Opisujemy protokoły pomiaru pH, zdarzeń oksydacyjnych i trawienia białek w poszczególnych makropinosomach w żywych komórkach. Nacisk kładziony jest na mikroskopię ratiometryczną z podwójnym fluoroforem i zalety, jakie oferuje w porównaniu z technikami populacyjnymi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar pH, chemii redoks i zdolności degradacyjnej makropinosomów za pomocą mikroskopii ratiometrycznej z podwójnym fluoroforem
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W ostatnich latach dziedzina makropinocytozy szybko się rozwinęła. Makropinocytoza stała się centralnym mechanizmem, dzięki któremu wrodzone komórki odpornościowe utrzymują homeostazę i odporność organizmu. Jednocześnie, w przeciwieństwie do swojej roli homeostatycznej, może również napędzać różne patologie, w tym raka i infekcje wirusowe. W przeciwieństwie do innych trybów endocytozy, narzędzia opracowane do badania dojrzewania makropinosomów pozostają słabo rozwinięte. W tym miejscu protokół opisuje nowo opracowane narzędzia do badania środowiska redoks w świetle wczesnych i dojrzewających makropinosomów. Opisano metodyki wykorzystania ratiometrycznej mikroskopii fluorescencyjnej do oceny pH, produkcji reaktywnych form tlenu oraz zdolności degradacyjnej w świetle poszczególnych makropinosomów w żywych komórkach. Pomiary pojedynczych organelli mają tę zaletę, że ujawniają niejednorodność czasoprzestrzenną, która często jest tracona w przypadku podejść populacyjnych. Nacisk kładziony jest na podstawowe zasady podwójnej fluoroforowej mikroskopii ratiometrycznej, w tym wybór sondy, oprzyrządowanie, kalibrację oraz metody oparte na pojedynczych komórkach i populacji.
Wprowadzenie
Makropinocytoza odnosi się do pobierania dużych ilości płynu zewnątrzkomórkowego do połączonych błoną organelli cytoplazmatycznych zwanych makropinosomami1,2. Jest to wysoce konserwatywny proces wykonywany przez wolno żyjące organizmy jednokomórkowe, takie jak ameba Dictyostelium spp. 3, a także anthozoans4 i metazoans2. W większości komórek makropinocytoza jest zdarzeniem indukowanym. Podwiązanie receptorów na powierzchni komórki indukuje wysunięcie się napędzanych aktyną rozszerzeń błony plazmatycznej, zwanych falbanami. Część t....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie komórek
- Hoduj komórki Raw264.7 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do 70% konfluencji w RPMI uzupełnione 10% surowicą inaktywowaną termicznie.
- Dzień przed testem wysiewaj komórki Raw264.7 o gęstości 5 x 104 komórek na dołek na 96-dołkowej płytce. Upewnij się, że każda studzienka zawiera 100 μl pożywki wzrostowej. Upewnij się, że płytka 96-dołkowa ma czarne boki i szklane dno do obrazowania.
UWAGA: W tym przypadku do obrazowania użyto 96-dołkowych płytek. Płytki 96-dołkowe pozwalają na użycie mniejszych ilości komórek i odczynników w stosunku do większych komór obrazowania. Można jednak użyć dowolnej komory ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Podczas pomiaru pH makropinosomów występuje okres czasu, w którym dynamika zakwaszania nie może być mierzona. Okres ten odpowiada fazie ładowania dekstranu (szare pole na Rysunku 2C oraz Rysunku 3C,D) i będzie różnić się w zależności od użytego typu komórek. Długość fazy ładowania zależy od (i) aktywności makropinocytozy komórek oraz (ii) czułości użytego przyrządu. Zaleca się dostosowanie tego okresu na początku każdego eksperymentu w taki spos.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż istnieje wiele protokołów zarówno do nisko-, jak i wysokoprzepustowych pomiarów wychwytu makropinocytarów w makrofagach, fibroblastach, a nawet Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33, podjęto bardzo niewiele prób zmierzenia biochemii światła tych dynamicznych przedziałów. Jest to prawdopodobnie spowodowane niedostatkiem sond, które można skutecznie u.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Uniwersytetowi w Calgary za wsparcie. Chcielibyśmy również podziękować dr Robinowi Yatesowi za dostęp do odczynników, sprzętu i przydatne dyskusje.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Czarnościenna 96-dołkowa płytka | PerkinElmer | 6005430 | |
| CypHer5e, NHS ester | Cytiva | PA15401 | |
| Dekstran-amino 70 kDa | Invitrogen | D1862 | |
| DQ-albumina jaja kurzego | Invitrogen | D12053 | |
| FITC-dekstran 70 kDa | Invitrogen | D1823 | |
| HBSS | Gibco | 14287 | |
| Nigericin | Sigma Aldrich | N7143 | |
| OxyBurst Green-SE | Invitrogen | D2935 | |
| pHrodo Red, SE | Invitrogen | P36600 | |
| Raw264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI medium | Gibco | 11875093 | |
| SP5 Mikroskop konfokalny | Leica | - | |
| TRITC-dekstran 70 kDa | Invitrogen | D1819 | |
| Antena | Ibidi | 81156 |
Bibliografia
- Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766(2017).
- Williams....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
