 100 ng/ml BMP2. Podczas przygotowywania BMP2 dodać 1 ml sterylnego 4 mM HCl 0,1% BSA do fiolek BMP2 (100 &mikro; g). Podwielokrotność 25 &mikro; L roztworu BMP4 w 4 probówkach. Pożywka bazowa jest stabilna do 3 tygodni, ale powinna być stosowana natychmiast po dodaniu czynników wzrostu.
HemocytometrSigma-AldrichZ359629N/A
Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC)Zakład Pluripotencjalnych Komórek MacierzystychN/AKomórki wysiane na 24-dołkowej płytce pokrytej Matrigelem (Thermo Scientific 73520-906).
Lodowaty 4% roztwór paraformaldehydu (PFA)N/AN/AN/A
Lodowata sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)N/AN/ApH musi wynosić 7,4.
ImmEdge Hydrofobowy długopis barierowyLaboratoria wektorowe101098-065N/A
Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC)Pluripotencjalne Centrum Komórkowe Komórek Macierzystych (Centrum Medyczne Szpitala Dziecięcego w Cincinnati)N/AMożna stosować inne linie hESC lub iPSC, ale protokół musi być zoptymalizowany dla każdej linii komórkowej.
Mikrotom LeicaN/AN/AN/A
Zobacz materiał LSM 880mikroskop konfokalny
Matrigel Matryca membrany podstawnejCorning354234N/A
Matrigel z kwalifikacją hESC MatrixCorning354277Przygotować 4 porcje Matrigel, które odpowiadają objętościom wystarczającym do wytworzenia wystarczającej ilości rozcieńczonego Matrigelu na 4 x 6-dołkowe szalki.
Pożywka indukcyjna dla środkowego odcinka jelita grubego (RPMI 1640)CorningMT10041CVAminokwasy endogenne (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 i mikro; M CHIR99021 i 500 ng/ml FGF4. Pożywka bazowa jest stabilna do 3 tygodni, ale powinna być stosowana natychmiast po dodaniu czynników wzrostu.
Sferoidy środkowego odcinka jelita grubegoN/AN/AN/A
MilliporeSigma Steriflip Sterylne jednorazowe filtry próżnioweMiliporeSigmaSCGP00525N/A
Mysz anty-CDX2Firma BioGenexMU392-UCRozcieńczenie 1:300 (przeciwciało pierwszorzędowe)
Mysz anty-FOXA2Abnova/NovusH00003170-M01Rozcieńczenie 1:500
Kompletna pożywka wzrostowa mTeSR1Technologie komórek macierzystych85870Dodaj 100 ml suplementu mTeSR (85870) do jednego 400 ml pożywki mTeSR (85870) i podwielokrotność do probówek 50 ml, unikając zanieczyszczenia. Przechowywać w 4° C do momentu użycia.
Przezroczyste rozwiązanie Murraya (znane również jako BABB)Murray'aN/ABenzoesan benzylu 1:2 i alkohol benzylowy.
Medium do wzorzysk NOG HION/AN/AZasadowe podłoże jelitowe, 100 ng/ml EGF i 100 ng/ml NOGGIN (Dozowanie 25 &mikro; g NOGGIN w 250 &mikro; l sterylny PBS z 0,1% BSA).
NucleoSpin RNATakara740955.25Można stosować inne zestawy do izolacji RNA.
Naczynie do hodowli tkankowej powierzchni Nunclon delta 24-dołkowe (Nunc)Thermo Scientific73521-004N/A
Naczynie do hodowli tkankowej powierzchni Nunclon delta 24-dołkowe pokryte MatrigelemThermo Scientific73521-004N/A
Naczynie do hodowli tkankowej powierzchni Nunclon delta 6-dołkowe (Nunc)Thermo Scientific73520-906N/A
Naczynie do hodowli tkankowej powierzchni nunclon delta 6-dołkowe pokryte   Matrigel.Thermo Scientific73520-906N/A
Pożywka do wzrostu dla HIO, CTRL HIO i HCON/AN/AZasadowe podłoże jelitowe i 100 ng/ml EGF (stężenie końcowe)
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna, 0,5% Triton X (PBS-T)N/AN/AN/A
PodkładyZintegrowane technologie DNA, Inc. (IDT)N/AStartery są wymienione w tabeli 2 protokołu.
Królik anty-CDX2Marka komórkiEPR22764YRozcieńczenie 1:100 (przeciwciało pierwszorzędowe)
Królik anty-SATB2Marka komórkiEP281 powiedział:Rozcieńczenie 1:100 (przeciwciało pierwszorzędowe)
Rekombinowane ludzkie białko BMP-4R& Systemy D314-BP-010Rozpuść liofilizowany proszek w stężeniu 100 &mikro; g/ml w sterylnym 4 mM HCl zawierającym 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Dodaj 4,17 ml roztworu HCl do 45,83 ml wody cząsteczkowej, co daje w sumie 50 ml 1 M HCl. Następnie dodaj 200 µ L 1 M HCl do 49,8 ml wody molekularnej, co daje łącznie 50 ml 4 mM HCl. Następnie dodać 0,05 g BSA do 50 ml 4 mM HCl i przefiltrować, aby uzyskać sterylność. Podwielokrotność 4 mM HCl 0,1% BSA do 33 probówek mikrowirówek łącznie i przechowywać w temperaturze -20 °C. Dodać 100 &mikro; l sterylnego 4 mM HCl 0,1% BSA do fiolek BMP4 (10 &mikro; g) wykonanie roztworu BMP4 przy 100 &mikro; g/ml.
Rekombinowane ludzkie białko FGF-4R& Systemy D235-F4-01MRozpuść w 100 &mikro; g/ml w sterylnym PBS zawierającym 0,1% albuminy surowicy bydlęcej. Dodać 0,05 g BSA do 50 ml PBS, aby uzyskać 0,1% BSA. Filtr 0,22 i mikro; M BSA do sterylizacji BSA. Podaniec 10 ml 0,1% BSA w 5 probówkach. Dodać 1 mg FGF-4 do 10 ml sterylnego 0,1% BSA. Porcja 250 &mikro; L do wstępnie schłodzonych 40 probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.
ROCK inhibitor Y-27632Tocris powiedział:1254Końcowe stężenie wynosi 10 mM (10 mmol/L). Zawiesić ponownie w DMSO przy 10 mM i wysterylizować filtrem. Dodać 3 ml sterylnego PBS do każdej fiolki. Aliqout 100 & mikro; L inhibitora ROCK w 30 probówkach i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Zestaw do syntezy cDNA SuperScript VILOThermo Scientific11-754-250N/A
Szkiełka mikroskopowe SuperFrost Plus
Związek Tissue Tek OCTFirma VWR25608-930N/A

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Montgomery, R. K., Mulberg, A. E., Grand, R. J. Development of the human gastrointestinal tract: twenty years of progress. Gastroenterology. 116 (3), 702-731 (1999).
  2. Beumer, J., et al. High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells. Cell. 181 (6), 1291-1306 (2020).
  3. van Klinken, B. J., et al. MUC5B is the prominent mucin in human gallbladder and is also expressed in a subset of colonic goblet cells. American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 871-878 (1998).
  4. Escande, F., Porchet, N., Aubert, J. P., Buisine, M. P. The mouse Muc5b mucin gene: cDNA and genomic structures, chromosomal localization and expression. Biochemical Journal. 363, Pt 3 589-598 (2002).
  5. Lau, S. T., et al. Activation of hedgehog signaling promotes development of mouse and human enteric neural crest cells, based on single-cell transcriptome analyses. Gastroenterology. 157 (6), 1556-1571 (2019).
  6. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  7. Munera, J. O., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into colonic organoids via transient activation of BMP signaling. Cell Stem Cell. 21 (1), 51-64 (2017).
  8. Higuchi, Y., et al. Gastrointestinal fibroblasts have specialized, diverse transcriptional phenotypes: a comprehensive gene expression analysis of human fibroblasts. PLoS One. 10 (6), 0129241(2015).
  9. Yahagi, N., et al. Position-specific expression of Hox genes along the gastrointestinal tract. Congenital Anomalies. 44 (1), 18-26 (2004).
  10. Sarvestani, S. K., et al. Induced organoids derived from patients with ulcerative colitis recapitulate colitic reactivity. Nature Communications. 12 (1), 262(2021).
  11. Holloway, E. M., et al. Differentiation of human intestinal organoids with endogenous vascular endothelial cells. Developmental Cell. 54 (4), 516-528 (2020).
  12. Britanova, O., et al. Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex. Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).
  13. Jaitner, C., et al. Satb2 determines miRNA expression and long-term memory in the adult central nervous system. Elife. 5, 17361(2016).
  14. Teo, A. K., et al. Activin and BMP4 synergistically promote formation of definitive endoderm in human embryonic stem cells. Stem Cells. 30 (4), 631-642 (2012).
  15. Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
  16. Tamminen, K., et al. Intestinal commitment and maturation of human pluripotent stem cells is independent of exogenous FGF4 and R-spondin1. PloS One. 10 (7), 0134551(2015).
  17. Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nature Medicine. 23 (7), 878-884 (2017).
  18. Lees, E. A., et al. Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against Salmonella and other pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478(2019).
  19. Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
  20. Jung, K. B., et al. Interleukin-2 induces the in vitro maturation of human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids. Nature Communications. 9 (1), 3039(2018).
  21. Woo, D. H., et al. Enhancing a Wnt-telomere feedback loop restores intestinal stem cell function in a human organotypic model of dyskeratosis congenita. Cell Stem Cell. 19 (3), 397-405 (2016).
  22. Sommer, C. A., et al. Modeling APC mutagenesis and familial adenomatous polyposis using human iPS cells. PLoS One. 13 (7), 0200657(2018).
  23. McCauley, H. A., et al. Enteroendocrine cells couple nutrient sensing to nutrient absorption by regulating ion transport. Nature Communications. 11 (1), 4791(2020).
  24. Zhang, X., et al. A comprehensive structure-function study of neurogenin3 disease-causing alleles during human pancreas and intestinal organoid development. Developmental Cell. 50 (3), 367-380 (2019).
  25. Kumar, N., et al. The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development. Development. 146 (5), (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pluripotent Stem CellsIntestinal OrganoidsColonic OrganoidsHuman Intestinal OrganoidsHuman Colonic OrganoidsBMP SignalingRegional SpecificationSATB2 ExpressionEpithelial Cell TypesMesenchymal Cells

Related Articles