Artykuł metodologiczny

Rejestracja szybkości wypalania węzłów zatokowo-przedsionkowych za pomocą matrycy mikroelektrod w celu identyfikacji wewnętrznych wad rozrusznika serca u myszy

DOI:

10.3791/62735

⸱

5 lipca 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Southern Methodist University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół ma na celu opisanie nowej metodologii pomiaru wewnętrznej szybkości wypalania serca za pomocą rejestracji matrycy mikroelektrod całej tkanki węzła zatokowo-przedsionkowego w celu identyfikacji wad rozrusznika serca u myszy. W tej metodzie można również wprowadzić środki farmakologiczne, aby zbadać ich wpływ na wewnętrzne rozruszniki serca.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Węzeł zatokowo-przedsionkowy (SAN), znajdujący się w prawym przedsionku, zawiera komórki rozrusznika serca, a dysfunkcja tego obszaru może powodować tachykardię lub bradykardię. Wiarygodna identyfikacja wad rozrusznika serca wymaga pomiaru wewnętrznego tętna poprzez znaczne zapobieganie wpływowi autonomicznego układu nerwowego, który może maskować deficyty tętna. Tradycyjne metody analizy wewnętrznej funkcji rozrusznika serca obejmują indukowaną lekiem blokadę autonomiczną do pomiaru częstości akcji serca in vivo, izolowane zapisy serca do pomiaru wewnętrznego tętna oraz zapisy paska zatokowo-przedsionkowego lub jednokomórkowego patch-clamp komórek rozrusznika serca w celu pomiaru szybkości spontanicznego wyzwalania potencjału czynnościowego. Jednak te bardziej tradycyjne techniki mogą być trudne technicznie i trudne do wykonania. W tym miejscu przedstawiamy nową metodologię pomiaru wewnętrznej szybkości wyzwalania serca poprzez wykonywanie zapisów matrycy mikroelektrod (MEA) preparatów węzłów zatokowo-przedsionkowych z całą mocowaniem od myszy. MEA składają się z wielu mikroelektrod ułożonych w siatkowy wzór do rejestrowania potencjałów pola zewnątrzkomórkowego in vitro. Opisana tutaj metoda ma tę zaletę, że jest stosunkowo szybsza, prostsza i bardziej precyzyjna niż poprzednie podejścia do rejestrowania wewnętrznego tętna, a jednocześnie umożliwia łatwe badanie farmakologiczne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serce jest złożonym organem, rządzonym zarówno przez wewnętrzne jak i zewnętrzne wpływy, takie jak te, które pochodzą z mózgu. Węzeł zatokowo-przedsionkowy (SAN) to zdefiniowany obszar w sercu, w którym znajdują się komórki rozrusznika serca (zwane również komórkami zatokowo-przedsionkowymi lub komórkami SA) odpowiedzialne za inicjację i utrwalenie bicia serca ssaków1,2. Wewnętrzne tętno to tętno napędzane przez komórki rozrusznika serca bez wpływu innych wpływów sercowych lub neurohumoralnych, ale tradycyjne pomiary tętna u ludzi i żywych zwierząt, takie jak elektrokardiogramy, odzwierciedlają zarówno rozrusznik serca, jak i wpływy neuronalne na serce. Najbardziej zauważalny wpływ neuronalny na komórki SA pochodzi z autonomicznego układu nerwowego, który stale moduluje wzorce odpalania, aby spełnić fizjologiczne wymagania organizmu3. Na poparcie tej tezy można znaleźć zarówno projekcje współczulne, jak i przywspółczulne w pobliżu klasy SAN4. Wewnętrzny sercowo-nerwowy układ nerwowy (ICNS) jest kolejnym ważnym czynnikiem neuronalnym, w którym sploty zwojowe, szczególnie w prawym przedsionku, unerwiają i regulują aktywność SAN5,6.

Zrozumienie deficytów rozrusznika serca jest klinicznie ważne, ponieważ dysfunkcja może leżeć u podstaw wielu zaburzeń serca, a także przyczyniać się do ryzyka innych powikłań. Zespół chorej zatoki (SSS) to kategoria chorób charakteryzujących się dysfunkcją węzła zatokowo-przedsionkowego, która utrudnia prawidłowe rozruszniki serca7,8. SSS może objawiać się bradykardią zatokową, przerwami w zatokach, zatrzymaniem zatok, blokadą wyjścia zatokowo-przedsionkowego oraz naprzemiennymi bradyarrytmiami i tachyarytmiami9 i może prowadzić do powikłań, w tym zwiększonego ryzyka udaru zatorowego i nagłej śmierci8,10. Osoby z zespołem Brugadów, zaburzeniem serca charakteryzującym się migotaniem komór ze zwiększonym ryzykiem nagłej śmierci sercowej, są bardziej narażone na zdarzenia arytmogenne, jeśli mają również współistniejącą dysfunkcję SAN11,12. Dysfunkcja zatok jednosionkowych może mieć również konsekwencje fizjologiczne wykraczające poza serce. Na przykład zaobserwowano, że SSS wywołuje drgawki u pacjenta z powodu hipoperfuzji mózgowej13.

Aby zidentyfikować deficyty stymulatora zatokowo-przedsionkowego, wewnętrzne tętno musi być określone poprzez pomiar aktywności SAN bez wpływu autonomicznego układu nerwowego lub czynników humoralnych. Klinicznie można to w przybliżeniu określić za pomocą farmakologicznej blokady autonomicznej14, ale ta sama technika może być również zastosowana w modelach ssaków do badania wewnętrznej funkcji serca15,16. Chociaż takie podejście blokuje dużą część wpływów neuronalnych i pozwala na badanie serca in vivo, nie eliminuje całkowicie wszystkich zewnętrznych wpływów na serce. Inną techniką badawczą stosowaną do badania wewnętrznej funkcji serca w modelach zwierzęcych są izolowane zapisy serca przy użyciu serc z perfuzją Langendorffa, które zazwyczaj obejmują pomiary za pomocą elektrogramów, stymulacji lub wieloelektrodowych matryc nasierdziowych17,18,19,20. Chociaż ta technika jest bardziej specyficzna dla funkcji serca, ponieważ polega na usunięciu serca z organizmu, na pomiary mogą nadal wpływać mechanoelektryczne mechanizmy autoregulacyjne, które mogą wpływać na wewnętrzne pomiary tętna21. Izolowane zapisy serca mogą być nadal pod wpływem regulacji autonomicznej za pośrednictwem ICNS5,6,22,23. Co więcej, utrzymanie fizjologicznie istotnej temperatury serca, która ma kluczowe znaczenie dla pomiarów czynności serca, może być trudne w przypadku izolowanych podejść do serca20. Bardziej bezpośrednią metodą badania funkcji SAN jest specyficzne wyizolowanie tkanki SAN i zmierzenie jej aktywności. Można to osiągnąć za pomocą pasków SAN (izolowana tkanka SAN) lub izolowanych komórek rozrusznika serca SAN24,25. Oba wymagają wysokiego stopnia przeszkolenia technicznego, ponieważ sieć SAN jest bardzo małym i wysoce zdefiniowanym regionem, a izolacja komórek stanowi jeszcze większe wyzwanie, ponieważ dysocjacja może zaszkodzić ogólnemu zdrowiu komórki, jeśli nie zostanie przeprowadzona prawidłowo. Co więcej, techniki te wymagają specjalistycznych umiejętności elektrofizjologicznych, aby można było skutecznie rejestrować z tkanki lub komórek za pomocą indywidualnych mikroelektrod rejestrujących.

W tym protokole opisujemy technikę zapisu SAN in vitro za pomocą matrycy mikroelektrod (MEA) w celu uzyskania wewnętrznych pomiarów tętna. Podejście to ma tę zaletę, że wysoce szczegółowe zapisy elektrofizjologiczne są dostępne dla badaczy nieposiadających intensywnych umiejętności elektrofizjologicznych. MEA były wcześniej używane do badania funkcji kardiomiocytów w pierwotnych hodowlach kardiomiocytów26,27,28,29,30,31,32, arkusze kardiologiczne33,34,35,36,37,38,39, and tissue whole mounts40,41,42,43,44,45,46,47. Poprzednie prace zostały również wykonane w celu zbadania potencjałów pola w sieci SAN tissue41,42. W tym miejscu przedstawiamy metodologię korzystania z MEA do rejestrowania i analizowania mysich wewnętrznych szybkości uruchamiania sieci SAN. Opisujemy również, w jaki sposób ta technika może być wykorzystana do testowania farmakologicznego wpływu leków na wewnętrzne szybkości wypalania SAN, dostarczając przykładowy eksperyment pokazujący działanie 4-aminopirydyny (4-AP), bramkowanego napięciem blokera kanału K+. Korzystając ze zdefiniowanych anatomicznych punktów orientacyjnych, możemy dokładnie zarejestrować SAN bez konieczności wykonywania rozległych sekcji tkanek lub izolacji komórek wymaganych innymi metodami. Chociaż MEA może być zbyt kosztowna, nagrania zapewniają wysoce szczegółowe i wiarygodne pomiary rozrusznika serca, które można wykorzystać w szerokim zakresie zastosowań klinicznych i fizjologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health (NIH), zatwierdzonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Southern Methodist University.

1. Powlekanie matrycy wieloelektrodowej (MEA) do nagrywania

  1. Wykonaj bufor boranowy o pojemności 25 mM.
    1. Rozpuścić 0,953 g Na2B4O7·10 H2O w 80 ml wody destylowanej.
    2. Dostosuj pH do 8,4 za pomocą HCl, a następnie dodaj wodę destylowaną do końcowej objętości 100 ml.
  2. Przygotować 0,1% roztwór podstawowy polietylenoiminy (PEI).
    1. Dodaj 100 μl 50% (w/v) PEI do 4,9 ml wody destylowanej, aby uzyskać 1% roztwór PEI.
    2. Rozcieńczyć 1% roztwór PEI do 0,1% w buforze boranowym, dodając 1 ml 1% roztworu PEI do 9 ml 25 mM buforu boranowego.
  3. Odpipetować ~1 ml 0,1% roztworu PEI do naczynia z matrycą mikroelektrod (MEA) tak, aby elektrody były całkowicie pokryte (Rysunek 1A i 1B).
    UWAGA: Mikroelektrody MEA są zwykle wykonane z czarnej platyny lub nanorurek węglowych i izolowane poliimidem (lub akrylem); Oba materiały są hydrofobowe. Poprzez pokrycie MEA kationowym polimerem, takim jak PEI, hydrofobowa powierzchnia MEA staje się bardziej hydrofilowa, co pozwala próbkom tkanek na lepszy kontakt z powierzchnią MEA (Rysunek 1A1).
  4. Przykryj naczynie MEA folią termoplastyczną, aby zmniejszyć parowanie i pozostaw MEA na noc w temperaturze pokojowej (Rysunek 1C).
  5. Odessać roztwór PEI z naczynia MEA za pomocą pipety, uważając, aby nie dotknąć siatki elektrod, co może uszkodzić elektrody, a następnie spłukać ≥4 razy wodą destylowaną (Rysunek 1D).
  6. Przechowuj MEA pokryty PEI w 1-2 ml ultraczystej wody i szczelnie zamknięty folią termoplastyczną w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebny. Alternatywnie, przechowuj powlekany MEA, zanurzając go w zlewce wypełnionej ultraczystą wodą (Rysunek 1E).
    UWAGA: Proces powlekania PEI należy wykonać tylko raz dla MEA przed jego pierwszym użyciem, a po każdej sesji nagraniowej MEA należy przechowywać zanurzony w ultraczystej wodzie.

2. Przygotowanie kompletnego roztworu Tyrode'a do rozwarstwienia tkanek

  1. Przygotuj 1000 ml kompletnego roztworu Tyrode'a do sekcji; najpierw dodaj 8,1816 g NaCl do 800 ml ultraczystej wody.
  2. Do roztworu dodać następującą ilość substancji chemicznych: 0,4025 g KCl; 0,1633 g KH2PO4; 1,1915 g HEPES; 0,9999 g glukozy; 0,0952 g MgCl2; 0,2646 g CaCl2·2H2O.
  3. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH, a następnie dodaj ultraczystą wodę, aż całkowita objętość wyniesie 1,000 ml.
    UWAGA: Ostateczny skład roztworu Complete Tyrode będzie następujący (w mM): 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,2 KH2PO4, 5 HEPES, 5,55 glukozy, 1 MgCl2, 1,8 CaCl2.

3. Przygotowanie natlenionego roztworu Tyrode'a do nagrywania

  1. Przygotować 500 ml roztworu Tyrode'a; dodać 4,003 g NaCl do 400 ml ultraczystej wody.
  2. Do roztworu dodać następujące ilości substancji chemicznych: 0,651 g NaHCO3; 0,042 g NaH2PO4; 0,132 g CaCl2·2H2O; 0,149 g KCl; 0,0476 g MgCl2; 0,999 g glukozy.
  3. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl, a następnie dodaj ultraczystą wodę, aż całkowita objętość wyniesie 500 ml.
  4. Natleniać roztwór karbogenem przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej przed rozpoczęciem zapisu.
    UWAGA: Ostateczny skład roztworu Tyrode'a będzie następujący (w mM): 137 NaCl, 15,5 NaHCO3, 0,7 NaH2PO4, 1,8 CaCl2, 4 KCl, 1 MgCl2, 11,1 glukozy. Ten roztwór Tyrode'a ma nieco inny skład niż roztwór Complete Tyrode używany do sekcji.

4. Przygotowanie roztworu 4-aminopirydyny (4-AP) do modulacji farmakologicznej

  1. Przygotować 1 mM roztwór roboczy 4-AP; dodać 18,82 mg 4-AP do 200 ml roztworu Tyrode'a z kroku 3.
  2. Natlenić roztwór 4-AP przez co najmniej 30 minut przed eksperymentem.

5. Przygotowanie szalki Petriego do sekcji

  1. Wymieszaj składniki elastomeru silikonowego w stosunku wagowym 10:1 (wagowo) bazy do utwardzacza.
  2. Wlać ~15 ml mieszaniny elastomerów silikonowych do szalki Petriego o średnicy 60 mm.
  3. Przed użyciem pozostawić elastomer do utwardzenia w temperaturze pokojowej przez 48 godzin.
    UWAGA: Silikonowana szalka Petriego może być ponownie wykorzystana do przyszłych sekcji.

6. Wypreparowanie węzła zatokowo-przedsionkowego (SAN)

  1. Przygotować heparynizowany roztwór Complete Tyrode do rozwarstwienia SAN.
    1. Dodać 400 μl heparyny (1 000 USP/ml) do 40 ml roztworu Complete Tyrode i ogrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  2. Wstrzyknąć myszy dootrzewnowo 200-300 μl heparyny (1000 USP/mL) i pozwolić zwierzęciu siedzieć przez 10 minut.
  3. Poddaj eutanazji heparynową mysz przez przedawkowanie izofluranu.
    1. Umieść mysz w małej szklanej komorze, która zawiera opary izofluranu powstające przez dodanie 200-300 μl ciekłego izofluranu do bibuły filtracyjnej wewnątrz perforowanej plastikowej rurki.
      UWAGA: Ponieważ izofluran może powodować podrażnienie skóry i może być również wchłaniany przez skórę, płyn nie powinien mieć bezpośredniego kontaktu z myszą. Dlatego chusteczkę nasączoną izofluranem umieszcza się w perforowanej tubie do podania.
    2. Zgon należy stwierdzić przez zaprzestanie ruchu i wysiłku oddechowego oraz przez brak odruchu szczypania palców u stóp. Śmierć trwa zwykle około 1-2 minut po umieszczeniu w komorze.
      UWAGA: Śmierci zwykle towarzyszy oddawanie moczu.
  4. Umieść mysz w pozycji leżącej na desce do sekcji z wyciągniętymi łapami i przymocuj łapy do deski za pomocą igieł strzykawkowych o długości 1 cala i rozmiarze 23. Następnie usuń sierść w pobliżu dolnej części klatki piersiowej za pomocą nożyczek chirurgicznych i odcinając futro u nasady.
    UWAGA: W przypadku deski rozwarstwiającej można użyć styropianowych pokryw chłodzących.
  5. Trzymając skórę hemostatem, użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać poprzeczne nacięcie w skórze tuż pod dnem klatki piersiowej od mniej więcej lewego łuku żebrowego do prawego łuku żebrowego (Rysunek 3A).
  6. Rozetnij otrzewną nożyczkami chirurgicznymi i ostrożnie oddziel wątrobę od przepony, uważając, aby nie naciąć wątroby, co spowoduje nadmierne krwawienie (Ryc. 3B). Naciąć przeponę wzdłuż klatki piersiowej, aby odsłonić jamę piersiową (Rysunek 3C-D).
  7. Za pomocą nożyczek chirurgicznych przetnij boczne ściany klatki piersiowej od krawędzi łuków żebrowych aż do obojczyków, aby odsłonić serce, uważając, aby nie uszkodzić serca (Rysunek 3D). Następnie użyj igły strzykawkowej o rozmiarze 23, aby przypiąć klatkę piersiową do ramienia, przytrzymując ją na miejscu i z dala od pola operacyjnego.
  8. Za pomocą pipety transferowej wlej ciepły (37 °C) heparynizowany roztwór Complete Tyrode na serce, aby było wilgotne.
    UWAGA: Nie dopuścić do wyschnięcia serca.
  9. Usuń płuca, przytrzymując je bardzo cienkimi kleszczami Graefe i przecinając tchawicę nożyczkami chirurgicznymi (Rysunek 3E).
  10. Przytrzymaj wierzchołek serca za pomocą bardzo cienkich kleszczyków Graefe i usuń go, przecinając aortę i żyły główne nożyczkami chirurgicznymi. Przenieś serce na szalkę Petriego zawierającą utwardzony elastomer silikonowy (Ryc. 4A) i użyj pipety transferowej, aby wykąpać serce w 2-3 ml ciepłego (37 °C) heparynizowanego roztworu Complete Tyrode.
    UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić delikatnej tylnej ściany prawego przedsionka, w której znajduje się SAN, oraz połączonych z nią prawych żył przedsionkowych. Kąpiel serca roztworem Complete Tyrode zapobiega wysychaniu serca, ale nie należy całkowicie zanurzać serca w roztworze, ponieważ pogorszy to widoczność podczas sekcji.
  11. Ustaw serce tak, aby prawe przedsionek znajdowało się po prawej stronie eksperymentatora, a lewe przedsionek znajdowało się po lewej stronie eksperymentatora.
    UWAGA: Sekcja tkanki SAN powinna być wykonana szybko, aby zapobiec urazom związanym z niedokrwieniem.
  12. Przymocuj wierzchołek serca do naczynia za pomocą szpilki do rozwarstwienia. Następnie, trzymając żyłę główną dolną za pomocą kleszczy laminektomijnych Dumont #2, włóż igłę strzykawki 22 G przez żyłę główną dolną i górną, aby zlokalizować ich położenie w prawym przedsionku, co również określa przybliżoną pozycję SAN (znajdującej się w plamie tkanki między żyłą główną dolną i górną (Ryc. 4B).
  13. Za pomocą małych szpilek do rozwarstwiania przypnij lewy i prawy przydatek przedsionka do naczynia.
    1. Trzymając wyrostek lewego przedsionka za pomocą kleszczy laminektomijnych Dumont #2, włóż szpilkę do wypreparowania przez wyrostek lewego przedsionka, aby utrzymać go na miejscu.
    2. Przytrzymując prawy uszek przedsionka kleszczami Dumont #55, włóż szpilkę do wypreparowania przez prawy wyrostek przedsionka, aby utrzymać go na miejscu.
      UWAGA: W razie potrzeby ten sam typ kleszczy może być używany do przytrzymywania przydatków lewego i prawego przedsionka.
  14. Wyjąć igłę strzykawki, która obejmuje żyły główne.
  15. Aby uwolnić krew z serca, użyj nożyczek Castroviejo, aby usunąć wierzchołek serca (tj. dolną połowę), wykonując poprzeczne nacięcie w poprzek komór (Rysunek 4C). Następnie umyć serce, dodając ciepły (37 °C) heparynizowany roztwór Complete Tyrode za pomocą pipety transferowej.
  16. Użyj nożyczek Castroviejo, aby przeciąć wzdłuż przegrody przedsionkowo-komorowej, utrzymując nacięcie bliżej komory niż przedsionków. Kontynuuj cięcie wzdłuż przegrody przedsionkowo-komorowej, aż przedsionki zostaną oddzielone od komór.
  17. Przeciąć wzdłuż przegrody międzyprzedsionkowej, aby usunąć lewy przedsionek.
  18. Umieść szpilki do preparowania na obrzeżach prawego przedsionka, aby leżało płasko (Rysunek 4D). Usuń pozostały tłuszcz, naczynia lub tkanki z przedsionka za pomocą nożyczek Castroviejo.
  19. Zlokalizuj SAN w prawym przedsionku, który w tej orientacji jest w przybliżeniu otoczony żyłą główną górną (na górze), żyłą główną dolną (na dole) i cristae terminalis (po lewej) (Rysunek 4D).
    UWAGA: Crista terminalis pojawia się jako ciemny muskularny grzbiet między uszkiem prawego przedsionka a SAN. Często można również zobaczyć tętnicę SAN przechodzącą przez sieć SAN (Rysunek 4D).

7. Przygotowanie systemu MEA do nagrywania

  1. Dodaj roztwór Tyrode'a (z kroku 3) do butelki z roztworem wejściowym (Rysunek 5C) i natlenić go, włączając przepływ gazu karbogenicznego (Rysunek 5A) do systemu.
    UWAGA: Roztwór Tyrode'a użyty do nagrania różni się nieco składem od roztworu Complete Tyrode użytego do sekcji.
  2. Sprawdź przepływ karbogenu, obserwując pęcherzyki w stożkowej kolbie, która służy do nawilżania gazu (Rysunek 5B) i butelki z roztworem wejściowym ( Rysunek 5C) .
  3. Włóż rurkę doprowadzającą pompę perystaltyczną ( Rysunek 5D) do roztworu nagrywającego Tyrode (Rysunek 5C). Następnie włóż rurkę odpływową pompy perystaltycznej do butelki zbiorczej (Rysunek 5I).
  4. Ustaw pompę perystaltyczną na 25 obr./min, co daje natężenie przepływu 2 ml/min i uruchom pompę. Sprawdź, czy w systemie nie ma wycieków lub przepełnienia bufora.
  5. Ustaw regulator temperatury na 37 °C, fizjologiczną temperaturę myszy (Rysunek 5E).

8. Umieszczanie tkanki serca na siatce MEA

  1. Przenieś wypreparowaną tkankę SAN za pomocą pędzla (Rysunek 6A) z preparowanej szalki Petriego na siatkę MEA (Rysunek 1A1).
    1. Patrząc pod odwrócony mikroskop, delikatnie ustaw tkankę miękkim pędzlem tak, aby obszar SAN nakładał się na siatkę elektrod.
    2. W razie potrzeby ponownie ułóż tkankę, aby upewnić się, że leży płasko na siatce elektrod, zapewniając dobry kontakt z elektrodami.
      UWAGA: Do przesuwania tkanki wymagany jest miękki pędzel, aby uniknąć uszkodzenia siatki elektrod.
  2. Po prawidłowym ułożeniu tkanki użyj kleszczyków do kości (lub dowolnych zakrzywionych kleszczy), aby umieścić siatkę na tkance (Rysunek 6A) . Następnie użyj kleszczyków do kości, aby umieścić kotwicę harfy (Rysunek 6A) na siatce, aby utrzymać wszystko na miejscu ( Rysunek 6B).
  3. Zrób zdjęcie położenia tkanki na MEA tak, aby aktywność poszczególnych elektrod mogła być skorelowana z ich anatomicznym położeniem podczas zapisu. Można to zrobić, przykładając smartfon do odwróconego obiektywu mikroskopu lub korzystając z dołączonej kamery mikroskopowej.
    UWAGA: Jeśli orientacja MEA nie zmieni się po zrobieniu zdjęcia, lewa górna elektroda pojawi się jako pierwszy kanał (Ch1) podczas nagrywania.
  4. Umieść nasadkę MEA na płytce łączącej (Rysunek 5F i 6C) i ostrożnie umieść nasadkę perfuzyjną ( Rysunek 6C) na czaszy MEA, nie naruszając kotwicy plastra harfy. Nasadkę perfuzyjną można dodatkowo zabezpieczyć za pomocą kawałka taśmy laboratoryjnej (Rysunek 6C).
    UWAGA: Oprócz regulowanych rur doprowadzających i odprowadzających roztwór, nasadka posiada również port do dostarczania gazu (Rysunek 6C). Ponadto pierścień elektrody referencyjnej przechodzi przez nasadkę (Rysunek 6C).
  5. Pozwól tkance zregenerować się po obchodzeniu się z nią i zaaklimatyzować się w komorze przez 15-20 minut przed zapisem.

9. Ustawianie protokołu akwizycji danych do nagrywania

UWAGA: Poniższe kroki opisują otwieranie protokołu oprogramowania do spontanicznego nagrywania dudnień i definiowanie warunków nagrywania. Specyfika tych kroków może się różnić w zależności od używanego oprogramowania, ale ogólny zarys powinien pozostać taki sam.

  1. Włącz wzmacniacz (Rysunek 5G) i ustaw przepływ pracy dla nagrywania w oprogramowaniu na komputerze (Rysunek 5H).
    1. Otwórz oprogramowanie i kliknij Przepływ pracy.
    2. Wybierz Otwórz nowy folder.
    3. Otwórz folder Z szablonów.
    4. Wybierz 64MD1-1920X1080 (w zależności od rozdzielczości pulpitu).
    5. Otwórz folder QT.
    6. Otwórz folder Nagranie spontaniczne.
    7. Wybierz szablon Beat_recording.moflo i otwórz go (Rysunek 7A).
  2. Ustaw parametry nagrywania, aby określić liczbę ścieżek, czas trwania ścieżki, interwał ścieżki, napięcie wejściowe, częstotliwość próbkowania itp., zgodnie z żądanymi warunkami nagrywania (Rysunek 7B).
    UWAGA: Do akwizycji danych o częstotliwości dudnień i skokach zwykle używa się napięcia w zakresie wejściowym 2.9 mV, filtra górnoprzepustowego 1 Hz, filtra dolnoprzepustowego 1000 Hz i częstotliwości próbkowania 20 kHz.
  3. Aby zaznaczyć różne fazy lub warunki eksperymentu, takie jak przed i po podaniu leku, kliknij zakładkę Adnotacje, aby dodać żądane notacje (Rysunek 7C).
  4. Aby określić miejsce docelowe pliku, w którym mają być zbierane dane, zaznacz pole Włącz pamięć masową i wprowadź żądaną nazwę pliku w polu Modyfikator nazwy pliku.

10. Wykonywanie zapisu i zbieranie danych

  1. Kliknij przycisk Nagraj i odtwórz na najwyższym pasku menu oprogramowania do akwizycji, aby rozpocząć nagrywanie. Pozyskaj dane dla 10 śladów trwających 1 minutę z odstępami 2 minut między śladami.
  2. Na podstawie tych początkowych śladów sprawdź, czy zarejestrowane przebiegi są zgodne ze zdrowym i wysokiej jakości preparatem tkankowym, potwierdzając, że większość kanałów rejestrujących wykazuje amplitudy sygnału ≥ 0,5 mV i identyczne odstępy między skokami (Rysunek 8).
    UWAGA: Wstępną ocenę aktywności i przebiegów poszczególnych mikroelektrod odpowiadających ich anatomicznym lokalizacjom można przeprowadzić, odwołując się do obrazu uzyskanego po umieszczeniu tkanki na MEA.
  3. Aby zmierzyć wpływ leków na tkankę, wstrzymaj zapis po uzyskaniu początkowych danych bazowych, klikając przycisk pauzy na najwyższym pasku menu.
    UWAGA: Fazę odpowiedzi na lek w eksperymencie można odnotować w nagraniu, klikając zakładkę Adnotacje i dodając żądaną notację, jak opisano powyżej (Rysunek 7C).
  4. Wstrzymaj pompę i zmień rurkę doprowadzającą pompę z normalnego roztworu do nagrywania na roztwór Tyrode'a zawierający żądany lek z wyboru.
    UWAGA: W przykładowym eksperymencie roztwór Tyrode'a użyto z 1 mM 4-aminopirydyny (4-AP).
  5. Uruchom ponownie pompę i cofnij wznowienie nagrywania, aby ponownie rozpocząć zbieranie danych.
  6. Gdy roztwór Tyrode'a z lekiem dotrze do tkanki, zapisz 10 śladów w taki sam sposób, jak wcześniej dla zapisów podstawowych.
    UWAGA: Ustabilizowanie śladów zajmie trochę czasu, gdy lek wprowadzi się do komory rejestracyjnej. Mechanizm działania leku może również wpływać na stabilność zapisu. W przypadku leków, które mają odwracalne mechanizmy działania, należy również odnotować okres wymywania w celu potwierdzenia przywrócenia aktywności do poziomów wyjściowych, co jest wskaźnikiem zdrowej tkanki.
  7. Kliknij przycisk Zatrzymaj, aby zakończyć nagrywanie.
  8. Wykonaj końcowe zdjęcie położenia tkanki na MEA pod mikroskopem w przypadku, gdy tkanka przesunęła się po wstępnej procedurze rejestracji.

11. Czyszczenie konfiguracji po nagraniu

  1. Wyczyść MEA.
    1. Po zakończeniu nagrywania delikatnie wyjmij roztwór nagrywający z naczynia MEA za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml.
      UWAGA: Uważaj, aby nie dotykać elektrod MEA, co może je uszkodzić.
    2. Usuń siatkę i kotwicę harfy za pomocą kleszczyków do kości (lub dowolnych zakrzywionych kleszczy). Następnie za pomocą pędzla usuń tkankę z powierzchni MEA, zawsze uważając, aby nie dotknąć poszczególnych mikroelektrod.
    3. Za pomocą butelki do mycia delikatnie spłucz naczynie MEA ultraczystą wodą około 3 do 4 razy.
    4. Oczyszczony MEA należy przechowywać zanurzony w ultraczystej wodzie o temperaturze 4 °C.
  2. Przepłukać rurkę systemu, przepuszczając przez nią ultraczystą wodę przez co najmniej 5 minut, używając ustawienia maksymalnej prędkości na pompie perystaltycznej.
    UWAGA: Aby zapobiec rozwojowi grzybów, po czyszczeniu nie należy pozostawiać wody ani roztworu buforowego wewnątrz rurki.

12. Analiza nagrań MEA w celu zmierzenia częstotliwości dudnień SAN

  1. Otwórz zapisany plik z zapisanymi danymi w szablonie "Beat_frequency_analysis" oprogramowania analitycznego (Rysunek 9) .
  2. Kliknij przycisk Odtwórz i pozwól na uruchomienie całego nagrania, aby zobrazować zestaw danych i przypisać odpowiednie parametry analizy.
    1. Wybierz okno kategoryzacji dla żądanego formatu wyświetlania danych, niezależnie od tego, czy są one wyświetlane jako średnia na ślad, czy średnia na czas (Rysunek 10A).
    2. Wybierz kanały, które mają zostać uwzględnione w analizie i ustaw żądane wartości progowe maksimów amplitudy lub minimów amplitudy dla automatycznej identyfikacji pików przebiegu (Rysunek 10B).
      UWAGA: Na tym etapie można wybrać do analizy pojedynczy kanał, kombinację kanałów lub wszystkie 64 kanały (Rysunek 9). Jeśli wybrane wartości progowe są zbyt bliskie wartościom maksimów i minimów przebiegu, niektóre szczyty przebiegu mogą nie zostać zidentyfikowane przez oprogramowanie analityczne.
    3. Ustaw czas przed skokiem i po skoku, który ma być uwzględniony w analizie.
      UWAGA: Ustawienia 50 ms przed skokiem i 100 ms po skoku zwykle działają dobrze (Rysunek 10B).
  3. Po ustawieniu warunków analizy kliknij ponownie przycisk Odtwórz, aby ponownie uruchomić zestaw danych i potwierdzić, że parametry analizy są odpowiednie do ekstrakcji spajków.
  4. Na potrzeby analizy zidentyfikuj trzy najbardziej stabilne kolejne ślady, które wykazują stabilną szybkość dudnienia dla każdego śladu w większości kanałów, zarówno w okresie wyjściowym eksperymentu, jak i kolejne trzy kolejne stabilne ślady w okresie ekspozycji na lek (Rysunek 10A).
  5. Określ początkowy i końcowy ślad do analizy i wprowadź czas trwania każdego śladu, który ma być analizowany (Rysunek 9).
  6. Przed rozpoczęciem analizy zaznacz pola włączające zarówno dla opcji Zapisz uderzenie na minutę, jak i Zapisz interwał międzyskokowy (Rysunek 10B).
  7. Wprowadź żądaną nazwę pliku w polu Modyfikator nazwy pliku (Rysunek 10B). Analizowane dane dotyczące częstotliwości dudnień i interwału międzyszczytowego zostaną zapisane w postaci formatu ASCII (tekstowego).
    UWAGA: Aby przeanalizować różne warunki (takie jak wartość wyjściowa i odpowiedź na lek), analiza musi być prowadzona oddzielnie dla każdego warunku.
  8. Kliknij przycisk Odtwórz i nagraj na górnym pasku kart, aby rozpocząć analizę.
  9. Aby wyeksportować dane dla innych aplikacji, zaznacz pola Zapisz rytm na minutę i Zapisz interwał międzyskokowy (Rysunek 10B). Wprowadź żądaną nazwę pliku w polu Modyfikator nazwy pliku (Rysunek 10B) i kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać analizowane dane w formacie tekstowym ASCII w wybranym folderze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po umożliwieniu tkance zaaklimatyzowania się w naczyniu przez 15 minut, rejestruje się 10 jednominutowych śladów. Nasz obecny protokół rejestruje aktywność przez ponad godzinę, ale zarejestrowaliśmy stabilne wzorce uruchamiania przez ≥4 godziny w niepublikowanych danych, które nie są tutaj pokazane. Jeśli eksperymentalne przygotowanie jest dobre do zbierania danych, każdy kanał nagrywający powinien wykazywać spójne i równomiernie rozmieszczone powtarzające się przebiegi (tj. skoki) o jednolitym kształcie dla danego kanał...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ćwiczenie i opanowanie procesu preparacji SAN jest konieczne, ponieważ tkanka jest delikatna, a zdrowa tkanka jest niezbędna do udanego nagrania. Podczas sekcji SAN niezbędna jest prawidłowa orientacja, aby uzyskać odpowiedni obszar tkanki. Jednak pierwotna orientacja serca może zostać łatwo utracona podczas procesu sekcji, co komplikuje to przedsięwzięcie. Dlatego, aby zapewnić prawidłową orientację lewo-prawo, przedsionki powinny być sprawdzone wzrokowo. Zazwyczaj prawy przedsionek jest bardziej przezroczysty, podczas ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez National Institutes of Health, granty o numerach R01NS100954 i R01NS099188.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-aminopirydynaSigmaA78403-25G
igła strzykawkowa o rozmiarze 22Fisher Scientific14-826-5AUżywana do rozwarstwiania
igły strzykawkowej o rozmiarze 23Fisher Scientific14-826-6CUżywana do rozwarstwiania
szalek Petriego 60 mmGenesee Scientific32-105G
500 ml Butelka PyrexFisher Scientific06-414-1CSłuży do przechowywania roztworów
1000 ml Butelka PyrexFisher Scientific06-414-1DSłuży do przechowywania roztworów
Kleszcze do kościNarzędzia do nauki o16060-11
Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2· 2H2O)Sigma-AldrichC5080-500G
Carbogen (95% O2, 5% CO2)
Nożyczki Castroviejo, 4"Narzędzia do nauki o naprawach15024-10
D-(+)-GlukozaSigma-AldrichG7021-1KG
Komputerdo akwizycji danychprocesor: Intel Xeon lub Intel Core i7, pamięć: 8 GB, dysk twardy: 1 TB, karta graficzna: NVIDIA lub wbudowana, ekran: 1920x1080
Mikroskop preparacyjnyJenco
Szpilki preparacyjneNarzędzia do nauki o narodzinach26002-20
Dumont #2 Kleszcze do laminektomiiNarzędzia naukowe11223-20
Dumont #55 KleszczeNarzędzia do nauki o nauce11295-51
  Extra Fine Graefe KleszczeFine Science Tools11152-10
Szklana komoraGrainger49WF30Służy do eutanazji
myszy Zestaw kotwic harfyWarner Instruments  SHD-22CL/15 WI 64-0247
HClFisher ChemicalsSA48-4Używany do równoważenia pH
HemostatFine Science Tools13013-14
HeparinAurobindo Pharma Limited IDA, PashamylaramNDC 63739-953-25
HEPESSigma-AldrichH3375-250G
Mikroskop odwróconyMoticAE2000
IsofluranePatterson Veterinary07-893-1389
Taśma laboratoryjnaFisher Scientific15-950
Światło do mikroskopu preparacyjnegoDolan-JennerMI150DG 660000391014
Chlorek magesu (MgCl2)Sigma-Aldrich208337-100G
MED64 Wzmacniacz głowicowyMED64MED-A64HE1S
MED64 Wzmacniacz głównyMED64MED-A64MD1A
MED64 Nasadka perfuzyjnaMED64MED-KCAP01
MED64 Zestaw uchwytu rurki perfuzyjnejMED64MED-KPK02
MED64 ThermoConnectorMED64MED-CP04
Mesh  Warner Instruments640246
Matryca mikroelektrod (MEA)Alpha Med ScientificMED-R515A
Mobius SoftwareWitWerx Inc.Specjalne oprogramowanie dla MED64
NaOHFisher ChemicalsS320-500Używany do równoważenia pH
Normalna sólUltigieneNDC 50989-885-17
Pędzel malarskiFisher ScientificNC1751733
ParafilmGenesee ScientificPM-996
Pompa perystaltycznaGilsonF155009
Rurka pompy perystaltycznejFisher Scientific14-171-2981/8 '' Średnica wewnętrzna
PolietylenoiminaSigmaP3143
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP9333-500G
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655-500G
Sód WodorowęglanSigmaS6297
Chlorek sodu (NaCl)Fisher ScientificS671-3
Zestaw elastomerów Sylgruard DowCorning184 SIL ELAST KIT 0,5 kg
Fosforan sodu jednozasadowySigmaS6566
Tetraboran soduSigmaS9640
Nożyczki chirurgiczneNarzędziado nauki14074-09
Pipety transferowe (z podziałką 3 ml)Samco Scientific225
naczyniu fizjologiczna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
  2. Josea, A. D., Collison, D. The normal range and determinants of the intrinsic heart rate in man. Cardiovascular Research. (4), 160-167 (1970).
  3. Peters, C. H., Sharpe, E. J., Proenza, C. Annual Review of Physiology Cardiac Pacemaker Activity and Aging. Annual Review of Physiology. 82, 21-43 (2019).
  4. Keith, A., Flack, M. The form and nature of the muscular connections between the primary divisions of the vertebrate heart. Journal of Anatomy and Physiology. 41 (3), 172-189 (1907).
  5. Wake, E., Brack, K. Characterization of the intrinsic cardiac nervous system. Autonomic Neuroscience. 199, (2016).
  6. Fedele, L., Brand, T. The intrinsic cardiac nervous system and its role in cardiac pacemaking and conduction. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 7 (4), 1-33 (2020).
  7. Mangrum, J. M., DiMarco, J. P. The evaluation and management of bradycardia. New England Journal of Medicine. 342 (10), 703-709 (2000).
  8. Adan, V., Crown, L. A. Diagnosis and treatment of Sick Sinus Syndrome. American Family Physician. 67 (8), 1725-1732 (2003).
  9. Semelka, M., Gera, J., Usman, S. Sick Sinus Syndrome: A Review. American Family Physician. 87 (10), 691-696 (2013).
  10. Zaragoza, M. V., et al. Exome sequencing identifies a novel LMNA splice-site mutation and multigenic heterozygosity of potential modifiers in a family with Sick Sinus Syndrome, dilated cardiomyopathy, and sudden cardiac death. PLoS ONE. 11 (5), 0155421(2016).
  11. Brugada, J., Campuzano, O., Arbelo, E., Sarquella-Brugada, G., Brugada, R. Present status of Brugada Syndrome: JACC State-of-the-Art Review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (9), 1046-1059 (2018).
  12. Rollin, A., et al. Prevalence, characteristics, and prognosis role of type 1 ST elevation in the peripheral ECG leads in patients with Brugada syndrome. Heart Rhythm. 10 (7), 1012-1018 (2013).
  13. Patel, N., Majeed, F., Sule, A. A. Seizure triggered by Sick Sinus Syndrome. BMJ case reports. 4, 2017222011(2017).
  14. Knecht, S., et al. Impact of pharmacological autonomic blockade on complex fractionated atrial electrograms. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 21 (7), 766-772 (2010).
  15. Saba, S., London, B., Ganz, L. Autonomic blockade unmasks maturational differences in rate-dependent atrioventricular nodal conduction and facilitation in the mouse. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 14 (2), 191-195 (2003).
  16. Shusterman, V., et al. Strain-specific patterns of autonomic nervous system activity and heart failure susceptibility in mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), 51-56 (2002).
  17. Tse, G., Tse, V., Yeo, J. M., Sun, B. Atrial anti-arrhythmic effects of heptanol in Langendorff-perfused mouse hearts. PLoS ONE. 11 (2), 0148858(2016).
  18. Tse, G., et al. Quantification of beat-to-beat variability of action potential durations in Langendorff-perfused mouse hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1578), 01578(2018).
  19. Avula, U. M. R., et al. Heterogeneity of the action potential duration is required for sustained atrial fibrillation. JCI Insight. 5 (11), 128765(2019).
  20. Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. (135), e57617(2018).
  21. Quinn, A. T., Kohl, P. Cardiac mechano-electric coupling: Acute effects of mechanical stimulation on heart rate and rhythm. Physiological Reviews. 101 (1), 37-92 (2021).
  22. Ripplinger, C. M., Noujaim, S. F., Linz, D. The nervous heart. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 199-209 (2016).
  23. Pauza, D. H., Pauziene, N., Pakeltyte, G., Stropus, R. Comparative quantitative study of the intrinsic cardiac ganglia and neurons in the rat, guinea pig, dog and human as revealed by histochemical staining for acetylcholinesterase. Annals of Anatomy. 184, 125-136 (2002).
  24. Golovko, V., Gonotkov, M., Lebedeva, E. Effects of 4-aminopyridine on action potentials generation in mouse sinoauricular node strips. Physiological Reports. 3 (7), 12447(2015).
  25. Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), e54555(2016).
  26. Doi, M., Ogawa, E., Arai, T. Effect of a photosensitization reaction performed during the first 3 min after exposure of rat myocardial cells to talaporfin sodium in vitro. Lasers in Medical Science. 32 (8), 1873-1878 (2017).
  27. Takanari, H., et al. A new in vitro co-culture model using magnetic force-based nanotechnology. Journal of Cellular Physiology. 231 (10), 2249-2256 (2016).
  28. Nakashima, T., et al. Rapid electrical stimulation causes alterations in cardiac intercellular junction proteins of cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1324-1333 (2014).
  29. Suzuki, S., et al. Effects of aldosterone on Cx43 gap junction expression in neonatal rat cultured cardiomyocytes. Circulation Journal. 73 (8), (2009).
  30. Horiba, M., et al. T-type Ca2+ channel blockers prevent cardiac cell hypertrophy through an inhibition of calcineurin-NFAT3 activation as well as L-type Ca2+ channel blockers. Life Sciences. 82 (11-12), 554-560 (2008).
  31. Inoue, N., et al. Rapid electrical stimulation of contraction modulates gap junction protein in neonatal rat cultured cardiomyocytes: involvement of mitogen-activated protein kinases and effects of angiotensin II receptor agonist. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 914-922 (2004).
  32. Aalders, J., et al. Effects of fibrillin mutations on the behavior of heart muscle cells in Marfan syndrome. Scientific Reports. 10 (16756), (2020).
  33. Matsuura, K., et al. Creation of mouse embryonic stem cell-derived cardiac cell sheets. Biomaterials. 32 (30), 7355-7362 (2011).
  34. Fujita, H., Shimizu, K., Nagamori, E. Application of a cell sheet-polymer film complex with temperature sensitivity for increased mechanical strength and cell alignment capability. Biotechnology and Bioengineering. 103 (2), 370-377 (2009).
  35. Baba, S., et al. Generation of cardiac and endothelial cells from neonatal mouse testis-derived multipotent germline stem cells. Stem Cells. 25 (6), 1375-1383 (2007).
  36. Baba, S., et al. Flk1+ cardiac stem/progenitor cells derived from embryonic stem cells improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model. Cardiovascular Research. 76 (1), 119-131 (2007).
  37. Shimizu, K., et al. Construction of multi-layered cardiomyocyte sheets using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 803-809 (2007).
  38. Haraguchi, Y., Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A., Okano, T. Electrical coupling of cardiomyocyte sheets occurs rapidly via functional gap junction formation. Biomaterials. 27 (27), 4765-4774 (2006).
  39. Miyagawa, S., et al. Tissue cardiomyoplasty using bioengineered contractile cardiomyocyte sheets to repair damaged myocardium: Their integration with recipient myocardium. Transplantation. 80 (11), 1586-1595 (2005).
  40. Watts, M., et al. Decreased bioavailability of hydrogen sulfide links vascular endothelium and atrial remodeling in atrial fibrillation. Redox Biology. 38, 101817(2021).
  41. Feng, Y., Cao, H., Zhang, Y. Prediction model of sinoatrial node field potential using high order partial least squares. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 1805-1811 (2015).
  42. Feng, Y., Cao, H., Wang, Y., Zhang, Y. Fuzzy linguistic prediction model for sinoatrial node field potential analysis in acute hyperglycemia environment. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, Suppl 1 881-887 (2015).
  43. Suzuki, K., Matsumoto, A., Nishida, H., Reien, Y., Maruyama, H., Nakaya, H. Termination of aconitine-induced atrial fibrillation by the KACh-channel blocker tertiapin: underlying electrophysiological mechanism. Journal of Pharmacological Sciences. 125 (4), 406-414 (2014).
  44. Chang, S. -L., et al. Heart failure enhances arrhythmogenesis in pulmonary veins. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 38 (10), 666-674 (2011).
  45. Wang, Y. -J., et al. Time-dependent block of ultrarapid-delayed rectifier K+ currents by aconitine, a potent cardiotoxin, in heart-derived H9c2 myoblasts and in neonatal rat ventricular myocytes. Toxicological Sciences. 106 (2), 454-463 (2008).
  46. Lai, Y. -J., Huang, E. Y. -K., Yeh, H. -I., Chen, Y. -L., Lin, J. J. -C., Lin, C. -I. On the mechanisms of arrhythmias in the myocardium of mXinα-deficient murine left atrial-pulmonary veins. Life Sciences. 83 (7-8), 272-283 (2008).
  47. Gustafson-Wagner, E. A., et al. Loss of mXinα, an intercalated disk protein, results in cardiac hypertrophy and cardiomyopathy with conduction defects. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (5), 2680-2692 (2007).
  48. Clark, R. B., et al. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, 1757-1766 (2004).
  49. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
  50. Nikmaram, M. R., et al. Characterization of the effects of Ryanodine, TTX, E-4031 and 4-AP on the sinoatrial and atrioventricular nodes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 96 (1-3), 452-464 (2008).
  51. Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
  52. Masé, M., Glass, L., Ravelli, F. A model for mechano-electrical feedback effects on atrial flutter interval variability. Bulletin of Mathematical Biology. 70 (5), 1326-1347 (2008).
  53. Franz, M. R., Bode, F. Mechano-electrical feedback underlying arrhythmias: The atrial fibrillation case. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 82 (1-3), 163-174 (2003).
  54. Bucchi, A., Tognati, A., Milanesi, R., Baruscotti, M., DiFrancesco, D. Properties of ivabradine-induced block of HCN1 and HCN4 pacemaker channels. Journal of Physiology. 572 (2), 335-346 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Microelectrode Array RecordingSinoatrial NodeCardiac PacemakingIntrinsic Heart RateMouse Heart PreparationPacemaker CellsExtracellular Field PotentialsPharmacological InterrogationBeat Frequency AnalysisElectrophysiology Techniques

Powiązane artykuły