Izolacja aktywnego ekstraktu jądrowego Caenorhabditis elegans i rekonstytucja do transkrypcji in vitro

Summary

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji aktywnego ekstraktu jądrowego z larwalnego stadium 4 C. elegans i wizualizacji aktywności transkrypcyjnej w systemie in vitro.

Abstract

Caenorhabditis elegans jest ważnym modelowym systemem dla badań biologicznych od czasu jego wprowadzenia w 1963 roku. Jednak C. elegans nie został w pełni wykorzystany w biochemicznych badaniach reakcji biologicznych z wykorzystaniem jego ekstraktów jądrowych, takich jak transkrypcja in vitro i replikacja DNA. Istotną przeszkodą w wykorzystaniu C. elegans w badaniach biochemicznych jest przerwanie grubego zewnętrznego naskórka nicienia bez poświęcania aktywności ekstraktu jądrowego. Chociaż do przerwania naskórka stosuje się kilka metod, takich jak homogenizacja Dounce lub sonikacja, często prowadzą one do niestabilności białka. Nie ma ustalonych protokołów izolowania aktywnych białek jądrowych od larw lub dorosłych C. elegans w reakcjach in vitro. W tym miejscu protokół szczegółowo opisuje homogenizację C. elegans w stadium larwalnym 4 za pomocą homogenizatora Balch. Homogenizator Balch wykorzystuje nacisk, aby powoli przepchnąć zwierzęta przez wąską szczelinę, łamiąc w ten sposób naskórek. Jednolita konstrukcja i precyzyjna obróbka homogenizatora Balch pozwalają na równomierne mielenie zwierząt między eksperymentami. Frakcjonowanie homogenatu uzyskanego z homogenizatora Balch daje funkcjonalnie aktywny ekstrakt jądrowy, który można zastosować w metodzie in vitro do oznaczania aktywności transkrypcyjnej C. elegans.

Introduction

Mały, wolno żyjący nicień Caenorhabditis elegans jest prostym, ale potężnym organizmem modelowym do rozwiązywania szerokiego zakresu zagadnień biologicznych. Od czasu wprowadzenia na rynek w 1963 roku, nicienie były nieocenione w odpowiadaniu na pytania z zakresu neurobiologii, metabolizmu, starzenia się, rozwoju, odporności i genetyki¹. Niektóre z wielu cech zwierzęcia, które czynią je idealnym organizmem modelowym, obejmują krótki czas generacji, skuteczność interferencji RNA, przezroczyste ciało oraz ukończone mapy zarówno jego linii komórkowej, jak i układu nerwowego.

Chociaż wkład nicieni w naukę jest o....

Protocol

1. Przygotowanie mediów

1. Przygotuj sterylne płytki agarowe bulionu lizogenicznego (LB) i płynne podłoże zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Smuga szczepu Escherichia coli (E. coli) OP50 na płytce agarowej LB. Inkubować smugę bakterii w temperaturze 37 °C przez noc.
3. Po inkubacji przechowywać płytkę paskową E. coli OP50 w temperaturze 4 °C. Płytka E. coli OP50 może być bezpiecznie przechowywana w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie, jeśli jest owinięta w parafilm, aby zapobiec utracie wilgoci.
4. Przygotować 2 l pożywki dla nicieni (NGM), korzystając z przepisu podanego w tabeli 1.<....

Results

Postępowanie zgodnie z opisanymi krokami powinno dać funkcjonalny ekstrakt jądrowy (Rysunek 1)), odchylenie w etapach mielenia lub mycia może prowadzić do słabej aktywności lub niskiej wydajności. Jeśli otrzymany zostanie funkcjonalny ekstrakt jądrowy C. elegans, po dodaniu do wcześniej opisanego testu in vitro dokona on transkrypcji regionu za promotorem CMV na matrycy DNA. Powstały transkrypt RNA można oczyścić z białek jądrowych i matrycy DNA przy.......

Discussion

C. elegans jest atrakcyjnym organizmem modelowym do badania eukariotycznego systemu transkrypcji ze względu na jego niskie koszty utrzymania i łatwość manipulacji genetycznej. W tym miejscu opisano protokół konsekwentnej izolacji funkcjonalnie aktywnego ekstraktu jądrowego z L4 C. elegans . Chociaż protokół ten koncentrował się na wizualizacji aktywności transkrypcyjnej, cDNA wytwarzane po transkrypcji można określić ilościowo za pomocą RT-qPCR w celu uzyskania bardziej precyzyjnego pomiaru aktywności t.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiały eksploatacyjne i odczynniki
0,2 ml 8-paskowe probówki i odczynniki Nakrętki z płaskim paskiem, przezroczyste	Genesee Scientific	24-706
0,2 ml Indywidualne probówki do PCR	Genesee Scientific	24-153G
1,7 ml sterylne mikroprobówki	Genesee Scientific	24-282S
100% absolutny etanol klasy molekularnej	Fisher Scientific	BP2818
100% etanol, Koptec	Decon Labs	Pipeta serologiczna V1001
10 ml	VWR international	89130-898
Płytki Petriego 150 mm	Tritech Research	T3325
15 ml stożkowe probówki wirówkowe	Genesee Scientific	28-103
Plastikowe strzykawki 20 ml	Fisher Scientific 14955460
Strzykawki 2 ml Norm-Ject	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 ml próżniowy kubek filtracyjny 0,22 i mikro; m PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 ml stożkowe probówki wirówkowe	ThermoFisher Scientific	339652
50 ml pipeta serologiczna	VWR international	89130-902
Pipeta serologiczna 5 ml	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agaroza	Denville Scientific	CA3510-6
Marker alkoholowy	VWR International	52877-310
Pepton baktonowy	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Dichlorek wapnia	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Kontrolne startery do klonowania skroni DNA, do przodu 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3'
Kontroluj spłonki klonowania świątyń DNA, Naprzód 5'- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3'
Woda
Ditiothreitol	Invitrogen	15508-013
Barwnik żelowy DNA, bezpieczny dla SYBR	Invitrogen	S33102
Mieszanka drabinkowa DNA, O' władca genów	Fisher Scientific	SM1173
Barwnik ładujący DNA, 6x TriTrack	Fisher Scientific
DNaza, linia bazowa-ZERO	Lucigen
Suchy lód
Escherichia coli Szczep OP50	CGC	OP50
Lodowaty kwas octowy	Fisher Scientific	A38
Glicerol	Millipore Sigma	G6279
System transkrypcji ekstraktu jądrowego HeLa in vitro, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Kwas solny 37%	Millipore Sigma	P0662
Wybielacz podchlorynowy	Clorox
LB Rosół	Millipore Sigma	L3022
Dichlorek magnezu	Millipore Sigma	M8266
Siarczan magnezu	Millipore Sigma	M7506
Naczynia o średniej wadze	Fisher Scientific	02-202-101
szkiełka mikroskopowe, Vista vision	VWR International	16004-368
woda molekularna,	Hypure Hyclone Laboratories
Nystatyna	Millipore Sigma	System N1638
PCR, FailSafe z premiksem A	Lucigen
Chlorek potasu	Millipore Sigma	P39111
Fosforan potasu dwuzasadowy	Millipore Sigma	P3786
Fosforan potasu jednozasadowy	Millipore Sigma	P0662
Inhibitor proteazy, jednorazowy koktajl Halt 100x	ThermoFisher Scientific	78430
, Qubit	ThermoFisher Scientific	Zestaw do odwrotnej transkrypcji Q33211
Sensiscript	Qiagen	205211
zestaw mikro RNeasy	Qiagen	74004
Inhibitor RNazy	Applied Biosystems
Chlorek sodu	VWR International	BDH9286-12KG
Wodorotlenek sodu	Millipore Sigma	1-09137
Sterylny filtr strzykawkowy z 0,2 i mikro; m Membrana polieterosulfonowa	VWR international	28145-501
Sacharoza	VWR International	200-334-9
startery transkrypcyjne, naprzód 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3'
startery do transkrypcji, odwrócone 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3'
Tris-Base	Fisher Naukowy	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Sprzęt
-20 ° Inkubator C	ThermoFisher Scientific
20 ° Inkubator C	ThermoFisher Scientific
37 ° Inkubator C	Forma Scientific
4 ° C lodówka	ThermoFisher Scientific-80
° C zamrażarka	Autoklaw Eppendorf
Homogenizator	Sanyo
Balch, homogenizator komórkowy isobiotec	Wirówka stołowa Isobiotec
Vortexer	Fisher Scientific	2215365
, Eppendorf 5418 R	5401000013		Eppendorf
, VWR Clinical 50	VWR Polska	82013-800
Mikroskop preparacyjny, Fluorometr Leica M80	Leica Microsystems
żelowego Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866,
iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
System żelowy	ThermoFisher Scientific
Blok grzewczy	VWR International	12621-048
Mikrowirówki, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
		Integra	Integra
L-1000 XLS+, Pipeta 17014382 Pipet-Lite LTS	Rainin
L-10 XLS+, Pipeta	17014388		Rainin
L-200 XLS+, Pipeta	17014391		Rainin
L-20 XLS+, Pipeta do 17014392			Rainin
Platforma wahadłowa	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010