Uproszczona pletyzmografia całego ciała w celu scharakteryzowania funkcji płuc podczas melioidozy oddechowej

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia budowę i wykorzystanie uproszczonego aparatu do pletyzmografii całego ciała do nieinwazyjnego monitorowania postępu bakteryjnej choroby układu oddechowego.

Streszczenie

Zastępcze zwierzęce modele chorób podlegają zasadom 3R odpowiedzialnych badań. Modele zwierzęce są często udoskonalane, aby zapewnić postęp zarówno w zakresie dobrostanu zwierząt, jak i wiedzy naukowej wraz z dostępnością nowych technologii. W artykule przedstawiono zastosowanie uproszczonej pletyzmografii całego ciała (sWBP) do nieinwazyjnego badania niewydolności oddechowej w modelu śmiertelnej melioidozy oddechowej. sWBP ma czułość wykrywania oddechu u myszy przez cały przebieg choroby, co pozwala na pomiar objawów związanych z konaniem (bradypnea i spłycony oddech) i potencjalne wykorzystanie ich do opracowania humanitarnych kryteriów punktu końcowego.

Niektóre z zalet sWBP w kontekście chorób układu oddechowego polegają na tym, że monitorowanie oddechu gospodarza jest najbardziej zbliżone do jakiegokolwiek fizjologicznego pomiaru w ocenie dysfunkcji pierwotnej zakażonej tkanki, a mianowicie płuc. Oprócz znaczenia biologicznego, zastosowanie sWBP jest szybkie i nieinwazyjne, minimalizując stres u zwierząt badawczych. Praca ta demonstruje zastosowanie własnej aparatury sWBP do monitorowania choroby przez cały przebieg niewydolności oddechowej w mysim modelu melioidozy oddechowej.

Wprowadzenie

Patogeny bakteryjne układu oddechowego są często związane z reakcją zapalną w płucach prowadzącą do patologii płuc^1,2. W warunkach klinicznych diagnoza zapalenia płuc zazwyczaj obejmuje techniki posiewu plwociny, analizę nasycenia krwi tlenem i prześwietlenie klatki piersiowej. Techniki te można zastosować w modelach zakażeń małych zwierząt, ale tylko analiza nasycenia tlenem stanowi szybką analizę w czasie rzeczywistym u myszy pod kątem ciężkości choroby. Nasycenie krwi tlenem (SpO2) było wcześniej badane jako metoda śledzenia postępu choroby w badaniach nad chorobami układu oddechowego; jednak umierające myszy mają nieoczekiwanie wysokie odczyty SpO2 zarówno w modelu Pseudomonas aeruginosa³, które nie są chorobą predykcyjną ani konającą, prawdopodobnie dlatego, że myszy mogą modulować swoją aktywność fizjologiczną. W tym celu do tej pory nie stwierdzono diagnostycznych poziomów SpO2 dla bakteryjnej choroby układu oddechowego u myszy.

Dlatego ta praca badała użycie innych klinicznie istotnych metod wykrywania wpływu choroby płuc na czynność płuc jako szybkiego pomiaru fizjologicznego. Uproszczona pletyzmografia całego ciała (sWBP) oferuje możliwość badania częstości i głębokości oddechu w postaci szybkiej, nieinwazyjnej analizy biometrycznej. Wcześniejsze badania wykazały, jak zmontować aparaturę WBP w laboratorium⁴; Jednak kilka składników pokazanych w takich badaniach nie jest obecnie dostępnych na rynku. Co więcej, tradycyjny WBP wymaga złożonego gromadzenia i przetwarzania danych w oparciu o wilgotność i temperaturę^5,6. W związku z tym zdecydowano się na opracowanie uproszczonego aparatu WBP, który jest codziennie kalibrowany do temperatury/wilgotności pokojowej i ocenia, czy wpływ temperatury/wilgotności samego badanego ma jakikolwiek wpływ na mierzoną objętość oddechu. W ten sposób powstała zmodyfikowana aparatura sWBP, która pozyskuje obecnie dostępne materiały. Ponadto zbadano, czy ten laboratoryjny aparat może wykrywać zmiany w oddychaniu związane z postępem choroby podczas modelu śmiertelnej melioidozy oddechowej u myszy.

Aparatura sWBP skonstruowana do tej pracy wykorzystywała dostępny na rynku sprzęt i oprogramowanie do przetwarzania danych z analogowych czujników ciśnienia na cyfrowy odczyt. Czujnik ciśnienia został zamontowany w hermetycznym szklanym słoiku z łącznikami grodziowymi. Zaletą szklanego słoika jest sztywność strukturalna materiału, który będzie odporny na zmiany ciśnienia wewnętrznego słoika, wpływając na pomiary zmian objętości podczas monitorowania oddechu. Komora pobierania próbek została zaprojektowana tak, aby miała dwa porty na dwóch płaskich powierzchniach kwadratowego słoika, jeden do dostępu do komory przez złącze Luer w celu kalibracji, a drugi do umieszczenia czujnika ciśnienia. Wybrany czujnik ciśnienia jest wyposażony w bardzo czuły przetwornik ciśnienia manometrycznego z zakresem dla niewielkich zmian ciśnienia (zakres 25 mbar).

Ten protokół jest demonstrowany przy użyciu mysiego modelu melioidozy oddechowej. Burkholderia pseudomallei (Bp) jest bakteryjnym czynnikiem wywołującym melioidozę - chorobę związaną z tropikalnymi regionami świata⁷. Bp występuje w środowisku, szczególnie w wilgotnym środowisku stojącej wody i wilgotnej gleby, z czego zwykle powoduje podskórne infekcje skaleczeń/zadrapań podatnych żywicieli. Jednak Bp jest również zakaźny w przypadku wdychania i stanowi potencjalne zagrożenie do wykorzystania w bioterroryzmie poprzez rozpraszanie aerozoli. Podczas gdy w pełni zjadliwe Bp wymaga postępowania w laboratorium BSL-3, wcześniej zaprojektowano zmutowany szczep beztorebkowy, który może być bezpiecznie przetwarzany w BSL-2 i wykluczony z kryteriów wyboru czynnika⁸. Ponadto opracowano model infekcji dotchawiczej za pośrednictwem intubacji (IMIT) melioidozy oddechowej w celu zbadania progresji choroby układu oddechowego Bp^5,9. Wykorzystaliśmy ten model infekcji do scharakteryzowania zmiany w oddychaniu, która zachodzi podczas progresji choroby do konającego punktu końcowego.

Protokół

Opisane tutaj procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu w Louisville (protokół # 14-038) oraz Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (protokół # 19567).

1. Montaż komory pobierania próbek

1. Wykonaj dwa otwory za pomocą wiertła diamentowego 3/4" na wiertarce na płaskich powierzchniach słoika do konserw Mason o pojemności 600 ml z kwadratowym szkłem i szerokim otworem z uszczelką 95 mm i hermetycznym pokrywkami, z pokrywkami z kabłąkiem i zaciskiem spustowym (Rysunek 1).
   UWAGA: Komora do pobierania próbek nie jest dostępna na rynku i musi być skonstruowana.
2. Zamontuj mosiężną przegrodę (gwint wewnętrzny 1/4" NPT, gwint zewnętrzny 3/4-16 UNF) przez oba otwory w słoiku Mason za pomocą gumowych podkładek (średnica wewnętrzna 3/4", średnica zewnętrzna 1") na obu powierzchniach styku przegrody ze szkłem, aby zapewnić hermetyczne uszczelnienie.
3. Użyj jednego zespołu grodziowego jako czujnika ciśnienia, podczas gdy druga przegroda jest mocowana za pomocą strzykawki podłączonej Luer w celu kalibracji.
   1. W przypadku czujnika ciśnienia owiń gwinty 1/4" NPT wysokowydajnego przetwornika ciśnienia manometrycznego taśmą teflonową i wkręć je w grodzi. Użyj lutownicy, aby podłączyć okablowanie czujnika ciśnienia do 8-pinowego męskiego złącza DIN, korzystając z instrukcji okablowania producenta do interfejsu z dostępnym na rynku wysokiej jakości urządzeniem do akwizycji danych (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Wymaga to użycia rezystora 150 K ohm 1/8 W 1% z folii metalowej w okablowaniu złącza DIN.
   2. Jako port kalibracyjny użyj adaptera 1/4" męskiego NPT na żeńskiego 1/8" NPT, aby podłączyć męski NPT 1/8" do żeńskiego niklowanego złącza Luer lock do mosiężnej grodzi, owijając połączenia gwintowane taśmą teflonową. Użyj męskiej nasadki Luer z gwintem polipropylenowym, aby uszczelnić złącze Luer, gdy nie jest używane.
      UWAGA: Nie dokręcaj zbyt mocno złączy grodziowych do szklanego słoika, ponieważ spowoduje to pęknięcia. W razie potrzeby do gumowych uszczelek można dodać silikon, aby zapewnić hermetyczne uszczelnienie grodzi do szklanego słoika.

2. Ustawienia systemu

1. Podłącz komorę próbkowania do wzmacniacza mostkowego za pomocą 8-pinowego złącza DIN, a wzmacniacz mostka do urządzenia do akwizycji danych, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Podłącz urządzenie do akwizycji danych do źródła zasilania i komputera z uruchomionym oprogramowaniem do analizy danych fizjologicznych za pomocą producenta.
   UWAGA: Upewnij się, że urządzenie do akwizycji danych jest włączone i rozgrzane przez co najmniej 5 minut przed użyciem, aby upewnić się, że czujnik stabilizuje swoje pomiary.
3. Uruchom oprogramowanie, aby połączyło się z systemem akwizycji danych.
4. Pobierz opcjonalny moduł spirometrii w oprogramowaniu i zmodyfikuj domyślne ustawienia urządzenia z L/s na μL/s w oknie Ustawienia > spirometrii.

3. Kalibracja systemu

1. W oprogramowaniu utwórz 4-kanałowe okno z następującymi oknami danych: Kanał 1: Dane źródłowe z częstotliwością próbkowania 4 k/s i zakresem 1 mV; Kanał 2: Filtr cyfrowy kanału 1 wykorzystujący filtr górnoprzepustowy 1 Hz z automatyczną regulacją; Kanał 3: Wygładzanie danych z kanału 2 poprzez uśrednianie 100 próbek; Kanał 4: Spirometryczny przepływ danych kanału 3 (niestandardowa głowica przepływowa, skalibrowana zgodnie ze wzorem (μL/s) = 120 000 x napięcie).
   UWAGA: 120 000 to współczynnik korelacji symboli zastępczych, który zostanie zmodyfikowany podczas kalibracji.
2. Skonfiguruj analizę DataPad kanału 4 z następującymi kolumnami: Kolumna 1: Dane kanału 4, Komentarze > Pełny tekst komentarza; Kolumna 2: Dane z kanału 4, pomiary cykliczne > średnia częstotliwość cykliczna; Kolumna 3: Dane kanału 4, pomiary cykliczne > średnia wysokość cykliczna.
3. Ustaw liczbę klatek na sekundę na 100:1 w prawym dolnym rogu ekranu. Zapisz tę konfigurację okna jako szablon dla wszystkich przyszłych badań.
4. Zamknij pokrywę komory na próbki i podłącz gazoszczelną strzykawkę o pojemności 25 μl do złącza grodziowego Luer. Wyposażyć strzykawkę w adapter Chaney, który umożliwia wielokrotne podawanie objętości 20 μl.
   UWAGA: Do podłączenia strzykawki do komory na próbkę można użyć opcjonalnego krótkiego odcinka rurki 1/16" i złączy Luer/zadziorowych. Należy jednak unikać długich przewodów, aby uniknąć znaczących zmian w całkowitej objętości powietrza w komorze próbki.
5. Wciągnąć 20 μl powietrza do strzykawki za pomocą ogranicznika głębokości adaptera Chaney.
6. Wyzeruj pleth w oprogramowaniu (Setup > Zero All Inputs (Alt-Z)) i rozpocznij nagrywanie.
7. Podczas nagrywania, przy stabilnej linii podstawowej, szybko wciśnij/wycofaj tłok strzykawki na około 10 powtórzeń, aby odtworzyć oddychanie pacjenta z mierzonym oddechem 20 μl. Zatrzymaj nagrywanie.
   UWAGA: Częstotliwość sztucznych oddechów powinna przekraczać 2 Hz, aby zmaksymalizować odtwarzalność kalibracji.
8. Oznacz tożsamość mierzonej próbki, klikając prawym przyciskiem myszy początek numerowanego zapisu pleth i kliknij Dodaj komentarz.
9. Zresetuj strzykawkę, wyzeruj wejście i powtórz pomiary nagrywania impulsów 20 μl jeszcze dwa razy (łącznie trzy sesje nagrywania).
10. Po wykonaniu wszystkich pomiarów użyj myszki komputerowej, aby wybrać część pletu oddechowego, która dokładnie odzwierciedla sztuczne 20 μl oddechów.
    UWAGA: W module DataPad dane pojawią się w nagłówku podglądu, zapewniając tymczasowy odczyt częstości oddechów (średnia częstotliwość cykliczna, Hz) i głębokości oddechu (średnia wysokość cykliczna, μL). Podgląd danych można zapisać w DataPad za pomocą ikony Dodaj do DataPad.
11. Przejrzyj dane z kolumny 3 (średnia wysokość cykliczna) i oblicz średnią zmierzoną objętość oddechu z trzech zapisów. Wykonaj następujące obliczenia średniej zmierzonej objętości oddechu: Współczynnik kalibracji = dostarczona objętość / zmierzona objętość x 120 000,
    UWAGA: 120 000 to zastępczy współczynnik kalibracji głowicy przepływowej użyty w kroku 3.1, teraz zmodyfikowany na podstawie zmierzonych danych. System jest teraz skalibrowany do typowego oddychania myszy przy użyciu aktualnej temperatury i wilgotności otoczenia. System może teraz monitorować oddech badanego, a kalibracja może być przeprowadzana codziennie ponownie, aby uwzględnić wszelkie wahania temperatury/wilgotności.

4. Monitorowanie obiektu

1. Otwórz szablon główny zgodnie z opisem w kroku 3.4 lub wykonaj kroki od 4.2 do 4.3.
2. W oprogramowaniu utwórz 4-kanałowe okno z następującym przetwarzaniem danych: Kanał 1: Dane źródłowe przy częstotliwości próbkowania 4 k/s i zakresie 1 mV; Kanał 2: Filtr cyfrowy kanału 1 wykorzystujący filtr górnoprzepustowy 1 Hz Auto Adjust; Kanał 3: Wygładzanie danych kanału 2 poprzez uśrednianie 100 próbek; Kanał 4: Spirometria Przepływ danych kanału 3 (niestandardowa głowica przepływowa, skalibrowana zgodnie ze wzorem (μL/s) = 120 000 x napięcie).
   UWAGA: 120 000 to współczynnik korelacji obliczony dla aktualnego czujnika ciśnienia; Użytkownik powinien jednak przeprowadzić kalibrację systemu opisaną w kroku 3 i zamiast tego użyć zdefiniowanego przez użytkownika współczynnika korelacji.
3. Skonfiguruj analizę DataPad kanału 4 z następującymi kolumnami: Kolumna 1: Dane kanału 4, Komentarze > Pełny tekst komentarza; Kolumna 2: Dane z kanału 4, pomiary cykliczne > średnia częstotliwość cykliczna; Kolumna 3: Dane kanału 4, pomiary cykliczne > średnia wysokość cykliczna.
4. Umieść badanego w komorze pobierania próbek i zamknij pokrywę. W tym eksperymencie wykorzystano przytomną samicę myszy albinosa C57BL/6J (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) w wieku 4-12 tygodni.
5. Wyrównaj ciśnienie atmosferyczne w komorze (od uszczelnienia pokrywy), na krótko poluzowując nasadkę grodzi Luer i ponownie dokręć.
6. Obserwuj, że obiekt nie porusza się aktywnie w komorze próbkowania przed wyzerowaniem wszystkich wejść (skrót Alt-Z) i rozpoczęciem nagrywania.
   UWAGA: Jeśli badany zacznie się poruszać w komorze próbkowania, linia bazowa może przesunąć się poza skalę, co można rozwiązać poprzez ponowne wyzerowanie wszystkich danych wejściowych w środku nagrania, co spowoduje utworzenie nowego zapisu na skali. Załóżmy, że osoba badana angażuje się w eksplorację lub pielęgnację podczas nagrywania; Zwróć uwagę, która część zapisu pletyzmografii najdokładniej odzwierciedla normalny oddech.
7. Oznacz tożsamość osoby, klikając prawym przyciskiem myszy początek ponumerowanego nagrania pleth i kliknij Dodaj komentarz.
8. Umieść obiekt z powrotem w klatce. Ogranicz czas spędzony w szczelnie zamkniętej komorze pobierania próbek do 5 minut, aby uniknąć uduszenia i stresu.
   UWAGA: Ryzyko uduszenia jest niskie, biorąc pod uwagę, że objętość powietrza wynosząca 600 ml w komorze na próbki nie zostanie szybko zużyta przez zdrową mysz oddychającą z prędkością <15 ml/min.
9. Użyj myszy komputerowej, aby wybrać fragment oddychania, który dokładnie odzwierciedla oddychający obiekt.
   UWAGA: W module DataPad dane pojawią się w nagłówku podglądu, zapewniając tymczasowy odczyt częstości oddechów (średnia częstotliwość cykliczna, Hz) i objętości oddechu (średnia wysokość cykliczna, μL). Podgląd danych można zapisać w DataPad za pomocą ikony Dodaj do DataPad.
10. Kontynuuj pomiar badanych myszy pojedynczo i rejestruj reprezentatywne odcinki oddechu na DataPadzie.
11. Po zarejestrowaniu danych wyeksportuj dane DataPad do programu Excel. Oblicz objętość minutową w następujący sposób: Objętość minutowa (ml/min) = częstość oddechów (Hz) x objętość oddechu (μl) x 0,06.

Wyniki

Kalibracja systemu
Oprogramowanie do analizy danych pozwala na bezpośrednią kalibrację niestandardowej głowicy przepływowej, takiej jak ta opisana w niniejszym dokumencie. Odbywa się to podczas ustawiania przepływu spirometrii. Jak opisano w kroku 3.1, istnieje opcja wprowadzania znanej objętości powietrza kalibracyjnego, która oblicza współczynnik korelacji napięcia do objętości w systemie. To jednak generuje współczynnik korelacji na podstawie pojedynczego odczytu i zaobserwowano, że nieodłączna zmienność kalibracji od standardu n = 1 ma słabą użyteczność. Obecne podejście może rozwiązać ten problem i umożliwia użytkownikowi wykonywanie codziennej kalibracji przy użyciu wielu odczytów uśrednionych w celu obliczenia współczynnika kalibracji. Zademonstrowano tutaj kalibrację za pomocą 20 μl wstrzykniętego powietrza, co odpowiada typowej objętości oddechu w typowej myszy. Oprogramowanie zakłada punkt przecięcia początku układu współrzędnych (0,0) i w związku z tym jest kalibrowane w zakresie 0-20 μl przy użyciu tego podejścia.

Metodologia proponowana tutaj dla sWBP kalibruje się codziennie, uwzględniając w ten sposób wszelkie wahania wilgotności/temperatury otoczenia. Oryginalne metody stosowane dla specyficznego WBP sięgają metodologii Drorbaugha i Fenna z 1955 roku, którzy opracowali WBP do pomiaru wentylacji u ludzkich niemowląt⁵. Obliczenia Drorbaugha i Fenna uwzględniają zmiany temperatury i wilgotności środowiska i obiektu. Obecne podejście koryguje fluktuacje środowiskowe poprzez kalibrację każdej sesji sWBP. Mimo to zdecydowano się zbadać, czy ogrzewanie i nawilżanie podczas oddychania w jamie nosowej/płucach myszy wpływa na pomiar znanej objętości powietrza. W związku z tym stworzono sztuczną aparaturę, która naśladuje wpływ badanego na ogrzewanie i nawilżanie skalibrowanych pomiarów powietrza. Złącza Luer zostały przymocowane do stożkowej rurki o pojemności 15 ml i umieszczone w tej szczelnej stożkowej linii między komorą próbki a gazoszczelną strzykawką kalibracyjną. Kalibrację 20 μl przeprowadzono przy użyciu pustej stożkowej rurki utrzymywanej w temperaturze pokojowej (23 °C). Stożkowa rurka została następnie częściowo wypełniona wodą destylowaną tuż poniżej złączy Luer, dając czas na zrównoważenie przestrzeni nad głową stożka; Objętość kalibracyjna została następnie ponownie zmierzona w celu zbadania wpływu wilgotności. Stożkową rurkę umieszczono w bloku grzewczym i zrównoważono w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku, a na koniec zrównoważono do 37 °C bez wody, aby ocenić efekt ogrzewania obiektu i bez dodatkowego udziału wilgoci. Rysunek 2 pokazuje, że wszystkie testowane warunki nie wpłynęły znacząco na skalibrowany pomiar 20 μL dostarczony przez gazoszczelną strzykawkę. Na podstawie tego odkrycia stwierdzono, że sWBP oferuje przystępne podejście do monitorowania oddychania u zwierząt badanych bez konieczności wykonywania skomplikowanych obliczeń opartych na temperaturze i wilgotności badanego zwierzęcia, ponieważ nie mają one znaczącego wpływu na mierzoną objętość oddechu.

Monitorowanie podmiotu
sWBP wykorzystano do monitorowania oddychania podczas choroby śmiertelnych zakażeń dróg oddechowych patogenem bakteryjnym B. pseudomallei. Jednym z wyzwań związanych z monitorowaniem oddychania u przytomnych zwierząt jest ciekawość normalnych, zdrowych zwierząt poruszających się w komorze na próbki. Ruch myszy tworzy stale poruszającą się linię podstawową, którą można częściowo złagodzić poprzez wstępne kondycjonowanie badanych w komorze przez okres kilku dni przed pomiarem. Problem ten wpływa przede wszystkim na pomiar wyjściowy u zdrowych myszy, ponieważ badani stają się ospali podczas infekcji, co sprawia, że sWBP jest znacznie łatwiejszy do opanowania przy zmniejszonej aktywności badanej. Może być kuszące, aby spróbować użyć jakiejś formy powściągliwości, czy to fizycznej, czy znieczulenia. Stosowanie przymusu fizycznego może wpływać na naturalne oddychanie, powodując stres. Ponadto wiadomo, że stosowanie środków znieczulających ma wyraźny wpływ na częstość i głębokość oddechu¹⁰; W związku z tym zdecydowano się na zbadanie wpływu znieczulenia za pomocą własnej aparatury sWBP. Izofluran jest powszechnie stosowany do wykonywania obrazowania diagnostycznego in vivo podczas modeli infekcji, dlatego mysz C57BL/6 została znieczulona i monitorowała postęp aż do wyzdrowienia ze znieczulenia za pomocą sWBP. Badanie to przeprowadzono na młodocianej 4-tygodniowej myszy albinosa C57BL/6J w celu przedłużenia okresu powrotu do zdrowia po znieczuleniu. Rysunek 3 pokazuje, że preferowany środek znieczulający powoduje, że myszy wykazują powolny oddech przy dużej objętości oddechowej powietrza. Gdy myszy zaczynają wracać do zdrowia po uspokojeniu, ich częstość oddechów wzrasta, a objętość oddechu maleje, w wyniku czego całkowita ilość wdychanego powietrza powoli rośnie. W tym badaniu stwierdzono, że objętość oddechu zostaje przywrócona do poziomu sprzed znieczulenia w ciągu pierwszych 30 sekund od wyzdrowienia. Częstość oddechów stale rośnie, aż do momentu, gdy podstawowy oddech zostanie przywrócony do 2-2,5 minuty po wyjęciu ze znieczulenia. Objętość minutowa ściśle podążała za wpływem częstości oddechów, osiągając wyjściową objętość minutową o 2,5 minuty po wyjęciu ze znieczulenia. Odkrycie to potwierdza, że znieczulenie nie powinno być stosowane w podejściu sWBP. Nie jest to zaskakujące, ponieważ znieczulenie spowolni metabolizm gospodarza, powodując zmniejszone zapotrzebowanie na wdychany tlen. Należy również rozważyć odkażanie komory na próbki między uczestnikami, aby zająć się kontrolą infekcji specyficzną dla badania, a także wpływem feromonów z moczu lub kału, które mogą wpływać na stres między uczestnikami.

WBP to atrakcyjna strategia monitorowania funkcji płuc w modelach chorób układu oddechowego w sposób nieinwazyjny. sWBP została użyta do zbadania, jak zmienia się oddychanie podczas śmiertelnych infekcji melioidozy oddechowej (Rysunek 4), z punktami czasowymi odzwierciedlającymi monitorowanie bioluminescencji w płucach. Zaobserwowano, że model ten wiąże się z wczesnym początkiem letargu, który utrzymuje się w sposób powoli postępujący aż do rozwoju choroby konającej po około 3 dniach od zakażenia. Zaobserwowano również, że częstość oddechów i całkowita ilość wdychanego powietrza (objętość minutowa) myszy gwałtownie spadają w pierwszym dniu infekcji i pozostają niskie przez pozostałą część infekcji (Rysunek 4A,C). Ten wzorzec jest zgodny z letargiem o wczesnym początku, który utrzymuje się przez następne 2 dni infekcji. W przeciwieństwie do tego, objętość oddechu nie spada gwałtownie w ciągu pierwszych 24 godzin, a zamiast tego ma niewielki i stały spadek, który zbliża się do liniowego spadku w ciągu 3-dniowego przebiegu choroby (Ryc. 4B).

Rysunek 1: Aparatura sWBP. Niestandardowa komora na próbki została zbudowana z zamykanego kwadratowego szklanego słoika z łącznikami grodziowymi na dwóch płaskich powierzchniach. Jedna gródź została wykorzystana do zamontowania czujnika ciśnienia manometrycznego połączonego ze wzmacniaczem mostkowym i digitizerem urządzenia do akwizycji danych za pomocą 8-pinowego złącza DIN. Druga gródź została wyposażona w złącze Luer do kalibracji za pomocą gazoszczelnej strzykawki. Urządzenie było podłączone do komputera, na którym uruchomione było oprogramowanie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wpływ temperatury i wilgotności obiektu na objętość oddechu. Stożkowa probówka o pojemności 15 ml ze złączami Luer została zainstalowana w linii między strzykawką kalibracyjną o pojemności 20 μl a komorą na próbki. System został skalibrowany do 20 μl bez dodatkowego wpływu temperatury/wilgotności ze stożkowej rurki. Inne pomiary wykonano po osiągnięciu równowagi z wilgotnością nasyconą z wody destylowanej i/lub ogrzaniem stożkowej rurki z temperatury pokojowej (23 °C) do temperatury ciała (37 °C). Nie wykryto istotnej różnicy między n = 5 pomiarami każdego stanu za pomocą jednokierunkowej ANOVA z wielokrotnym porównaniem Tukeya po teście. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wpływ znieczulenia gazowego na oddychanie u myszy. Reprezentatywne dane pochodzące od 4-tygodniowej samicy myszy albinosa C57BL/6J (8,6 g) poddano sedacji przez 5 minut 3% izofluranem w tlenie i przeniesiono do komory na próbki sWBP. Dane Pleth zbierano przez 150 s po wyjęciu ze znieczulenia. Pacjent zaczął początkowo poruszać się po 100 sekundach od odłączenia od narkozy. (A) Oddychanie wyjściowe przed znieczuleniem, mierzące częstość oddechów 4,97 Hz, objętość oddechu 9,74 μl i objętość minutową 2,91 ml. (B) Pierwsze 60 s zmian w oddychaniu podczas rekonwalescencji po znieczuleniu. Punkty A-B) Oś pionowa mierząca μL na oddech i oś pozioma w sekundach. (C-E) Dane dotyczące wentylacji zebrano w ciągu 150 s rekonwalescencji po znieczuleniu, uśredniając z ≥3 cykli oddechowych na punkt czasowy dla (C) częstości oddechów, (D) objętości oddechu i (E) obliczonej objętości minutowej. Wartości wyjściowe przed znieczuleniem są oznaczone poziomą linią przerywaną na każdym odpowiednim wykresie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wpływ melioidozy oddechowej na oddychanie gospodarza. Pięć 8-tygodniowych samic myszy C57BL/6 zostało zakażonych 4,9 log CFU bioluminescencyjnego szczepu B. pseudomallei JW270. sWBP prowadzono przez cały 3-dniowy przebieg infekcji, mierząc częstość oddechów (A) i objętość oddechu (B). Całkowita ilość wdychanego powietrza została obliczona jako objętość minutowa (C). Dane dla każdego z pięciu badanych są niezależnie wykreślane za pomocą regresji wielomianowej trzeciego rzędu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

sWBP jest atrakcyjnym podejściem do lepszego zrozumienia infekcji dróg oddechowych w modelach małych zwierząt. Co ważne, jest to podejście nieinwazyjne i jako takie nie stwarza znaczącego ryzyka spowodowania nadmiernego stresu u zwierząt badawczych podczas wyzwania infekcji. Rzeczywiście, procedura monitorowania oddechu osoby jest szybkim testem wymagającym kilku minut i minimalnej obsługi pacjenta. Korzyścią naukową jest zrozumienie w wysokiej rozdzielczości, w jaki sposób patogeny mikrobiologiczne wpływają na czynność płuc podczas choroby. Podejście to przyniesie korzyści badaniom podstawowym, ułatwiając zrozumienie, w jaki sposób patogen powoduje chorobę, a także zapewniając narzędzie translacyjne do zrozumienia, w jaki sposób nowatorski środek terapeutyczny przywraca badanemu badanemu stan zdrowia układu oddechowego.

W niniejszym manuskrypcie przedstawiono reprezentatywne wyniki dla patogenu B. pseudomallei, który powoduje wczesną reakcję letargiczną. Nie wszystkie bakteryjne infekcje płuc występują w ten sam sposób w modelach infekcji myszy. Wcześniejsze doświadczenia z innymi modelami infekcji wykazały, że patogen bakteryjny Klebsiella pneumoniae przedstawia się jako infekcja bezobjawowa do momentu, w którym myszy ulegają zakażeniu, również około 3. dnia po zakażeniu¹¹. Przypuszcza się, że zapotrzebowanie gospodarza na wdychane powietrze (tj. objętość minutowa) może być ściśle związane ze stopniem letargu, z jakim objawia się dana choroba. Konieczne będą dalsze badania, aby zbadać, w jaki sposób różne patogeny bakteryjne wpływają na czynność płuc podczas chorób układu oddechowego. Zrozumiałe jest, że różne patogeny mają unikalne podejścia do unikania obrony gospodarza, w tym różnice w (1) skłonności do bycia patogenami wewnątrzkomórkowymi lub zewnątrzkomórkowymi, (2) zdolności do wywoływania wczesnej/późnej odpowiedzi hipotermicznej oraz (3) stosowaniu różnych repertuarów determinantów wirulencji ^3,12,13. W związku z tym jest prawdopodobne, że różne strategie chorobowe będą miały unikalny wpływ na czynność płuc i oddychanie podczas infekcji.

Zalecane ustawienia opisane w tym protokole mogą być modyfikowane w celu uwzględnienia unikalnych wyzwań występujących podczas sWBP. Jednym z typowych problemów występujących podczas sesji nagraniowej sWBP jest ruch obiektu w komorze próbki. Jak wspomniano, ruch ten modyfikuje linię bazową i może wpływać na dokładność pomiarów oddechu. Do normalizacji przesuwającej się linii podstawowej zastosowano filtr cyfrowy, umożliwiając realne pomiary oddechu pomimo niewielkich ruchów. Nadmierny ruch może wypchnąć pomiar bazowy poza zakres wyzerowanych danych wejściowych. Nagrania są zalecane w zakresie 1 mV (ustawienie kanału 1), co zapewnia kompromis polegający na dalszym obserwowaniu szczytów pletyzmografii przy jednoczesnym unikaniu utraty danych poza zakresem. W przypadku wyjątkowo aktywnych obiektów może być konieczne rozszerzenie zakresu nagrywania >1 mV, aby uniknąć utrzymujących się sygnałów poza zakresem.

Zalecana procedura wymaga codziennej kalibracji (lub podczas każdej sesji) w celu dostosowania się do wahań wilgotności/temperatury otoczenia. Tradycyjny WBP wykorzystuje złożone obliczenia, które uwzględniają temperaturę/wilgotność zarówno otoczenia, jak i obiektu ^5,6. Wykazano, że w obecnym aparacie sWBP wpływ temperatury/wilgotności gospodarza nie zmienia znacząco zmierzonej objętości oddechu źródła kalibracji. W związku z tym to podejście w sWBP zasadniczo różni się od >50-letniego podejścia Drorbaugha i Fenna. W tym przypadku sWBP bezpośrednio wiąże zmiany ciśnienia ze zmierzoną objętością oddechu bez dalszej korekty ze strony gospodarza.

Konieczne jest porównanie WBP badanych zwierząt z klinicznym WBP. Rodzaje danych biometrycznych, które próbowano zebrać za pomocą sWBP, to objętość i częstotliwość oddechu. Takie pomiary są zbierane klinicznie za pomocą prostego sprzętu spirometrycznego, w którym pacjent trzyma monitor oddechu przy ustach i normalnie oddycha do urządzenia monitorującego przepływ powietrza. Podobna spirometria u zwierząt badawczych wymaga powściągliwości, przyczyniając się w ten sposób do stresu i nieodłącznych zakłóceń w oddychaniu. Dlatego prosta spirometria jest funkcjonalna klinicznie, ale nie dla zwierząt badawczych. WBP służy podstawowemu celowi w klinice, jakim jest gromadzenie zaawansowanych danych, w tym takich pomiarów, jak resztkowa objętość płuc. Takie dane mogą być zawarte tylko w kontekście tego, że badany jest w stanie postępować zgodnie z instrukcjami dotyczącymi oddychania, w tym wymuszonego wydechu (opróżnienie płuc przez głęboki wydech). Nie można polegać na zwierzętach badawczych, że będą postępować zgodnie z instrukcjami oddychania od badacza. Wiele zaawansowanych pomiarów zebranych klinicznie podczas WBP nie może być odtworzonych na zwierzętach badawczych. WBP u zwierząt badawczych zasadniczo różni się od klinicznego WBP. Animal WBP ma na celu gromadzenie prostych danych dotyczących wentylacji (częstość i objętość oddechu) w nieskrępowany sposób, aby uniknąć stresu zwierząt i zaburzeń oddychania. Jak dotąd, zastosowanie WBP u zwierząt badawczych wydaje się powielać techniki stosowane w klinicznych WBP, w tym złożone obliczenia oparte na temperaturze i wilgotności środowiska oraz obiektu, ale bez możliwości zebrania zaawansowanych danych od osoby, która może postępować zgodnie z instrukcjami, jak wykonać wymuszony wydech. Mając to na uwadze, starano się wykazać, czy uproszczona wersja WBP wystarczy, aby zebrać odpowiednią częstotliwość i objętość oddechu istotne dla badań nad chorobami układu oddechowego. Przeprowadzono sesję kalibracyjną, która skompensowała wszelkie zmiany temperatury i wilgotności otoczenia. Co więcej, wykazano na sztucznej myszy, że poddanie temperatury i wilgotności zmierzonej objętości oddechu nie ma znaczącego wpływu na dokładny pomiar objętości oddechu. Stwierdzono, że sWBP ma doskonałe zastosowanie w badaniach na zwierzętach, bez konieczności stosowania przez użytkownika kłopotliwego matematycznego przetwarzania danych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Adapter 1/8" NPT Luer	Port kalibracji	Amazon	B07DH9MY8W
Adapter 1/8" NPT na 1/4" NPT	Amazon		B07T6CR6FS Przejściówka grodziowa na luer
Rezystor 150 kΩ	Amazon	B07GPRYL81	Wybór napięcia wzbudzenia przetwornika ciśnienia
/4" Wiertło diamentowe	Drilax	DRILAX100425	Do wiercenia mocowań grodziowych w szklany słoik
Bridge Amp	AD Instruments	FE221	Opcja jednokanałowa
Łącznik grodziowy	Legines	3000L-B	1/4" NPT, 3/4-16 UNF mosiężne złącze grodziowe
Adapter Chaney	Hamilton	14725	Gazoszczelny adapter strzykawkowy do złącza DIN o ustalonej objętości
	AD Instruments	SP0104	Do podłączenia czujnika ciśnienia do wzmacniacza mostkowego
Strzykawka gazoszczelna, 25 uL	Strzykawka kalibracyjna	Hamilton	80201
LabChart	AD Instruments Oprogramowanie		akwizycji danych z nauk przyrodniczych Wtyczka
Luer	Cole Parmer	45513-56	Zamknięcie portu kalibracyjnego
PowerLab 4/26	AD Instruments	PL2604	Cyfrowy interfejs do komputera
Przetwornik ciśnienia	Omega Engineering	PX409-10WGV	Czujnik ciśnienia w oleju o wysokiej dokładności
Uszczelka gumowa	Amazon	B07LH4C8LS	Do montażu grodzi (wymagane 4 na komorę)
Kwadratowy szklany słoik	Amazon	B07VNSPR8P	600 ml z uszczelką silikonową 95 mm