Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mezenchymalne komórki macierzyste regulują fagocytozę makrofagów; Kwantyfikacja i obrazowanie

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62729

⸱

16 lipca 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Molloy College

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół do ilościowego określania i tworzenia dynamicznych obrazów regulacji makrofagów (MΦ) za pośrednictwem mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) fagocytozy nieopsonizowanych cząsteczek drożdży (zymosan), które są sprzężone z cząsteczką fluorescencyjną wrażliwą na pH.

Streszczenie

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) były tradycyjnie badane pod kątem ich właściwości regeneracyjnych, ale ostatnio na pierwszy plan wysunęły się ich cechy immunoregulacyjne. Oddziałują na komórki odpornościowe i regulują ją. Przedmiotem badań jest regulacja aktywności fagocytarnej makrofagów przez MSC. Fagocytoza makrofagów (MΦ) jest ważną częścią wrodzonej odpowiedzi układu odpornościowego na zakażenie, a mechanizmy, za pomocą których MSC moduluje tę odpowiedź, są aktywnie badane. Przedstawiono metodę badania fagocytozy MΦ nieopsonizowanych cząstek zymosanu sprzężonych z cząsteczką fluorescencyjną wrażliwą na pH podczas jednoczesnej hodowli z MSC. Wraz ze wzrostem aktywności fagocytarnej i zamknięciem znakowanych cząstek zymosanu w kwaśnym środowisku fagolizosomu wzrasta intensywność fluorescencji cząsteczki wrażliwej na pH. Przy odpowiednich długościach fal wzbudzenia i emisji aktywność fagocytarną mierzy się za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego, a dane kinetyczne przedstawia się jako zmiany względnych jednostek fluorescencyjnych w okresie 70 minut. Aby wesprzeć te dane ilościowe, zmiana aktywności fagocytarnej jest wizualizowana za pomocą obrazowania dynamicznego. Wyniki uzyskane przy użyciu tej metody pokazują, że w jednoczesnej hodowli MSC zwiększa fagocytozę MΦ nieopsonizowanego zymozanu zarówno nieleczonego, jak i leczonego IFN-γ MΦ. Dane te uzupełniają obecną wiedzę na temat regulacji MSC wrodzonego układu odpornościowego. Metoda ta może być zastosowana w przyszłych badaniach, aby w pełni nakreślić podstawowe mechanizmy komórkowe i molekularne.

Wprowadzenie

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) to komórki progenitorowe, które dają początek komórkom tkanki łącznej. MSC są obecne w tkankach dorosłych ssaków i mogą być izolowane ze szpiku kostnego1. Ze względu na swoje właściwości immunomodulujące, komórki te są szeroko badane2. Wczesne badania koncentrowały się na regulacji limfocytów T przez MSC3,4,5,6, ale ostatnio ich regulacja komórek makrofagów (MΦ), głównego składnika komórkowego odporności wrodzonej, zyskała zwiększoną uwagę7,8,9,10, 11,12,13,14. Znaczenie interakcji MSC-MΦ w leczeniu chorób zapalnych podkreśla fakt, że wyczerpanie monocytów/makrofagów niweluje terapeutyczne efekty MSC w modelach zwierzęcych8. W tym przypadku nacisk kładziony jest na interakcję kontaktową MSC z MΦ. MSC mają zdolność regulowania fenotypu MΦ poprzez promowanie przejścia od odpowiedzi zapalnej do przeciwzapalnej, co prowadzi do działań naprawczych tkanek8,9,10,11, i wiele zrobiono, aby zademonstrować te mechanizmy regulacyjne. W innych okolicznościach MSC może wspierać lub nasilać reakcję zapalną wywołaną przez MΦ12,13 i zwiększać aktywność fagocytarną MΦ14,15. Brakuje jednak krytycznych danych, które określałyby mechanizmy i warunki, w jakich MSC reguluje aktywność fagocytarną MΦ.

MΦ mają rodziny receptorów, które rozpoznają albo opsonizowane (przeciwciało lub dopełniacz, pokryte dopełniaczem), albo nieopsonizowane patogeny, co prowadzi do fagocytozy16. Aktywacja i aktywność tego ostatniego jest słabiej zbadana17. W niezapalnym środowisku in vitro, MSC wzmacnia fagocytozę MΦ nieopsonizowanych patogenów13. Jednak rozpoznawanie nieopsonizowanych patogenów przez MΦ może być zmniejszone po ekspozycji na środowisko zapalne wytwarzane przez limfocyty podczas adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. IFN-γ, uwalniany przez komórki NK i limfocyty efektorowe, działa hamująco na fagocytozę MΦ cząstek nieopsonizowanych18. Opracowano model kohodowli w celu zbadania mechanizmów regulacji fagocytozy MΦ przez bezpośredni kontakt z MSC. Celem przedstawionego eksperymentu jest ustalenie, czy MSC reguluje fagocytozę MΦ nieopsonizowanych patogenów po tym, jak MΦ zostały wystawione na działanie IFN-γ (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie techniki przygotowania pożywki i hodowli komórkowej są przeprowadzane w warunkach aseptycznych przy użyciu komory bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym. Wszystkie opisane etapy inkubacji kultur przeprowadza się przy użyciu inkubatora zaprojektowanego do utrzymywania atmosfery o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.

1. Hodowla komórkowa

  1. Przygotowanie podłoża wzrostowego
    1. W przypadku MSC i LADMAC dodaj 50 ml FBS i 5 ml 100x mieszanki antybiotykowo-przeciwgrzybiczej do 500 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy.
    2. W przypadku MΦ dodać 50 ml FBS, 100 ml pożywki LADMAC (przygotowanej zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 1.2) i 5 ml 100-krotnej mieszanki antybiotyków do 500 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy.
      UWAGA: Komórki LADMAC wytwarzają czynnik stymulujący tworzenie kolonii (CSF-1) niezbędny do wspierania wzrostu komórek MΦ.
  2. Przygotowanie pożywki kondycjonowanej LADMAC
    1. Aby wysiać komórki LADMAC z zamrożonego bulionu, dodać 19 ml pożywki wzrostowej z sekcji 1.1 do każdej z pięciu kolb T75 cm2 poddanych działaniu kultur komórkowych i umieścić w inkubatorze do hodowli komórkowych na 15 minut w celu zrównoważenia do 37 °C.
    2. W międzyczasie szybko rozmrozić jedną porcję10-6 zamrożonych komórek, inkubując w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty lub do momentu rozmrożenia. Dodać komórki do 9 ml świeżej pożywki wzrostowej MSC w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml lub 50 ml i odwirować przy 125 x g w obracającym się wirniku kubełkowym przez 5 minut.
    3. Odessać lub zdekantować supernatant, dodać 5 ml świeżej pożywki wzrostowej i delikatnie pipetować w górę iw dół, aby ponownie zawiesić osad komórkowy.
    4. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do każdej z pięciu kolb T75 cm2 za pomocą sterylnej pipety serologicznej i umieścić je w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    5. Co 2-3 dni dodawaj dodatkowe 10 ml pożywki przez okres 7-10 dni. Następnie zebrać komórki i supernatant do sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml za pomocą sterylnej pipety serologicznej i odwirować przy 125 x g przez 5 minut.
    6. Oddzielić supernatant od osadu komórkowego i sterylnie przefiltrować supernatant za pomocą sterylnego jednorazowego filtra próżniowego o wielkości 0,2 μm.
      1. Wyjmij zespół aspiratora z opakowania i podłącz za pomocą rurki próżniowej do pompy aspiratora. Wlej supernatant do górnej komory i załóż pokrywę. Włącz pompę aspiratora, aby przefiltrować do dolnej komory.
      2. Przygotować podwielokrotności przez pipetowanie do sterylnych probówek stożkowych o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    7. Aby zamrozić osad komórkowy, należy go ponownie zawiesić w podłożu zamrażającym w temperaturze 106 komórek/ml, umieścić w pojemniku do zamrażania, a następnie umieścić w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Po 24 godzinach przenieś do magazynu LN2.
  3. Rozmnażanie komórek w ramach przygotowań do kohodowli
    1. Aby wysiać komórki MSC i MΦ z zamrożonego bulionu, należy zrównoważyć 9 ml odpowiedniej pożywki wzrostowej przygotowanej w sekcji 1.1 w każdej z czterech naczyń poddanych działaniu hodowli komórkowej o średnicy 100 mm dla każdego typu komórek i umieścić w inkubatorze do hodowli komórkowych na 15 minut.
    2. W międzyczasie szybko rozmrozić porcje 10-6 zamrożonych komórek, inkubując je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty lub do momentu rozmrożenia. Następnie dodać rozmrożone komórki MSC do 9 ml świeżej pożywki wzrostowej MSC i dodać rozmrożone komórki MΦ do 9 ml świeżej pożywki wzrostowej MΦ w sterylnych stożkowych probówkach o pojemności 15 lub 50 ml i odwirować przy 125 x g w wahadłowym wirniku kubełkowym przez 5 minut.
    3. Odessać lub zdekantować supernatant i ponownie zawiesić każdy granulat w 4 ml odpowiedniej świeżej pożywki, delikatnie pipetując w górę i w dół. Dodać 1 ml zawiesiny komórek do każdej z czterech szalek o średnicy 100 mm dla każdego typu komórek, które zostały zrównoważone w kroku 1.3.1.
    4. Włóż szalki z komórkami do inkubatora. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni, aż do uzyskania 70%-80% zlewu.

2. Nasiona MSC w naczyniach eksperymentalnych, Dzień 1

UWAGA: Przed uruchomieniem MSC, zaprojektuj eksperymentalny układ płytki 96-dołkowej do spektrofotometrii fluorescencyjnej oraz szkiełko komorowe do obrazowania dynamicznego. W przypadku płytki 96-dołkowej należy otoczyć dołki doświadczalne studzienkami zawierającymi komórki, ale nie używać ich w teście. Zaznaczyć co najmniej cztery studzienki, które mają być użyte do ślepej próby odczynnika (RBL). Tabela 1 zawiera przykładowy szablon 96-dołkowy, a tabela 2 zawiera przykład szablonu szkiełka 4-dołkowego. Zalecane są czarne lub białe płytki 96-dołkowe z przezroczystym dnem. Optymalna jest prowadnica komorowa ze szkła borokrzemianowego o grubości 1,5 mm, ale liczba komór może być dostosowana w zależności od projektu badania. Schemat blokowy podsumowania następujących metod znajduje się w Rysunek 2.

  1. Przy zbiegu 70%-80% odessać pożywkę wzrostową z kultur na szalkach o średnicy 100 mm i dodać 5 ml PBS w celu wyizolowania MSC.
  2. Odessać PBS, dodać 2 ml 0,05% trypsyny/EDTA i umieścić w inkubatorze hodowli na 3-5 minut.
  3. Po 3 minutach sprawdź odłączenie komórek za pomocą odwróconego mikroskopu. Jeśli komórki są odłączone, przejdź do następnego kroku; Jeśli nie, kontynuuj inkubację przez kolejne 1-2 minuty. Nie inkubować dłużej niż 5-6 minut.
  4. Dodaj 5 ml świeżej pożywki wzrostowej do naczynia z oderwanymi komórkami. Opłucz naczynie za pomocą mieszaniny trypsyny i pożywki i zbierz komórki do czystej, sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą sterylnej pipety serologicznej.
  5. Wirować przez 5 minut przy 125 x g. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml świeżej pożywki wzrostowej, delikatnie pipetując w górę i w dół.
  6. Aby policzyć komórki, dodaj 10 μl zawiesiny komórek do 30 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Następnie odpipetować 10 μl mieszaniny pod szkiełkiem nakrywkowym komory zliczającej hemocytometry.
  7. Za pomocą mikroskopu odwróconego lub jasnego pola, z obiektywem 10x, policz niebarwione (żywotne) komórki w czterech kwadratach o boku1 mm 2. Oblicz liczbę komórek za pomocą wzoru: komórki/ml = liczba komórek/# 1 mm2 kwadraty x współczynnik rozcieńczenia x 104,
    UWAGA: W tym przykładzie liczba kwadratów o wielkości 1 mm2 liczonych wynosi cztery, a współczynnik rozcieńczenia wynosi 4.
  8. Użyj równania C1V1 = C2V2, aby obliczyć i przygotować zawiesinę 1 x 105 komórek/ml. Przygotować 1 ml zawiesiny komórki/ml dla każdej kolumny płytki 96-dołkowej, która ma być napełniona, i 0,75 ml dla każdej komory szkiełka 4-dołkowego, która ma być napełniona zgodnie z projektem płytki.
    UWAGA: C1 = liczba komórek, V1 = to, co jest obliczane, C2 = 1 x 105, V2 = 5,50 ml.
  9. Oznaczyć V1, odjąć go od pożądanych 5,50 ml całkowitej objętości, aby określić objętość świeżej pożywki potrzebnej do przygotowania zawiesiny. Dodać objętość komórek (V1) z oryginalnej zawiesiny do objętości świeżej pożywki, w sumie 5,50 ml z 1 x 105 komórek/ml.
  10. Dodać 100 μl zawiesiny 1 x 105 komórek/ml do każdego dołka płytki 96-dołkowej zgodnie z projektem płytki za pomocą mikropipety wielokanałowej i 530 μl do każdego z dołków szkiełka komorowego za pomocą mikropipety zgodnie ze wzorem płytki. Inkubować przez noc.
    UWAGA: W tym eksperymencie MSC są platerowane w kolumnach 1, 2, 3 i 6 płytki 96-dołkowej (Tabela 1) oraz w dołkach 1 i 2 szkiełka 4-dołkowego (Tabela 2). Dlatego przygotowuje się co najmniej 5,50 ml zawiesiny 1 x 105 komórek/ml. MΦ przy 80% konfluencji są traktowane mediatorami stanu zapalnego w tym samym dniu, w którym MSC są wysiewane na płytkach doświadczalnych.

3. Aktywuj MΦ za pomocą IFN-γ, Dzień 1

  1. Przygotować pożywkę aktywacyjną i zapas IFN-γ.
    1. W przypadku 200 ml pożywki aktywacyjnej dodać 40 mg BSA do 200 ml bezsurowicy DMEM o wysokiej zawartości glukozy i sterylnego filtra za pomocą sterylnego jednorazowego filtra próżniowego 0,2 μm.
    2. Aby przygotować 0,1% BSA/PBS, dodaj 20 mg BSA do 20 ml PBS. Wir do rozpuszczenia. Użyj sterylnego filtra strzykawkowego 0,2 μm, aby przefiltrować do czystej, sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    3. Dodać 1 ml sterylnego 0,1% roztworu BSA/PBS do 100 μg liofilizowanego IFN-γ uzyskać 100 μg/ml roztworu podstawowego. Przechowywać w 50 μl porcji w temperaturze -20 °C.
  2. Aktywuj MΦ za pomocą IFN-γ
    1. Dodać 2,5 μl ze 100 μg/ml IFN-γ na każdy 1 ml potrzebnej pożywki. Na każdą szalkę o średnicy 100 mm, która ma być aktywowana, należy przygotować 10 ml pożywki aktywacyjnej zawierającej IFN-γ o stężeniu 250 ng/ml.
    2. Odessać pożywkę wzrostową z kultur MΦ i zastąpić ją 5 ml pożywki aktywacyjnej bez IFN- γ do płukania.
    3. Odessać pożywkę używaną do płukania i zastąpić ją 10 ml pożywki aktywacyjnej uzupełnionej IFN-γ do naczynia doświadczalnego oraz 10 ml nieuzupełnionej pożywki aktywacyjnej do kontroli. Inkubuj kultury przez 16-24 godziny.

4. Wyizoluj MΦ i przygotuj kokultury, Dzień 2

  1. Usuń pożywkę aktywacyjną z komórek MΦ i zastąp ją 5 ml świeżej pożywki wzrostowej. Delikatnie zeskrob podnośnikiem do komórek i zbierz komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  2. Policz komórki, stosując wykluczenie błękitu trypanowego i hemocytometrię, jak opisano dla MSC w krokach 2.6-2.7.
  3. Korzystając z równania w krokach 2.8-2.9, przygotuj dwie oddzielne zawiesiny po 2 x 105 komórek/ml, jedną z komórkami z kontrolnej i jedną z komórkami z kultur MΦ poddanych działaniu środka.
    UWAGA: Przygotować 1 ml zawiesiny komórki/ml na każdą kolumnę płytki 96-dołkowej, która ma być napełniona, i 0,75 ml na każdą komorę szkiełka 4-dołkowego, która ma być napełniona zgodnie z projektem płytki.
  4. Delikatnie odessać pożywkę z dołków doświadczalnych 96-dołkowej płytki zawierającej MSC. Za pomocą mikropipety wielokanałowej dodać 100 μl poddanej działaniu substancji i kontrolnych zawiesin komórek MΦ do odpowiednich studzienek doświadczalnych z MSC i bez MSC, zgodnie ze wzorem płytki. Inkubować przez noc.
  5. Delikatnie odessać pożywkę z 4-dołkowego szkiełka zawierającego MSC i za pomocą mikropipety dodać 530 μl zawiesiny komórek MΦ do odpowiednich studzienek zgodnie z projektem. Inkubować przez noc.

5. Test fagocytozy, kinetyczny odczyt fluorescencyjnej płytki 96-dołkowej, dzień 3

  1. Ustawianie parametrów testu
    1. W dniu testu należy włączyć czytnik płytek fluorescencyjnych i komputerowo ustawić temperaturę w systemie na 37 °C.
    2. Otwórz oprogramowanie systemu Pro i sprawdź ikonę instrumentu w lewym górnym rogu, aby określić, czy instrument jest podłączony do komputera. Jeśli widoczne jest czerwone kółko z linią, kliknij ikonę instrumentu i wybierz instrument w wyskakującym okienku, aby nawiązać połączenie.
    3. Wybierz opcję Nowy eksperyment, aby uzyskać dostęp do wyskakującego okna Pomocnik konfiguracji płyty. Z menu Plate Set-Up Helper (Pomocnik konfiguracji płyty) wybierz opcję Configure Your Acquisition Settings (Konfiguruj ustawienia pobierania).
    4. Wybierz Monochromator z menu ustawień konfiguracji optycznej. Wybierz FL (fluorescencja) jako tryb odczytu i Kinetic jako typ odczytu.
    5. W tym samym oknie konfiguracji, w obszarze Kategoria, kliknij Długości fal, a następnie ustaw szerokości pasma na 9 nm dla wzbudzenia i 15 nm dla emisji.
    6. Ustaw liczbę par długości fal na 1. Ustaw długości fal LM1 na 510 nm dla wzbudzenia i na 540 nm dla emisji.
    7. Kontynuuj przeglądanie kategorii i wybierz Typ blachy jako następny. Wybierz opcję odpowiadającą używanemu typowi blachy.
      UWAGA: Ważne jest, aby wybór był zgodny z typem płyty. Wysokości odczytu są ustawiane przez system zgodnie z wyborem.
    8. Następnie wybierz obszar odczytu i zaznacz obszar płytki 96-dołkowej uwzględnionej w projekcie eksperymentalnym.
    9. Wybierz PMT i optykę, ustaw wzmocnienie PMT na wysokie i błyski na odczyt na 6. Zaznacz pole obok opcji Czytaj od dołu, jeśli używasz przezroczystej płyty dolnej.
    10. Wybierz Czas i ustaw na 10-minutowe interwały w okresie 70 minut.
    11. Wybierz Potrząśnij, zaznacz pole Przed pierwszym odczytem i ustaw na 5 s. Zaznacz pole Między odczytami i ustaw na 3 s. Ustaw intensywność potrząsania zarówno dla opcji Niskie, jak i Liniowe.
    12. Zamknij okno. Gdy pojawi się okno Pomocnik ustawiania blachy, wybierz opcję Konfiguruj układ blachy. Podświetl dołki BL projektu płyty i kliknij Płyta pusta.
    13. Zaznacz każdy z eksperymentalnych wierszy, kliknij Dodaj, nazwij grupę, a następnie wybierz kolor.
    14. W obszarze Opcje przypisania poniżej projektu blachy wybierz Seria, a następnie zdefiniuj serię w oknie i kliknij przycisk OK. Powtórz te czynności dla każdej grupy.
  2. Przygotować zawiesinę zymosanu
    1. Czekając, aż temperatura systemu osiągnie 37 °C, ponownie zawiesić 1 mg cząstek zymosanu w 5 ml pożywki do obrazowania żywych komórek.
      1. Dodać 1 ml pożywki do obrazowania żywych komórek do fiolki zawierającej cząstki i zebrać je do szklanej probówki hodowlanej. Przepłukać fiolkę dodatkowym 1 ml roztworu do obrazowania i przenieść do tej samej szklanej probówki, aby upewnić się, że wszystkie cząstki zostały przeniesione. Dodać 3 ml dodatkowego roztworu do obrazowania, aby uzyskać 0,2 mg/ml zawiesiny cząstek.
    2. Wir z szybkimi impulsami przez 30-60 s. Następnie użyj sonikatora z sondą, aby wykonać sonifikację za pomocą 60 szybkich impulsów.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby stworzyć jednorodną zawiesinę cząstek i nie pozwolić, aby zawiesina pozostawała zbyt długo przed dodaniem do dołków doświadczalnych. Zbrylanie się powtarza się szybko. Gęstość cząstek na komórkę może wymagać optymalizacji w zależności od zastosowanego źródła, obróbki i gęstości MΦ. W prezentowanych badaniach wykorzystano sprzężone cząstki zymozanu. Dostępne są jednak również sprzężone E. coli i S. aureus.
  3. Dodaj zymosan i odczytaj płytkę
    1. Odessać pożywkę z dołków doświadczalnych i przepłukać 1x 100 μl roztworu do obrazowania żywych komórek. Przepłucz studzienki RBL roztworem do obrazowania żywych komórek.
    2. Odessać roztwór do obrazowania żywych komórek z dołków doświadczalnych i RBL i zastąpić go 100 μl zawiesiny cząstek zymosanu przygotowanej w sekcji 5.2.
    3. Otwórz tacę na płytki czytnika fluorescencyjnego za pomocą interfejsu panelu dotykowego. Umieść talerz bez pokrywki w tacce z dołkiem A1 w lewym górnym rogu. Zamknij zasobnik za pomocą touchpada i kliknij zielony przycisk Czytaj w górnym menu.
    4. Po zakończeniu odczytu zapisz plik w odpowiednim folderze i wyeksportuj dane w formacie arkusza kalkulacyjnego, klikając Plik i wybierając Eksportuj.
    5. Obliczyć średnią ± względną fluorescencję SEM dla każdej grupy kontrprób w każdym punkcie czasowym (10 min, 20 min, 30 min itd.) w arkuszu kalkulacyjnym (plik uzupełniający 1) i przenieść dane do oprogramowania do tworzenia wykresów.
    6. Użyj formatu wykresu liniowego, aby przedstawić dane i zastosuj dwukierunkową ANOVA (czas x leczenie/MSC jako czynniki), a następnie test wielokrotnych porównań Tukeya w celu określenia różnic między poszczególnymi grupami.
      UWAGA: Podczas odczytywania płytki 96-dołkowej należy przygotować płytkę do obrazowania dynamicznego do akwizycji obrazu poklatkowego. Upewnij się, że obrazowanie dynamiczne jest kontynuowane z analizą jednego odwiertu doświadczalnego na raz.

6. Test fagocytozy, obrazowanie dynamiczne, Dzień 3

  1. Włącz system obrazowania i komputer. Kliknij dwukrotnie, aby otworzyć oprogramowanie. Wybierz tryb programu Pro.
  2. Sprawdź obszar stolika, aby upewnić się, że nie ma próbek i nic nie utrudnia ruchu stolika. Następnie kliknij Kalibruj teraz.
  3. W menu Inkubacja na pasku bocznym po prawej stronie zaznacz pole obok H Unit XL i ustaw ją na 37 °C.
    UWAGA: Poczekaj, aż inkubowany etap osiągnie temperaturę bliską temperatury, zanim przygotujesz próbki do obrazowania.
  4. Przepłukać pierwszą studzienkę doświadczalną 750 μl pożywki do obrazowania i zastąpić ją 400 μl zawiesiny cząstek zymosanu przygotowanej w sekcji 5.2. Pozostaw pozostałe dołki w podłożu wzrostowym.
    UWAGA: Może być konieczne ponowne krótkie wirowanie i sonikowanie zawiesiny cząstek, jeśli osiadła na dłużej niż 15 minut.
  5. Umieścić szkiełko na inkubowanym stoliku systemu obrazowania. Ustaw minutnik na 10 minut.
  6. Użyj oprogramowania do obrazowania, wybierz Brightfield na karcie Zlokalizuj, a następnie kliknij ikonę okularu w oknie konfiguracji systemu poniżej. Po założeniu obiektywu 10x użyj okularu i pokrętła ostrości, aby ustawić ostrość na komórkach.
  7. Wybierz kartę Akwizycja, użyj menu rozwijanego Eksperyment, a następnie wybierz zestaw długości fal, który zawiera zestaw filtrów EGFP, aby pomieścić długości fal emisji wzbudzenia 509 nm i 533 nm barwnika wrażliwego na pH.
  8. Gdy na timerze pozostało ~2 minuty, użyj oprogramowania, aby zmienić cel na 20x, klikając ikonę 20x w menu celu.
    1. Kliknij menu Kanały, wybierz filtry EGFP i użyj menu Ekspozycja, aby ustawić czas ekspozycji na 400 ms, aby wykryć wrażliwy na pH zielony fluorofor po zamknięciu go w fagolizosomie.
    2. Kliknij Live i dostosuj ostrość za pomocą pokrętła ostrości.
  9. Kliknij Zatrzymaj, aby wyłączyć światło i zaznacz pole obok eksperymentalnego ustawienia poklatkowego u góry.
  10. W menu Focusing Strategy (Strategia ustawiania ostrości) wybierz opcję Software Autofocus (Autofokus programowy). Z listy rozwijanej w menu Autofokus wybierz Ustawienia inteligentne i zgrubne, aby skrócić czas ekspozycji na światło podczas pracy autofokusa.
  11. W menu Time-Lapse ustaw żądaną liczbę akwizycji na 30-60, a czas interwału na 1 min.
  12. Po ustawieniu parametrów poklatkowych i po 10 minutach dodawania cząstek do pierwszego dołka, kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment, aby rozpocząć akwizycję.
  13. Po zakończeniu akwizycji przy użyciu pierwszego odwiertu doświadczalnego należy powtórzyć kroki 6.4-6.12 dla każdego z pozostałych odwiertów doświadczalnych.
  14. Zapisz wszystkie pliki eksperymentu z datą i parametrami w tytule do odpowiedniego folderu.
  15. Zamknij oprogramowanie. Otwórz ponownie oprogramowanie w trybie przetwarzania i wyeksportuj pliki w formacie MP4 za pomocą menu Eksportuj.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po obliczeniu średniej ± SEM dla każdej grupy we wszystkich punktach czasowych, dane są prezentowane w formie wykresu liniowego z osią Y jako względną intensywnością fluorescencji i osią X jako czasem. Plik uzupełniający 1 zawiera przykład surowych danych z odczytu kinetycznego płytki 96-dołkowej w formacie arkusza kalkulacyjnego.

W tym badaniu, optymalne wyniki przedstawione w Rysunek 3A i Tabela 3 pokazują, że 1) współhodowla z ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Analiza fagocytozy przy użyciu biocząstek sprzężonych z barwnikiem wrażliwym na pH jest stosunkowo nowym narzędziem, które okazało się korzystne w porównaniu z tradycyjnymi cząstkami znakowanymi fluorescencyjnie 12,19,20. W przypadku tradycyjnych cząstek znakowanych fluorescencyjnie możliwa jest tylko analiza punktu końcowego. Wykrywanie przeprowadza się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i/lub spektrofluorometrii po umyciu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez mechanizm NSF Major Research Instrument pod numerami grantów 1626093 i 1919583.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowa mikropłytka polistyrenowaMilliporeSigmaCLS3603-48EA
0,4% roztwór błękitu trypanowegoMilliporeSigmaT8154-20ML
15 ml i 50 ml Stożkowe sterylne probówki wirówkowe z polipropylenuThermoFisher339653
4-dołkowa komorowa szklana z nieusuwalnymi studzienkamiThermoFisher155382PK
Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy (100X)  System obrazowania GibcoThermoFisher15240096
Axiobserver 7Zeiss
(BSA)MilliporeSigmaA8806-1G
Podnośnik komórekMilliporeSigmaCLS3008-100EA
Kolby hodowlane, poddane obróbce kultur tkankowych, powierzchnia 75  cm2, skośna szyja, z nasadką, filtrowanaMilliporeSigmaC7231-120EA
D1 ORL UVA [D1]ATCCCRL-12424Mysza linia komórkowa MSC
DMEM, wysokoglukozowaThermoFisher
kwalifikowana, inaktywowana termicznieHemocytometr ThermoFisher16140071
FisherScientific02-671-51B
I-11.15ATCCCRL-2470Mysz MΦ Linia komórkowa
LADMAC Linia komórkowaATCCCRL-2420Komórki LADMAC wydzielają czynnik wzrostu, czynnik stymulujący tworzenie kolonii 1 (CSF-1).
Rozwiązanie do obrazowania żywych komórekThermoFisherA14291DJ
PBS, pH 7,4ThermoFisher10010031
pHrodo Zielone biocząstki zymosanu KoniugatThermoFisherP35365
Rekombinowany mysi IFN-γPreprotech315-05
Spectramax i3XUrządzenia molekularne
Sterylne jednorazowe filtry próżniowe, 250 ml, 0,2 i mikro; mThermoFisher568-0020
Sterylne filtry strzykawkowe, 0,2 mikrometraThermoFisher723-2520
Szalki hodowlane poddane kulturom tkankowym, 100 mm x 20 mmMilliporeSigmaCLS430167-100EA
Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaThermoFisher25300054
Albumina surowicy bydlęcej płodowa surowica bydlęca 11965092,

Bibliografia

  1. Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
  2. Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
  3. Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
  4. Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988(2011).
  5. Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
  6. Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65(2013).
  7. Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088(2010).
  8. Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
  9. Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252(2010).
  10. Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
  11. Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
  12. Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56(2015).
  13. Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70(2014).
  14. Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257(2017).
  15. Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
  16. Chaplin, D. D. Overview of the immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), Suppl 2 3-23 (2010).
  17. Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
  18. Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
  19. Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
  20. Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
  21. Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mezenchymalne kom rki macierzystemetoda kokulturyodporno wrodzonatest fagocytozycz steczki zymozanuobrazowanie fluorescencyjneinterferon gammaliczenie kom rekfluorescencja fagolizosom w
Mezenchymalne komórki macierzyste regulują fagocytozę makrofagów; Kwantyfikacja i obrazowanie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.