Izolacja aktywnego ekstraktu jądrowego Caenorhabditis elegans i rekonstytucja do transkrypcji in vitro

Podsumowanie

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji aktywnego ekstraktu jądrowego z larwalnego stadium 4 C. elegans i wizualizacji aktywności transkrypcyjnej w systemie in vitro.

Streszczenie

Caenorhabditis elegans jest ważnym modelowym systemem dla badań biologicznych od czasu jego wprowadzenia w 1963 roku. Jednak C. elegans nie został w pełni wykorzystany w biochemicznych badaniach reakcji biologicznych z wykorzystaniem jego ekstraktów jądrowych, takich jak transkrypcja in vitro i replikacja DNA. Istotną przeszkodą w wykorzystaniu C. elegans w badaniach biochemicznych jest przerwanie grubego zewnętrznego naskórka nicienia bez poświęcania aktywności ekstraktu jądrowego. Chociaż do przerwania naskórka stosuje się kilka metod, takich jak homogenizacja Dounce lub sonikacja, często prowadzą one do niestabilności białka. Nie ma ustalonych protokołów izolowania aktywnych białek jądrowych od larw lub dorosłych C. elegans w reakcjach in vitro. W tym miejscu protokół szczegółowo opisuje homogenizację C. elegans w stadium larwalnym 4 za pomocą homogenizatora Balch. Homogenizator Balch wykorzystuje nacisk, aby powoli przepchnąć zwierzęta przez wąską szczelinę, łamiąc w ten sposób naskórek. Jednolita konstrukcja i precyzyjna obróbka homogenizatora Balch pozwalają na równomierne mielenie zwierząt między eksperymentami. Frakcjonowanie homogenatu uzyskanego z homogenizatora Balch daje funkcjonalnie aktywny ekstrakt jądrowy, który można zastosować w metodzie in vitro do oznaczania aktywności transkrypcyjnej C. elegans.

Wprowadzenie

Mały, wolno żyjący nicień Caenorhabditis elegans jest prostym, ale potężnym organizmem modelowym do rozwiązywania szerokiego zakresu zagadnień biologicznych. Od czasu wprowadzenia na rynek w 1963 roku, nicienie były nieocenione w odpowiadaniu na pytania z zakresu neurobiologii, metabolizmu, starzenia się, rozwoju, odporności i genetyki¹. Niektóre z wielu cech zwierzęcia, które czynią je idealnym organizmem modelowym, obejmują krótki czas generacji, skuteczność interferencji RNA, przezroczyste ciało oraz ukończone mapy zarówno jego linii komórkowej, jak i układu nerwowego.

Chociaż wkład nicieni w naukę jest ogromny, nie został on wykorzystany do wyjaśnienia systemu transkrypcji eukariotycznej, a większość naszej wiedzy na temat tych mechanizmów pochodzi z badań z wykorzystaniem ekstraktu jądrowego z drożdży, muszki owocowej i hodowli komórek ssaków². Największą przeszkodą, która zniechęca naukowców do ekstrakcji funkcjonalnego ekstraktu jądrowego, jest twardy zewnętrzny naskórek nicienia. Ten egzoszkielet składa się z usieciowanych kolagenów, kutykin, glikoprotein i lipidów, dzięki czemu C. elegans od stadium larwalnego do dorosłości jest odporny na ekstrakcję białek za pomocą sił chemicznych lub mechanicznych³. System transkrypcji in vitro wykorzystujący ekstrakt jądrowy C. elegans został kiedyś opracowany, ale nie został powszechnie przyjęty ze względu na ograniczony zakres systemu, a użycie homogenizatora Dounce do przygotowania ekstraktu może prowadzić do niestabilności białka^4,5.

W przeciwieństwie do poprzedniego protokołu izolacji ekstraktu jądrowego, który wykorzystywał homogenizator Dounce do rozbijania C. elegans, ten protokół wykorzystuje homogenizator Balch. Homogenizator Balch składa się z dwóch głównych elementów: kulki z węglika wolframu i bloku ze stali nierdzewnej z kanałem przewierconym z jednego końca na drugi. Homogenizator Balch jest załadowany kulką z węglika wolframu i zaślepiony po obu stronach w celu uszczelnienia komory mielenia. Strzykawki można ładować na dwa pionowe porty prowadzące do komory mielenia. Gdy materiał jest przenoszony z jednej strzykawki do drugiej przez komorę mielenia, ciśnienie ze strzykawek przepycha materiał przez wąską szczelinę między kulką a ścianką komory. Ten powolny i stały nacisk rozbija materiał, aż osiągnie stały rozmiar, który jest w stanie łatwo przejść przez wąską szczelinę. Przepychanie C. elegans przez wąską szczelinę poprzez stały, ale delikatny nacisk rozbija zwierzęta, uwalniając ich zawartość do otaczającego bufora. Zmiana rozmiarów kulek jeszcze bardziej zacieśnia szczelinę, rozbijając nowo uwolnione komórki i uwalniając jądra do bufora. Wielokrotne wirowanie oddziela jądra od reszty szczątków komórkowych, co pozwala na zebranie czystego ekstraktu jądrowego. Homogenizator Balch jest preferowany w stosunku do homogenizatora Dounce z kilku powodów: system może obsłużyć dużą liczbę zwierząt, dzięki czemu możliwe jest wyekstrahowanie dużej ilości aktywnych białek za jednym razem; Precyzyjna obróbka kulek i bloku stalowego pozwala na równomierne mielenie między wieloma próbkami; Ciężki stalowy blok działa jak radiator, równomiernie odprowadzając ciepło z komory mielenia, zapobiegając denaturacji.

Po izolacji, aktywność transkrypcyjna ekstraktu jądrowego musi zostać zweryfikowana przed użyciem w jakichkolwiek eksperymentach biochemicznych. Tradycyjnie, aktywność transkrypcyjną mierzono za pomocą znakowanych radioaktywnie nukleotydów do śledzenia i wizualizacji nowo zsyntetyzowanego RNA. Jednak etykietowanie radioaktywne może być uciążliwe, ponieważ wymaga ostrożności podczas użytkowania i usuwania⁶. Postęp technologiczny pozwala dziś naukowcom na stosowanie znacznie mniej szkodliwych lub kłopotliwych metod pomiaru nawet małych ilości RNA przy użyciu technik takich jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)⁷. W tym przypadku protokół opisuje metodę izolowania aktywnego ekstraktu jądrowego z larwalnego stadium 4 (L4) C. elegans i wizualizacji aktywności transkrypcyjnej w systemie in vitro.

Protokół

1. Przygotowanie mediów

1. Przygotuj sterylne płytki agarowe bulionu lizogenicznego (LB) i płynne podłoże zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Smuga szczepu Escherichia coli (E. coli) OP50 na płytce agarowej LB. Inkubować smugę bakterii w temperaturze 37 °C przez noc.
3. Po inkubacji przechowywać płytkę paskową E. coli OP50 w temperaturze 4 °C. Płytka E. coli OP50 może być bezpiecznie przechowywana w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie, jeśli jest owinięta w parafilm, aby zapobiec utracie wilgoci.
4. Przygotować 2 l pożywki dla nicieni (NGM), korzystając z przepisu podanego w tabeli 1.
   UWAGA: Nystatyna jest opcjonalna. Nystatyna pomaga zapobiegać rozwojowi pleśni i innych zanieczyszczeń grzybiczych na płytkach NGM. Duże płytki o średnicy 150 mm mają większą szansę na złapanie zarodników grzybów, gdy pokrywka jest zdejmowana w celu nalewania i wysiewu E. coli OP50. Nystatynę można kupić wstępnie zmieszaną w sterylnym roztworze od dostawców w ilości 10 000 jednostek/ml lub można ją kupić w postaci sterylnego proszku i zmieszać ze sterylną wodą. Nystatyna nie może być sterylizowana w autoklawie, ani nie może być skutecznie sterylizowana filtracyjnie. Uwaga na technikę aseptyczną ma kluczowe znaczenie podczas mieszania roztworu nystatyny w laboratorium. Autoklaw 1 M CaCl₂, 1 M KPO₄ pH 6,0 i 1 M_MgSO4 w temperaturze 121 °C przez 15 min. Filtr sterylizuje cholesterol przez filtr 0,22 μm po rozpuszczeniu w 95% etanolu.
5. Po dodaniu odczynników do pożywki wlać NGM do czterdziestu szalek Petriego o średnicy 150 mm. Do napełnienia każdej naczynia o średnicy 150 mm wymagane jest 50 ml. Pozostaw płytki NGM do ostygnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.
6. Zaszczepić dwie stożkowe probówki o pojemności 50 ml zawierające 25 ml sterylnego LB bakterią E. coli OP50 z poprzedniej płytki z paskami. Inkubować bulion w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w inkubatorze z wytrząsaniem utrzymywanym z prędkością 200 obr./min.
   UWAGA: Aby uzyskać spójność, zaszczep obie probówki tą samą pojedynczą kolonią z płytki smugowej. Jeśli okaże się to trudne, należy zaszczepić 5 ml sterylnego LB pojedynczą kolonią w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i inkubować kulturę przez 16 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem utrzymywanym z prędkością 200 obr./min na dzień przed przygotowaniem płytek NGM. Świeżą płynną kulturę kultury należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch dni. Zaszczepić dwa 25 ml bulionu 25 μl płynnej kultury i inkubować w tych samych warunkach, jak wspomniano powyżej.
7. Wysiewaj świeże płytki NGM 1 ml świeżej płynnej kultury E. coli OP50 i rozprowadź za pomocą sterylizowanego płomieniowo rozsiewacza równomiernie na powierzchni płytki aseptycznie, aby stworzyć duży trawnik bakteryjny, który pokrywa większość płytki, uważając, aby nie rozprzestrzeniać bakterii od krawędzi do krawędzi. Pozwól E. coli OP50 rosnąć w temperaturze pokojowej przez 72-96 godzin lub do momentu, gdy pojawi się widocznie gęsty trawnik.
   UWAGA: Po 24 godzinach przenieś świeżo wysiane płytki NGM do zakrytego pojemnika, aby zmniejszyć utratę wilgoci i przedłużyć żywotność płytek.

2. Preparaty zwierzęce i synchronizacja wybielacza

1. Przenieś 5 dobrze odżywionych, dzikich typów, ciężarnych dorosłych C. elegan na każdą z 10 świeżych płytek NGM obsianych E. coli OP50, co daje w sumie 50 zwierząt.
2. Pozwól zwierzętom złożyć jaja. Pozwól potomstwu rosnąć w temperaturze 20 °C, aż osiągnie dojrzałe stadium ciężaru.
3. Użyj 15 ml buforu M9 (Tabela 2), aby zebrać nowe, dobrze odżywione, grawitacyjne dorosłe osobniki typu dzikiego z dziesięciu płytek podtrzymujących i przenieść zwierzęta do oznakowanej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
4. Odwirować zwierzęta przy 1,000 x g przez 3 minuty, aby wszystkie zwierzęta zostały ogranulowane na dnie probówki.
5. W oddzielnej, znakowanej stożkowej probówce o pojemności 15 ml wymieszaj 2 ml wybielacza z 5 ml 1 N NaOH w celu synchronizacji wybielacza. Odwiruj roztwór, aby dokładnie wymieszać.
   UWAGA: Użyj roztworu wybielacza + NaOH tego samego dnia, w którym jest przygotowany, aby był skuteczny.
6. Delikatnie usunąć sklarowany osad z odwirowanych zwierząt za pomocą sterylnej pipety o pojemności 10 ml. Spróbuj usunąć jak najwięcej bufora M9, aby poprawić rozbijanie zwierząt.
7. Dodaj 500 μl roztworu wybielacza + NaOH do granulki zwierzęcej i uruchom minutnik na 4 minuty.
8. Ręcznie lub za pomocą kołyski delikatnie kołysz rurką, aby całkowicie rozbić granulki zwierzęce i pozwól zwierzętom swobodnie poruszać się w roztworze wybielacza + NaOH. Kontynuuj kołysanie rurką przez całe 4 minuty.
   UWAGA: Potrzebna ilość roztworu wybielacza + NaOH może się różnić w zależności od wielkości synchronizowanego granulatu zwierzęcego. Zoptymalizuj tę technikę wcześniej z różnymi ilościami zwierząt i roztworem wybielacza + NaOH.
9. Po 4 minutach sprawdzić skuteczność łamania pod mikroskopem preparacyjnym. Upewnij się, że większość ciężarnych dorosłych zwierząt jest rozbita, a ich wewnętrzna zawartość, w tym jaja, została uwolniona.
10. Jeśli zwierzęta nie są rozszczepione, na krótko obróć rurkę z maksymalną prędkością, a następnie sprawdź ponownie pod mikroskopem.
    UWAGA: Chociaż jaja są odporne na roztwór wybielacza + NaOH, nie są nieprzepuszczalne. Jaja nie mogą być wystawione na działanie roztworu wybielacza + NaOH dłużej niż jest to konieczne. Zbyt długie zwlekanie podczas etapu łamania zwierzęcia może prowadzić do problemów rozwojowych u potomstwa.
11. Dodać 10 ml buforu M9 do rozdrobnionego roztworu zwierzęcego.
12. Odwirować jaja i resztki w temperaturze 1 000 x g przez 3 minuty.
13. Odpipetować supernatant, uważając, aby nie dotknąć nowej osadki zawierającej wszystkie jaja znajdujące się na dnie probówki.
14. Dodać kolejne 10 ml buforu M9 i ponownie odwirować przez 3 minuty przy 1,000 x g.
15. Powtórz kroki 2.13-2.14 jeszcze dwa razy, aby upewnić się, że nie pozostał żaden roztwór wybielacza + NaOH.
16. Po trzecim przemyciu buforem M9 usunąć supernatant i dodać 10 ml buforu S-bazowego (Tabela 2).
17. Odwróć rurkę, aby rozbić osad na dole, aby równomiernie zawiesić jaja w buforze.
18. Umieścić probówkę na kołysce i delikatnie kołysać rurkę przez 22 godziny w temperaturze 20 °C, aby jaja mogły się wykluć i osiągnąć zatrzymanie larw w stadium 1 (L1).
19. Po 22 godzinach odwirować probówkę zawierającą zsynchronizowane zwierzęta L1 przez 3 minuty przy 1000 x g.
20. Odpipetować i odrzucić sklarowany nad osadem, pozostawiając w probówce około 1 ml buforu.
21. Za pomocą mikropipety rozbić osad zwierzęcy, aby uzyskać jednorodną zawiesinę zwierząt L1 w pozostałym buforze.
22. Przenieść pojedynczą kroplę jednorodnej zawiesiny zwierząt L1 na oznakowaną płytkę NGM o średnicy 150 mm wysianą E. coli OP50.
23. Oblicz zagęszczenie zwierząt na kroplę, wizualnie licząc liczbę zwierząt L1 na kroplę za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Płyta NGM o średnicy 150 mm z w pełni wyrośniętym trawnikiem E. coli OP50 może utrzymać do 500 zwierząt w stadium L1, aby osiągnąć stan ciężkości dorosłej.
24. Przenieś zwierzęta L1 na sześć płytek NGM o średnicy 150 mm z E. coli OP50. Upewnij się, że nie przeciążasz płyty.
    UWAGA: Jeśli nie jest jasne, czy zwierzęta będą miały wystarczającą ilość pożywienia do rozwoju między L1 a dorosłym osobnikiem, dodaj mniej zwierząt do każdego talerza i użyj więcej talerzy.
25. Pozwolić zwierzętom rosnąć przez 72 godziny w temperaturze 20 °C, aż osiągną stan ciężkości i zaczną składać jaja.
26. Wykonaj drugą rundę synchronizacji wybielacza na zsynchronizowanych, dobrze odżywionych dorosłych zwierzętach gravid typu dzikiego.
27. Umieść zsynchronizowane zwierzęta L1 na dziesięciu 150-milimetrowych płytkach NGM wysianych E. coli OP50, po około 1000 zwierząt na płytkę.
28. Pozwól nowym zsynchronizowanym zwierzętom L1 rosnąć przez 48 godzin w temperaturze 20 °C, aż osiągną stadium L4.
    UWAGA: Celem jest uzyskanie około 700 - 800 μL granulatu zwierząt L4. Zbyt duża liczba zwierząt może utrudnić korzystanie z homogenizatora Balch; Może to prowadzić do nadwyrężenia mięśni podczas pracy homogenizatora i możliwego wycieku ze strzykawek z powodu zwiększonego ciśnienia.

3. Przygotowanie homogenizatora Balch

1. Przygotować zarówno hipotoniczne, jak i hipertoniczne, jak podano w Tabeli 3 i Tabeli 4.
   UWAGA: hipotoniczne i hipertoniczne można przygotować z wyprzedzeniem i bezpiecznie przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Wyczyść homogenizator Balch, zalewając komorę mielenia 70% etanolem, a następnie przepłucz komorę wodą dejonizowaną, aby usunąć nadmiar etanolu.
   UWAGA: Unikaj używania jakichkolwiek środków do czyszczenia homogenizatora Balch. Dokładne spłukanie etanolem i wodą dejonizowaną powinno wystarczyć do jego oczyszczenia.
3. Włóż kulkę z węglika wolframu o średnicy 7,9820 mm (odstęp 18 μm) do komory mielenia.
4. Zakręć każdy koniec cylindra homogenizatora Balch i zabezpiecz nakrętki dostarczonymi skrzydełkowymi.
5. Przygotować 5 ml "kompletnego buforu hipotonicznego" na próbkę: dodać 5 μl 1 M DTT (stężenie końcowe: 1 mM DTT) i 100 μl 100x inhibitora proteazy, koktajlu jednorazowego użytku (końcowe stężenie: 2x). Utrzymuj bufor na lodzie.
6. Przygotować 5 ml "kompletnego buforu hipertonicznego" na próbkę: dodać 5 μl 1 M DTT (stężenie końcowe: 1 mM DTT) i 100 μl 100x inhibitora proteazy, koktajlu jednorazowego użytku (stężenie końcowe: 2x). Utrzymuj bufor na lodzie.
   UWAGA: Kompletny bufor hipotoniczny i hipertoniczny należy zużyć tego samego dnia przygotowania. Nie przechowuj go do późniejszego wykorzystania. Przechowywać 1 M DTT w postaci jednorazowych podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Przechowywać jednorazowy koktajl inhibitora proteazy w temperaturze 4 °C.
7. Napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 2 ml 1 ml "kompletnego buforu hipotonicznego" i delikatnie przepłukać komorę mielenia homogenizatora Balch. Pozostawić w komorze około 500 μl "pełnego buforu hipotonicznego".
8. Przepłukany homogenizator należy przechowywać na lodzie i pozostawić do ostygnięcia przez 30 min.
   UWAGA: Homogenizator musi być lodowaty przed zmieleniem zwierząt. Proces mielenia może wytwarzać ciepło w wyniku tarcia i denaturować białka jądrowe. Upewnij się, że metalowy homogenizator jest lodowaty, aby temu zapobiec. Należy uważać, aby woda z otaczającego lodu nie dostała się do homogenizatora. Użyj dwóch sterylnych strzykawek, aby zatkać otwory w homogenizatorze i zablokować przedostawanie się niezamierzonych płynów do komory mielenia.

4. Kolekcja zwierząt

UWAGA: Dostępny jest krótki przewodnik, oznaczający główne kroki do zbierania, rozbijania i frakcjonowania zwierząt (Rysunek 1).

1. Zebrać dobrze odżywione zwierzęta L4 z buforem M9 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować zwierzęta przy 1000 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant i kontynuować mycie osadu zwierzęcego, aż supernatant będzie klarowny.
2. Umyć zwierzęta 3 ml buforu hipotonicznego o temperaturze 4 °C i ponownie odwirować przy 1000 x g przez 3 min.
   UWAGA: Podczas końcowego mycia buforem hipotonicznym o temperaturze 4 °C zwierzęta mogą przykleić się do boku rurki. Jest to normalne i może spowodować niewielką utratę zwierząt podczas usuwania supernatantu.
3. Usunąć bufor hipotoniczny i dodać 1 ml "pełnego buforu hipotonicznego" do osadu zwierzęcego. Przenieść zawiesinę zwierzęcą do nowej sterylnej strzykawki o pojemności 2 ml.
   UWAGA: Podczas przenoszenia zwierząt do strzykawki za pomocą mikropipety, należy delikatnie odpipetować sterylny 0,1% roztwór Tween20, aby pokryć wnętrze końcówki pipety, aby zmniejszyć liczbę zwierząt utraconych w wyniku przyklejenia się do ścianek końcówki pipety.

5. Frakcjonowanie

1. Na lodzie homogenizować zwierzęta, delikatnie przepychając je przez komorę mielenia homogenizatora Balch załadowanego kulką o średnicy 7,9820 mm i do nowej sterylnej strzykawki. Powtórz przepychanie zwierząt przez komorę mielenia przez 30 pełnych cykli.
   UWAGA: "Pełny cykl" definiuje się jako całkowity ruch tłoka strzykawki w górę i w dół.
   Ten etap szlifowania wykorzystuje kulkę 7,9820 mm (łożysko kulkowe 18 μm).
2. Po 30 cyklach należy usunąć jak najwięcej zawiesiny zwierzęcej z homogenizatora Balch i przechowywać strzykawkę w mikroprobówce o pojemności 1,7 ml (końcówką do dołu).
3. Wyjmij kulę o średnicy 7.9820 mm z komory mielenia i wyczyść ją wodą dejonizowaną. Wysuszyć i umieścić piłkę z powrotem w oznaczonej tubie.
4. Włóż kulkę o średnicy 7,9880 mm (odstęp 12 μm) do komory mielenia i ponownie zamknij homogenizator.
5. Ponownie przepłukać komorę mielenia 1 ml lodowatego "kompletnego buforu hipotonicznego".
6. Miel zawiesinę przez 25 pełnych cykli.
7. Po 25 cyklach usuń zawiesinę zwierzęcą z homogenizatora Balch, przenieś zawiesinę do czystej mikroprobówki o pojemności 1,7 ml i przechowuj ją na lodzie.
   UWAGA: Zdemontuj i wyczyść homogenizator Balch 70% etanolem i wodą dejonizowaną. Upewnij się, że kula o średnicy 7,9880 mm została umieszczona z powrotem w odpowiedniej rurze.
8. Ciała zwierząt i szczątki osadzać przez odwirowanie zawiesiny w temperaturze 500 x g, 4 °C przez 5 minut.
9. Pobrać pipetą 40 μl supernatantu do probówki z napisem "frakcja wejściowa" i przechowywać na lodzie.
   UWAGA: Napisz wszystkie etykiety pisakiem nasączonym alkoholem, aby uniknąć ich późniejszego rozmazania.
10. Przenieść pozostały supernatant do nowej probówki o pojemności 1,7 ml, uważając, aby nie dotknąć osadu na dnie probówki, a następnie wyrzucić osad
.
11. Odwirować supernatant w celu osadzenia jąder w temperaturze 4 000 x g, 4 °C przez 5 minut.
12. Przenieść supernatant, uważając, aby nie naruszyć granulowanych jąder, do nowej probówki o pojemności 1,7 ml i oznaczyć probówkę jako "frakcję cytozolową".
    UWAGA: Odwirować frakcję cytozolową dalej w temperaturze 17 000 x g, 4 °C przez 30 minut, aby usunąć pozostały nierozpuszczalny materiał i użyć go jako kontroli ujemnej dla western blot (szczególnie dla białek jądrowych).
13. Przepłukać osad jądrowy 500 μl "pełnego buforu hipotonicznego" i przenieść osad do nowej probówki o pojemności 1,7 ml. Odwirować zawieszony osad w temperaturze 4 000 x g, 4 °C przez 5 min.
14. Odrzucić supernatant i dodać 500 μl świeżego "kompletnego buforu hipotonicznego" do osadu jądrowego i przenieść zawiesinę do nowej probówki o pojemności 1,7 ml. Ponownie odwirować próbkę w temperaturze 4 000 x g, w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
15. Usunąć supernatant i rozpuścić osad w 40 μl "kompletnego buforu hipertonicznego". Przenieś nową zawiesinę jądrową do nowej probówki o pojemności 1,7 ml, oznacz probówkę jako "frakcję jądrową" i przechowuj ją na lodzie.
16. Oznaczyć stężenie białka w trzech frakcjach za pomocą fluorescencyjnego zestawu do oznaczania ilościowego.
    UWAGA: Ilość białka jądrowego uzyskanego tą metodą może wynosić od 1-2 μg/μL.
17. Podwielokrotność frakcji jądrowych rozmieścić w jednorazowych probówkach zawierających 6 μg białka jądrowego i zamrozić w kąpieli z suchym lodem i etanolem. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

6. Test transkrypcji

1. Włącz i podgrzej blok grzewczy do 30 °C.
2. Usunąć następujące elementy z systemu transkrypcji in vitro Nulcear Extract: 50 mM MgCl₂, Nuclear Extract 1x Transcription Buffer, 100 mM rATP, 100 mM rCTP, 100 mM rGTP, 100 mM rUTP i matryca kontroli dodatniej promotora CMV. Rozmrozić na lodzie.
   UWAGA: Amplifikuj matrycę DNA kontroli dodatniej za pomocą polimerazy o wysokiej wierności i przechowuj ją jako znormalizowane podwielokrotności jednorazowego użytku.
3. Wymieszaj i odwiruj rozmrożone rNTP przed przygotowaniem 10 mM roztworu roboczego.
   UWAGA: Dodaj po 2 μl każdego rATP, rCTP, rGTP i rUTP do 12 μl H₂O, aby uzyskać 10 mM każdego rNTP. W razie potrzeby kompozycję tę można zwiększyć w górę.
4. Mieszaninę rNTP należy rozmieścić w oznakowanych probówkach jednorazowego użytku i przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
5. W świeżej probówce o pojemności 1,5 ml oznaczonej "Mastermix" dodać odczynniki do każdej reakcji, jak podano w Tabeli 5
6. Przenieść 14 μl Mastermixu do każdej probówki reakcyjnej
7. Dodać 11 μl minus (objętość na 5 μg ekstraktu jądrowego) 1x buforu transkrypcyjnego do każdej probówki reakcyjnej.
8. Dodać 5 μg ekstraktu jądrowego do każdej probówki reakcyjnej.
9. Delikatnie postukaj w probówkę reakcyjną, aby wymieszać zawartość w środku, a po wymieszaniu odwiruj pulsacyjnie probówki, aby upewnić się, że żaden materiał reakcyjny nie przykleił się do ścianki probówek.
10. Inkubować reakcje w temperaturze 30 °C przez 30 minut.
11. Natychmiast zatrzymaj reakcję, dodając 400 μl buforu RLT dostarczonego przez zestaw do ekstrakcji RNA.
    UWAGA: W tym momencie można bezpiecznie przestać. Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego czyszczenia za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA.

7. Czyszczenie RNA

1. Przygotuj roztwór podstawowy DNazy I, używając zestawu DNazy wolnego od RNaz dostarczonego w zestawie do ekstrakcji RNA. Rozpuść liofilizowaną DNazę I w 550 μl wody wolnej od RNaz. Delikatnie wymieszaj roztwór. Nie wirować. Podwielokrotność roztworu DNazy I rozlać do jednorazowych probówek o pojemności 10 μl i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
2. Przygotuj 70% i 80% etanol, używając etanolu o jakości cząsteczkowej i wody wolnej od RNaz.
3. Przed rozpoczęciem czyszczenia przenieś próbki i odczynniki do obszaru roboczego wolnego od RNaz.
4. Dodaj 400 μl 70% etanolu do każdej próbki i delikatnie odpipetuj do dobrego wymieszania.
5. Przenieść 400 μl próbki do znakowanej kolumny wirowej do ekstrakcji RNA z probówką zbiorczą o pojemności 2 ml i odwirować próbkę przy 8 500 x g przez 30 s. Odrzucić przepływ.
6. Powtórzyć krok 7.5 z pozostałą próbką i odrzucić przepływ.
7. Dodać 350 μl buforu RW1 (zestaw do ekstrakcji RNA) do każdej kolumny. Odwirować kolumny przy 8 500 x g przez 30 s. Odrzuć przepływ.
8. Dodać 70 μl buforu RDD (zestaw do ekstrakcji RNA) do pojedynczej 10 μl podwielokrotności roztworu podstawowego DNazy I i delikatnie wymieszać. Nie wirować.
9. Dodać mieszaninę inkubacyjną DNazy I (80 μl) bezpośrednio do membrany kolumny wirowej. Inkubować kolumny w temperaturze pokojowej przez 15 min.
   UWAGA: Pamiętaj, aby dodać roztwór DNazy I do membrany. Unikaj utraty części roztworu na ściankę kolumny lub O-ring.
10. Po 15 minutach dodać do kolumn 350 μl buforu RW1. Wirować przez 30 s przy 8 500 x g. Odrzuć przepływ.
11. Umieścić kolumny w nowych probówkach zbiorczych o pojemności 2 ml. Dodać 500 μl buforu RPE (zestaw do ekstrakcji RNA) do kolumny wirowej. Odwirować kolumny przy 8 500 x g przez 30 sekund w celu przepłukania membrany. Odrzuć przepływ.
12. Dodać 500 μl 80% etanolu do każdej kolumny i odwirować kolumny przy 8 500 x g przez 30 s. Wyrzucić przepływ.
13. Umieścić kolumny w nowych probówkach zbiorczych o pojemności 2 ml. Pozostawiając otwarte pokrywy kolumn, odwirować kolumny przy sile 17 900 x g przez 5 minut. Odrzuć przepływ.
14. Umieść kolumny w oznaczonych probówkach o pojemności 1,7 ml. Dodaj 17 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio do środka membrany kolumny wirowej. Pozostaw kolumny w temperaturze pokojowej na 1 minutę. Odwirować kolumny przy 17 900 x g przez 1 min.
15. Wyrzucić kolumnę i zachować probówkę o pojemności 1,7 ml ze świeżo oczyszczoną próbką RNA.

8. Trawienie DNA

1. Rozgrzej dwa bloki grzewcze w temperaturze 37 °C i 65 °C.
2. Dodać 2 μl 10x buforu reakcyjnego do każdej próbki.
3. Dodać 1 μl (1 MBU) DNazy do każdej próbki.
4. Ustaw pipetę na 10 μl i pipetuj nowy roztwór w górę i w dół, aby delikatnie wymieszać. Nie wirować.
5. Próbki RNA należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu strawienia pozostałego DNA.
6. Dezaktywować DNazę przez inkubację próbek w bloku grzewczym w temperaturze 65 °C przez 10 min.
   UWAGA: Bezpiecznie jest zatrzymać się na tym etapie i przechowywać RNA w temperaturze -80 °C, aby później przeprowadzić odwrotną transkrypcję.

9. Odwrotna transkrypcja

1. Podczas programowania termocyklera dodaj dodatkowy krok 1 godzina, 37 °C przed inkubacją, aby wstępnie podgrzać termocykler. Uruchom program z "etapem podgrzewania" podczas przygotowywania próbek i pozwól termocyklerowi osiągnąć temperaturę 37 °C. Gdy próbki do odwrotnej transkrypcji są gotowe, należy pominąć etap podgrzewania wstępnego w temperaturze 37 °C i przejść do właściwego etapu inkubacji (tabela 6). Jeśli termocykler nie jest wyposażony w funkcję pomijania, przed inkubacją dodaj krok 1 min 37 °C. Poczekaj, aż termocykler nagrzeje się do odpowiedniej temperatury przed zatrzymaniem systemu i dodaniem przygotowanych próbek.
2. Przygotować 10 μM roztwór roboczy startera odwrotnego do transkrypcji w H_2Owolnym od RNaz i przechowywać go na lodzie.
3. Rozmrozić na lodzie, 10-krotny bufor z zestawu do odwrotnej transkrypcji, mieszanka dNTP (po 5 mM każdy dNTP), inhibitor RNazy i odwrotna transkryptaza.
4. Przygotować Mastermix (na reakcję), dodając składniki wymienione w tabeli 7 do czystej probówki PCR o pojemności 0,2 ml.
5. Porcję 18 μl Mastermixu do nowych probówek PCR o pojemności 0,2 ml dla każdej próbki.
6. Dodaj 2 μl RNA poddanego działaniu DNazy dla każdej próbki do odpowiednio znakowanych probówek.
7. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w nagrzanym termocyklerze.
8. Przenieść próbki do temperatury -20 °C w celu przechowywania po odwrotnej transkrypcji lub przejść bezpośrednio do następnego etapu.
   UWAGA: Zatrzymanie się na tym kroku jest bezpieczne; przechowywać cDNA w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.

10. Specyficzne wzmocnienie produktu

1. Rozmrażanie na lodzie: cDNA, startery 10 μM transkrypcji do przodu i 10 μM transkrypcji odwrotnej oraz premiks PCR 2x A.
   UWAGA: Podatkować premiks PCR 2x A na mniejsze objętości, aby skrócić czas rozmrażania.
2. Utworzyć Mastermix (na reakcję), dodając składniki wymienione w tabeli 8 do czystej probówki PCR o pojemności 0,2 ml.
3. Porcję 24 μl Mastermix dla każdej próbki rozlać na czysto, oznakowane probówki PCR o pojemności 0,2 ml.
4. Dodaj 1 μl cDNA z każdej próbki do odpowiednich probówek.
5. Inkubować próbki w termocyklerze, stosując warunki programu wymienione w tabeli 9
6. Po inkubacji produkty PCR należy przechowywać w temperaturze 4 °C lub -20 °C w celu dłuższego przechowywania.

11. Analiza żelu

1. Użyj 1x buforu TAE do przygotowania żelu, który zawiera 2% w/v agarozy i 1x barwnik żelowy.
2. Uruchom produkty PCR przy napięciu 50 V i natężeniu 300 mA przez 1 godzinę lub do momentu, gdy nastąpi wyraźna separacja pasm.
3. Zobrazuj żel za pomocą automatycznego programu do naświetlania wstępnie załadowanego do naświetlania żelu.

Wyniki

Postępowanie zgodnie z opisanymi krokami powinno dać funkcjonalny ekstrakt jądrowy (Rysunek 1)), odchylenie w etapach mielenia lub mycia może prowadzić do słabej aktywności lub niskiej wydajności. Jeśli otrzymany zostanie funkcjonalny ekstrakt jądrowy C. elegans, po dodaniu do wcześniej opisanego testu in vitro dokona on transkrypcji regionu za promotorem CMV na matrycy DNA. Powstały transkrypt RNA można oczyścić z białek jądrowych i matrycy DNA przy...

Dyskusja

C. elegans jest atrakcyjnym organizmem modelowym do badania eukariotycznego systemu transkrypcji ze względu na jego niskie koszty utrzymania i łatwość manipulacji genetycznej. W tym miejscu opisano protokół konsekwentnej izolacji funkcjonalnie aktywnego ekstraktu jądrowego z L4 C. elegans . Chociaż protokół ten koncentrował się na wizualizacji aktywności transkrypcyjnej, cDNA wytwarzane po transkrypcji można określić ilościowo za pomocą RT-qPCR w celu uzyskania bardziej precyzyjnego pomiaru aktywności t...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiały eksploatacyjne i odczynniki
0,2 ml 8-paskowe probówki i odczynniki Nakrętki z płaskim paskiem, przezroczyste	Genesee Scientific	24-706
0,2 ml Indywidualne probówki do PCR	Genesee Scientific	24-153G
1,7 ml sterylne mikroprobówki	Genesee Scientific	24-282S
100% absolutny etanol klasy molekularnej	Fisher Scientific	BP2818
100% etanol, Koptec	Decon Labs	Pipeta serologiczna V1001
10 ml	VWR international	89130-898
Płytki Petriego 150 mm	Tritech Research	T3325
15 ml stożkowe probówki wirówkowe	Genesee Scientific	28-103
Plastikowe strzykawki 20 ml	Fisher Scientific 14955460
Strzykawki 2 ml Norm-Ject	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 ml próżniowy kubek filtracyjny 0,22 i mikro; m PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 ml stożkowe probówki wirówkowe	ThermoFisher Scientific	339652
50 ml pipeta serologiczna	VWR international	89130-902
Pipeta serologiczna 5 ml	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agaroza	Denville Scientific	CA3510-6
Marker alkoholowy	VWR International	52877-310
Pepton baktonowy	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Dichlorek wapnia	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Kontrolne startery do klonowania skroni DNA, do przodu 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3'
Kontroluj spłonki klonowania świątyń DNA, Naprzód 5'- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3'
Woda
Ditiothreitol	Invitrogen	15508-013
Barwnik żelowy DNA, bezpieczny dla SYBR	Invitrogen	S33102
Mieszanka drabinkowa DNA, O' władca genów	Fisher Scientific	SM1173
Barwnik ładujący DNA, 6x TriTrack	Fisher Scientific
DNaza, linia bazowa-ZERO	Lucigen
Suchy lód
Escherichia coli Szczep OP50	CGC	OP50
Lodowaty kwas octowy	Fisher Scientific	A38
Glicerol	Millipore Sigma	G6279
System transkrypcji ekstraktu jądrowego HeLa in vitro, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Kwas solny 37%	Millipore Sigma	P0662
Wybielacz podchlorynowy	Clorox
LB Rosół	Millipore Sigma	L3022
Dichlorek magnezu	Millipore Sigma	M8266
Siarczan magnezu	Millipore Sigma	M7506
Naczynia o średniej wadze	Fisher Scientific	02-202-101
szkiełka mikroskopowe, Vista vision	VWR International	16004-368
woda molekularna,	Hypure Hyclone Laboratories
Nystatyna	Millipore Sigma	System N1638
PCR, FailSafe z premiksem A	Lucigen
Chlorek potasu	Millipore Sigma	P39111
Fosforan potasu dwuzasadowy	Millipore Sigma	P3786
Fosforan potasu jednozasadowy	Millipore Sigma	P0662
Inhibitor proteazy, jednorazowy koktajl Halt 100x	ThermoFisher Scientific	78430
, Qubit	ThermoFisher Scientific	Zestaw do odwrotnej transkrypcji Q33211
Sensiscript	Qiagen	205211
zestaw mikro RNeasy	Qiagen	74004
Inhibitor RNazy	Applied Biosystems
Chlorek sodu	VWR International	BDH9286-12KG
Wodorotlenek sodu	Millipore Sigma	1-09137
Sterylny filtr strzykawkowy z 0,2 i mikro; m Membrana polieterosulfonowa	VWR international	28145-501
Sacharoza	VWR International	200-334-9
startery transkrypcyjne, naprzód 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3'
startery do transkrypcji, odwrócone 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3'
Tris-Base	Fisher Naukowy	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Sprzęt
-20 ° Inkubator C	ThermoFisher Scientific
20 ° Inkubator C	ThermoFisher Scientific
37 ° Inkubator C	Forma Scientific
4 ° C lodówka	ThermoFisher Scientific-80
° C zamrażarka	Autoklaw Eppendorf
Homogenizator	Sanyo
Balch, homogenizator komórkowy isobiotec	Wirówka stołowa Isobiotec
Vortexer	Fisher Scientific	2215365
, Eppendorf 5418 R	5401000013		Eppendorf
, VWR Clinical 50	VWR Polska	82013-800
Mikroskop preparacyjny, Fluorometr Leica M80	Leica Microsystems
żelowego Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866,
iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
System żelowy	ThermoFisher Scientific
Blok grzewczy	VWR International	12621-048
Mikrowirówki, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
		Integra	Integra
L-1000 XLS+, Pipeta 17014382 Pipet-Lite LTS	Rainin
L-10 XLS+, Pipeta	17014388		Rainin
L-200 XLS+, Pipeta	17014391		Rainin
L-20 XLS+, Pipeta do 17014392			Rainin
Platforma wahadłowa	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010