Artykuł metodologiczny

Szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych

DOI:

10.3791/62728

⸱

14 czerwca 2021

 , 
1Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie opisuje protokół tworzenia dużych (μg-mg) ilości DNA do kampanii przesiewowych białek z syntetycznych fragmentów genów bez klonowania lub używania żywych komórek. Minimalny szablon jest trawiony enzymatycznie i okrężny, a następnie amplifikowany za pomocą izotermicznego amplifikacji tocznego koła. Bezkomórkowe reakcje ekspresji można przeprowadzić z nieoczyszczonym produktem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje projekt minimalnej matrycy DNA i etapy enzymatycznej amplifikacji, umożliwiając szybkie prototypowanie możliwych do przetestowania białek w czasie krótszym niż 24 godziny przy użyciu ekspresji bezkomórkowej. Po otrzymaniu DNA od dostawcy, fragment genu jest amplifikowany metodą PCR, cięty, okrężny i kriobankowany. Niewielka ilość zbankowanego DNA jest następnie rozcieńczana i znacznie amplifikowana (do 10,6x) za pomocą izotermicznej amplifikacji toczącego się koła (RCA). RCA może otrzymać mikrogramowe ilości matrycy minimalnej ekspresji z poziomów pikogramów materiału wyjściowego (poziomy mg, jeśli stosuje się cały wyjściowy fragment syntetyczny). W tej pracy początkowa ilość 20 pg dała 4 μg produktu końcowego. Otrzymany produkt RCA (konkatener minimalnego szablonu) może być dodany bezpośrednio do reakcji bezkomórkowej bez etapów oczyszczania. Ze względu na to, że metoda ta jest całkowicie oparta na PCR, może ona umożliwić przyszłe badania przesiewowe o wysokiej przepustowości w połączeniu ze zautomatyzowanymi systemami obsługi cieczy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekspresja genów bez komórek (CFE) stała się potężnym narzędziem o wielu zastosowaniach. Do takich zastosowań należą wykrywanie chorób1,2,3,4,5,6, wykrywanie mikroelementów i małych cząsteczek7,8,9,10,11,12, biomanufacturing13,14,15,16,17,18, education19,20,21, produkcja trudnych białek17,22,23,24,25,26,27, oraz screening23,28,29,30,31,32,33. Wynika to z otwartego charakteru systemów bezkomórkowych i elastyczności, jaką zapewniają. Wiele świetnych artykułów przeglądowych oferuje edukację historyczną i przyszłe perspektywy na technologię34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44.

Typowa reakcja bezkomórkowa składa się z trzech głównych składników: ekstraktu komórkowego, mieszanki energetycznej i szablonu genetycznego. Aktywny ekstrakt komórkowy zawiera wszystkie niezbędne mechanizmy do transkrypcji i translacji (TXTL) i może być przetwarzany na wiele sposobów36. Glikolityczne produkty pośrednie, elektrolity, aminokwasy i kofaktory w miksie energetycznym wspomagają proces TXTL. Jest to główne źródło zmienności w eksperymentach bezkomórkowych45 i może być przygotowany na wiele sposobów34,46. Przygotowanie matrycy genetycznej przyniosło mniej ulepszeń, ponieważ tradycyjne metody klonowania dają plazmidy o doskonałych właściwościach ekspresji. Wadą tych tradycyjnych metod jest czas realizacji i ilość wiedzy biologicznej potrzebnej do ich skonstruowania i rozmnażania. Ostatnie działania optymalizacyjne zaowocowały prostymi, 24-godzinnymi przepływami pracy w celu przygotowania ekstraktu komórkowego47,48, które można wykonywać równolegle z przygotowaniem mieszanki energetycznej49,50. Jednak tradycyjne klonowanie dodaje wiele dni do osi czasu prototypowania CFE (Tabela 1)23. Szybko amplifikowane produkty PCR z komercyjnego fragmentu genu mogą być używane bezpośrednio51, ale ogranicza to liczbę eksperymentów prototypowych, ponieważ wytwarzany jest tylko 1 μg DNA, co odpowiada około pięciu reakcjom (tradycyjne objętości 15 μL). Dzięki tym dodatkowym etapom cyrkularyzacji i amplifikacji izotermicznej możliwe jest uzyskanie większej niż miligram ilości DNA (~5000 reakcji na 1 mg). To znacznie zwiększa liczbę testów, które można wykonać w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych białek lub kombinatorycznych sieci enzymatycznych (bezkomórkowa inżynieria metaboliczna); pozwala również na skuteczne zachowanie biblioteki matryc liniowych w postaci DNA o wysokim stężeniu. Co więcej, zwiększona ilość matrycy byłaby niezbędna do prototypowania większych ilości białka potrzebnego do zastosowań w materiałoznawstwie (włókna na bazie białek i hydrożele). Niektóre ograniczenia szablonów liniowych można pokonać, używając ekstraktu z BL21 DE3 Star lub korzystając z niedawno odkrytych metod ochrony szablonów liniowych przed degradacją52,53,54. Nie dotyczy to jednak posiadania ograniczonych zapasów DNA wyprodukowanego przez dostawców do amplifikacji PCR ani kwestii wiedzy biologicznej i sprzętu potrzebnego do klonowania.

Ta praca przedstawia protokół wyraźnie zaprojektowany w celu zwiększenia ilości szablonu ekspresji, który można uzyskać z małych ilości fragmentów genów wyprodukowanych przez dostawcę (zazwyczaj 500-1000 ng liofilizowanego proszku). Opisana metoda nie wymaga umiejętności niezbędnych do wykonywania tradycyjnego klonowania w plazmidach czy transformacji i namnażania w żywych komórkach. Po otrzymaniu fragmentu genu w wiadomości e-mail, użytkownik może wytworzyć wystarczającą ilość szablonów dla wielu reakcji bezkomórkowych, stosując izotermiczną amplifikację toczącego się koła (RCA) (Rysunek 1)23. Chociaż ilość DNA otrzymana od dostawcy może być wystarczająca do ograniczonych wysiłków związanych z badaniami przesiewowymi, szybko się wyczerpuje, a ponowny zakup fragmentów genów jest czasochłonny i kosztowny. Metoda ta jest również szczególnie odpowiednia w przypadku genów, które są toksyczne i trudne do sklonowania w E. coli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie fragmentu genu

UWAGA: Fragment genu powinien zawierać wszystkie niezbędne elementy genetyczne do transkrypcji/translacji, w tym promotor, miejsce wiązania rybosomów (RBS), kodon start, gen będący przedmiotem zainteresowania i terminator. Chociaż terminator nie jest konieczny dla szablonu wyrażenia liniowego (LET), będzie ważny, jeśli użytkownik zdecyduje się wstawić sekwencję do plazmidu. Sekwencje te zostały pobrane z plazmidu pJL1-sfGFP class<="xref">55 (dar z laboratorium Michaela Jewetta), który wykorzystuje promotor T7. Oprócz tych niezbędnych elementów genetycznych, miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego dodaje się sześć par zasad przed promotorem (miejsce cięcia 5') i kolejne sześć par zasad po terminatorze (miejsce cięcia 3'), w tym przypadku przy użyciu HindIII (można użyć innych enzymów restrykcyjnych, ale pomocna jest standaryzacja sekwencji za pomocą jednego enzymu restrykcyjnego o wysokiej wierności, aby zmniejszyć liczbę potrzebną do przechowywania w bibliotece). Miejsca podkładu są dodawane dziesięć par zasad przed miejscem cięcia 5' i dziesięć par zasad poniżej miejsca cięcia 3', w tym przypadku przy użyciu znormalizowanych sekwencji starterów M13 (startery są niedrogimi pozycjami magazynowymi). Miejsce enzymu restrykcyjnego i użyte startery zależą od uznania użytkownika. Użytkownik musi jednak upewnić się, że sekwencje nie są obecne nigdzie indziej w szablonie (nie chce tworzyć niechcianych cięć lub miejsc inicjacji amplifikacji). Sekwencje szablonów użytych w tej pracy są szczegółowo opisane w materiale dodatkowym. Te kroki służą do modyfikowania na podstawie tego szablonu podstawowego.

  1. Określić pożądany gen, który ma ulec ekspresji, i uzyskać sekwencję aminokwasów lub sekwencję genetyczną, jeśli uległa ekspresji w E. coli.
  2. Jeśli jest to sekwencja aminokwasowa, przeprowadź optymalizację kodonów dla E. coli, korzystając z jednego z wielu standardowych narzędzi dostawców56. W przypadku korzystania z szablonu dostarczonego w suplemencie upewnij się, że zoptymalizowana sekwencja nie ma miejsc ograniczeń HindIII (AAGCTT). W takim przypadku kontynuuj optymalizację sekwencji, aż nie będzie już witryny HindIII.
  3. Skopiuj sekwencję i wklej ją do dostarczonego szablonu dla Sekwencji Uzupełniającej #1, w której wskazany jest interesujący gen. Jeśli wyraża sfGFP, użyj Sekwencji Uzupełniającej #1 bez zmian. W przypadku wyrażania subtylizyny należy użyć Sekwencji Uzupełniającej #2 w takiej postaci, w jakiej jest.
  4. Zamów minimalny szablon i niezbędne startery w preferowanej usłudze syntezy DNA.

2. Ponowne zawieszenie fragmentu genu i starterów

UWAGA: Po otrzymaniu fragmentu genu, postępuj zgodnie z protokołami producenta dotyczącymi ponownego zawieszenia lub skorzystaj z tego prostego przewodnika, aby stworzyć zapas DNA.

  1. Odwirować probówkę (300 x g przez 5 s), aby zebrać osad DNA na dnie.
  2. Dodać podwójnie destylowaną wodę (ddH2O), aby uzyskać końcowe stężenie 10 ng/μl matrycy DNA.
  3. Wiruj roztwór na podłożu przez 5-10 sekund.
  4. Rozpuścić cały osad przez inkubację w temperaturze 50 °C przez 20 minut.
  5. Na krótko znowu wir
  6. Wirować przy 300 x g przez 5 sekund, aby zebrać roztwór na dnie probówki.
  7. Przechowywać w temperaturze -20 °C lub stosować w PCR.
  8. Przygotuj zapas starterów 100 μM, ponownie zawieszając je w wodzie wolnej od nukleaz. Aby określić ilość wody do dodania, pomnóż liczbę nanomoli liofilizowanego startera przez 10. Na przykład, jeśli probówka zawiera 45 nM liofilizowanego startera, dodaj 450 μl ddH2O i zwiruj roztwór.
  9. Roztwory podstawowe startera należy przechowywać w temperaturze -20 °C lub kontynuować amplifikację.

3. Amplifikacja fragmentu genu metodą PCR

UWAGA: Zdecyduj, który zestaw do PCR jest odpowiedni dla interesującego genu. Mniejsze geny (<1000 kb) mogą być bardziej podatne na tańszą polimerazę Taq, podczas gdy większe geny (≥1000 kb) mogą skorzystać z polimerazy o wysokiej wierności w celu zmniejszenia błędów. Ważne jest, aby pamiętać, że ta początkowa amplifikacja PCR nie jest konieczna, jeśli użytkownik nie jest zainteresowany zachowaniem początkowego fragmentu genu (zapewnia wiele prób cyrkularyzacji i pozwala na badania porównawcze produktu LET i RCA). Ważne jest również, aby pamiętać, że ten LET z amplifikacją PCR może być stosowany bezpośrednio w reakcjach; Jednak, jak wspomniano we wstępie, pozwoliłoby to na ograniczoną liczbę reakcji, gdyby dalsze kroki amplifikacji zostały zignorowane. Trawienie i ligację można przeprowadzić bezpośrednio na zawieszonym fragmencie genu57 (jeśli ktoś jest pewien, nie będzie potrzebował więcej LET do wykonania dodatkowych zapasów cyrkularyzacji). W takim przypadku pomiń sekcję 3 i przejdź do sekcji 4. Aby wykonać PCR, wykonaj następujące kroki.

  1. Użyj zapasów 100 μM z kroku 2.8, aby utworzyć roztwory robocze 10 μM. Wiele protokołów zestawów PCR wymaga roztworów starterów o wielkości 10 μM.
  2. Zaprogramuj termocykler tak, aby przeprowadzał reakcję zgodnie z protokołami producenta zestawu. Różne zestawy wymagają nieco zróżnicowanych parametrów rowerowych. Dla zestawu wymienionego w tabeli materiałów warunki wynoszą 94 °C przez 30 s początkowej denaturacji; 30 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 s denaturacji, 45 °C przez 30 s wyżarzania podkładu i 68 °C przez 60 s przedłużania; z końcowym przedłużeniem w temperaturze 68 °C przez 5 minut; i wreszcie bezterminowe utrzymywanie w temperaturze 10 °C.
    1. Upewnij się, że wybrałeś właściwy czas elongacji (zmienny w zależności od długości genu, który ma być amplifikowany). Mają czas wydłużenia wynoszący 1 minutę na każde 1 000 pz.
    2. Upewnij się, że wprowadzono prawidłową temperaturę wyżarzania dla podkładów. Skorzystaj z internetowego kalkulatora Tm, który wykorzystuje oba startery jako dane wejściowe do określenia najlepszej temperatury wyżarzania58. Temperatura wyżarzania wynosząca 45 °C jest wystarczająca w przypadku stosowania podkładów M13.
    3. Przy określaniu liczby cykli należy zapoznać się z protokołem producenta, ale 30 cykli najczęściej spowoduje wystarczające wzmocnienie.
  3. Jeśli wykonujesz PCR, rozmrozić i odwirować dNTP. Użyj buforu PCR dostarczonego w zestawie.
  4. W jednej probówce do PCR połącz wszystkie elementy zestawu zgodnie z zaleceniami w protokole producenta. Aby zapewnić pomyślną amplifikację, dodać 1 μl zawieszonego materiału wyjściowego DNA (krok 2.6).
  5. Delikatnie homogenizować mieszaninę, wirując na pożywce przez 5-10 s. Alternatywnie, odpipetuj połowę objętości w górę i w dół 10-20 razy, aby uzyskać wir.
  6. Wykonaj reakcję PCR.
  7. Jeżeli protokół PCR nie obejmował końcowego etapu chłodzenia, przed usunięciem należy pozostawić reakcję do ochłodzenia przez 5 minut w temperaturze 10 °C w celu skierowania kondensatu na dno probówki.
  8. Oczyść reakcję za pomocą zestawu do czyszczenia PCR, postępując zgodnie z instrukcjami dostawcy.
    1. W probówce o pojemności 1,5 ml dodaj bufor wiążący DNA i próbkę PCR w stosunku odpowiednio 5:1.
    2. Przenieść tę mieszaninę do kolumny wirowej i odwirować przy 16 000 x g przez 1 minutę. Wyrzucić przepływ.
    3. Dodać 200 μl buforu do przemywania DNA do kolumny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
    4. Wirować przez 1 minutę przy 16 000 x g i odrzucić przepływ.
    5. Powtórzyć kroki 2.8.3 i 2.8.4 bez etapu inkubacji trwającego 1 minutę.
    6. Wirować przez dodatkowe 1-2 minuty przy 16 000 x g, aby usunąć pozostały bufor.
    7. Eluować DNA w 46 μl ddH2O.
  9. Określić ilościowo oczyszczone DNA za pomocą spektrofotometru.
  10. Przechowywać oczyszczone DNA w temperaturze -20 °C lub przejść do następnego etapu.

4. Trawienie i cyrkularyzacja

UWAGA: Dalsza amplifikacja może być osiągnięta poprzez cyrkularyzację DNA, a następnie RCA. Strawić DNA, aby przygotować matrycę do cyrkularyzacji. Spowoduje to usunięcie sekwencji starterów i utworzenie lepkich końców zarówno na końcach 5', jak i 3' szablonu. Ponownie przymocuj te końce w reakcji podwiązania.

  1. W probówce do PCR połącz 5 μl niezbędnego buforu, 20 μl HindIII i 45 μl oczyszczonego DNA z kroku 3.8.
  2. Delikatnie homogenizuj tę mieszaninę za pomocą pipety.
  3. Inkubować mieszaninę w termocyklerze przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Inaktywować HindIII na gorąco przez inkubację przez 20 minut w temperaturze 80 °C.
  5. Pozostawić reakcję do ostygnięcia do 10 °C przed usunięciem w celu sprowadzenia kondensatu na dno rurki.
  6. Dodać 5 μl buforu ligazy T4 i 800 j. ligazy T4 do nowo strawionego DNA.
    1. W razie potrzeby użyj ligazy T7.
  7. Delikatnie homogenizuj tę mieszaninę za pomocą pipety.
  8. Inkubować mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C w celu przeprowadzenia reakcji cyrkularyzacji.
  9. Oczyść reakcję za pomocą zestawu do czyszczenia PCR, postępując zgodnie z instrukcjami dostawcy. Użyj tego samego protokołu, który został opisany w kroku 3.8.
  10. Określić ilościowo DNA za pomocą spektrofotometru. Oczekiwane wartości to ~20 ng/μL.
  11. Przechowywać w temperaturze -20 °C lub przejść do następnego kroku.

5. Izotermiczne wzmocnienie okręgu tocznego

UWAGA: Wzmocnienie Rolling circle (RCA) może być wykonane przy użyciu zestawu komercyjnego lub z indywidualnie zakupionych komponentów. Postępowanie zgodnie z protokołem producenta zapewni udane wzmocnienie. Zestawy zazwyczaj zawierają bufor próbki, bufor reakcyjny i polimerazę wypierającą nić, taką jak polimeraza φ29. Wiele probówek reakcyjnych można łączyć w celu wytworzenia dużej ilości DNA do ekspresji bezkomórkowej (4 μg z 20 pg materiału wyjściowego). Następujący protokół działa wydajnie.

  1. W pojedynczej probówce połączyć 20 μl buforu próbki, 20 μl buforu reakcyjnego, 0,8 μl enzymu i 1 μl okrągłej matrycy ekspresji (CET) z kroku 4.9.
    UWAGA: Będzie to miało całkowitą masę DNA ~ 20 ng, ale RCA może pracować z ilościami pikogramów, umożliwiając w ten sposób rozcieńczenie CET i ekstremalną amplifikację enzymatyczną, jeśli istnieje znaczne zapotrzebowanie na materiał w wysokoprzepustowym badaniu przesiewowym.
  2. Homogenizować mieszaninę za pomocą pipety i podatkować 10 μl mieszaniny do czterech oddzielnych probówek.
  3. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 4-18 godzin.
  4. Inaktywować enzym na gorąco przez inkubację w temperaturze 65 °C przez 10 minut. Zmniejszyć temperaturę do 12 °C na 5 minut, aby zapobiec kondensacji na dnie probówki.
    UWAGA: Najłatwiej jest połączyć wszystkie kroki temperatury w automatycznym protokole na termocyklerze.
  5. Rozcieńczyć otrzymany roztwór, dodając 15 μl ddH2O do każdej probówki.
  6. Połącz wszystkie probówki i dodaj bezpośrednio do reakcji bezkomórkowej.
  7. W razie potrzeby użyj zestawu do czyszczenia PCR, aby oczyścić produkt i eluować go w 36 μl ddH2O w celu określenia ilościowego. Upewnij się, że stężenie matrycy wynosi ~100 ng/μL.

6. Reakcja bezkomórkowa

UWAGA: Wykonaj ekspresję bez komórki, łącząc bufor energii, ekstrakt i szablon RCA. Typowa reakcja bezkomórkowa z wykorzystaniem bufora energetycznego PANOx-SP składa się z 1,2 mM ATP, po 0,85 mM GMP, UMP i CMP, 30 mM fosfoenolopirogenianianu, 130 mM glutaminianu potasu, 10 mM glutaminianu amonu, 12 mM glutaminianu magnezu, 1,5 mM spermidyny, 1 mM putrescyny, 34 μg/ml kwasu folinowego, 171 μg/ml mieszaniny tRNA E. coli, 2 mM każdy z 20 nieznakowanych aminokwasów, 0,33 mM NAD, 0,27 mM koenzymu A (CoA), 4 mM szczawianu potasu, 57 mM buforu HEPES-KOH (pH 7,5), 0,24% objętości ekstraktu E. coli i zmienne ilości DNA23,49. Objętość reakcji może się różnić, ale 15 μl reakcji pozwala zaoszczędzić na zużyciu odczynnika i jest wystarczająco małe, aby można je było zastosować w mikropłytce o czarnych ściankach 38449,50.

  1. W przypadku ekspresji białka fluorescencyjnego, takiego jak sfGFP, należy przygotować czytnik płytek do odczytu przy pożądanym wzbudzeniu/emisji, temperaturze i mieszaniu.
  2. W przypadku stosowania płytki 384-dołkowej należy wprowadzić 60 μlH2Odo studzienek graniczących z pustą studzienką na próbkę, aby utrzymać wilgotność i zmniejszyć efekt krawędzi.
  3. Dodaj różne wymagane składniki do probówki dla każdej próbki. Dodaj tyle, aby wykonać trzy próby. Powtórzenia w obrębie płytki mogą pomóc w zidentyfikowaniu przyczyn zmienności.
    1. Dodaj ekstrakt, bufor energetyczny, a następnie DNA.
    2. Rozcieńczyć do ostatecznej pożądanej objętości za pomocą ddH2O.
  4. Dokładnie wymieszać ten roztwór, pipetując połowę objętości roztworu w górę i w dół 10-20 razy.
  5. Przenieść mieszaninę reakcyjną w 15 μl podwielokrotności do żądanych dołków na płytce do mikromiareczkowania.
  6. Uszczelnij płytkę bezbarwną folią uszczelniającą, aby utrzymać wilgotność i zapobiec parowaniu.
  7. Umieścić zapieczętowaną płytkę w czytniku płytek i poczekać, aż reakcja się zakończy.
    1. W przypadku ekspresji białka, które nie ma możliwości monitorowania na żywo, należy użyć innego urządzenia o kontrolowanej temperaturze, takiego jak termoblok, do inkubacji płytki.

7. Test subtylizyny

UWAGA: Jeśli w Sekwencji Uzupełniającej #2 dochodzi do ekspresji genu subtylizyny BPN' (SBT(n)) postępuj zgodnie z tym protokołem, aby ocenić aktywność.

  1. Przygotować 10 μM roztwór podstawowy p-nitroanilidu N-sukcynylo-Ala-Ala-Pro-Phe w dimetyloformamidzie (DMF).
  2. Ustawić czytnik płytek tak, aby mierzył absorbancję przy 410 nm co 20 s przez 10 minut, utrzymując temperaturę 25 °C.
  3. Na płaskiej, bezbarwnej 96-dołkowej płytce, podwielokrotność 94 μl ddH2O i 1 μl N-sukcynylo-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilidu z kroku 7.1.
  4. Dodać 5 μl gotowej reakcji bezkomórkowej z kroku 6.7 i odczytać za pomocą czytnika płytek ustawionego na protokół opisany w kroku 7.2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekspresja sfGFP z matryc RCA była porównywalna do tej z plazmidu pJL1 przy użyciu tylko 0,30 μL nieoczyszczonego DNA RCA w reakcji 15 μL (Rysunek 2A). W rzeczywistości podwojenie i potrojenie ilości matrycy wydaje się nie przynosić żadnych korzyści w ekstrakcie BL21 DE3 Star, co sugeruje już nasycone poziomy matrycy przy 0,30 μl na reakcję. Z drugiej strony, wydaje się, że zwiększenie ilości matrycy RCA po dodaniu do ekstraktu komórkowego pochodzącego ze szczepu SHuffle przynosi korzyści (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interesującym genem może być dowolne pożądane białko, ale najlepiej jest zacząć od białka fluorescencyjnego jako wygodnego reportera do odczytu w czasie rzeczywistym lub punktu końcowego na czytniku płytki studziennej dla nowych użytkowników tej metody. W przypadku nowych sekwencji białek skopiuj sekwencję aminokwasową żądanego białka i wklej ją do żądanego narzędzia do optymalizacji kodonów 61,62. W narzędziu do optymalizacji kodonów zwykle dostępnych jest wiele...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nigel Reuel zasiada w naukowej radzie doradczej BigHat Biosciences Inc., firmy, która wykorzystuje systemy bezkomórkowe do projektowania przeciwciał.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują NIH 1R35GM138265-01 i NSF 2029532 za częściowe wsparcie tego projektu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AlalinaFormediumDOC0102
Glutaminian amonuMP BiomedicalsMP21805951
ArgininaFormediumDOC0106
AsparagineFormediumDOC0114
Kwas asparaginowyFormediumDOC0118
ATPSigmaA2383
Folia uszczelniająca AxygenCorningPCR-SP
CMPSigmaC1006
Koenzym ASigmaC3144
Bufor CutSmartNEBB7204SDostarczany z HindIII
CysteinaFormediumDOC0122
Zestaw do czyszczenia i koncentratora DNAZymo ResearchD4004Służy do oczyszczania DNA
dNTPsNEBN0447
E. coli tRNASigma (Roche) 10109541001
Kwas folinowySigma47612
Fragment genuIDT
Kwas glutaminowyFormediumDOC0134
GlutaminaFormediumDOC0130
GlicynaFormedium
GMPSigmaG8377
HEPESSigmaH3375
HindIII-HFNEBR3104L
HistydynaFormediumDOC0142
IzoleucynaFormediumDOC0150
LeucynaFormediumDOC0154
LizynaFormediumDOC0158
Glutaminian magnezuSigma49605
MetioninaFormediumDOC0166
Płytka do mikromiareczkowania (384 dołki)Płytka do mikromiareczkowania Greiner781906
(96 dołków)Greiner
BioTekSynergy Neo2
NADSigmaN8535
NanofotometrImplenNP80
OneTaq Polimeraza DNANEBM0480
Probówka PCRVWR20170-012
FenyloalaninaFormediumDOC0170
FosfoenolopirogronianSigma (Roche)10108294
Glutaminian potasuSigmaG1501
Szczawian potasuFisher ScientificP273
ProlinaFormediumDOC0174
PutrescynaSigmaP5780
SerineFormediumDOC0178
SpermidynaSigmaS0266
T4 Ligaza DNANEBM0202S
T4 Bufor reakcyjny ligazy DNA NEBB0202S Dostarczanyligazy DNA T4
TempliPhiCytiva25640010używany do
termocykleraRCA BioradC1000 Touch
ThermoblockEppendorfThermoMixer FP
TreoninaFormediumDOC0182
TryptofanFormedium
TyrozynaFormediumDOC0190
UMPSigmaU6375
WalinaFormediumDOC0194
DOC0138Wielomodowy czytnik płytek 655809 z zestawem do amplifikacji DOC0186

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sun, Q., et al. A simple and low-cost paper-based colorimetric method for detecting and distinguishing the GII.4 and GII.17 genotypes of norovirus. Talanta. 225, 121978(2021).
  2. Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  3. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  4. Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), Oxford, England. (2018).
  5. Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using rna toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1772(2021).
  6. Cao, M., Sun, Q., Zhang, X., Ma, Y., Wang, J. Detection and differentiation of respiratory syncytial virus subgroups A and B with colorimetric toehold switch sensors in a paper-based cell-free system. Biosensors and Bioelectronics. 182, 113173(2021).
  7. Mcnerney, M. P., et al. Point-of-care biomarker quantification enabled by sample-specific calibration. Science Advances. 5 (9), (2019).
  8. Silverman, A. D., Akova, U., Alam, K. K., Jewett, M. C., Lucks, J. B. Design and optimization of a cell-free atrazine biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (3), 671-677 (2020).
  9. Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
  10. Garamella, J., Majumder, S., Liu, A. P., Noireaux, V. An adaptive synthetic cell based on mechanosensing, biosensing, and inducible gene circuits. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1913-1920 (2019).
  11. Glasscock, C. J., et al. Dynamic control of pathway expression with riboregulated switchable feedback promoters. ACS Synthetic Biology. 16, (2019).
  12. Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
  13. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  14. Nelson, J. A. D., et al. Hydrofoam and oxygen headspace bioreactors improve cell-free therapeutic protein production yields through enhanced oxygen transport. Biotechnology Progress. 37 (2), 3079(2020).
  15. Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
  16. Ogonah, O. W., Polizzi, K. M., Bracewell, D. G. Cell free protein synthesis: a viable option for stratified medicines manufacturing? A brief history of cell free synthesis systems. Current Opinion in Chemical Engineering. 18, 77-83 (2017).
  17. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Stark, J. C., et al. On-demand biomanufacturing of protective conjugate vaccines. Science Advances. 7 (6), (2021).
  19. Huang, A., et al. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 1-11 (2018).
  20. Stark, J. C., et al. BioBits health: classroom activities exploring engineering, biology, and human health with fluorescent readouts. ACS Synthetic Biology. 8 (5), 1001-1009 (2019).
  21. Stark, J. C., et al. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 33(2018).
  22. Shinoda, T., et al. Cell-free methods to produce structurally intact mammalian membrane proteins. Scientific Reports. 6, (2016).
  23. Dopp, J. L., Rothstein, S. M., Mansell, T. J., Reuel, N. F. Rapid prototyping of proteins: Mail order gene fragments to assayable proteins within 24 hours. Biotechnology and Bioengineering. 116 (3), 667-676 (2019).
  24. Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
  25. Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnology Journal. 11 (2), 274-281 (2016).
  26. Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: New opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16 (2), 269-281 (2016).
  27. Thoring, L., et al. Cell-free systems based on CHO cell lysates: Optimization strategies, synthesis of "difficult-to-express" proteins and future perspectives. PLoS One. 11 (9), (2016).
  28. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Simple, functional, inexpensive cell extract for in vitro prototyping of proteins with disulfide bonds. Biochemical Engineering Journal. 164, 107790(2020).
  29. Isaksson, L., Enberg, J., Neutze, R., Göran Karlsson, B., Pedersen, A. Expression screening of membrane proteins with cell-free protein synthesis. Protein Expression and Purification. 82 (1), 218-225 (2012).
  30. Techner, J. M., et al. High-throughput synthesis and analysis of intact glycoproteins using SAMDI-MS. Analytical Chemistry. 92 (2), 1963-1971 (2020).
  31. Kim, H. C., et al. Implementing bacterial acid resistance into cell-free protein synthesis for buffer-free expression and screening of enzymes. Biotechnology and Bioengineering. 112 (12), 2630-2635 (2015).
  32. Rolf, J., Siedentop, R., Lütz, S., Rosenthal, K. Screening and identification of novel cGAS homologues using a combination of in vitro and in vivo protein synthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), (2020).
  33. Haslinger, K., Hackl, T., Prather, K. L. J. Rapid in vitro prototyping of O-methyltransferases for pathway applications in Escherichia coli. bioRxiv. , (2020).
  34. Dopp, J. L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2018).
  35. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 24(2019).
  36. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  37. Chiba, C. H., Knirsch, M. C., Azzoni, A. R., Moreira, A. R., Stephano, M. A. Cell-free protein synthesis: advances on production process for biopharmaceuticals and immunobiological products. BioTechniques. 70, (2021).
  38. Laohakunakorn, N. Cell-free systems: A proving ground for rational biodesign. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788(2020).
  39. Dondapati, S. K., Stech, M., Zemella, A., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: A promising option for future drug development. BioDrugs. , 1-22 (2020).
  40. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
  41. Khambhati, K., et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  42. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  43. Rosenblum, G., Cooperman, B. S. Engine out of the chassis: Cell-free protein synthesis and its uses. FEBS Letters. 588 (2), 261-268 (2014).
  44. Swartz, J. R. Transforming biochemical engineering with cell-free biology. AIChE Journal. 58 (1), 5-13 (2012).
  45. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
  46. Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
  47. Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-hour workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
  48. Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
  49. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  50. Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e50762(2013).
  51. Schinn, S. M., Broadbent, A., Bradley, W. T., Bundy, B. C. Protein synthesis directly from PCR: Progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 480-487 (2016).
  52. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  53. Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114, 2137-2141 (2017).
  54. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
  55. Addgene: pJL1. , Available from: https://www.addgene.org/69496/ (2021).
  56. IDT Codon Optimization Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool (2021).
  57. Hadi, T., et al. Rolling circle amplification of synthetic DNA accelerates biocatalytic determination of enzyme activity relative to conventional methods. Scientific Reports. 10 (1), 10279(2020).
  58. New England Biolabs Tm Calculator. , Available from: https://tmcalculator.neb.com/#!/main (2021).
  59. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, (2010).
  60. Colant, N., et al. A rational approach to improving titer in Escherichia coli-based cell-free protein synthesis reactions. Biotechnology Progress. 37 (1), 3062(2021).
  61. Burgess-Brown, N. A., et al. Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli: A multi-gene study. Protein Expression and Purification. 59, 94-102 (2008).
  62. Maertens, B., et al. Gene optimization mechanisms: A multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli. Protein Science. 19 (7), 1312-1326 (2010).
  63. Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Genome Research. 1 (1), 17-24 (1991).
  64. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
  65. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
  66. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58882(2019).
  67. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekspresja bezkom rkowaamplifikacja z tocz cym si kr giemminimalna matryca DNAamplifikacja PCRcyklizacja DNAwysokoprzepustowy screeningsyntetyczne fragmenty gen wproces ekspresji bia ekenzymatyczna amplifikacja DNA

Powiązane artykuły