Ten protokół przedstawia budowę i wykorzystanie uproszczonego aparatu do pletyzmografii całego ciała do nieinwazyjnego monitorowania postępu bakteryjnej choroby układu oddechowego.
Artykuł metodologiczny
Uproszczona pletyzmografia całego ciała w celu scharakteryzowania funkcji płuc podczas melioidozy oddechowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zastępcze zwierzęce modele chorób podlegają zasadom 3R odpowiedzialnych badań. Modele zwierzęce są często udoskonalane, aby zapewnić postęp zarówno w zakresie dobrostanu zwierząt, jak i wiedzy naukowej wraz z dostępnością nowych technologii. W artykule przedstawiono zastosowanie uproszczonej pletyzmografii całego ciała (sWBP) do nieinwazyjnego badania niewydolności oddechowej w modelu śmiertelnej melioidozy oddechowej. sWBP ma czułość wykrywania oddechu u myszy przez cały przebieg choroby, co pozwala na pomiar objawów związanych z konaniem (bradypnea i spłycony oddech) i potencjalne wykorzystanie ich do opracowania humanitarnych kryteriów punktu końcowego.
Niektóre z zalet sWBP w kontekście chorób układu oddechowego polegają na tym, że monitorowanie oddechu gospodarza jest najbardziej zbliżone do jakiegokolwiek fizjologicznego pomiaru w ocenie dysfunkcji pierwotnej zakażonej tkanki, a mianowicie płuc. Oprócz znaczenia biologicznego, zastosowanie sWBP jest szybkie i nieinwazyjne, minimalizując stres u zwierząt badawczych. Praca ta demonstruje zastosowanie własnej aparatury sWBP do monitorowania choroby przez cały przebieg niewydolności oddechowej w mysim modelu melioidozy oddechowej.
Wprowadzenie
Patogeny bakteryjne układu oddechowego są często związane z reakcją zapalną w płucach prowadzącą do patologii płuc1,2. W warunkach klinicznych diagnoza zapalenia płuc zazwyczaj obejmuje techniki posiewu plwociny, analizę nasycenia krwi tlenem i prześwietlenie klatki piersiowej. Techniki te można zastosować w modelach zakażeń małych zwierząt, ale tylko analiza nasycenia tlenem stanowi szybką analizę w czasie rzeczywistym u myszy pod kątem ciężkości choroby. Nasycenie krwi tlenem (SpO2) było wcześniej badane jako metoda śledzenia postępu choroby w badaniach nad chorobami układu oddechowego; jednak umierające myszy mają nieoczekiwanie wysokie odczyty SpO2 zarówno w modelu Pseudomonas aeruginosa3, które nie są chorobą predykcyjną ani konającą, prawdopodobnie dlatego, że myszy mogą modulować swoją aktywność fizjologiczną. W tym celu do tej pory nie stwierdzono diagnostycznych poziomów SpO2 dla bakteryjnej choroby układu oddechowego u myszy.
Dlatego ta praca badała użycie innych klinicznie istotnych metod wykrywania wpływu choroby płuc na czynność płuc jako szybkiego pomiaru fizjologicznego. Uproszczona pletyzmografia całego ciała (sWBP) oferuje możliwość badania częstości i głębokości oddechu w postaci szybkiej, nieinwazyjnej analizy biometrycznej. Wcześniejsze badania wykazały, jak zmontować aparaturę WBP w laboratorium4; Jednak kilka składników pokazanych w takich badaniach nie jest obecnie dostępnych na rynku. Co więcej, tradycyjny WBP wymaga złożonego gromadzenia i przetwarzania danych w oparciu o wilgotność i temperaturę5,6. W związku z tym zdecydowano się na opracowanie uproszczonego aparatu WBP, który jest codziennie kalibrowany do temperatury/wilgotności pokojowej i ocenia, czy wpływ temperatury/wilgotności samego badanego ma jakikolwiek wpływ na mierzoną objętość oddechu. W ten sposób powstała zmodyfikowana aparatura sWBP, która pozyskuje obecnie dostępne materiały. Ponadto zbadano, czy ten laboratoryjny aparat może wykrywać zmiany w oddychaniu związane z postępem choroby podczas modelu śmiertelnej melioidozy oddechowej u myszy.
Aparatura sWBP skonstruowana do tej pracy wykorzystywała dostępny na rynku sprzęt i oprogramowanie do przetwarzania danych z analogowych czujników ciśnienia na cyfrowy odczyt. Czujnik ciśnienia został zamontowany w hermetycznym szklanym słoiku z łącznikami grodziowymi. Zaletą szklanego słoika jest sztywność strukturalna materiału, który będzie odporny na zmiany ciśnienia wewnętrznego słoika, wpływając na pomiary zmian objętości podczas monitorowania oddechu. Komora pobierania próbek została zaprojektowana tak, aby miała dwa porty na dwóch płaskich powierzchniach kwadratowego słoika, jeden do dostępu do komory przez złącze Luer w celu kalibracji, a drugi do umieszczenia czujnika ciśnienia. Wybrany czujnik ciśnienia jest wyposażony w bardzo czuły przetwornik ciśnienia manometrycznego z zakresem dla niewielkich zmian ciśnienia (zakres 25 mbar).
Ten protokół jest demonstrowany przy użyciu mysiego modelu melioidozy oddechowej. Burkholderia pseudomallei (Bp) jest bakteryjnym czynnikiem wywołującym melioidozę - chorobę związaną z tropikalnymi regionami świata7. Bp występuje w środowisku, szczególnie w wilgotnym środowisku stojącej wody i wilgotnej gleby, z czego zwykle powoduje podskórne infekcje skaleczeń/zadrapań podatnych żywicieli. Jednak Bp jest również zakaźny w przypadku wdychania i stanowi potencjalne zagrożenie do wykorzystania w bioterroryzmie poprzez rozpraszanie aerozoli. Podczas gdy w pełni zjadliwe Bp wymaga postępowania w laboratorium BSL-3, wcześniej zaprojektowano zmutowany szczep beztorebkowy, który może być bezpiecznie przetwarzany w BSL-2 i wykluczony z kryteriów wyboru czynnika8. Ponadto opracowano model infekcji dotchawiczej za pośrednictwem intubacji (IMIT) melioidozy oddechowej w celu zbadania progresji choroby układu oddechowego Bp5,9. Wykorzystaliśmy ten model infekcji do scharakteryzowania zmiany w oddychaniu, która zachodzi podczas progresji choroby do konającego punktu końcowego.
Protokół
Opisane tutaj procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu w Louisville (protokół # 14-038) oraz Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (protokół # 19567).
1. Montaż komory pobierania próbek
- Wykonaj dwa otwory za pomocą wiertła diamentowego 3/4" na wiertarce na płaskich powierzchniach słoika do konserw Mason o pojemności 600 ml z kwadratowym szkłem i szerokim otworem z uszczelką 95 mm i hermetycznym pokrywkami, z pokrywkami z kabłąkiem i zaciskiem spustowym (Rysunek 1).
UWAGA: Komora do pobierania próbek nie jest dostępna na rynku i musi być skonstruowana. - Zamontuj mosiężną przegrodę (gwint wewnętrzny 1/4" NPT, gwint zewnętrzny 3/4-16 UNF) przez oba otwory w słoiku Mason za pomocą gumowych podkładek (średnica wewnętrzna 3/4", średnica zewnętrzna 1") na obu powierzchniach styku przegrody ze szkłem, aby zapewnić hermetyczne uszczelnienie.
- Użyj jednego zespołu grodziowego jako czujnika ciśnienia, podczas gdy druga przegroda jest mocowana za pomocą strzykawki podłączonej Luer w celu kalibracji.
- W przypadku czujnika ciśnienia owiń gwinty 1/4" NPT wysokowydajnego przetwornika ciśnienia manometrycznego taśmą teflonową i wkręć je w grodzi. Użyj lutownicy, aby podłączyć okablowanie czujnika ciśnienia do 8-pinowego męskiego złącza DIN, korzystając z instrukcji okablowania producenta do interfejsu z dostępnym na rynku wysokiej jakości urządzeniem do akwizycji danych (patrz tabela materiałów).
UWAGA: Wymaga to użycia rezystora 150 K ohm 1/8 W 1% z folii metalowej w okablowaniu złącza DIN. - Jako port kalibracyjny użyj adaptera 1/4" męskiego NPT na żeńskiego 1/8" NPT, aby podłączyć męski NPT 1/8" do żeńskiego niklowanego złącza Luer lock do mosiężnej grodzi, owijając połączenia gwintowane taśmą teflonową. Użyj męskiej nasadki Luer z gwintem polipropylenowym, aby uszczelnić złącze Luer, gdy nie jest używane.
UWAGA: Nie dokręcaj zbyt mocno złączy grodziowych do szklanego słoika, ponieważ spowoduje to pęknięcia. W razie potrzeby do gumowych uszczelek można dodać silikon, aby zapewnić hermetyczne uszczelnienie grodzi do szklanego słoika.
- W przypadku czujnika ciśnienia owiń gwinty 1/4" NPT wysokowydajnego przetwornika ciśnienia manometrycznego taśmą teflonową i wkręć je w grodzi. Użyj lutownicy, aby podłączyć okablowanie czujnika ciśnienia do 8-pinowego męskiego złącza DIN, korzystając z instrukcji okablowania producenta do interfejsu z dostępnym na rynku wysokiej jakości urządzeniem do akwizycji danych (patrz tabela materiałów).
2. Ustawienia systemu
- Podłącz komorę próbkowania do wzmacniacza mostkowego za pomocą 8-pinowego złącza DIN, a wzmacniacz mostka do urządzenia do akwizycji danych, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
- Podłącz urządzenie do akwizycji danych do źródła zasilania i komputera z uruchomionym oprogramowaniem do analizy danych fizjologicznych za pomocą producenta.
UWAGA: Upewnij się, że urządzenie do akwizycji danych jest włączone i rozgrzane przez co najmniej 5 minut przed użyciem, aby upewnić się, że czujnik stabilizuje swoje pomiary. - Uruchom oprogramowanie, aby połączyło się z systemem akwizycji danych.
- Pobierz opcjonalny moduł spirometrii w oprogramowaniu i zmodyfikuj domyślne ustawienia urządzenia z L/s na μL/s w oknie Ustawienia > spirometrii.
3. Kalibracja systemu
- W oprogramowaniu utwórz 4-kanałowe okno z następującymi oknami danych: Kanał 1: Dane źródłowe z częstotliwością próbkowania 4 k/s i zakresem 1 mV; Kanał 2: Filtr cyfrowy kanału 1 wykorzystujący filtr górnoprzepustowy 1 Hz z automatyczną regulacją; Kanał 3: Wygładzanie danych z kanału 2 poprzez uśrednianie 100 próbek; Kanał 4: Spirometryczny przepływ danych kanału 3 (niestandardowa głowica przepływowa, skalibrowana zgodnie ze wzorem (μL/s) = 120 000 x napięcie).
UWAGA: 120 000 to współczynnik korelacji symboli zastępczych, który zostanie zmodyfikowany podczas kalibracji. - Skonfiguruj analizę DataPad kanału 4 z następującymi kolumnami: Kolumna 1: Dane kanału 4, Komentarze > Pełny tekst komentarza; Kolumna 2: Dane z kanału 4, pomiary cykliczne > średnia częstotliwość cykliczna; Kolumna 3: Dane kanału 4, pomiary cykliczne > średnia wysokość cykliczna.
- Ustaw liczbę klatek na sekundę na 100:1 w prawym dolnym rogu ekranu. Zapisz tę konfigurację okna jako szablon dla wszystkich przyszłych badań.
- Zamknij pokrywę komory na próbki i podłącz gazoszczelną strzykawkę o pojemności 25 μl do złącza grodziowego Luer. Wyposażyć strzykawkę w adapter Chaney, który umożliwia wielokrotne podawanie objętości 20 μl.
UWAGA: Do podłączenia strzykawki do komory na próbkę można użyć opcjonalnego krótkiego odcinka rurki 1/16" i złączy Luer/zadziorowych. Należy jednak unikać długich przewodów, aby uniknąć znaczących zmian w całkowitej objętości powietrza w komorze próbki. - Wciągnąć 20 μl powietrza do strzykawki za pomocą ogranicznika głębokości adaptera Chaney.
- Wyzeruj pleth w oprogramowaniu (Setup > Zero All Inputs (Alt-Z)) i rozpocznij nagrywanie.
- Podczas nagrywania, przy stabilnej linii podstawowej, szybko wciśnij/wycofaj tłok strzykawki na około 10 powtórzeń, aby odtworzyć oddychanie pacjenta z mierzonym oddechem 20 μl. Zatrzymaj nagrywanie.
UWAGA: Częstotliwość sztucznych oddechów powinna przekraczać 2 Hz, aby zmaksymalizować odtwarzalność kalibracji. - Oznacz tożsamość mierzonej próbki, klikając prawym przyciskiem myszy początek numerowanego zapisu pleth i kliknij Dodaj komentarz.
- Zresetuj strzykawkę, wyzeruj wejście i powtórz pomiary nagrywania impulsów 20 μl jeszcze dwa razy (łącznie trzy sesje nagrywania).
- Po wykonaniu wszystkich pomiarów użyj myszki komputerowej, aby wybrać część pletu oddechowego, która dokładnie odzwierciedla sztuczne 20 μl oddechów.
UWAGA: W module DataPad dane pojawią się w nagłówku podglądu, zapewniając tymczasowy odczyt częstości oddechów (średnia częstotliwość cykliczna, Hz) i głębokości oddechu (średnia wysokość cykliczna, μL). Podgląd danych można zapisać w DataPad za pomocą ikony Dodaj do DataPad. - Przejrzyj dane z kolumny 3 (średnia wysokość cykliczna) i oblicz średnią zmierzoną objętość oddechu z trzech zapisów. Wykonaj następujące obliczenia średniej zmierzonej objętości oddechu: Współczynnik kalibracji = dostarczona objętość / zmierzona objętość x 120 000,
UWAGA: 120 000 to zastępczy współczynnik kalibracji głowicy przepływowej użyty w kroku 3.1, teraz zmodyfikowany na podstawie zmierzonych danych. System jest teraz skalibrowany do typowego oddychania myszy przy użyciu aktualnej temperatury i wilgotności otoczenia. System może teraz monitorować oddech badanego, a kalibracja może być przeprowadzana codziennie ponownie, aby uwzględnić wszelkie wahania temperatury/wilgotności.
4. Monitorowanie obiektu
- Otwórz szablon główny zgodnie z opisem w kroku 3.4 lub wykonaj kroki od 4.2 do 4.3.
- W oprogramowaniu utwórz 4-kanałowe okno z następującym przetwarzaniem danych: Kanał 1: Dane źródłowe przy częstotliwości próbkowania 4 k/s i zakresie 1 mV; Kanał 2: Filtr cyfrowy kanału 1 wykorzystujący filtr górnoprzepustowy 1 Hz Auto Adjust; Kanał 3: Wygładzanie danych kanału 2 poprzez uśrednianie 100 próbek; Kanał 4: Spirometria Przepływ danych kanału 3 (niestandardowa głowica przepływowa, skalibrowana zgodnie ze wzorem (μL/s) = 120 000 x napięcie).
UWAGA: 120 000 to współczynnik korelacji obliczony dla aktualnego czujnika ciśnienia; Użytkownik powinien jednak przeprowadzić kalibrację systemu opisaną w kroku 3 i zamiast tego użyć zdefiniowanego przez użytkownika współczynnika korelacji. - Skonfiguruj analizę DataPad kanału 4 z następującymi kolumnami: Kolumna 1: Dane kanału 4, Komentarze > Pełny tekst komentarza; Kolumna 2: Dane z kanału 4, pomiary cykliczne > średnia częstotliwość cykliczna; Kolumna 3: Dane kanału 4, pomiary cykliczne > średnia wysokość cykliczna.
- Umieść badanego w komorze pobierania próbek i zamknij pokrywę. W tym eksperymencie wykorzystano przytomną samicę myszy albinosa C57BL/6J (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) w wieku 4-12 tygodni.
- Wyrównaj ciśnienie atmosferyczne w komorze (od uszczelnienia pokrywy), na krótko poluzowując nasadkę grodzi Luer i ponownie dokręć.
- Obserwuj, że obiekt nie porusza się aktywnie w komorze próbkowania przed wyzerowaniem wszystkich wejść (skrót Alt-Z) i rozpoczęciem nagrywania.
UWAGA: Jeśli badany zacznie się poruszać w komorze próbkowania, linia bazowa może przesunąć się poza skalę, co można rozwiązać poprzez ponowne wyzerowanie wszystkich danych wejściowych w środku nagrania, co spowoduje utworzenie nowego zapisu na skali. Załóżmy, że osoba badana angażuje się w eksplorację lub pielęgnację podczas nagrywania; Zwróć uwagę, która część zapisu pletyzmografii najdokładniej odzwierciedla normalny oddech. - Oznacz tożsamość osoby, klikając prawym przyciskiem myszy początek ponumerowanego nagrania pleth i kliknij Dodaj komentarz.
- Umieść obiekt z powrotem w klatce. Ogranicz czas spędzony w szczelnie zamkniętej komorze pobierania próbek do 5 minut, aby uniknąć uduszenia i stresu.
UWAGA: Ryzyko uduszenia jest niskie, biorąc pod uwagę, że objętość powietrza wynosząca 600 ml w komorze na próbki nie zostanie szybko zużyta przez zdrową mysz oddychającą z prędkością <15 ml/min. - Użyj myszy komputerowej, aby wybrać fragment oddychania, który dokładnie odzwierciedla oddychający obiekt.
UWAGA: W module DataPad dane pojawią się w nagłówku podglądu, zapewniając tymczasowy odczyt częstości oddechów (średnia częstotliwość cykliczna, Hz) i objętości oddechu (średnia wysokość cykliczna, μL). Podgląd danych można zapisać w DataPad za pomocą ikony Dodaj do DataPad. - Kontynuuj pomiar badanych myszy pojedynczo i rejestruj reprezentatywne odcinki oddechu na DataPadzie.
- Po zarejestrowaniu danych wyeksportuj dane DataPad do programu Excel. Oblicz objętość minutową w następujący sposób: Objętość minutowa (ml/min) = częstość oddechów (Hz) x objętość oddechu (μl) x 0,06.
Wyniki
Kalibracja systemu
Oprogramowanie do analizy danych umożliwia bezpośrednią kalibrację niestandardowej głowicy przepływowej, takiej jak ta opisana w niniejszym opracowaniu. Jest to wykonywane podczas ustawiania przepływu spirometrycznego. Zgodnie z opisem w kroku 3.1, istnieje opcja wprowadzenia znanej objętości powietrza kalibracyjnego, co pozwala systemowi obliczyć współczynnik korelacji napięcia i objętości. Generuje to jednak współczynnik korelacji na podstawie pojedynczego odczytu, a zaobserwowano, że wrodzona zmienność kalibracji przy standardzie n = 1 ma niską użyteczność. Obecne podejście pozwala rozwiązać ten problem i umożliwia użytkownikowi przeprowadzanie codziennej kalibracji przy użyciu wielu odczytów, których średnia służy do obliczenia współczynnika kalibracji. W niniejszym opracowaniu zademonstrowano kalibrację z użyciem 20 µL wstrzykniętego powietrza, co reprezentuje typową wysoką objętość oddechu u typowej myszy. Oprogramowanie zakłada punkt przecięcia w początku układu współrzędnych (0,0), zatem przy zastosowaniu tego podejścia kalibracja odbywa się w zakresie 0-20 µL.
Zaproponowana tutaj metodologia dla sWBP jest kalibrowana codziennie, co pozwala uwzględnić wszelkie wahania wilgotności i temperatury otoczenia. Pierwotne metody stosowane dla specyficznego WBP wywodzą się z metodologii Drorbaugha i Fenna z 1955 roku, którzy opracowali WBP do pomiaru wentylacji u niemowląt5. Obliczenia Drorbaugha i Fenna uwzględniają zmienność temperatury i wilgotności środowiska oraz badanego obiektu. Obecne podejście koryguje wahania środowiskowe poprzez kalibrowanie każdej sesji sWBP. Mimo to zdecydowano się sprawdzić, czy ogrzewanie i nawilżanie powietrza podczas oddychania w jamie nosowej/płucach myszy wpływa na pomiar określonej objętości powietrza. W związku z tym stworzono sztuczną aparaturę, aby zasymulować wpływ badanego obiektu na ogrzewanie i nawilżanie kalibrowanych pomiarów powietrza. Złącza Luer przymocowano do stożkowej probówki o pojemności 15 mL i umieszczono tę szczelną probówkę w linii między komorą próbki a gazoszczelną strzykawką kalibracyjną. Przeprowadzono kalibrację 20 µL przy użyciu pustej probówki stożkowej utrzymywanej w temperaturze pokojowej (23 °C). Następnie probówkę stożkową częściowo napełniono wodą destylowaną do poziomu tuż poniżej złączy Luer, pozostawiając czas na wyrównanie stanu przestrzeni nad cieczą w probówce; następnie ponownie zmierzono objętość kalibracyjną, aby zbadać wpływ wilgotności. Probówkę stożkową umieszczono w bloku grzewczym i wyrównano temperaturę do 37 °C w wilgotnym środowisku, a na koniec wyrównano do 37 °C bez wody, aby ocenić wpływ ogrzewania przez badanego obiektu bez dodatkowego wpływu wilgotności. Rysunek 2 wykazuje, że wszystkie testowane warunki nie miały istotnego wpływu na kalibrowany pomiar 20 µL podawany przez gazoszczelną strzykawkę. Na podstawie tego wyniku wyciągnięto wniosek, że sWBP stanowi dostępną metodę monitorowania oddychania u zwierząt badawczych bez konieczności stosowania złożonych obliczeń opartych na temperaturze i wilgotności zwierzęcia, ponieważ czynniki te nie mają istotnego wpływu na mierzoną objętość oddechu.
Monitorowanie obiektów
sWBP wykorzystano do monitorowania oddychania podczas przebiegu śmiertelnych infekcji dróg oddechowych wywołanych patogenem bakteryjnym B. pseudomallei. Jednym z wyzwań związanych z monitorowaniem oddychania u świadomych zwierząt jest ciekawość zdrowych osobników, które poruszają się wewnątrz komory próbnej. Ruch myszy powoduje ciągle zmieniającą się linię bazową, co można częściowo zniwelować poprzez wstępną adaptację obiektów do komory przez kilka dni przed pomiarem. Problem ten dotyczy głównie pomiarów bazowych u zdrowych myszy, ponieważ podczas infekcji osobniki stają się letargiczne, co sprawia, że sWBP jest znacznie łatwiejszy do opanowania ze względu na ograniczoną aktywność obiektów. Można odczuwać pokusę zastosowania pewnej formy unieruchomienia, fizycznego lub anestezji. Użycie unieruchomienia fizycznego może wpłynąć na naturalny oddech poprzez wywołanie stresu. Co więcej, wiadomo, że stosowanie środków znieczulających ma wyraźny wpływ na częstotliwość i głębokość oddechu10; w związku z tym zdecydowano się zbadać wpływ anestezji przy użyciu opracowanego wewnętrznie aparatu sWBP. Izofluran jest powszechnie stosowany do obrazowania diagnostycznego in vivo w modelach infekcji, dlatego mysz C57BL/6 została poddana znieczuleniu, a następnie monitorowano jej stan aż do wybudzenia przy użyciu sWBP. Próbę tę przeprowadzono na młodym, 4-tygodniowym albinie myszy C57BL/6J, aby wydłużyć okno wybudzania z anestezji. Rysunek 3 pokazuje, że preferowany środek znieczulający powoduje u myszy spowolnienie częstości oddechów przy dużej objętości oddechowej powietrza. W miarę jak myszy zaczynają budzić się z sedacji, ich częstość oddechów wzrasta, a objętość oddechu spada, co w efekcie końcowym prowadzi do powolnego wzrostu całkowitej ilości zainspirowanego powietrza. W tej próbie stwierdzono, że objętość oddechu wraca do poziomów sprzed anestezji w ciągu pierwszych 30 s wybudzania. Częstość oddechów stopniowo wzrasta, aż do przywrócenia oddechu bazowego w czasie 2-2,5 min po zaprzestaniu znieczulenia. Wentylacja minutowa ściśle podążała za efektami częstości oddechów, osiągając bazową wartość wentylacji minutowej w 2,5 min po zaprzestaniu znieczulenia. Wynik ten potwierdza, że w podejściu sWBP nie należy stosować anestezji. Wpływa ona drastycznie na oddech bazowy, co nie jest zaskakujące, ponieważ znieczulenie spowalnia metabolizm gospodarza, tworząc zmniejszone zapotrzebowanie na zainspirowany tlen. Należy również rozważyć sanitację komory próbnej pomiędzy obiektami, aby zapewnić kontrolę infekcji specyficzną dla badania, a także zniwelować wpływ feromonów z moczu lub kału, które mogłyby wpłynąć na poziom stresu u kolejnych osobników.
WBP jest atrakcyjną strategią nieinwazyjnego monitorowania funkcji płuc w modelach chorób układu oddechowego. sWBP wykorzystano do zbadania zmian w oddychaniu podczas śmiertelnych infekcji melioidozą układu oddechowego (Rycina 4), w punktach czasowych odpowiadających monitorowaniu bioluminescencji w płucach. Zaobserwowano, że model ten wiąże się z wczesnym wystąpieniem letargu, który utrzymuje się w sposób powoli postępujący aż do rozwoju stanu agonalnego około 3 dni po infekcji. Zaobserwowano również, że częstotliwość oddechów oraz całkowita objętość powietrza wdychanego (objętość minutowa) u myszy gwałtownie spadają w ciągu pierwszej doby infekcji i pozostają na niskim poziomie przez resztę przebiegu choroby (Rycina 4A,C). Wzorzec ten jest zgodny z wczesnym wystąpieniem letargu, który utrzymuje się przez kolejne 2 dni infekcji. W przeciwieństwie do tego, objętość oddechowa nie spada gwałtownie w ciągu pierwszych 24 h, lecz wykazuje lekki i stały spadek, który w ciągu 3-dniowego przebiegu choroby przyjmuje formę bliską spadkowi liniowemu (Rycina 4B).
Rysunek 1: Aparatura sWBP. Zastosowano specjalnie skonstruowaną komorę próbkową wykonaną z uszczelnialnego szklanego słoika o przekroju kwadratowym z przyłączami przelotowymi na dwóch płaskich ściankach. Jeden przelot posłużył do montażu czujnika ciśnienia manometrycznego podłączonego do wzmacniacza mostkowego i cyfryzatora urządzenia do akwizycji danych poprzez 8-pinowe złącze DIN. Drugi przelot wyposażono w złącze Luer w celu kalibracji za pomocą strzykawki gazoszczelnej. Urządzenie zostało podłączone do komputera PC z uruchomionym oprogramowaniem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Wpływ temperatury i wilgotności próbki na objętość oddechu. W układzie pomiędzy strzykawką kalibracyjną 20 µL a komorą próbki (Sample Chamber) zainstalowano stożkową probówkę 15 mL z złączami Luer. System skalibrowano do wartości 20 µL bez dodatkowego wpływu temperatury/wilgotności z probówki stożkowej. Pozostałe pomiary zebrano po osiągnięciu stanu równowagi z nasyconą wilgotnością z wody destylowanej i/lub po ogrzaniu probówki stożkowej od temperatury pokojowej (23 °C) do temperatury ciała (37 °C). Nie stwierdzono istotnych różnic dla n = 5 pomiarów z każdego stanu, stosując jednoczynnikową analizę wariancji (One-way ANOVA) z testem post-hoc Tukey’s Multiple Comparison. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Wpływ znieczulenia gazowego na oddychanie u myszy. Reprezentatywne dane od 4-tygodniowej samicy białej myszy C57BL/6J (8,6 g), która była sedowana przez 5 min 3% izofluranem w tlenie, a następnie przeniesiona do komory pomiarowej sWBP. Dane pletyzmograficzne zbierano przez 150 s po zakończeniu znieczulenia. Badany osobnik zaczął się poruszać do 100 s po wybudzeniu z narkozy. (A) Oddychanie bazowe przed znieczuleniem, wykazujące częstość oddechów 4,97 Hz, objętość oddechową 9,74 µL oraz objętość minutową 2,91 mL. (B) Pierwsze 60 s zmian w oddychaniu podczas wybudzania z narkozy. (A-B) Oś pionowa mierzy µL na oddech, a oś pozioma jest podana w sekundach. (C-E) Dane dotyczące wentylacji zbierano podczas 150 s wybudzania z narkozy, uśredniając ≥3 cykle oddechowe dla każdego punktu czasowego dla (C) częstości oddechów, (D) objętości oddechowej oraz (E) obliczonej objętości minutowej. Wartości bazowe sprzed znieczulenia zaznaczono poziomą linią przerywaną na każdym z odpowiednich wykresów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Wpływ melioidozy układu oddechowego na oddychanie gospodarza. Pięć 8-tygodniowych samic myszy C57BL/6 zainfekowano dawką 4,9 log CFU bioluminescencyjnego szczepu B. pseudomallei JW270. Przez cały 3-dniowy okres infekcji przeprowadzano sWBP, mierząc częstość oddechów (A) oraz objętość oddechu (B). Całkowita objętość powietrza wdechowego została obliczona jako objętość minutowa (C). Dane dla każdego z pięciu osobników przedstawiono niezależnie z regresją wielomianową trzeciego stopnia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
sWBP jest atrakcyjnym podejściem do lepszego zrozumienia infekcji dróg oddechowych w modelach małych zwierząt. Co ważne, jest to podejście nieinwazyjne i jako takie nie stwarza znaczącego ryzyka spowodowania nadmiernego stresu u zwierząt badawczych podczas wyzwania infekcji. Rzeczywiście, procedura monitorowania oddechu osoby jest szybkim testem wymagającym kilku minut i minimalnej obsługi pacjenta. Korzyścią naukową jest zrozumienie w wysokiej rozdzielczości, w jaki sposób patogeny mikrobiologiczne wpływają na czynność płuc podczas choroby. Podejście to przyniesie korzyści badaniom podstawowym, ułatwiając zrozumienie, w jaki sposób patogen powoduje chorobę, a także zapewniając narzędzie translacyjne do zrozumienia, w jaki sposób nowatorski środek terapeutyczny przywraca badanemu badanemu stan zdrowia układu oddechowego.
W niniejszym manuskrypcie przedstawiono reprezentatywne wyniki dla patogenu B. pseudomallei, który powoduje wczesną reakcję letargiczną. Nie wszystkie bakteryjne infekcje płuc występują w ten sam sposób w modelach infekcji myszy. Wcześniejsze doświadczenia z innymi modelami infekcji wykazały, że patogen bakteryjny Klebsiella pneumoniae przedstawia się jako infekcja bezobjawowa do momentu, w którym myszy ulegają zakażeniu, również około 3. dnia po zakażeniu11. Przypuszcza się, że zapotrzebowanie gospodarza na wdychane powietrze (tj. objętość minutowa) może być ściśle związane ze stopniem letargu, z jakim objawia się dana choroba. Konieczne będą dalsze badania, aby zbadać, w jaki sposób różne patogeny bakteryjne wpływają na czynność płuc podczas chorób układu oddechowego. Zrozumiałe jest, że różne patogeny mają unikalne podejścia do unikania obrony gospodarza, w tym różnice w (1) skłonności do bycia patogenami wewnątrzkomórkowymi lub zewnątrzkomórkowymi, (2) zdolności do wywoływania wczesnej/późnej odpowiedzi hipotermicznej oraz (3) stosowaniu różnych repertuarów determinantów wirulencji 3,12,13. W związku z tym jest prawdopodobne, że różne strategie chorobowe będą miały unikalny wpływ na czynność płuc i oddychanie podczas infekcji.
Zalecane ustawienia opisane w tym protokole mogą być modyfikowane w celu uwzględnienia unikalnych wyzwań występujących podczas sWBP. Jednym z typowych problemów występujących podczas sesji nagraniowej sWBP jest ruch obiektu w komorze próbki. Jak wspomniano, ruch ten modyfikuje linię bazową i może wpływać na dokładność pomiarów oddechu. Do normalizacji przesuwającej się linii podstawowej zastosowano filtr cyfrowy, umożliwiając realne pomiary oddechu pomimo niewielkich ruchów. Nadmierny ruch może wypchnąć pomiar bazowy poza zakres wyzerowanych danych wejściowych. Nagrania są zalecane w zakresie 1 mV (ustawienie kanału 1), co zapewnia kompromis polegający na dalszym obserwowaniu szczytów pletyzmografii przy jednoczesnym unikaniu utraty danych poza zakresem. W przypadku wyjątkowo aktywnych obiektów może być konieczne rozszerzenie zakresu nagrywania >1 mV, aby uniknąć utrzymujących się sygnałów poza zakresem.
Zalecana procedura wymaga codziennej kalibracji (lub podczas każdej sesji) w celu dostosowania się do wahań wilgotności/temperatury otoczenia. Tradycyjny WBP wykorzystuje złożone obliczenia, które uwzględniają temperaturę/wilgotność zarówno otoczenia, jak i obiektu 5,6. Wykazano, że w obecnym aparacie sWBP wpływ temperatury/wilgotności gospodarza nie zmienia znacząco zmierzonej objętości oddechu źródła kalibracji. W związku z tym to podejście w sWBP zasadniczo różni się od >50-letniego podejścia Drorbaugha i Fenna. W tym przypadku sWBP bezpośrednio wiąże zmiany ciśnienia ze zmierzoną objętością oddechu bez dalszej korekty ze strony gospodarza.
Konieczne jest porównanie WBP badanych zwierząt z klinicznym WBP. Rodzaje danych biometrycznych, które próbowano zebrać za pomocą sWBP, to objętość i częstotliwość oddechu. Takie pomiary są zbierane klinicznie za pomocą prostego sprzętu spirometrycznego, w którym pacjent trzyma monitor oddechu przy ustach i normalnie oddycha do urządzenia monitorującego przepływ powietrza. Podobna spirometria u zwierząt badawczych wymaga powściągliwości, przyczyniając się w ten sposób do stresu i nieodłącznych zakłóceń w oddychaniu. Dlatego prosta spirometria jest funkcjonalna klinicznie, ale nie dla zwierząt badawczych. WBP służy podstawowemu celowi w klinice, jakim jest gromadzenie zaawansowanych danych, w tym takich pomiarów, jak resztkowa objętość płuc. Takie dane mogą być zawarte tylko w kontekście tego, że badany jest w stanie postępować zgodnie z instrukcjami dotyczącymi oddychania, w tym wymuszonego wydechu (opróżnienie płuc przez głęboki wydech). Nie można polegać na zwierzętach badawczych, że będą postępować zgodnie z instrukcjami oddychania od badacza. Wiele zaawansowanych pomiarów zebranych klinicznie podczas WBP nie może być odtworzonych na zwierzętach badawczych. WBP u zwierząt badawczych zasadniczo różni się od klinicznego WBP. Animal WBP ma na celu gromadzenie prostych danych dotyczących wentylacji (częstość i objętość oddechu) w nieskrępowany sposób, aby uniknąć stresu zwierząt i zaburzeń oddychania. Jak dotąd, zastosowanie WBP u zwierząt badawczych wydaje się powielać techniki stosowane w klinicznych WBP, w tym złożone obliczenia oparte na temperaturze i wilgotności środowiska oraz obiektu, ale bez możliwości zebrania zaawansowanych danych od osoby, która może postępować zgodnie z instrukcjami, jak wykonać wymuszony wydech. Mając to na uwadze, starano się wykazać, czy uproszczona wersja WBP wystarczy, aby zebrać odpowiednią częstotliwość i objętość oddechu istotne dla badań nad chorobami układu oddechowego. Przeprowadzono sesję kalibracyjną, która skompensowała wszelkie zmiany temperatury i wilgotności otoczenia. Co więcej, wykazano na sztucznej myszy, że poddanie temperatury i wilgotności zmierzonej objętości oddechu nie ma znaczącego wpływu na dokładny pomiar objętości oddechu. Stwierdzono, że sWBP ma doskonałe zastosowanie w badaniach na zwierzętach, bez konieczności stosowania przez użytkownika kłopotliwego matematycznego przetwarzania danych.
Oświadczenia
Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Te badania były wspierane przez grant COBRE National Institutes of Health P20GM125504-01 Podprojekt 8246.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Adapter 1/8" NPT Luer | Port kalibracji | Amazon | B07DH9MY8W |
| Adapter 1/8" NPT na 1/4" NPT | Amazon | B07T6CR6FS Przejściówka grodziowa na luer | |
| Rezystor 150 kΩ | Amazon | B07GPRYL81 | Wybór napięcia wzbudzenia przetwornika ciśnienia |
| /4" Wiertło diamentowe | Drilax | DRILAX100425 | Do wiercenia mocowań grodziowych w szklany słoik |
| Bridge Amp | AD Instruments | FE221 | Opcja jednokanałowa |
| Łącznik grodziowy | Legines | 3000L-B | 1/4" NPT, 3/4-16 UNF mosiężne złącze grodziowe |
| Adapter Chaney | Hamilton | 14725 | Gazoszczelny adapter strzykawkowy do złącza DIN o ustalonej objętości |
| AD Instruments | SP0104 | Do podłączenia czujnika ciśnienia do wzmacniacza mostkowego | |
| Strzykawka gazoszczelna, 25 uL | Strzykawka kalibracyjna | Hamilton | 80201 |
| LabChart | AD Instruments Oprogramowanie | akwizycji danych z nauk przyrodniczych Wtyczka | |
| Luer | Cole Parmer | 45513-56 | Zamknięcie portu kalibracyjnego |
| PowerLab 4/26 | AD Instruments | PL2604 | Cyfrowy interfejs do komputera |
| Przetwornik ciśnienia | Omega Engineering | PX409-10WGV | Czujnik ciśnienia w oleju o wysokiej dokładności |
| Uszczelka gumowa | Amazon | B07LH4C8LS | Do montażu grodzi (wymagane 4 na komorę) |
| Kwadratowy szklany słoik | Amazon | B07VNSPR8P | 600 ml z uszczelką silikonową 95 mm |
Bibliografia
- Warawa, J. M., Long, D., Rosenke, R., Gardner, D., Gherardini, F. C. Role for the Burkholderia pseudomallei capsular polysaccharide encoded by the wcb operon in acute disseminated melioidosis. Infection and Immunity. 77 (12), 5252-5261 (2009).
- West, T. E., Myers, N. D., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Murine pulmonary infection and inflammation induced by inhalation of Burkholderia pseudomallei. International Journal of Experimental Pathology. 93 (6), 421-428 (2012).
- Lawrenz, M. B., et al. Development and evaluation of murine lung-specific disease models for Pseudomonas aeruginosa applicable to therapeutic testing. Pathogens and Disease. 73 (5), (2015).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51755(2014).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Simon, G., Pride, N. B., Jones, N. L., Raimondi, A. C. Relation between abnormalities in the chest radiograph and changes in pulmonary function in chronic bronchitis and emphysema. Thorax. 28 (1), 15-23 (1973).
- Gassiep, I., Armstrong, M., Norton, R. Human melioidosis. Clinical Microbiology Reviews. 33 (2), 06-19 (2020).
- Gutierrez, M. G., Warawa, J. M. Attenuation of a select agent-excluded Burkholderia pseudomallei capsule mutant in hamsters. Acta Tropica. 157, 68-72 (2016).
- Gutierrez, M. G., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. Type 3 secretion system cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (1), 3441(2015).
- Rocco, P. R. M., Zin, W. A. Anaesthesia, Pain, Intensive Care and Emergency Medicine. Gullo, A. , Springer. (2002).
- Fodah, R. A., et al. Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model. PLoS One. 9 (9), 107394(2014).
- Gotts, J. E., et al. Clinically relevant model of pneumococcal pneumonia, ARDS, and nonpulmonary organ dysfunction in mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (5), 717-736 (2019).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host & Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
Przedruki i uprawnienia
