Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja kofaktora F420 do analizy długości ogona poliglutaminianu z czystych kultur metanogennych i próbek środowiskowych

DOI:

10.3791/62737

⸱

14 października 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Universität Innsbruck, 2Department of Hygiene and Medical Microbiology, Medical University of Innsbruck

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda ekstrakcji kofaktora F420 z czystych kultur została zoptymalizowana do separacji metodą chromatografii cieczowej i analizy długości ogona F420 w czystych kulturach i próbkach środowiskowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kofaktor F420 odgrywa centralną rolę jako nośnik wodorków w pierwotnym i wtórnym metabolizmie wielu taksonów bakteryjnych i archeonowych. Kofaktor jest najbardziej znany ze swojej roli w metanogenezie, gdzie ułatwia trudne termodynamicznie reakcje. Ponieważ ogon poliglutaminianu różni się długością u różnych organizmów, analizy profilu długości mogą być potężnym narzędziem do rozróżniania i charakteryzowania różnych grup i ścieżek w różnych siedliskach. W tym miejscu protokół opisuje ekstrakcję i optymalizację wykrywania kofaktora F420 poprzez zastosowanie ekstrakcji do fazy stałej w połączeniu z analizą wysokosprawnej chromatografii cieczowej niezależnie od podejść kulturowych lub biologii molekularnej. Metodę zastosowano w celu uzyskania dodatkowych informacji na temat ekspresji kofaktora F420 ze zbiorowisk drobnoustrojów w glebach, osadach beztlenowych i czystych kulturach i oceniono za pomocą eksperymentów z dopalaniem. W ten sposób udało się wygenerować różne profile długości ogona F420 dla metanogenów wodorotropowych i acetoklastycznych w kontrolowanych czystych kulturach metanogenicznych, a także z próbek środowiskowych, takich jak osad z fermentacji beztlenowej i gleby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

F420 jest szeroko rozpowszechnionym, ale często zaniedbywanym kofaktorem, który funkcjonuje jako obowiązkowy nośnik dwuelektronowy wodorku w pierwotnych i wtórnych procesach metabolicznych zarówno archeonów, jak i bakterii1,2. F420 jest 5-deazaflawiną i strukturalnie przypomina flawiny, przy czym jej właściwości chemiczne i biologiczne są bardziej porównywalne z właściwościami NAD+ lub NADP+. Ze względu na podstawienie azotu węglem w pozycji 5 pierścienia izoalloksazynowego jest silnym reduktorem, wykazując tym samym niski standardowy potencjał redoks wynoszący -340 mV1,3. F420 składa się z pierścienia 5-deazaflawiny i łącznika 2-fosfo-L-mleczanu (F420-0). Ogon oligoglutaminianu zawierający monomery glutaminianu n+1 może być przyłączony do cząsteczki (F420-n+1)4.

Przez długi czas, kofaktor F420 był kojarzony wyłącznie z Archaea i Actinobacteria. Zostało to w dużej mierze uchylone. Ostatnie analizy wykazały, że F420 jest rozpowszechniany wśród różnych organizmów beztlenowych i tlenowych z rodzaju Proteobacteria, Chloroflexi i potencjalnie Firmicutes zamieszkujących niezliczone siedliska, takie jak gleby, jeziora i ludzkie jelita1,5. W 2019 roku Braga i in.6, wykazali, że proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica wytwarza unikalną pochodną F420, zawierającą 3-fosfoglicerynian zamiast ogona 2-fosfolioctanu, który może być szeroko rozpowszechniony w różnych siedliskach. W obrębie domeny Archaea, F420 został znaleziony w kilku liniach, w tym methanogenic7, methanotrophic8,9 i zamówieniach redukujących siarczany10, i ma być produkowany w Thaumarchaeota11. F420 jest najbardziej znany jako niezbędny koenzym redoks w metanogenezie hydrogenotropowej i metylotroficznej. Zredukowana forma F420 (F420H2) funkcjonuje jako donor elektronów do redukcji metylenotetrahydrometanoopteryny (metylenotetrahydrometanoopteryny (metylenotetrahydrometanoopteryny (metyleno-H4MPT, Mer) i metenylo-H4MPT12,13. Może być również stosowany jako nośnik elektronów w niezależnych od H2 szlakach transportu elektronów metanogenów zawierających cytochromy12,14. Co więcej, utleniona forma F420 ma charakterystyczną niebiesko-zieloną fluorescencję po wzbudzeniu przy 420 nm, co ułatwia mikroskopowe wykrywanie metanogenów (Rysunek 1). Ze względu na niski potencjał redoks, F420 ułatwia (i) egzogenną redukcję szerokiego spektrum opornych lub toksycznych związków organicznych, (ii) syntezę antybiotyków lub fitotoksyn tetracykliny i linkozamidów w paciorkowcach (gromada Actinobacteria) oraz (iii) odporność na stres oksydacyjny lub nitrozatywny lub inne niekorzystne warunki u prątków (gromada Actinobacteria)1,5,15,16,17,18,19,20,21,22. W związku z tym oksydoreduktazy zależne od F420 są obiecującymi biokatalizatorami do celów przemysłowych i farmaceutycznych, a także do bioremediacji zanieczyszczonych środowisk1,23. Pomimo tych ostatnich odkryć, dokładna rola kofaktora F420 jest nadal marginalnie znana w przypadku promieniowców lub innych typów bakterii.

Istnieją co najmniej trzy ścieżki biosyntezy F4202,6,24. Na początku szlak biosyntezy jest podzielony na biosyntezę 5-deazaflawiny i gałąź metabolizmu 2-fosfolimaktu. Reaktywna część cząsteczki F420 jest syntetyzowana przez syntazęF O przy użyciu substratów tyrozyny i 5-amino-6-rybityloamino-2,4(1H, 3H)-pirymidynodionu. Rezultatem jest chromoforF.O. na poziomie ryboflawiny. W ramach obecnie akceptowanej gałęzi metabolizmu mleczanu, L-mleczan jest fosforylowany do 2-fosfo-L-mleczanu przez kinazę L-mleczanową (CofB); 2-fosfo-L-mleczan z kolei jest guanylowany do L-laktylo-2-difosfo-5'-guanozyny przez guanylotransferazę 2-fosfo-L-mleczanu (CofC). W następnym kroku L-laktylo-2-difosfo-5'-guanozyna jest połączona zF O przez transferazę 2-fosfo-L-mleczanu (CofD), tworząc F420-02. Wreszcie, enzym F420-0:ɣ-gligaza glutamylowa (CofE) liguje monomery glutaminianu do F420-0, tworząc końcowy kofaktor6 w różnych liczbach23,25. Różne organizmy wykazują różne wzorce w liczbie przyłączonych reszt glutaminianu, przy czym krótsze ogony występują w przypadku metanogenów niż u prątków2,25,26. Ogólnie rzecz biorąc, metanogeny wykazują długość ogona od dwóch do trzech, z maksymalnie pięcioma długościami ogona w acetoklatycznym metanogenie, Methanosarcina sp., podczas gdy długości ogonów znalezione w Mycobacterium sp. wahały się od pięciu do siedmiu reszt glutaminianu2,25,26,27. Jednak ostatnie odkrycia wykazały, że długołańcuchowy F420 wiąże się z oksydoreduktazami zależnymi od F420 z wyższym powinowactwem niż krótkołańcuchowy F420; ponadto związany długołańcuchowy F420 zwiększa powinowactwo do substratu, ale zmniejsza szybkość obrotu odpowiednich enzymów23.

Wykrywanie kofaktora F420 często opiera się na jego fluorescencji. W ten sposób jego pochodne oligoglutaminianu zostały rozdzielone za pomocą odwróconej fazy (RP)-HPLC27,28. Ostatnio Ney i in. użyli wodorotlenku tetrabutyloamoniowego jako odczynnika parującego jony dla ujemnie naładowanego ogona glutaminianu, aby skutecznie zwiększyć separację na RP-HLPC5. W tym miejscu przedstawiamy metodę przygotowania próbek, późniejszej lizy, ekstrakcji, oczyszczania, separacji i oznaczania ilościowego kofaktora F420 nie tylko z czystych kultur, ale także z różnych próbek środowiskowych (tj. gleb i osadów z komory fermentacyjnej).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ekstrakcja i analiza kofaktora F420 to trzyetapowy proces, w tym liza próbki, wstępne oczyszczanie kofaktora poprzez ekstrakcję do fazy stałej (SPE) i wykrywanie kofaktora za pomocą parzystego jonu RP-HPLC (IP-RP-HPLC) z detekcją fluorescencji. Przed rozpoczęciem należy przygotować materiały i odczynniki zgodnie z tabelą 1.

1. Próba lizy

  1. Dodać do 5 g próbki do odpowiednich probówek (np. probówek stożkowych o pojemności 50 ml).
  2. Dodać 5 ml buforu do lizy (2 x roztwór podstawowy, tabela 1) do próbek.
  3. Doprowadzić do końcowej objętości 10 ml wodą destylowaną, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,5 g·mL-1.
  4. Wirować rozcieńczone próbki przez 20 sekund.
  5. Autoklaw przez 30 min w temperaturze 121 °C.
  6. W przypadku próbek suchych, takich jak gleba leśna, po autoklawowaniu doprowadzić do końcowej objętości 20 ml wodą destylowaną i ponownie zawirować rozcieńczoną próbkę.
    UWAGA: Wzrost temperatury podczas autoklawowania może spowodować pęknięcie probówek.

2. Wstępne oczyszczanie kofaktora F 420 poprzez ekstrakcję do fazy stałej (SPE)

UWAGA: Wszystkie etapy SPE są przeprowadzane w temperaturze pokojowej

  1. Schłodzić próbki do temperatury pokojowej.
  2. Odwirować autoklawizowane próbki przez 5 minut przy 11 000 x g.
  3. Przygotować 5 ml kolumn SPE wypełnionych 100 mg słabego anionowego sorbentu polimerowego w trybie mieszanym.
  4. Kondycjonować wymieniacz anionowy 3 ml metanolu (roztwór kondycjonowany, tabela 1).
  5. Zrównoważyć wymieniacz anionowy z 3 ml wody destylowanej (roztwór równoważący, tabela 1).
  6. Załadować do 9,0 ml supernatantu z odwirowanego lizatu na kolumnę SPE.
  7. Zmyć zanieczyszczenia 5 ml 25 mM octanu amonu (roztwór płuczący SPE 1, tabela 1).
  8. Zmyć zanieczyszczenia 5 ml metanolu (roztwór płuczący SPE 2, tabela 1).
  9. Eluować kofaktor F420 w 1,0 ml buforu elucyjnego (tabela 1).
    UWAGA: Przygotować świeży bufor elucyjny. Ze względu na zastosowaną próżnię i wysoką prężność par buforu elucyjnego, objętości elucji mogą się różnić w zależności od próbki. W celu zapewnienia tej samej objętości końcowej we wszystkich próbkach zaleca się zważenie naczyń do pobierania próbek przed i po elucji oraz obliczenie efektywnej objętości elucji. Zrównoważyć różnice przez dodanie buforu elucyjnego.

3. Wykrycie kofaktora F420

  1. Ustaw piekarnik na 40 °C, a detektor fluorescencji na długość fali ekstynkcji 420 nm i długość fali emisji 470 nm. Osiągnij separację w trybie gradientowym przy użyciu ruchomych faz A i B (tabela 1): 0-3 min: 26% B; 3-24 min: 26%-50% B; 24-25 min: 50% B; 25-27 min: 50%-26% B; 27-35 min: 26% B przy natężeniu przepływu 0,75 ml·min-1,
    UWAGA: Zagwarantować równoważenie warunków w kolumnie przed wstrzyknięciem próbek poprzez przepłukanie kolumny co najmniej 3 objętościami kolumny: 74% fazy ruchomej A i 26% fazy ruchomej B (tabela 1).
    1. Przefiltrować eluowane próbki z SPE do fiolek HPLC za pomocą filtra PTFE o wielkości porów 0,22 μm.
      UWAGA: Zalecane są filtry PTFE o wielkości porów 0,22 μm.
    2. Wstrzyknąć 50 μl eluowanej próbki do systemu HPLC w celu przeanalizowania składu i stężenia kofaktora F420.
      UWAGA: Ponieważ w tym protokole nie stosuje się żadnego wzorca ilościowego, próbki i warianty muszą być porównywane według powierzchni pików.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czyste kultury Methanosarcina thermophila i Methanoculleus thermophilus, oba termofilne metanogenne Archaea, były uprawiane w odpowiednich podłożach, jak opisano wcześniej29,30. W przypadku Methanosarcina thermophila metanol był używany jako źródło energii, podczas gdy Methanoculleus thermophilus był hodowany na H2 / CO2 . Wzrost sprawdzono za pomocą oceny mikroskopowej, podczas gdy aktywność zbad...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W celu oceny kofaktora F420 z czystych kultur metanogennych można przeprowadzić ocenę mikroskopową w celu wizualizacji wzrostu i aktywności (mikroskopia fluorescencyjna) zaangażowanych mikroorganizmów (ryc. 1). W przypadku próbek pochodzących ze środowiska naturalnego zastosowanie mikroskopii do wykrywania lub ilościowego oznaczania F420 jest ograniczone ze względu na interferencje z innymi mikroorganizmami fluorescencyjnymi, cząstkami organicznymi i nieorganicznymi. W ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z wdzięcznością dziękujemy Prof. Colinowi Jacksonowi za wsparcie z oczyszczonym kofaktorem F420. Badania były wspierane przez Tyrolski Fundusz Naukowy (TWF) oraz Universität Innsbruck (Publikationsfonds). Bardzo dziękujemy za wsparcie GPS, HK, SB, GG i HB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Autoklaw
Biokompatybilny system HPLC wyposażony w moduł gradientowy, piec i detektor fluorescencjiShimadzuHPLC
Wirówka i rotor do 50 ml " Sokół" probówki (11.000 rcf) i odpowiednie rurki
Kolumna HPLC: Gemini NX C18, 5 μ m, 150 x 3 mmkolumnowy PhenomenexHPLC
(wielkość porów 0,22 i mikro; m) w celu usunięcia cząstek stałych przed analizą
Żywica do SPE: Strata-X-AW 33 μ m jako słaby anion sorbent polimerowy w trybie mieszanymPhenomenexsłaby anion sorbent polimerowy w trybie mieszanym
Kolektor próżniowy do SPE i odpowiednie probówki zbiorcze SprzętSPE
Mieszalnik
System Filtr PTFE HPLC wirowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Greening, C., et al. Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).
  2. Bashiri, G., et al. A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes. Nature Communications. 10 (1), 451(2019).
  3. Grinter, R., Greening, C. Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea. FEMS Microbiology Reviews. , (2021).
  4. Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium. Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).
  5. Ney, B., et al. The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria. The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).
  6. Braga, D., et al. Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420. ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).
  7. Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments. Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).
  8. Michaelis, W., et al. Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane. Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).
  9. Knittel, K., Lösekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps. Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).
  10. Lin, X. -L., White, R. H. Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria. Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).
  11. Spang, A., et al. The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations. Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).
  12. Mand, T. D., Metcalf, W. W. Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).
  13. Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis. Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).
  14. Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri. mBio. 9 (4), (2018).
  15. Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea. FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).
  16. Purwantini, E., Daniels, L. Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).
  17. McCormick, J. R. D., Morton, G. O. Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species. Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).
  18. Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -S. T., Yurek, D. A. Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis. The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).
  19. Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase. Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).
  20. Gurumurthy, M., et al. A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents. Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).
  21. Greening, C., et al. Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism. Frontiers in Microbiology. 8, 1000(2017).
  22. Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -T., Fraaije, M. W. Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes. Chemical Communications. 54 (79), Cambridge, England. 11208-11211 (2018).
  23. Ney, B., et al. Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases. Frontiers in Microbiology. 8, 1902(2017).
  24. Grinter, R., et al. Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria. mSystems. 5 (3), (2020).
  25. Peck, M. W. Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei. Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).
  26. Gorris, L. G., vander Drift, C. Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed. BioFactors. 4 (3-4), Oxford, England. 139-145 (1994).
  27. Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species. Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).
  28. Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain). Microbial Ecology. 61, (2011).
  29. Wagner, A. O., et al. Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155(2019).
  30. Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila. Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).
  31. Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments. Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).
  32. Wagner, A. O., et al. Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants. Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).
  33. Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis. PloS one. 5 (12), 15803(2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kultury metanogenneekstrakcja do fazy sta ejwysokosprawna chromatografia cieczowaanaliza d ugo ci ogonadetekcja metanogen wosad anaerobowyglebowe spo eczno ci mikrobiologiczne

Powiązane artykuły