Artykuł metodologiczny

Pomiar pH, chemii redoks i zdolności degradacyjnej makropinosomów za pomocą mikroskopii ratiometrycznej z podwójnym fluoroforem

DOI:

10.3791/62733

⸱

19 sierpnia 2021

 , 
1Department of Biochemistry & Microbiology, Faculty of Science, University of Victoria, 2Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, Faculty of Veterinary Science, University of Calgary, 3Calvin, Joan and Phoebe Snyder Institute for Chronic Diseases, University of Calgary

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokoły pomiaru pH, zdarzeń oksydacyjnych i trawienia białek w poszczególnych makropinosomach w żywych komórkach. Nacisk kładziony jest na mikroskopię ratiometryczną z podwójnym fluoroforem i zalety, jakie oferuje w porównaniu z technikami populacyjnymi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach dziedzina makropinocytozy szybko się rozwinęła. Makropinocytoza stała się centralnym mechanizmem, dzięki któremu wrodzone komórki odpornościowe utrzymują homeostazę i odporność organizmu. Jednocześnie, w przeciwieństwie do swojej roli homeostatycznej, może również napędzać różne patologie, w tym raka i infekcje wirusowe. W przeciwieństwie do innych trybów endocytozy, narzędzia opracowane do badania dojrzewania makropinosomów pozostają słabo rozwinięte. W tym miejscu protokół opisuje nowo opracowane narzędzia do badania środowiska redoks w świetle wczesnych i dojrzewających makropinosomów. Opisano metodyki wykorzystania ratiometrycznej mikroskopii fluorescencyjnej do oceny pH, produkcji reaktywnych form tlenu oraz zdolności degradacyjnej w świetle poszczególnych makropinosomów w żywych komórkach. Pomiary pojedynczych organelli mają tę zaletę, że ujawniają niejednorodność czasoprzestrzenną, która często jest tracona w przypadku podejść populacyjnych. Nacisk kładziony jest na podstawowe zasady podwójnej fluoroforowej mikroskopii ratiometrycznej, w tym wybór sondy, oprzyrządowanie, kalibrację oraz metody oparte na pojedynczych komórkach i populacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makropinocytoza odnosi się do pobierania dużych ilości płynu zewnątrzkomórkowego do połączonych błoną organelli cytoplazmatycznych zwanych makropinosomami1,2. Jest to wysoce konserwatywny proces wykonywany przez wolno żyjące organizmy jednokomórkowe, takie jak ameba Dictyostelium spp. 3, a także anthozoans4 i metazoans2. W większości komórek makropinocytoza jest zdarzeniem indukowanym. Podwiązanie receptorów na powierzchni komórki indukuje wysunięcie się napędzanych aktyną rozszerzeń błony plazmatycznej, zwanych falbanami. Część tych falban, za sprawą jakiegoś słabo poznanego mechanizmu, uszczelnia się na swoich dystalnych końcach, tworząc makropinosomy (chociaż poza zakresem tego artykułu metodologicznego, szczegółowe przeglądy mechaniki makropinocytozy można znaleźć w bibliografii1,2,5,6,7). Bodźcem zewnątrzkomórkowym indukującym makropinocytozę jest najczęściej rozpuszczalny czynnik wzrostu5,8. W związku z tym zdarzenie makropinocytarne pozwala na spożycie bolusa materiału zewnątrzkomórkowego, z którego komórka może czerpać użyteczne metabolity ułatwiające wzrost. Niestety, ta ścieżka dostarczania składników odżywczych może również napędzać patologię. Niektóre komórki rakowe zawierają mutacje, które powodują ciągłą lub konstytutywną makropinocytozę. Ciągłe dostarczanie składników odżywczych ułatwia niekontrolowaną proliferację komórek rakowych i jest powiązane ze szczególnie agresywnymi nowotworami9,10,11,12,13. Podobnie, wirusy mogą indukować makropinocytozę, aby uzyskać dostęp do komórek gospodarza, napędzając w ten sposób patologię wirusową14.

Makropinocytoza również przyczynia się do utrzymania odporności na patogeny. Niektóre wrodzone komórki odpornościowe, takie jak makrofagi i komórki dendrytyczne, angażują się w konstytutywne i agresywne pobieranie próbek płynu zewnątrzkomórkowego za pomocą makropinocytozy6,15,16. Ten rodzaj makropinocytozy jest niezwykle aktywny, a pojedyncza komórka dendrytyczna może nabrzmiewać objętością płynu zewnątrzkomórkowego równą jej własnej wadze co godzinę17. Pomimo tego konstytutywnego pobierania próbek, makrofagi i komórki dendrytyczne nie replikują się w niekontrolowany sposób, tak jak komórki nowotworowe, zamiast tego wydają się przetwarzać materiał zewnątrzkomórkowy w taki sposób, że można wydobyć informacje informujące o obecności lub nawet braku potencjalnych zagrożeń. Informacje są pozyskiwane jako i) wzorce molekularne związane z patogenami, które mogą być odczytane przez wewnątrzkomórkowe receptory rozpoznające patogeny oraz ii) krótkie odcinki aminokwasów, które można załadować do głównych cząsteczek zgodności tkankowej w celu przeprowadzenia badań przesiewowych przez komórki adaptacyjnego układu odpornościowego16,18,19. To, czy patogeny zakłócają ten szlak przetwarzania informacji przez komórki odpornościowe, jest obecnie niejasne.

Pomimo tych dobrze zdefiniowanych i krytycznych ról makropinocytozy zarówno w utrzymaniu odporności, jak i homeostazy, a także w przeciwieństwie do innych, częściej badanych sposobów endocytozy, niewiele wiadomo o wewnętrznych (luminalnych) funkcjach makropinosomów. Opracowanie ustandaryzowanych protokołów i narzędzi do badania biochemii luminalnej makropinosomów nie tylko pomoże nam lepiej zrozumieć ich unikalną biologię, ale także dostarczy informacji, które można wykorzystać do nowych strategii terapeutycznych, w tym dostarczania leków20. Niniejszy manuskrypt metody skupi się na niedawno opracowanych narzędziach do analizy, na poziomie pojedynczych organelli, różnych aspektów biochemii luminalnej makropinosomów.

Fluorofory mogą być używane do pomiaru specyficznych biochemii organelli, jeśli i) rozdzielają się preferencyjnie na interesujący nas przedział i/lub ii) ulegają zmianom widmowym w odpowiedzi na interesujący ich parametr. Na przykład w przypadku pH słabe zasady fluorescencyjne, takie jak pomarańcz akrydynowy, fiolet krezylowy i barwniki LysoTracker, gromadzą się preferencyjnie w kwaśnych organellach. Dlatego ich względna intensywność jest przybliżonym wskaźnikiem, że oznakowane organelle są kwaśne. Inne fluorofory reagujące na pH, takie jak fluoresceina, pHrodo i cypHer5e, ulegają zmianom widmowym po związaniu się z protonami (Rysunek 1A-C). Zmiany w emisji fluorescencji fluoroforów wrażliwych na pH mogą zatem stanowić użyteczne przybliżenie pH. Stosowanie pojedynczych fluoroforów ma jednak szereg wad. Na przykład zmiany w płaszczyźnie ogniskowej, fotowybielanie i zmiany objętości poszczególnych organelli, powszechne zjawisko w makropinosomach21, mogą indukować zmiany w intensywności fluorescencji pojedynczych fluoroforów, a tego nie można łatwo skorygować dla22. Oceny pojedynczej długości fali, choć przydatne do wizualizacji przedziałów kwasowych, są zatem czysto jakościowe.

Bardziej ilościowym podejściem jest celowanie w wrażliwy na parametry fluorofor wraz z fluoroforem referencyjnym do interesujących organelli. Fluorofor referencyjny jest idealnie niewrażliwy na zmiany biochemiczne w organellach (Rysunek 1D-F) i dlatego może być używany do korygowania zmian w płaszczyźnie ogniskowej, objętości organellarów i, do pewnego stopnia, fotowybielania23. Stosując to podejście, określane jako fluorescencja ratiometryczna podwójnego fluoroforu, korekcję można osiągnąć poprzez wygenerowanie stosunku emisji fluorescencji fluoroforu wrażliwego na parametry do fluoroforu referencyjnego.

Tutaj protokół będzie wykorzystywał zasadę obrazowania ratiometrycznego z podwójnym fluoroforem do pomiaru pH, zdarzeń oksydacyjnych i degradacji białek w makropinosomach. W każdym przypadku zostanie wybrany fluorofor, który jest wrażliwy na interesujący nas parametr oraz fluorofor referencyjny. W celu ukierunkowania fluoroforów specyficznie na makropinosomy, zostaną one kowalencyjnie sprzężone z dekstranem o sile 70 kDa, który jest preferencyjnie włączony do makropinosomów24. Wszystkie testy zostaną przeprowadzone w komórkach Raw264.7, ale można je dostosować do innych typów komórek. Tam, gdzie to możliwe, współczynniki fluorescencji zostaną skalibrowane względem krzywej odniesienia w celu uzyskania wartości bezwzględnych. Co ważne, wszystkie pomiary będą wykonywane w żywych komórkach w celu dynamicznej i ilościowej oceny środowiska świetlnego makropinosomów.

Przy wyborze fluoroforów wrażliwych na pH, należy wziąć pod uwagę kilka czynników. Pierwszym z nich jestpK a fluoroforu, który wskazuje zakres wartości pH, przy których sonda będzie najbardziej czuła. Jeśli założymy, że wkrótce po utworzeniu pH makropinosomu będzie zbliżone do pH podłoża zewnątrzkomórkowego (~pH 7,2) i że będzie on stopniowo zakwaszał się poprzez interakcje z późnymi endosomami i lizosomami (~pH 5,0), należy wybrać sondę o pKa, która jest czuła w tym zakresie (Rysunek 2C). Fluorofor fluoresceina, który mapK a 6,4, jest optymalnie czuły w tym zakresie. Był szeroko stosowany do pomiaru innych podobnych organelli, takich jak fagosomy, i będzie fluoroforem z wyboru w tym manuskrypcie22,25. Jako fluorofor referencyjny zostanie użyta tetrametylorodamina, która jest niewrażliwa na pH (Rysunek 1E). Inne fluorofory, takie jak pHrodo i cypHer5e, mogą być zastąpione fluoresceiną, jeśli właściwości spektralne fluoresceiny pasują do innych zmiennych eksperymentalnych. Niektóre sugerowane fluorofory referencyjne dla pHrodo i cypHer5e są pokazane na Rysunek 1.

Drugą kwestią jest metoda, za pomocą której te dwa fluorofory będą kierowane konkretnie do makropinosomów. Dekstran o wielkości 70 kDa, który ma promień hydrodynamiczny około 7 nm, nie przykleja się niespecyficznie do komórek i jest wbudowywany w makropinosomy, ale nie w jamach pokrytych klatryną lub kaweolach, a zatem oznacza makropinosomy (Rysunek 2A i Rysunek 3A,B)16,24,26. W tym protokole dekstran 70 kDa znakowany fluoresceiną i dekstran 70 kDa znakowany tetrametylorodaminą (TMR) zostaną użyte odpowiednio jako sondy wrażliwe na pH i referencyjne.

W wrodzonych komórkach odpornościowych, makropinocytoza i fagocytoza reprezentują dwie główne drogi internalizacji materiału egzogennego do przetworzenia i późniejszej prezentacji komórkom adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej27. Staranna i skoordynowana kontrola składu chemicznego redoks światła fagosomów i makropinosomów ma kluczowe znaczenie dla kontekstowego przetwarzania materiału egzogenicznego. Być może najlepiej zbadanym regulatorem zdarzeń oksydacyjnych w fagosomach jest oksydaza NADPH, duży kompleks wielopodjednostkowy, który wytwarza duże ilości reaktywnych form tlenu (ROS) w świetle fagosomów28. Rzeczywiście, jego aktywność ma kluczowe znaczenie dla odpowiedniego przetwarzania antygenu w fagosomach29,30. Jednak aktywność oksydazy NADPH na błonach makropinosomalnych nie została zbadana.

W tym protokole, H2DCFDA ester sukcynimidylu jest używany do pomiaru zdarzeń oksydacyjnych w makropinosomie. Jest to zmodyfikowana forma fluoresceiny (dioctan 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny), która jest minimalnie fluorescencyjna w swojej zredukowanej formie. Po utlenieniu jego emisja fluorescencji znacznie wzrasta. Warto jednak zwrócić uwagę na istotne zastrzeżenie H2DCFDA - ponieważ opiera się na fluoroforze fluoresceinie, jego fluorescencja jest również wygaszana w komorach kwaśnych i należy zadbać o kontrolę tej zmiennej podczas projektowania eksperymentów28. Podobnie jak w przypadku podejścia do pomiaru pH, H2DCFDA ester sukcynimidylowy zostanie kowalencyjnie przyłączony do dekstranu 70 kDa, a dekstran 70 kDa znakowany TMR zostanie użyty jako fluorofor referencyjny (Rysunek 3A).

Fluorescencyjna albumina jaja kurzego będzie używana do pomiaru degradacji białek w makropinosomach. Zastosowana tutaj albumina jaja kurzego jest gęsto znakowana barwnikiem FL 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY), który ulega samogaszeniu. Po trawieniu uwalniane są silnie fluorescencyjne peptydy znakowane barwnikiem. Ponieważ albuminy jaja kurzego nie można łatwo sprzęgnąć z dekstranem 70 kDa, komórki z dekstranem 70 kDa znakowanym TMR i albuminą jaja kurzego w fazie płynnej będą inkubowane. Sygnał TMR zostanie wykorzystany do wygenerowania maski makropinosomu podczas analizy po obrazowaniu, a sygnał uwolniony z strawionej albuminy jaja kurzego zostanie zmierzony w masce (Rysunek 3B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórek

  1. Hoduj komórki Raw264.7 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do 70% konfluencji w RPMI uzupełnione 10% surowicą inaktywowaną termicznie.
  2. Dzień przed testem wysiewaj komórki Raw264.7 o gęstości 5 x 104 komórek na dołek na 96-dołkowej płytce. Upewnij się, że każda studzienka zawiera 100 μl pożywki wzrostowej. Upewnij się, że płytka 96-dołkowa ma czarne boki i szklane dno do obrazowania.
    UWAGA: W tym przypadku do obrazowania użyto 96-dołkowych płytek. Płytki 96-dołkowe pozwalają na użycie mniejszych ilości komórek i odczynników w stosunku do większych komór obrazowania. Można jednak użyć dowolnej komory przeznaczonej do obrazowania żywych komórek, a odczynniki można odpowiednio skalować.
  3. W dniu próby sprawdź, czy studzienki są zlewające się w co najmniej 70%.

2. Pomiar pH makropinosomów

  1. Przygotuj komórki jak w rozdziale 1.
  2. Przemyć wszystkie studzienki 100 μl HBSS w temperaturze 37 °C.
  3. Wypełnić każdą studzienkę 100 μl HBSS zawierającego 0,025 mg/ml dekstranu 70 kDa znakowanego TMR i 0,025 mg/ml dekstranu 70 kDa znakowanego fluoresceiną.
  4. Umieścić komórki w inkubatorze ustawionym na 37 °C na 15 minut.
  5. Wyjąć komórki z inkubatora i umyć je 6x 100 μl HBSS.
  6. Napełnić każdą studzienkę 100 μl HBSS w temperaturze 37 °C.
  7. Umieść płytkę na mikroskopie z podgrzewanym stolikiem i komorą.
  8. Dostosuj parametry wzbudzenia/emisji dla każdego fluoroforu zgodnie z potrzebami.
    UWAGA: Idealne warunki do uzyskania obrazu będą się różnić w zależności od użytych fluoroforów i indywidualnych ustawień mikroskopu. W tym przypadku obrazy zostały uzyskane za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Leica SP5. TMR został wzbudzony za pomocą linii laserowej 543, a emisja została zebrana w zakresie od 610 nm do 650 nm. Fluoresceina została wzbudzona za pomocą linii laserowej 488, a emisja została zebrana w zakresie od 500 nm do 550 nm. Użyto obiektywu zanurzeniowego z olejkiem 63x i uzyskano objętość Z 10 μm w odstępach 0,5 μm.
  9. Uzyskaj obraz z każdej studzienki, naprzemiennie między fluoroforami między każdą studzienką.
  10. Po pierwszej akwizycji sprawdź, czy wszystkie dołki pozostały ostre na całej płycie.
  11. Rób zdjęcia każdej studni w odstępach 1-15 minut przez żądany okres czasu.

3. Kalibracja pH makropinosomów in situ

  1. Podczas akwizycji obrazu należy przygotować 1 l roztworu bogatego w potas (bogatego w K+) zawierającego 140 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 i 5 mM glukozy. Uzupełnij jedną objętość 400 ml roztworu bogatego w K+ 25 mM HEPES (z 1 M roztworu podstawowego o pH 7,2) i oddzielną objętość 400 ml roztworem podstawowym 25 mM MES (z 0,5 M roztworu podstawowego o pH 6,0).
  2. W razie potrzeby dostosować 50 ml podwielokrotności roztworu bogatego w K+ buforowanego 25 mM HEPES do pH 7,5 przy użyciu 10 M HCl lub 10 M KOH.
  3. Dostosuj trzy oddzielne 50 ml podwielokrotności roztworu bogatego w K+ buforowanego 25 mM MES do pH 6,5, pH 5,5 i pH 5,0 przy użyciu 10 M HCl lub 10 M KOH w zależności od potrzeb.
    UWAGA: Bufor octanowo-octowy może być preferowany w przypadku roztworów o niższym pH.
  4. Po zakończeniu akwizycji obrazu usuń HBSS z 96-dołkowej płytki zawierającej komórki i zastąp ją roztworem bogatym w K+ o pH 7,5.
  5. Dodać nigerycynę do końcowego stężenia 10 μg/ml.
    UWAGA: Nigerycyna to jonofor, który wymienia K+ na H+. Ustawiając stężenie K+ w roztworze bogatym w K+ na wartość zbliżoną do stężenia K+ w cytozolu, można zapewnić, że nigerycyna ograniczy pH makropinosomu do pH cytozolu, co z kolei odzwierciedla pH buforu kalibracyjnego.
  6. Umieść płytkę z powrotem na mikroskopie i uzyskaj obrazy każdej studzienki przy użyciu tych samych ustawień akwizycji, co powyżej.
  7. Powtórz kroki 3.5 i 3.6 dla każdego bufora kalibracyjnego.

4. Analiza danych dla pH makropinosomów

  1. Korzystając z oprogramowania FIJI, odejmij tło zarówno od TMR, jak i kanału fluoresceiny.
  2. Wygeneruj maskę na kanale TMR. Aby wygenerować maskę, przekonwertuj obraz na obraz binarny, wybierając opcję Dostosuj próg > > Zastosuj. Następnie zaznacz obraz binarny i wybierz Edytuj > zaznaczenie > Utwórz maskę.
  3. Zastosuj go zarówno do obrazów TMR, jak i fluoresceiny. Aby to zrobić, podświetl maskę i wybierz Edytuj > zaznaczenie > Utwórz zaznaczenie. Kliknij obraz TMR i naciśnij Shift + E, aby zastosować maskę do kanału TMR. Podobnie kliknij obraz fluoresceiny i naciśnij Shift + E, aby nałożyć maskę na kanał OB.
  4. Zapisz intensywność TMR i fluoresceiny dla każdego makropinosomu w maskach.
  5. Powtórz kroki 4.1-4.3 dla każdego punktu czasowego z przebiegu czasu.
  6. Powtórz kroki 4.1-4.3 dla obrazów zarejestrowanych w kalibracji in situ.
  7. Podziel intensywność fluoresceiny przez intensywność TMR, aby uzyskać stosunek fluoresceiny do TMR.
  8. Wykreślić pH w stosunku do stosunku fluoresceiny do TMR dla obrazów kalibracyjnych.
  9. Dopasuj krzywą do danych kalibracji.
  10. Interpoluj dane dla każdego punktu czasowego z przebiegu czasu, aby uzyskać bezwzględne wartości pH.

5. Pomiar zdarzeń oksydacyjnych w makropinosomach

  1. Przygotuj komórki jak w rozdziale 1.
  2. Na dzień przed badaniem należy przygotować H2DCFDA ester sukcynimidylowy znakowany dekstranem 70 kDa poprzez ponowne zawieszenie 10 mg dekstroaminy o stężeniu 70 kDa w 1 ml 0,1 M roztworu wodorowęglanu sodu (pH 8,3). Dodać 1 mg estru sukcynimidylowego H2DCFDA do roztworu dekstro-aminowego i inkubować przez 1 godzinę. Dializuj znakowany H2DCFDA dekstran 70 kDa w stosunku do PBS. Nie przechowywać dłużej niż 1 dzień, ponieważ dekstran 70 kDa oznaczony H2DCFDA utlenia się podczas przechowywania.
  3. W dniu przeprowadzenia testu przemyć wszystkie studzienki 100 μl HBSS w temperaturze 37 °C.
  4. Napełnij każdą studzienkę 100 μl HBSS zawierającej 0,025 mg/ml dekstranu 70 kDa znakowanego TMR i 0,025 mg/ml znakowanego H2DCFDA dekstranu 70 kDa.
  5. Umieścić komórki w inkubatorze ustawionym na 37 °C na 15 minut.
  6. Wyjąć komórki z inkubatora i umyć je 6x 100 μl HBSS.
  7. Napełnić każdą studzienkę 100 μl HBSS w temperaturze 37 °C.
  8. Umieść płytkę na mikroskopie z podgrzewanym stolikiem i komorą i dostosuj parametry wzbudzenia/emisji dla każdego fluoroforu zgodnie z potrzebami.
    UWAGA: Idealne warunki do uzyskania obrazu będą się różnić w zależności od użytych fluoroforów i indywidualnych ustawień mikroskopu. Zdjęcia zostały wykonane za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Leica SP5. TMR został wzbudzony za pomocą linii laserowej 543, a emisja została zebrana w zakresie od 610 nm do 650 nm. H2DCFDA został wzbudzony za pomocą linii laserowej 488, a emisja została zebrana w zakresie od 500 nm do 550 nm. Użyto obiektywu zanurzającego w oleju 63x i uzyskano objętość Z 10 μm w odstępach 0,5 μm.
  9. Uzyskaj obraz z każdej studzienki, naprzemiennie między fluoroforami między każdą studzienką.
  10. Po pierwszej akwizycji sprawdź, czy wszystkie dołki pozostają ostre na całej płycie.
  11. Rób zdjęcia każdej studni w odstępach 1-15 minut przez żądany okres czasu.

6. Analiza danych dla zdarzeń oksydacyjnych w makropinosomach

  1. Korzystając z oprogramowania FIJI, odejmij tło zarówno od kanału TMR, jak i H2DCFDA.
  2. Wygeneruj maskę na kanale TMR. Aby wygenerować maskę, przekonwertuj obraz na obraz binarny, wybierając opcję Dostosuj próg > > Zastosuj. Następnie zaznacz obraz binarny i wybierz Edytuj > zaznaczenie > Utwórz maskę.
  3. Zastosuj maskę zarówno do obrazów TMR, jak i H2DCFDA. Aby to zrobić, podświetl maskę i wybierz Edytuj > zaznaczenie > Utwórz zaznaczenie. Kliknij obraz TMR i naciśnij Shift + E, aby zastosować maskę do kanału TMR. Podobnie kliknij H2DCFDA obraz i naciśnij Shift + E, aby zastosować maskę do kanału H2DCFDA.
  4. Zapisz intensywność TMR i H2DCFDA dla każdego makropinosomu w maskach.
  5. Powtórz kroki 4.1-4.3 dla każdego punktu czasowego z przebiegu czasu.
  6. Podziel intensywność H2DCFDA przez intensywność TMR, aby uzyskać stosunek H2DCFDA: TMR.
  7. Wykreśl stosunek H2DCFDA do TMR w czasie.

7. Pomiar trawienia białek w makropinosomach

  1. Przygotuj komórki jak w rozdziale 1.
  2. W dniu przeprowadzenia testu przepłukać wszystkie studzienki 100 μl HBSS w temperaturze 37 °C.
  3. Rozpuścić albuminę jaja kurzego znakowaną bodipy do stężenia 4 mg/ml w HBSS.
  4. Napełnij każdą studzienkę 100 μl HBSS zawierającej 0,025 mg/ml dekstranu 70 kDa znakowanego TMR i 0,2 mg/ml albuminy jaja kurzego znakowanej BODIPY.
  5. Umieścić komórki w inkubatorze ustawionym na 37 °C na 15 minut.
  6. Wyjąć komórki z inkubatora i umyć je 6x 100 μl HBSS.
  7. Napełnić każdą studzienkę 100 μl HBSS w temperaturze 37 °C.
  8. Umieść płytkę na mikroskopie z podgrzewanym stolikiem i komorą i dostosuj parametry wzbudzenia/emisji dla każdego fluoroforu zgodnie z potrzebami.
    UWAGA: Idealne warunki do uzyskania obrazu będą się różnić w zależności od użytych fluoroforów i indywidualnych ustawień mikroskopu. W tym przypadku obrazy zostały uzyskane za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Leica SP5. TMR został wzbudzony za pomocą linii laserowej 543, a emisja została zebrana w zakresie od 610 nm do 650 nm. BODIPY został wzbudzony za pomocą 488-laserowej linii, a emisja została zebrana w zakresie od 500 nm do 550 nm. Użyto obiektywu zanurzeniowego z olejkiem 63x i uzyskano objętość Z 10 μm w odstępach 0,5 μm.
  9. Uzyskaj obraz z każdej studzienki, naprzemiennie między fluoroforami między każdą studzienką.
  10. Po pierwszej akwizycji sprawdź, czy wszystkie dołki pozostają ostre na całej płycie.
  11. Rób zdjęcia każdej studni w odstępach 1-15 minut przez żądany okres czasu.

8. Analiza danych dotyczących trawienia białek w makropinosomach

  1. Korzystając z oprogramowania FIJI, odejmij tło zarówno od kanałów TMR, jak i BODIPY.
  2. Wygeneruj maskę na kanale TMR i zastosuj ją zarówno do obrazów TMR, jak i BODIPY, jak w krokach 6.2 i 6.3 powyżej (Rysunek 3B).
  3. Zapisz intensywność TMR i BODIPY dla każdego makropinosomu w maskach.
  4. Powtórz kroki 4.1-4.3 dla każdego punktu czasowego z przebiegu czasu.
  5. Podziel intensywność BODIPY przez intensywność TMR, aby uzyskać stosunek BODIPY:TMR.
  6. Wykreśl stosunek BODIPY:TMR w czasie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas pomiaru pH makropinosomów istnieje okres czasu, dla którego dynamika zakwaszenia nie może być zmierzona. Okres ten odpowiada fazie ładowania dekstranu (szare pole w Rysunek 2C i Rysunek 3C,D) i będzie się różnić w zależności od użytego typu komórki. Długość fazy ładowania będzie się różnić w zależności od (i) aktywności makropinocytarnej komórek oraz (ii) czułości użytego instrumentu. Zaleca się dostosowanie tego okresu na początku każdego eksperymentu w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż istnieje wiele protokołów zarówno do nisko-, jak i wysokoprzepustowych pomiarów wychwytu makropinocytarów w makrofagach, fibroblastach, a nawet Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33, podjęto bardzo niewiele prób zmierzenia biochemii światła tych dynamicznych przedziałów. Jest to prawdopodobnie spowodowane niedostatkiem sond, które można skutecznie u...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Uniwersytetowi w Calgary za wsparcie. Chcielibyśmy również podziękować dr Robinowi Yatesowi za dostęp do odczynników, sprzętu i przydatne dyskusje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Czarnościenna 96-dołkowa płytkaPerkinElmer6005430
CypHer5e, NHS esterCytivaPA15401
Dekstran-amino 70 kDaInvitrogenD1862
DQ-albumina jaja kurzegoInvitrogenD12053
FITC-dekstran 70 kDaInvitrogenD1823
HBSSGibco14287
NigericinSigma AldrichN7143
OxyBurst Green-SEInvitrogenD2935
pHrodo Red, SEInvitrogenP36600
Raw264.7 cellsATCCTIB-71
RPMI mediumGibco11875093
SP5 Mikroskop konfokalnyLeica-
TRITC-dekstran 70 kDaInvitrogenD1819
AntenaIbidi81156

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  2. Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766(2017).
  3. Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434(2018).
  4. Ganot, P., et al. Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans. eLife. 50022, (2020).
  5. Charpentier, J. C., et al. Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1. Nature Communications. 11, 180(2020).
  6. Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).
  7. Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).
  8. Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131, (2018).
  9. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
  10. Commisso, C. The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153(2019).
  11. Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. , (2021).
  12. Lee, S. -W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).
  13. Michalopoulou, E., et al. Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition. Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).
  14. Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).
  15. West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, 1153-1157 (2004).
  16. Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284(2016).
  17. Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).
  18. Bhosle, V. K., et al. SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling. Nature Communications. 11, 4112(2020).
  19. Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1(2015).
  20. Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156(2019).
  21. Freeman, S. A., et al. Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance. Science. 367, 301-305 (2020).
  22. Canton, J., Grinstein, S. Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 185-199 (2017).
  23. Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging. Methods Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 227-239 (2017).
  24. Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
  25. Canton, J., Grinstein, S. Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).
  26. Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).
  27. Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).
  28. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).
  29. Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112, 4712-4722 (2008).
  30. Canton, J., et al. The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens. Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).
  31. Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts. Bio-Protocol. 9, (2019).
  32. Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, Clifton NJ. 113-123 (2019).
  33. Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton NJ. 171-181 (2019).
  34. Swanson, J. A., King, J. S. The breadth of macropinocytosis research. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

pH makropinosomudegradacja makropinosom wmakropinocytozareaktywne formy tlenutrawienie bia ekobrazowanie ywych kom rekkalibracja fluorescencji

Powiązane artykuły