Artykuł metodologiczny

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/62726

⸱

26 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Johns Hopkins University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę różnicowania rdzenia kręgowego, indukowanych przez człowieka astrocytów i neuronów pochodzących z pluripotencjalnych źródeł oraz ich wspólnej hodowli do zapisu elektrofizjologicznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie astrocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC-A) i neurony (hiPSC-N) dostarczają potężnego narzędzia do modelowania patofizjologii stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) in vitro. Zapisy z matrycą wieloelektrodową (MEA) są sposobem na rejestrowanie potencjałów pola elektrycznego z dużych populacji neuronów i analizowanie aktywności sieci w czasie. Wcześniej wykazano, że obecność hiPSC-A, które są różnicowane za pomocą technik promowania fenotypu astrocytów rdzenia kręgowego, poprawiła dojrzewanie i aktywność elektrofizjologiczną regionalnie specyficznych neuronów ruchowych hiPSC rdzenia kręgowego (MN) w porównaniu z tymi hodowanymi bez hiPSC-A lub w obecności astrocytów gryzoni. Opisano metodę kohodowli rdzenia kręgowego hiPSC-A z hiPSC-MN i rejestrowania aktywności elektrofizjologicznej za pomocą zapisów MEA. Podczas gdy opisane tutaj protokoły różnicowania są specyficzne dla astrocytów i neuronów, które są regionalnie specyficzne dla rdzenia kręgowego, platforma kokulturowania może być stosowana do astrocytów i neuronów zróżnicowanych za pomocą technik specyficznych dla innych losów, w tym korowych hiPSC-A i hiPSC-N. Protokoły te mają na celu dostarczenie testu elektrofizjologicznego w celu poinformowania o interakcjach glej-neuron i zapewnienie platformy do testowania leków o potencjale terapeutycznym w ALS.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie astrocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC-A) i neurony (hiPSC-N) są potężnymi narzędziami do modelowania patofizjologii stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) in vitro i stanowią paradygmat translacyjny dla strategii odkrywania leków1. Naukowcy wykazali, że kokultura hiPSC-A z hiPSC-N zwiększa morfologiczne, molekularne, elektrofizjologiczne i farmakologiczne dojrzewanie obu typów komórek, generując złożone sieci neuronowe i interakcje astrocyty-neurony, które przypominają ich odpowiedniki in vivo2,3. Podobne eksperymenty z kokulturą mogą podsumować cechy charakterystyczne patobiologii ALS, takie jak neurotoksyczność za pośrednictwem astrocytów4,5 i nadpobudliwość neuronalna6. Dodatkowo, dzięki postępom w protokołach różnicowania, ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) mogą być różnicowane w regionalnie specyficzne podtypy neuronalne, w tym hiPSC-A i hiPSC-N7,8. Strategie te dają potencjał do modelowania patologii neuronów ruchowych kory mózgowej i rdzenia kręgowego w ALS, a także wpływu astrocytów na oba. Wymaga to jednak powtarzalnego testu funkcjonalnego w celu określenia tych efektów.

Ostatnio pokazano, że zapis z matrycą wieloelektrodową (MEA) jest szczególnie odpowiedni do elektrofizjologicznej charakterystyki kokultur neuronów i astrocytów2. W przeciwieństwie do analiz elektrofizjologicznych pojedynczych komórek, te matryce elektrod o dużej gęstości pasywnie rejestrują potencjały pola zewnątrzkomórkowego z dużych populacji neuronów, nie zakłócając warunków hodowli i zachowując integralność błon komórkowych. Platformy te są szczególnie przydatne do rejestrowania aktywności komórkowej i sieciowej kultur w czasie oraz w odpowiedzi na manipulacje farmakologiczne. Wreszcie, gdy obecność astrocytów jest zmienną hodowlaną, nagrania MEA mogą dostarczyć funkcjonalnego wglądu w dwukierunkowe interakcje astrocyta-neuron2,9.

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół różnicowania hiPSC na rdzenia kręgowego hiPSC-A i hiPSC-neurony ruchowe (MN), który został wcześniej zweryfikowany2. Protokół różnicowania hiPSC-A rdzenia kręgowego konsekwentnie prowadzi do hodowli astrocytów, które są dodatnie dla białka B wiążącego wapń S100 (S100β), kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) i Homeobox B4 (HOXB4) odpowiednio w maksymalnie 80%, 50% i 90% komórek, co wskazuje na dojrzewającą specyfikację gleju i rdzenia kręgowego2,10. Protokół różnicowania hiPSC-MN generuje neurony, które są >90% dodatnie dla acetylotransferazy choliny (ChAT), co sugeruje tożsamość dojrzałego neuronu ruchowego alfa2. Ponadto w protokole opisano techniki generowania kokultur hiPSC-A/MN, w przypadku których wykazano wcześniej, że skutkują neuronami o zwiększonej złożoności morfologicznej za pomocą analizy Scholla i mikroskopii immunofluorescencyjnej w porównaniu z kulturami neuronów bez astrocytów lub z astrocytami gryzoni2. Chociaż opisy te są specyficzne dla rdzenia kręgowego hiPSC-A i hiPSC-N, unikalną zaletą jest to, że początkowa niezależna hodowla astrocytów i neuronów, po której następują kroki do kohodowli w późniejszych punktach czasowych, może zostać przetłumaczona w celu zbadania skutków interakcji neuron-astrocyty z innych określonych regionów, a także komórek specyficznych dla choroby7,8. Wreszcie, protokół opisuje, w jaki sposób hodować te kultury na płytkach MEA, tak aby aktywność funkcjonalna jako czynnik składu kokultury mogła być badana w czasie z możliwością manipulowania składem komórkowym, a także warunkami hodowli.

Celem tych protokołów jest dostarczenie funkcjonalnego testu do badania interakcji astrocytów-neuronów, badania zmian specyficznych dla choroby i testowania leków o potencjale terapeutycznym w dziedzinie ALS. Instrukcje wideo są dostępne dla najtrudniejszych kroków tego protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowych

  1. Przygotować poszczególne pożywki do hodowli komórkowych, stosując kompozycje wymienione w tabeli 1.
  2. Wymieszać i sterylnie przefiltrować pożywkę w przefiltrowanych butelkach o pojemności 500 ml i przechowywać w bezpiecznym miejscu w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.

2. Utrzymywanie i przekazywanie niezlewających się ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC)

  1. Matrycę błony podstawnej (przechowywaną w porcjach w temperaturze -80 °C) rozmrozić w lodówce o temperaturze 2-8 °C przez noc.
  2. Rozcieńczyć matrycę błony podstawnej w stosunku 1:100 (v/v) w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub zmodyfikowanym pożywką Eagles (DMEM) firmy Dulbecco.
  3. Dodać wystarczającą ilość macierzy błony podstawnej, aby pokryć dno płytki do hodowli tkankowej (5 ml dla płytki 10 cm, 2 ml dla pojedynczych dołków na płytce 6-dołkowej) i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut przez noc lub w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
  4. Odessać rozcieńczoną matrycę błony podstawnej i raz umyć płytkę PBS przed dodaniem pożywki hodowlanej i komórek wysiewu.
  5. Codziennie sprawdzaj płyty, aby określić i przewidzieć, kiedy są gotowe do przejścia. Płytki przejściowe hiPSC, gdy większość kolonii stanie się wystarczająco gęsta, tak że w środku kolonii pojawiają się rozproszone białe obszary. Nie pozwól, aby płytki dojrzały powyżej tego punktu. Spowoduje to nadmierne różnicowanie prowadzące do pojawienia się żółtego obszaru w środku kolonii z powodu wielowarstwowości komórek, nadmiaru wydłużonych komórek na krawędziach, luźnej zwartości w koloniach lub zwiększonej śmierci komórek.
  6. W dniu przejścia narysuj markerem linie siatki na dolnej zewnętrznej powierzchni płytek, aby ułatwić dokładne pokrycie całej płyty.
  7. Odłącz zróżnicowane kolonie w kapturze hodowlanym za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym (10-krotne powiększenie), ręcznie zeskrobując końcówką do pipety o pojemności 200 μl.
  8. Opłucz płytki dwukrotnie za pomocą PBS (5 ml na pranie na płytki 10 cm).
  9. Dodać 5 ml wstępnie podgrzanej proteazy dysocjacyjnej tkanek (tabela materiałów) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C, aż krawędzie kolonii zaczną się zaokrąglać w górę (4-7 min), ale przed oderwaniem kolonii od płytki.
  10. Ostrożnie odessać proteazę dysocjacyjną. Delikatnie spłucz płytkę dwukrotnie PBS, uważając, aby nie usunąć kolonii.
  11. Dodać 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki hiPSC (Tabela 1) do płytki hodowlanej.
  12. Podnieś kolonie, rozbijając je na mniejsze agregaty komórek, drapiąc całą płytkę końcówką pipety o pojemności 5 ml, wykonując ruchy w przód iw tył od góry do dołu.
  13. Obróć płytkę o 90° i powtórz powyższy krok.
  14. Delikatnie rozcierać agregaty komórek, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 5 ml i okresowo sprawdzać wielkość agregatów pod mikroskopem, aż większość agregatów komórkowych będzie liczyła około 50-100 komórek.
  15. Wysiewaj agregaty komórkowe do wstępnie pokrytych płytek matrycy membrany podstawnej, używając dodatkowego podłoża hiPSC do umycia oryginalnej płytki. Zebrać i przenieść większość agregatów komórek na nowe płytki za pomocą pipety 5 ml.
    UWAGA: Jeśli protokół jest stosowany konsekwentnie, oryginalna płytka powinna zawierać kolonie iPSC pokrywające około 50% powierzchni hodowli przed pasażem. W takim przypadku współczynnik podziału powinien wynosić od jednej płyty do pięciu nowych płyt. Może to jednak wymagać dostosowania w zależności od warunków wzrostu i tempa wzrostu specyficznego dla linii komórkowej.
  16. Potrząśnij nowo wysianymi talerzami w przód iw tył, aby równomiernie rozprowadzić agregaty.
  17. Przenieść płytki do inkubatora (37 °C i 5% CO2 ) i pozostawić je w spokoju na noc, aby umożliwić prawidłowe przyleganie komórek.
  18. Codziennie wykonuj pełną zmianę podłoża za pomocą 10 ml pożywki hiPSC. Jeśli następnego dnia po przejściu znajduje się nadmiar resztek komórkowych, przed zmianą pożywki należy przemyć raz 5 ml pożywki.
  19. Zaplanuj przejście w następnej kolejności, gdy w centrum większości kolonii iPSC pojawią się białe obszary (krok 2.5). Nastąpi to 4-6 dni po każdym przejściu.

3. Zawieszanie się hiPSC

  1. Wykonaj początkowe kroki, jak w krokach 2.5-2.14 dla przejścia hiPSC.
  2. Zebrać agregaty komórek do probówki o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze 200 x g przez 2 minuty.
  3. Odessać supernatant, ponownie zawiesić osad w podłożu zamrażającym i przenieść do krioprobówek za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
    UWAGA: Podobnie jak w przypadku etapów przejścia, zwykły współczynnik podziału to jedna płytka iPSC na pięć krioprobówek, w zależności od gęstości kolonii. Użyj całkowitej objętości 1 ml środka zamrażającego dla każdej krioprobówki.
  4. Umieścić krioprobówki w schłodzonym pojemniku do krioprezerwacji i przenieść do temperatury -80 °C na noc.
  5. Po 24 godzinach przenieś komórki do ciekłego azotu.

4. Rozmrażanie hiPSC

  1. Pokryć 10-centymetrową płytkę matrycą błony podstawnej (patrz 2.1-2.3).
  2. Wyjmij krioprobówkę iPSC z ciekłego azotu i natychmiast umieść ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na maksymalnie 2 minuty, aby szybko się rozmroziła. Wstrząsnąć fiolką w kąpieli, aż do częściowego rozmrożenia i będzie zawierać mały kawałek lodu otoczony płynem.
  3. Przenieś agregaty komórek z krioprobówki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 1000 μl. Dodać do 15 ml wstępnie podgrzanej pożywki hiPSC, aby rozcieńczyć dimetylosulfotlenek (DMSO) w pożywce do zamrażania.
  4. Odwirować stożkową probówkę o pojemności 15 ml o masie 200 x g przez 2 minuty.
  5. Odessać supernatant i użyć pipety o pojemności 5 ml do ponownego zawieszenia osadu komórkowego w pożywce hiPSC zawierającej 20 μM inhibitora kinazy serynowo-treoninowej białka tworzącego cewki serynowo-treoninowe związanego z Rho, w celu uniknięcia dalszego rozwarstwiania agregatów komórkowych.
  6. Przenieść agregaty komórek na 10-centymetrową płytkę pokrytą membraną podstawną za pomocą pipety 5 ml.
    UWAGA: Jeśli protokół jest stosowany konsekwentnie, komórki w jednej krioprobówce można przenieść na pojedynczą płytkę o średnicy 10 cm.
  7. Potrząśnij płytą, aby równomiernie rozprowadzić agregaty.
  8. Przenieść płytkę do inkubatora i pozostawić ją w spokoju na noc, aby umożliwić prawidłowe przyleganie komórek.
  9. Wykonaj pełną wymianę pożywki następnego dnia po rozmrożeniu za pomocą 10 ml pożywki hiPSC bez ROCK-I.

5. Różnicowanie hiPSC na neuronalne komórki progenitorowe rdzenia kręgowego (NPC)

  1. Upewnij się, że 6-dołkowe płytki pokryte matrycą membrany podstawnej są gotowe do użycia przed rozpoczęciem różnicowania.
  2. Zacznij od iPSC, które zostały przepasane co najmniej raz, a najlepiej dwa razy po rozmrożeniu i z co najmniej czterema płytkami o średnicy 10 cm (patrz wyjaśnienie w kroku 5.11).
  3. Wykonaj początkowe kroki, jak w krokach 2.5-2.14 dla przejścia hiPSC.
  4. Przenieść agregaty komórek z co najmniej dwóch płytek o średnicy 10 cm do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
  5. Wirować przy 200 x g przez 2 min.
  6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 10 ml pożywki hiPSC za pomocą pipety o pojemności 10 ml, a następnie ponownie odwirować przy 200 x g przez 2 minuty, aby rozluźnić zrosty między komórkami w każdym skupisku.
  7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki hiPSC zawierającej 20 μM ROCK-I za pomocą pipety 1000 μl.
  8. Pipetować w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1000 μl, aby rozcierać agregaty komórek. Okresowo sprawdzać wielkość agregatów pod mikroskopem, aż większość zawiesiny komórek będzie składała się z pojedynczych komórek lub małych agregatów <10 komórek.
  9. Policz komórki za pomocą hemocytometru (preferowane) lub automatycznego licznika komórek i oblicz gęstość komórek w zawiesinie komórek.
  10. Płytka 3,0 x 106 komórek w każdym dołku 6-dołkowej płytki wstępnie pokrytej matrycą membrany podstawnej. Użyj pipety o pojemności 1000 μl, aby przenieść zawiesinę komórek.
    UWAGA: Jeśli protokół jest stosowany konsekwentnie, odpowiada to stosunkowi dwóch 10-centymetrowych płytek do jednego dołka 6-dołkowego/płytki.
  11. Powtórzyć kroki 5.3-5.10 z drugą partią dwóch płytek o średnicy 10 cm i umieścić produkt końcowy w basenie pokrytym matrycą membrany podstawnej na drugiej płytce 6-dołkowej. Użyj pipety o pojemności 1000 μl, aby przenieść zawiesinę komórek.
    UWAGA: Idealne uzupełnienie protokołu NPC rdzenia kręgowego wymaga dwóch studzienek równych czterem 10-centymetrowym płytkom. Aby ułatwić przepływ pracy, wykonaj kroki 5.3-5.10 z dwiema partiami dwóch płytek, z których każda ma produkt końcowy to dwie oddzielne płytki 6-dołkowe, a każda z nich ma jedną studzienkę zawierającą 3,0 x 106 komórek.
  12. Utrzymuj otrzymaną ludzką monowarstwę iPSC w pożywce hiPSC zawierającej 20 μM ROCK-I, aż konfluencja osiągnie >90%, zwykle następnego dnia, ale nie dłużej niż 3 dni po początkowym posiewie, aby uniknąć spontanicznego (niekontrolowanego) różnicowania.
  13. Jeżeli nie można rozpocząć różnicowania następnego dnia po posiewie komórek, należy przemyć komórki raz PBS i codziennie zmieniać pożywkę na świeżą pożywkę hiPSC zawierającą 20 μM ROCK-I. Jeśli nie zbiegnie się >90% w ciągu 3 dni od posiewu, wyrzuć komórki i rozpocznij protokół od nowa.
  14. Po osiągnięciu >90% zbieżności rozpocznij różnicowanie. Jest to dzień in vitro 1 (DIV1) protokołu różnicowania.
  15. W przypadku DIV 1 należy wyrzucić pożywkę hiPSC zawierającą 20 μM ROCK-I i dwukrotnie przepłukać PBS w celu usunięcia płodowego czynnika wzrostu (FGF) i transformującego czynnika wzrostu beta (TGFβ) obecnych w pożywce komórek macierzystych.
  16. Zmień pożywkę na pożywkę WiCell (Tabela 1) uzupełnioną o 0,2 μM LDN193189 (LDN) i 10 μM SB431542 (SB) przez 48 godzin.
  17. Na DIV 3 przemyć raz PBS i zmienić pożywkę na pożywkę WiCell uzupełnioną LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + kwas retinowy (RA; 1μM) przez 48 godzin.
  18. Na DIV 5 przemyj raz PBS i zmień pożywkę na WiCell: Podłoże do indukcji neuronalnej (NIM) na zasadzie (Tabela 1) (50%:50%, v/v) uzupełnione LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + RA (1 μM) przez 48 godzin.
  19. W elemencie DIV 7 wykonaj wymianę nośnika z tym samym nośnikiem, co w kroku 5.18.
  20. Na DIV 8 przemyj raz PBS i zmień podłoże na bazę WiCell:NIM (50%:50%) uzupełnioną RA (1 μM) + puromorfamina (PMN) (1 μM) + rekombinowany czynnik neurotroficzny pochodzenia ludzkiego mózgu (BDNF) (10 ng/ml) + kwas askorbinowy (ASAC) (0,4 μg/ml) przez 48 godzin.
  21. W przypadku DIV 10 przemyć raz PBS i zmienić podłoże na bazę NIM (100%) uzupełnioną zgodnie z krokiem 5.20 przez 48 godzin.
  22. Na DIV 11 lub 12 pokryć sterylną kolbę hodowlaną o średnicy 25 cm2 matrycą błony podstawnej, przygotowując się do przejścia.
  23. Odessać pożywkę z każdego dołka 6-dołkowej płytki l i raz przepłukać komórki PBS.
  24. Dodaj 2 ml 0,05% trypsyny do każdego dołka i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 5-15 minut; przerywane potrząsanie płytkami może pomóc w oderwaniu komórek.
  25. Jeśli komórki nadal nie są w zawiesinie, należy je odłączyć mechanicznie, wyrzucając pożywkę NIM z końcówki pipety o pojemności 1000 μl na komórki ruchem okrężnym (upewnij się, że pokrywa całą powierzchnię) lub skrobając je skrobakiem do komórek (niezalecane).
  26. Przenieś komórki z 2 dołków do probówki o pojemności 15 ml i dodaj inhibitor trypsyny w odpowiedniej proporcji do ilości użytej trypsyny za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
  27. Wirować przy 200 x g przez 2 minuty, odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić z 10 ml zasady NIM za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
  28. Ponownie odwirować przy 200 x g przez 2 minuty, aby poluzować zrosty między komórkami.
  29. Po drugim etapie wirowania usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad z 1 ml pożywki NIM (100%) uzupełnionej RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/ml) + ASAC (0,4 μg/ml) i ROCK-I (20 μM). Używając końcówki do pipety o pojemności 1000 μl, rozcierać komórki w górę i w dół około pięć razy, aż do uzyskania mętnej zawiesiny.
  30. Ponownie zasiać agregaty w tym pożywce do sterylnej kolby hodowlanej o średnicy 25 cm2 pokrytej matrycą błony podstawnej, tak aby końcowym wynikiem było połączenie komórek z dwóch dołków płytki 6-dołkowej do pojedynczej, pokrytej matrycą podstawną, sterylnej kolby hodowlanej o średnicy 25 cm2 (pasaż 2:1). Użyj pipety o pojemności 1000 μl, aby przenieść zawiesinę komórek.
    UWAGA: Komórki powinny zlewać się w >90% z DIV 13 i nie są wymagane żadne dalsze kroki do 14 dnia. Jeśli komórki nie zlewają się, trzymaj ROCK-I w pożywce przez dodatkowe 1 lub 2 dni.
  31. W DIV 14 zmień pożywkę na świeżą pożywkę NIM + RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/ml) + ASAC (0,4 μg/ml).
  32. W DIV 15 zmień pożywkę na NIM: Podłoże do różnicowania neuronalnego (NDM) (Tabela 1) (50%:50%) z RA (1 μM) + PMN (1 μM) + ASAC (0,4 μg/mL) + Suplement B (50x) + BDNF (10 ng/ml) + neurotroficzny pochodzący z linii komórek glejowych (GDNF) (10 ng / ml) + Insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (IGF-1) (10 ng / ml) + Rzęskowy czynnik neurotroficzny (CNTF) (10 ng / ml). Zmieniaj na nowe nośniki co drugi dzień.
  33. W DIV 21 zmień pożywkę na bazę NDM (100%) uzupełnioną jak w kroku 5.32 i zmieniaj na świeżą pożywkę co drugi dzień.
  34. Na DIV 25-30 zbierz NPC i albo zamroź go, albo przenieś na 10-centymetrową płytkę w celu rozróżnienia końcowego.
  35. Przepłukać kolbę T-25 PBS i dodać 0,05% trypsyny.
  36. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  37. Przepłucz trypsynę i komórki bazą NDM i przenieś do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać inhibitor trypsyny w odpowiedniej proporcji do trypsyny i odwirowywać w stężeniu 300 x g przez 5 min.
  38. Zawiesić osad komórkowy za pomocą pożywki różnicującej neuron ruchowy lub astrocyty (Tabela 1) i użyć pipety o pojemności 1000 μl, aby rozcierać w górę iw dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki (zwykle do 5 razy).
  39. Policz komórki i przenieś na 10-centymetrową płytkę pokrytą zgodnie z opisem w sekcji 6, używając pożywki różnicującej + Rock-I, w celu rozróżnienia hiPSC-MN i hiPSC-A.
  40. Alternatywnie, zamrozić kultury poprzez ponowne zaparcie w pożywce zamrażającej składającej się w 90% z pożywki NDM z czynnikami wzrostu (jak w krokach 5.32-5.33) i 10% DMSO, rozcierać podobnie, a następnie przenieść do krioprobówki. Porcja 6 x 106 NPC na krioprobówkę.

6. Rozmrażanie kultur NPC

  1. Posmaruj 10 cm płytki poliornityną (PLO) i lamininą na dzień przed rozmrożeniem komórek.
    1. Dodać 5 ml PLO rozcieńczonego do 100 μg/ml w PBS lub wodzie destylowanej (dH2O) do płytek. Inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc.
    2. Odessać roztwór PLO i trzykrotnie przepłukać płytki PBS. (PLO jest toksyczny, jeśli nie jest odpowiednio umyty.)
    3. Dodać lamininę rozcieńczoną w PBS do stężenia 10 μg/ml do płytek powlekanych PLO. Inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę, najlepiej przez noc. Po inkubacji odessać roztwór lamininy bez spłukiwania, aby zwiększyć adhezję komórek.
      UWAGA: Płytki można wcześniej pokryć PLO, trzykrotnie umyć wodą, wysuszyć w sterylnym kapturze i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Rozmrozić jedną fiolkę NPC (tj. DIV 25 lub 30) zawierającą 6 x 106 komórek/fiolkę na każdą 10 cm płytkę do hodowli komórek.
  3. Wyjmij krioprobówkę NPC z ciekłego azotu i natychmiast umieść w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na maksymalnie 2 minuty. Szybko rozmrozić, potrząsając fiolką, aż pojawi się mały kawałek lodu otoczony płynem.
  4. Przenieść agregacje komórek do stożkowego 15 ml za pomocą pipety 1000 μl i dodać do 15 ml wstępnie podgrzanego NDM lub suplementu Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) / Ham's F21 F12 w celu rozcieńczenia DMSO.
  5. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
  6. Odessać supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą pożywki różnicującej astrocyty lub MN (Tabela 1) + ROCK-I (20 μM) i za pomocą pipety o pojemności 1000 μl rozcierać w górę iw dół, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki (do 5 razy).
  7. Przenieść zawiesinę jednokomórkową na płytkę pokrytą PLO-Laminin o średnicy 10 cm.
  8. Przenieś płytkę do inkubatora i pozostaw ją w spokoju na noc, aby umożliwić prawidłowe przyleganie komórek.

7. Różnicowanie NPC rdzenia kręgowego na neurony ruchowe

  1. Wykonaj początkowe kroki, jak wspomniano w krokach 6.1-6.8, przy czym końcowym podłożem jest ośrodek różnicujący MN + ROCK-I (20 μM).
  2. Dzień po posiewie należy przeprowadzić całkowitą wymianę pożywki na pożywkę różnicującą MN bez ROCK-I, a następnie zmieniać pożywkę co drugi dzień. W weekend nakarm komórki w piątek, a następnie ponownie w poniedziałek. W razie potrzeby przepłucz komórki PBS, aby usunąć resztki komórek.
  3. Zmień pożywkę za pomocą pożywki różnicującej MN + arabinozydu cytozyny (ARA-C) (0,02 μM) i inkubuj przez 48 godzin, gdy komórki progenitorowe zaangażowane glejowo wyłaniają się jako pojedyncze proliferujące płaskie komórki pod postmitotycznym progenitorem MN zagregowanym w skupiska komórek.
    UWAGA: Zwykle dzieje się to w ciągu pierwszych 7 dni po początkowym posiewie, chociaż może występować zmienność w zależności od linii komórkowej.
  4. Po 48 godzinach odessać pożywkę zawierającą ARA-C, delikatnie przepłukać kultury trzykrotnie PBS i zmienić pożywkę na świeżą pożywkę MN bez ARA-C.
  5. Po leczeniu ARA-C należy wykonywać wymianę pożywki co drugi dzień (lub w poniedziałek, środę i piątek), usuwając starą pożywkę za pomocą ręcznej pipety, a nie aspiratora próżniowego, aby zapobiec przedwczesnemu oderwaniu się klastrów neuronalnych. Ponadto raz w tygodniu należy wzbogacić pożywkę MN o Lamininę w dawce 1 μg/ml, aby jeszcze bardziej zwiększyć przywiązanie neuronów do płytek hodowlanych.

8. Różnicowanie NPC na astrocyty rdzenia kręgowego

  1. Rozmrozić kultury NPC jak w sekcji 6, używając pożywki do różnicowania astrocytów (Tabela 1) z dodatkiem płodowej surowicy bydlęcej (FBS) o stężeniu objętościowym 1% (NS + 1% FBS) oraz ROCK-I (20 μM) do posiewu.
    UWAGA: Dostępny w handlu zamiennik surowicy (Tabela 1) może być zastąpiony FBS przy użyciu tych samych współczynników rozcieńczenia.
  2. Następnego dnia po posiewie należy zmienić pożywkę na pożywkę NS + 1% FBS bez inhibitora ROCK, a następnie zmieniać pożywkę co drugi dzień. W weekendy karmić komórki w piątek, a następnie ponownie w poniedziałek. W razie potrzeby przepłucz komórki PBS, aby usunąć resztki komórek. Jeśli komórki nadal umierają, uzupełnij pożywkę ROCK-I (10 μM), aby zwiększyć przeżycie komórek. Należy uważać, aby nie używać ROCK-I zbyt często lub zbyt długo, biorąc pod uwagę możliwość selekcji nieśmiertelnych komórek.
  3. Pozwól astrocytom zlać się przed ich przejściem.
    UWAGA: Rozmiar komórki będzie się zwiększał z czasem, więc nie ma ustalonej liczby do przejścia. Typowy współczynnik przejścia wynosi 1:2 lub 1:3. W przypadku słabej przeżywalności lub przejścia do zbyt wielu talerzy, należy połączyć dwie (lub więcej, w razie potrzeby) płytki 10 cm na jedną płytkę 10 cm, aby zachować zbieg.
  4. Aby przejść hodowle progenitorów astrocytów, należy raz przemyć płytki PBS (w celu usunięcia FBS), inkubować z 0,05% trypsyny przez 5 minut, zebrać komórki w pożywce NS + 1% FBS (FBS dezaktywuje trypsynę), a następnie odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki w pożywce NS + 1% FBS, a następnie rozprowadzić do zawiesiny jednokomórkowej. Rozprowadź ogniwa w NS + 1% FBS na nowe płytki 10 cm.
    UWAGA: Oprócz rozszerzania kultur astrocytów, wielokrotne pasażowanie płytek służy zabijaniu wszelkich pozostałych komórek progenitorowych, które wybrały los neuronalny. Dlatego też, nawet jeśli nie ma bardzo wysokiego wskaźnika mitotyki, płytki mogą być pasażowane w stosunku 1:1, jeśli wydaje się, że występuje zanieczyszczenie neuronów.
  5. Zmieniaj powłokę w trakcie różnicowania, aby zwiększyć wydajność w następujący sposób.
    1. Na płytce umieszczono początkowo rozmrożone kultury NPC i pierwsze przejścia po wstępnym posianiu na PLO/Lamininie.
    2. Umieść niedojrzałe astrocyty na płytkach pokrytych macierzą błony podstawnej.
    3. Płytkować bardziej dojrzałe astrocyty (tj. po 90 dniu) na macierzy błony podstawnej, płytkach pokrytych PLO / Lamininą (zwykle do wspólnej hodowli z neuronami) lub na płytkach niepowlekanych.
  6. Zamroź progenitory astrocytów w dowolnym momencie w ciągu 60-dniowego okresu dojrzewania, aby zsynchronizować kultury lub zachować na późniejsze eksperymenty. Podczas rozmrażania poza etap NPC, rozmrozić progenitory astrocytów na płytkach pokrytych macierzą błony podstawnej, a nie PLO/Laminina.
  7. W DIV 90 i później zmień pożywkę z NS + 1% FBS na NS + 5% FBS, aby zwiększyć przeżywalność astrocytów i zmniejszyć ich proliferację.

9. Jednoczesna hodowla MN i astrocytów rdzenia kręgowego na płytkach z matrycą wieloelektrodową

  1. Różnicuj i płytkuj neurony ruchowe i astrocyty, gdy są gotowe do użycia tego samego dnia i dojrzewają do DIV 60 dla neuronów ruchowych i DIV 90 dla astrocytów.
  2. Pokryj płytki MEA dzień przed lub w dniu posiewu w następujący sposób, jeśli pracujesz z 24-dołkowymi płytkami z tworzywa sztucznego (tabela materiałów).
  3. Rozcieńczyć PLO w wodzie lub PBS do 100 μg/ml.
    1. Dodać 15-20 μl do każdego dołka (w zależności od poziomu komfortu pipety), tworząc kroplę na środku studzienki pokrywającą obszar elektrod i otoczenia, ale nie całą studzienkę.
    2. Uważaj, aby nie uszkodzić elektrod z końcówką pipety. Bądź spójny z objętością od studzienki do studni, aby zapewnić pokrycie tej samej powierzchni w każdym dołku.
    3. Inkubować PLO w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę (najlepiej 2 godziny).
      UWAGA: Małe objętości wyschną, jeśli w płytkach nie będzie wystarczającej wilgotności. Dodaj wodę do komór otaczających studnie, aby zapewnić wystarczającą wilgotność przez cały czas powlekania i nagrywania.
  4. Odessać jak najwięcej PLO za pomocą plastikowej końcówki do mikropipety. Uważaj, aby nie dotykać elektrod. Umyć trzykrotnie 250 μl wody. Jeśli używasz aspiratora próżniowego do mycia, nie pozwól, aby końcówka zbliżyła się do układu elektrod. Po trzecim praniu usuń jak najwięcej wody, w razie potrzeby używając końcówki pipety. Pozostaw powierzchnię do wyschnięcia pod kapturem do hodowli komórkowych ze zdjętą pokrywą.
  5. Po wyschnięciu powierzchni płytki dodać Lamininę rozcieńczoną do 10 μg/ml w PBS. Użyj 15-20 μl, aby pokryć każdy układ elektrod. Dodać wodę do komór wilgotnościowych, założyć pokrywę i przywrócić płytkę do inkubacji w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny lub przez noc.
  6. W dniu posiewu przepłukać hodowle MN i astrocytów raz PBS i dodać trypsynę 0,05% w temperaturze 37 °C w celu podniesienia komórek (5 min). Zebrać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej inhibitor trypsyny i przemyć płytki pożywką lub zasadą, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane. Wirować przy 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić za pomocą pipety o pojemności 1000 μl, aby wytworzyć 1 ml zawiesiny pojedynczej komórki. W przypadku ponownego zawieszenia MN i astrocytów należy przejść na pożywkę do kohodowli (Tabela 1) z dodatkiem 20 μM ROCK-I.
  7. Policz MN i astrocyty równolegle za pomocą hemocytometru. Podczas liczenia i wykonywania obliczeń należy przykryć zawiesiny komórek i umieścić je w styropianowym stojaku o temperaturze 4 °C.
  8. Obliczyć objętość wymaganą do ponownego zawieszenia kultur do stężenia 5 x 104 komórek na 5 μl w przypadku neuronów ruchowych i 2,5 x 104 komórek na 5 μl w przypadku astrocytów. Odwirować 1 ml zawiesiny komórek o stężeniu 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w obliczonej objętości.
  9. Oblicz liczbę pożądanych studzienek do wysiania i pomnóż ją przez 5 μl każdej zawiesiny komórek. Połączyć wymaganą objętość zawiesin neuronów i astrocytów w stosunku 1:1 i mieszać pipetując, aż do całkowitego połączenia (zwykle dwukrotnie), ale unikając zbyt agresywnej gry.
  10. Usuń Lamininę z każdej studzienki płytki MEA za pomocą końcówki pipety. Przenieś 10 μl końcowej połączonej zawiesiny komórek do każdej studzienki, tworząc małą kropelkę pokrywającą matrycę elektrod, aby zapewnić gęstość komórek 5 x 104 MN i 2,5 x 104 astrocytów na dołek.
    UWAGA: Wysoka gęstość komórek w połączonej zawiesinie wymaga częstego ponownego zawieszania między studzienkami na etapie wysiewu, aby zapewnić dokładne i spójne zliczanie komórek.
  11. Włóż płytki do inkubatora na 20-30 minut. Należy uważać, aby nie naruszyć kropelki komórek i pozwolić komórkom na uformowanie początkowych przyczepów na płytkach.
  12. Po 20-30 minutach dodaj ciepłą pożywkę do współhodowli + ROCK-I do każdej studzienki, pipetując 250 μl w dół na ściankę każdej studzienki, a następnie dodatkowe 250 μl w dół ścianki tego samego dołka po przeciwnej stronie. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.
  13. Zbadaj płytki dzień po wysiewie (dzień 1 kokultury). Jeśli występuje znaczna ilość szczątków komórkowych lub martwych komórek, należy wymienić pożywkę na świeżą pożywkę do kohodowli zawierającą ROCK-I. W przeciwnym razie należy zmienić pożywkę drugiego dnia po wysiewie (dzień 2 wspólnej hodowli) na pożywkę kokulturową bez ROCK-I. Wykonuj wymianę połowy pożywki (zasysanie 50% i dodawanie 60% końcowej objętości, aby uwzględnić parowanie) dwa razy w tygodniu.
  14. W przypadku stosowania systemów MEA z jednostudzienkowymi płytkami szklanymi o średnicy 30 mm (tabela materiałów), przygotowanie płytki może zająć 2 lub więcej dni. Wykonaj poniższe czynności, aby to zrobić.
  15. Podnieś komórki i resztki komórek z poprzednich kultur MEA za pomocą 0,05% trypsyny przez 5-15 minut.
  16. Odessać trypsynę i spłukać trzykrotnie wodą.
  17. Sterylizować, dodając 70% etanolu i inkubować w kapturze przez 10 minut. Odessać etanol, a następnie trzykrotnie spłukać wodą.
  18. Nałóż 1% anionowy detergent z enzymem proteazy w wodzie. Przykryj talerze pokrywką i zawiń folią termoplastyczną i folią aluminiową, a następnie pozostaw na noc na bujaku w temperaturze pokojowej.
  19. Zassać detergent, a następnie spłukać trzykrotnie wodą.
  20. Jeśli planujesz przechowywać talerze, dodaj odpowiednią ilość wody. Przykryj talerze pokrywką i owiń je folią termoplastyczną oraz folią aluminiową, a następnie pozostaw w lodówce do następnego użycia.
  21. Jeśli planujesz powlekanie, pozwól powierzchni wyschnąć pod kapturem hodowli komórkowej.
  22. Jeśli potrzebna jest dodatkowa sterylizacja (np. wcześniejsza infekcja lub niedawne użycie), tylko w tym momencie należy wystawić płytki MEA na działanie światła ultrafioletowego (UV) pod maską przez 30-60 min.
    UWAGA: Unikanie częstego światła UV zapobiegnie uszkodzeniu elektrod. Stosowanie światła UV, gdy na płytkach znajduje się surowica, spowoduje niesprawne elektrody, dlatego należy je stosować tylko na czyszczonych płytkach.
  23. Gdy płytki całkowicie wyschną, przystąp do czyszczenia plazmowego przez 1 minutę, aby naładować szklaną powierzchnię płytek MEA i zwiększyć skuteczność powlekania. Czyszczenie plazmowe należy wykonywać co najmniej raz na 4-5 cykli czyszczenia płyt MEA.
    1. Alternatywnie, gdy czyszczenie plazmowe nie jest wykonalne lub nie jest uzasadnione, należy dodać wystarczającą ilość podłoża zawierającego FBS, aby pokryć powierzchnię płytek MEA i zwrócić je do inkubatora na noc.
  24. Użyć powłoki PLO/Laminin, jak opisano powyżej w sekcji 6. Dodać roztwór PLO (100 μg w PBS) natychmiast po oczyszczeniu plazmowym lub zasysaniu i wypłukaniu pożywki zawierającej FBS.
  25. Płytkie ogniwa jak powyżej o następujących gęstościach: 1 x 105 hiPSC-A / płytka i 5 x 105 hiPSC-MN / płytka.

10. Zapis w matrycy wieloelektrodowej

  1. Wyodrębnij surowe dane dotyczące napięcia przy częstotliwości próbkowania 12,5 kHz, używając filtra Butterwortha z filtrem górnoprzepustowym 200 Hz i filtrem dolnoprzepustowym 3 kHz. Ustaw rozpoznawanie skoków jako chwilowe punkty czasowe napięć ≥6 odchyleń standardowych od linii bazowej. Zidentyfikuj wybuchy jako aktywność z >5 skokami w ciągu 100 ms. Zdefiniuj aktywność sieci, gdy ponad 35% wszystkich aktywnych elektrod wystrzeliwuje w ciągu 100 ms z minimalnymi 50 impulsami na impuls sieci.
  2. Rozpocznij nagrywanie tak szybko, jak to możliwe po Co-Culture (CC) Dzień 1.
    UWAGA: Aktywność elektryczna będzie rzadko odnotowywana przed CC Day 3.
  3. Równoległe hodowle płytkowe o podobnej gęstości i repliki w odpowiednich płytkach hodowlanych lub szkiełkach nakrywkowych do testów biochemicznych, immunocytochemii (ICC) lub qPCR.
  4. Wykonuj nagrania z temperaturą ustawioną na 37 °C i CO2 na poziomie 5%. Przenieść płytki do maszyny i pozostawić je do zrównoważenia przez co najmniej 5 minut przed zapisem.
  5. Rejestruj podstawową aktywność co drugi dzień lub co tydzień, przez 1-15 minut, w zależności od projektu eksperymentalnego. Nie nagrywaj przez co najmniej 1 godzinę po wymianie nośnika, a najlepiej odczekaj 24 godziny po każdej wymianie nośnika.
  6. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, należy zmienić pożywkę (tj. wymianę połowy pożywki, jak w kroku 9.14) po każdym zapisie, w którym wieczko sterylnej płytki musi zostać otwarte na zewnątrz sterylnego kaptura (tj. po zastosowaniu związków leczniczych). Wykonaj pełną wymianę pożywki i płukanie w celu wypłukania leków, jeśli płytki mają być nadal używane po leczeniu farmakologicznym.
  7. Do celów analizy należy użyć co najmniej trzech kontrprób technicznych i biologicznych dla każdego warunku. Wyrazić dane elektrofizjologiczne jako n ≥ 3 powtórzenia.

11. Testy farmakologiczne na matrycy wieloelektrodowej

  1. Użyj różnych kombinacji kokultur w zależności od pytania eksperymentalnego: neurony ALS z astrocytami kontrolnymi, neurony kontrolne z astrocytami ALS, neurony i astrocyty ALS, neurony kontrolne i astrocyty.
  2. Badając przejściowe efekty elektrofizjologiczne związków ukierunkowanych na neurony lub astrocyty, należy rejestrować aktywność wyjściową przez co najmniej 1 minutę ze zdjętą pokrywką płytki, ale zamkniętą pokrywą maszyny.
  3. Ręcznie otworzyć pokrywę urządzenia bez zatrzymywania zapisu elektrofizjologicznego i wymienić 25 μl pożywki na odpowiedni nośnik leku (zwykle świeże podłoże) za pomocą pipety wielokanałowej w przypadku leczenia wielu studzienek. Zamknij pokrywę ręcznie.
  4. Nagrywaj przez dodatkową 1 minutę (lub dłużej, jeśli występują znaczące zmiany wywołane przez nośnik, po których posiewu musi się zregenerować).
  5. Ręcznie ponownie otworzyć pokrywę i wymienić 25 μl pożywki na lek będący przedmiotem zainteresowania w tym samym pojeździe. Zamknij pokrywę urządzenia i kontynuuj nagrywanie.
    UWAGA: Czas trwania zapisu i objętość podawanego leku/nośnika mogą się różnić lub wymagać optymalizacji w zależności od pytania eksperymentalnego.
  6. Do celów analizy należy upewnić się, że dodanie pojazdu nie powoduje znaczących zmian parametrów elektrofizjologicznych. Oblicz procentowe zmiany aktywności po podaniu leku w porównaniu do po dodaniu nośnika i porównaj między warunkami.
  7. Aby zbadać podłużne efekty elektrofizjologiczne, takie jak potencjalne leki modyfikujące przebieg choroby, należy zarejestrować aktywność wyjściową opisaną w kroku 11.2. W tym celu należy użyć pożywki kokulturowej zawierającej lek(i) będącego przedmiotem zainteresowania w odpowiednim nośniku lub pożywki zawierającej tylko nośnik.
  8. Dla celów analizy należy porównać zapisy punktów czasowych z ALS lub kokultur kontrolnych leczonych długofalowo lekami ze sobą i warunkami kontrolnymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół tworzenia wzorców rdzenia kręgowego do generowania hiPSC-MN i rdzenia kręgowego hiPSC-A jest opisany w Rysunek 1. W tym protokole hiPSC są utrzymywane i pasażowane jako kolonie niezlewające się (Rysunek 2A). Neurogeneza jest inicjowana (indukcja neuronalna) poprzez podwójne hamowanie SMAD przez dodanie LDN193189 i SB431542, inaktywując odpowiednio szlaki białka morfogenetycznego kości (BMP) i transformującego czynnika wzrostu-beta (TGF-β). Na tym etapie stosuje się metodę ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do tej pory metody oparte na hiPSC i MEA do elektrofizjologicznych zapisów kokultur astrocytów i neuronów znalazły ograniczone zastosowanie w dziedzinie ALS6 i nadal nie na platformach w pełni ludzkich, w przeciwieństwie do ich bardziej rozpowszechnionego zastosowania do modelowania padaczki in vitro 9. Platforma ta ma jednak potencjał, aby odpowiedzieć na patofizjologicznie istotne pytania w badaniach nad ALS, takie jak mechanizmy nadpobudliwości neuronów, udział ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt został poparty następującymi dokumentami: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Nagroda za rozwój kariery naukowca klinicznego (CWH) Fundacji Charytatywnej Doris Duke. 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Dziękujemy dr Raha Dastgheyb i dr Normanowi Haugheyowi za dostarczenie platformy MEA i oprogramowania do analizy danych, które wykorzystaliśmy do walidacji opisanej platformy elektrofizjologicznej. Chcielibyśmy podziękować Khalilowi Rustowi za pomoc w demonstracji protokołu i filmowaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 cm sterylne płytki hodowlaneFalcon353003
25 cm2 sterylne kolbyhodowlane Falcon353136
2-merkaptoetanol (β-ME)Thermofisher21985023Stężenie robocze 110 &mikro; M
500 ml 0,2 &mikro; m CA System filtrówCorning430769
Pipeta 5 mlFalcon357543
6-dołkowe sterylne płytki hodowlaneFalcon3046
Amfoterycyna BGibco15290018Stężenie robocze 2,0 i mu; g / ml
Anionowy detergent z enzymem proteazy - Terg-A-ZymeSigma-AldrichZ273287Stężenie robocze 1% m/v
Kwas askorbinowy (ASAC)SigmaA4403Rozpuść 100 mg w 250 ml dH2O, aby uzyskać 0,4 mg / ml zapasu. Sterylny filtr przez 0,22 &mikro; m przefiltrować, podwielokrotność i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 0,4 i mikro; g/ml).
Płytki Axion CytoView MEA 24 (M384-tMEA-24W)Platforma AxionOPT-24
Axion Edge MEAMatryca membranowa AxionMaestro Edge
Basement - MatrigelCorning354277Szczegóły w protokole
Mikroskop stacjonarny (sterylny pod kapturem do hodowli komórkowych)Zeiss415510-1100-000Primo Vert
BicucullineSigma Aldrich14340Stężenie robocze10 μ M
Rzęskowy czynnik neurotroficzny (CNTF)Peprotech450-13Rozpuścić 100 &mikro; g w 1 ml sterylnego PBS, a następnie dodać 9 ml sterylnego 0,1% BSA-PBS do 10 &mikro; g/ml. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 10 ng/ml).
Zbiorniki CO2 i reduktor do Axion EdgeAirGas/Harris9296NC
Compound EAbcamab142164Rozpuszczanie 250 &mikro; g w 2.0387 mL DMSO, aby uzyskać 250 &mikro; M zapasów. Podwielokrotność i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:2000 do użycia. (stężenie robocze 125 nM).
Cyjankiksalina  (CNQX)Sigma AldrichC239Stężenie robocze 50 μ M
Kwas dihydrokainowy (DHK)Tocris111Stężenie robocze 50 μ M oraz 300 μ M
DMEM/F12Thermofisher113300Stężenie robocze 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 SuplementThermofisherA1517001Połącz 10 ml Essential 8 (10x)  suplementu z 500 ml pożywki wzrostowej Essential 8 (1x)
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Thermofisher16140071Stężenie robocze 1x
neurotroficzny pochodzenia komórek glejowych (GDNF)Peprotech450-10Rozpuścić 100 &mikro; g w 1 ml PBS do 100 i mikro; g/ml, a następnie dodać 9 ml sterylnego 0,1% BSA-PBS do 10 &mikro; g/ml. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 10 ng/ml).
HemocytometrMikroskopia wyborcza Nauki63510-20
HeparynaMillipore-sigmaH3149-100KURozpuść 200 mg w 100 ml PBS, aby uzyskać roztwór podstawowy 2 mg / mL. Porcjować bulion w 15 ml i 500 &mikro; Rury L. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 2 i mikro; g/ml).
Kontrolowana wilgotność Inkubator do hodowli komórkowychThermoFisher370ustawiony na 37 º C, 5 % CO2
Insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (IGF-1)R& Systemy D291-G1-200Rozpuszczanie 200 &mikro; g w 2 ml PBS do 100 i mikro; g / ml, a następnie dodaj 18 ml 0,1% BSA-PBS, aby uzyskać 10 &mikro; g/ml przechowywać w temperaturze -80 „ C. Podwielokrotność i zamrażać w temperaturze -80 „ C. Rozcieńczyć 10  � g/ml zapas w stosunku 1: 1000 do użytku. (stężenie robocze 10 ng/ml).
Kwas kaincAbcamab144490Stężenie robocze 5 μ
M Zamiennik surowicy nokautującej (KSR)Thermofisher10828Stężenie robocze 1x
LamininThermofisher23017-015Roztwór podstawowy 1 mg/ml, stężenie robocze 10 i mikro; g/ml (powłoka), 1 i mikro; g/ml (pożywka komórkowa)
LDN193189Stemgent04-0074Rozpuścić 2 mg LDN w 500 &mikro; L chloroformu, aby uzyskać 10 mM zapasu. Podziel to i zamroź w temperaturze -80 ºC. Przed użyciem najpierw rozcieńczyć materiał od 1 do 10 w DMSO [do 1 mM], a następnie rozcieńczyć 1:5000 z 1 mM w żądanym medium, aby uzyskać 0,2 i mikro; Roztwór roboczy M
L-GlutaminaThermofisher25030Stężenie robocze 100x
płytki szklane MEA Systemywielokanałowe60MEA200/30iR-Ti-gr
Pipet wielokanałowy P200GilsonPJ22224
NeurobasalThermofisher21103049Stężenie robocze 1x
Aminokwasy endogenne (NEAA)Thermofisher11140050Stężenie robocze 100x
Pencillin/StreptomycynaThermofisher15140122Stężenie robocze 100x
Poliornityna (PLO)Sigma-AldrichP3655Rozpuść 100 mg w 1 ml ddW, aby uzyskać 100 mg/ml roztworu podstawowego. Podziel zapas na 100 &mikro; Rury L. (stężenie robocze 100 &mikro; g / ml)
Chlorek potasu (KCl)NANAStężenie robocze100 mM
Purmorphamine (PMN)Millipore-Sigma540223Rozpuść 5 mg w 9,6 ml DMSO, aby uzyskać 1 mM roztworu. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 1 i mikro; M).
Rekombinowany czynnik neurotroficzny pochodzenia ludzkiego i mózgu (BDNF)Peprotech450-02Wirować na krótko przed rozpuszczeniem. Rozpuścić 100 &mikro; g w 1 ml PBS do 100 i mikro; g/ml, a następnie dodać 9 ml sterylnego 0,1% BSA-PBS do 10 &mikro; g/ml. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 10 ng/ml).
Kwas retinowy (RA)SigmaR2625Rozpuść 100 mg w 3,3 ml DMSO, aby uzyskać 100 mM roztworu podstawowego. Podziel zapas 100 &mikro; L/probówkę i zamrozić w temperaturze -80 ºC. Weź 200 i mikro; L 100 mM zapasu i rozcieńczyć 10x (dodać 1,8 ml DMSO), aby uzyskać 10 mM zapasu. Porcja 50 &mikro; L/rura  i przechowywać w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:10000 do użycia. (stężenie robocze 2 i mikro; M).
ROCK-I nhibitorPeprotech1293823Rozpuścić 5 mg w 1480 &mikro; L dH2O, aby uzyskać 10 mM zapasu, podwielokrotność i zamrozić w temperaturze -80 ºC. Rozcieńczyć w temperaturze 1: 500 do użycia. (stężenie robocze 20 &mikro; M).
SB431542SigmaS4317Rozpuść 5 mg w 1,3 ml DMSO, aby uzyskać 10 mM roztworu podstawowego. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (Działający Con 10 & Micro; M)
Sterylne kaptury do hodowli komórkowychBaker CompanySG-600
Suplement B - B27 SuplementThermofisher21985023Stężenie robocze 50x
Suplement N - N2 SuplementThermofisher17502048Stężenie robocze 100x
Wirówka do hodowli komórkowychThermoFisher75004261Sorvall Legend X1R
Tworzywo termoplastyczne  film - ParafilmPARAFILMP7793
Proteaza dysocjacji tkanek - DispaseStemCell Technologies7923Stężenie robocze 1x
Inhibitor trypsynySigmaT6522-1GRozpuść 1g w 100 ml ddH2O, aby uzyskać zapas 10 mg / mL. Porcję i przechowywać w temperaturze 4 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 objętości trypsyny do użycia. (stężenie robocze 1 mg/ml).
Trypsyna-EDTA (0,05%)Thermofisher2530054Stężenie robocze 1x
Kąpiel wodnaThermoFisher2332Isotemp

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911(2021).
  2. Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
  3. Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
  4. Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
  5. Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
  6. Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
  7. Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
  8. Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
  9. Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416(2018).
  10. Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
  11. Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
  12. Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79(2015).
  13. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
  14. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  15. Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
  16. Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
  17. Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
  18. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Modelowanie ALSludzkie pluripotencjalne kom rki macierzystekokultura astrocyt w i neuron wmacierz wieloelektrodowarejestracja elektrofizjologicznaastrocyty rdzenia kr gowegor nicowanie neuron w ruchowychpodw jna inhibicja SMADszlak JAK STATinterakcja gleja neuron

Powiązane artykuły