Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62744

⸱

20 listopada 2021

 , 
1DBT-National Brain Research Centre

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

Streszczenie

W neuronach orientacja mikrotubul była kluczowym czynnikiem do identyfikacji aksonów, które mają mikrotubule na końcu plusa i dendryty, które zazwyczaj mają orientację mieszaną. W tym miejscu opisujemy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamiki i wzrostu mikrotubul podczas rozwoju i regeneracji neuronów dotykowych u C. elegans. Używając genetycznie kodowanych fluorescencyjnych reporterów końcówek mikrotubul, zobrazowaliśmy mikrotubule aksonalne. Lokalne zmiany w zachowaniu mikrotubul, które inicjują regenerację aksonów po aksotomii, można określić ilościowo za pomocą tego protokołu. Test ten można dostosować do innych neuronów i tła genetycznego w celu zbadania regulacji dynamiki mikrotubul w różnych procesach komórkowych.

Wprowadzenie

Neurony mają skomplikowaną architekturę z wyspecjalizowanymi przedziałami, takimi jak dendryty, ciała komórkowe, aksony i synapsy. Cytoszkielet neuronalny składa się z mikrotubul, mikrofilamentów i neurofilamentów, a ich odrębna organizacja wspiera przedziały neuronalne strukturalnie i funkcjonalnie1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Z biegiem lat organizacja mikrotubul została zidentyfikowana jako kluczowy czynnik determinujący polaryzację i funkcję neuronów. Ponieważ neurony przechodzą przebudowę strukturalną podczas rozwoju lub regeneracji, dynamika i orientacja mikrotubul determinują tożsamość, spolaryzowany transport, wzrost i rozwój różnych przedziałów neuronalnych7. Dlatego konieczna jest ocena dynamiki i orientacji mikrotubul in vivo, aby skorelować z procesem przebudowy neuronów.

Mikrotubule składają się z protofilamentów α i β heterodimerów tubuliny z dynamicznymi końcami dodatnimi i względnie stabilnymi końcami ujemnymi11,12. Odkrycie kompleksu końcówki dodatniej i związanych z nim białek wiążących końce umożliwiło stworzenie platformy do oceny organizacji mikrotubul13. Białka wiążące końce (EBP) przejściowo wiążą się z rosnącymi końcami dodatnimi mikrotubuli, a ich dynamika asocjacji jest skorelowana ze wzrostem protofilamentów mikrotubul14,15. Ze względu na częste asocjacje i dysocjację kompleksu końcówki dodatniej z mikrotubulą, funkcja rozrzutu punktowego EBP oznaczonego GFP pojawia się jako "kometa" w filmie poklatkowym15,16. Od czasu pionierskiej obserwacji w neuronach ssaków16, białka wiążące końce oznaczone białkami fluorescencyjnymi są używane do określania dynamiki mikrotubul w różnych systemach modelowych i typach neuronów17,18,19,20,21,22,Lokal mieszkalny 23.

Ze względu na swój prosty układ nerwowy i przezroczyste ciało, C. elegans okazał się doskonałym modelowym systemem do badania przebudowy neuronów podczas rozwoju i regeneracji in vivo. W tym miejscu opisujemy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamiki i wzrostu mikrotubul podczas rozwoju i regeneracji neuronów dotykowych u C. elegans. Używając genetycznie kodowanego EBP-2::GFP, zobrazowaliśmy mikrotubule w neuronie PLM, co pozwoliło nam określić polaryzację mikrotubul w dwóch różnych neurytach tego neuronu24. Metoda ta pozwala na obserwację i kwantyfikację komet EBP jako miary dynamiki mikrotubul w różnych kontekstach komórkowych, na przykład lokalne zmiany w zachowaniu mikrotubul, które inicjują regenerację aksonów po aksotomii, można ocenić za pomocą naszego protokołu. Test ten można dostosować do badania regulacji dynamiki mikrotubul w różnych procesach komórkowych w różnych typach komórek i tłach genetycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Szczep reporterski: Hodowla i utrzymanie

UWAGA: Aby zmierzyć dynamikę i orientację mikrotubul w neuronach PLM, użyliśmy szczepu robaka wyrażającego EBP-2::GFP pod promotorem specyficznym dla neuronów dotykowych mec-4 (allel juIs338)18,25,26. Używamy standardowych metod hodowli i konserwacji robaków dla tego szczepu27.

  1. Przygotować pożywkę do wzrostu nicieni (3,0 g/l chlorku sodu, 2,5 g/l peptonu, 20,0 g/l agaru, 10 mg/l cholesterolu (rozcieńczonego z roztworu podstawowego 10 mg/ml)) w wodzie i autoklawować mieszaninę.
  2. Schłodzić mieszaninę krótko przez 10-15 minut, a następnie uzupełnić ją 1 mM chlorku wapnia, 1 mM siarczanu magnezu i 25,0 mM fosforanu potasu jednozasadowego o pH 6,0.
  3. Wlać około 9 ml mieszaniny na szalki Petriego o średnicy 60 mm za pomocą sterylnego dozownika, a następnie przechowywać w temperaturze pokojowej i sterylnych warunkach przez jeden dzień, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotować 50 ml bulionu B (5,0 g/l chlorku sodu, 10,0 g/l bakto-tryptonu), autoklaw i schłodzić przed zaszczepieniem pojedynczą kolonią Escherichia coli (szczep OP50).
  5. Hodować bakterie w temperaturze 37 °C przez 12 godzin. Doprowadź schłodzone płytki NGM do temperatury pokojowej w celu wysiewu i za pomocą wysterylizowanego rozsiewacza szkła rozsmaruj bakterie OP50 na płytce NGM.
  6. Utrzymuj zaszczepione płytki NGM w temperaturze 37 °C przez 12 godzin, co pozwoli na utworzenie bakteryjnego trawnika do hodowli C. elegans. Płytki te można przechowywać w inkubatorze w temperaturze 20 °C do czasu użycia.
  7. Umieść szczep transgeniczny na wysiewanych płytkach NGM.
  8. Wysterylizuj platynowy druciany szpikulec na płomieniu i wybierz 20-25 grawitacyjnych dorosłych hermafrodytów do przeniesienia na świeżo wysiany talerz.
  9. Po przeniesieniu przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 20 °C na 1 godzinę. Następnie wyciągnij dorosłe osobniki z tych talerzy. Te talerze będą teraz zawierały jaja, które są dopasowane do wieku.
  10. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 20 °C w celu odchowu do momentu osiągnięcia fazy rozwojowej będącej przedmiotem zainteresowania, którą w tym przypadku jest stadium L4 po 43,5 godziny po złożeniu jaj. Aby uzyskać więcej robaków, przyłóż wiele tablic, aby uniknąć zatłoczenia.
  11. Na pożądanym etapie rozwoju, robaki te mogą być zamontowane w celu obrazowania komet EBP-2::GFP.

2. Przygotowanie próbki: Montaż robaków do obrazowania komet EBP-2

UWAGA: Aby umożliwić obserwację komet EBP na żywo w neuronach PLM, umieściliśmy robaki na poduszkach agarozowych, aby zminimalizować ich ruchliwość, nie naruszając jednocześnie fizjologii neuronu. Spośród różnych metod unieruchomienia wybraliśmy rozwiązanie z kulkami polistyrenowymi 0,1 μm, które są łatwo dostępne na rynku. Przedstawiliśmy procedurę montażu używaną specjalnie do obserwacji EBP-2::GFP.

  1. Przygotować roztwór 10% agarozy, topiąc 0,2 g agarozy w 2 ml 1x buforu M9 (0,02 M KH2PO4, 0,02 M Na2HPO4, 0,008 M NaCl, 0,02 M NH4Cl) w szklanej probówce o pojemności 5 ml nad płomieniem. Ta probówka może z łatwością zmieścić się w bloku grzewczym, który utrzymuje agarozę w stanie stopionym do momentu użycia.
  2. Za pomocą zakraplacza z szerokim otworem dozuj kroplę (około 100 μl) tej stopionej agarozy na czyste szkiełko o wymiarach 35 mm x 25 mm.
  3. Gdy jest w stanie stopionym, dociśnij kroplę innym szkiełkiem, aby utworzyć cienką warstwę agarozy między szkiełkami. Agaroza krzepnie w postaci filmu o grubości około 0,5 - 1,0 mm w ciągu około 30 sekund.
  4. Gdy agaroza zastygnie, przytrzymaj dolny szkiełko w ręce niedominującej, a górne szkiełko w ręce dominującej. Podnieś górną prowadnicę, trzymając dolną prowadnicę stabilnie, w wyniku czego podkładka agarozowa przykleja się do jednego z dwóch slajdów.
  5. Jeśli uformowana podkładka z agarozy jest większa niż rozmiar szkiełka nakrywkowego (18 mm x 18 mm), należy przyciąć krawędzie podkładki, aby uzyskać wymagane wymiary, aby zapewnić prawidłowe ułożenie szkiełka nakrywkowego. Te płatki agarozowe są przeznaczone do natychmiastowego użycia i nie mogą być przechowywane.
  6. Sprawdź wzrokowo podkładkę agarozową pod kątem gładkiej powierzchni, która jest wilgotna i nadaje się do montażu. Jeśli podkładka agarozowa zostanie wystawiona na działanie powietrza i wyschnie, powierzchnia podkładki agarozowej wydaje się pomarszczona. W takim scenariuszu przygotuj świeżą podkładkę z agarozy, jak wspomniano w krokach 2-6 tej sekcji.
  7. Na podkładkę agarozową umieść 2 μl roztworu kulek polistyrenowych o stężeniu 0,1 μm jako medium montażowe.
  8. Zbierz 3-4 robaki za pomocą platynowego drucianego kilofa i przenieś je na nieobsianą płytkę NGM. Proces ten zapewnia usunięcie bakterii powierzchniowych, które utrudniają unieruchomienie podczas montażu.
  9. Gdy robaki wypełzną z ich powierzchni, podnieś je do montażu za pomocą platynowego drucianego szpikulca i ponownie zawieś w kropli kulek polistyrenowych na podkładce agarozowej.
  10. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 mm x 18 mm na robakach. Aby zapobiec patroszeniu zamontowanych ślimaków, nie przesuwaj szkiełka nakrywkowego po umieszczeniu.
  11. Zamontuj przygotowane szkiełko na mikroskopie w celu obrazowania.

3. Konfiguracja i akwizycja obrazowania

UWAGA: Komety EBP poruszają się z przybliżoną prędkością 0,22 μm/s, jak zaobserwowano w neuronach ssaków i PLM C. elegans16,18. Aby optymalnie próbkować zdarzenia w akwizycji poklatkowej zgodnie z kryteriami Nyquista28, wymagane są skale przestrzenne i czasowe odpowiednio 0,09 μm i 0,43 s. W celu zapobiegania fototoksyczności lub fotowybielaniu zastosowaliśmy akwizycję Spinning Disk. Poniżej opisaliśmy naszą konfigurację obrazowania i ustawienia akwizycji.

  1. Uchwyć obrazy za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w obracający się dysk i kamerę. Włącz konfigurację zgodnie z instrukcją producenta.
  2. Włącz oprogramowanie, które steruje konfiguracją.
  3. Ponieważ jest to mikroskop odwrócony, umieść szkiełko z zamontowanymi robakami na stoliku z obiektywem o małym powiększeniu (5x lub 10x) z szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w dół.
  4. Ustaw ścieżkę światła do oka lub tryb widzialny, który wykorzystuje oświetlenie z lampy halogenowej dla światła przechodzącego i lampy łukowej rtęciowej dla światła odbitego.
  5. Ustaw ostrość i wyśrodkuj robaka w polu widzenia pod jasnym polem.
  6. Nałóż olejek immersyjny i zmień powiększenie na 63x (1,4 NA/olej) i ponownie ustaw ostrość ogona robaka w jasnym polu dla neuronów PLM.
  7. Włącz fluorescencję lampy łukowej rtęciowej, aby na krótko przeogniskować neurony PLM. Umieść odpowiedni zestaw odbłyśnika (AF488) na ścieżce światła w celu wizualizacji GFP.
  8. Ustaw mikroskop na akwizycję kamery, kierując ścieżkę światła do kamery.
    UWAGA: Sterowanie wyżej wymienionymi krokami 4-7 za pomocą ekranu tranzystora cienkowarstwowego (TFT) mikroskopu jest szybkie i zapobiega niepotrzebnemu narażeniu na oświetlenie. Alternatywnie steruj oświetleniem, odbłyśnikiem za pomocą oprogramowania.
  9. Po zogniskowaniu neuronu PLM w polu widzenia, w interfejsie oprogramowania wybierz oświetlenie lasera 488 nm o mocy 30% i ekspozycji 300 ms dla kamery o wartości wzmocnienia zwielokrotnienia elektronów (EM) 70. W zależności od wyrażenia reportera należy zmieniać te parametry zgodnie z wymaganiami. Zapisz ustawienia jako konfigurację dla kolejnych sesji obrazowania.
  10. Na karcie Kanały przechowywane są ścieżki, z których każda ma określone ustawienie oświetlenia i kamery. Podświetlona ścieżka umożliwia wizualizację na żywo, natomiast w celu uzyskania obrazu ścieżka musi być zaznaczona. Podświetl kanał za pomocą jasnego pola (DIC), aby na żywo wyświetlić ogon robaka w obszarze roboczym. Próbka jest zogniskowana i wyśrodkowana w oknie obrazowania na żywo w przestrzeni roboczej.
  11. Podświetl kanał za pomocą wzbudzenia laserowego 488 nm, aby szybko ustawić ostrość neuronu PLM w oknie obrazowania na żywo. Po ustawieniu fokusu rozpocznij akwizycję poklatkową, ustawiając parametry szeregów czasowych, jak wspomniano w następnym kroku.
  12. Korzystając z oświetlenia laserowego 488 nm, skonfiguruj eksperyment z szeregami czasowymi na 2 minuty i bez odstępu czasu między klatkami. Aby utrzymać skale czasowe akwizycji obrazu, uzyskaliśmy tylko fluorescencję GFP.
  13. Korzystając z karty Rozpocznij eksperyment, rozpocznij pobieranie. Użycie 63-krotnego powiększenia ogranicza rozdzielczość przestrzenną do 0,21 μm, która jest próbkowana przez kamerę przy rozmiarze piksela 0,09 μm. Uzyskaj upływ czasu z prędkością 3,3 klatki/s, aby optymalnie próbkować zdarzenie. Zdjęcie poklatkowe zawierało 396 klatek czasowych wykonanych w czasie 2 minut. Po pobraniu zapisz obraz w formacie domyślnym, do którego można później uzyskać dostęp za pomocą domyślnego oprogramowania lub ImageJ.

4. Obserwacja i analiza

  1. Wyświetl podgląd akwizycji poklatkowej w domyślnym oprogramowaniu lub otwórz ją w Image J za pomocą wtyczki Bioformats.
    UWAGA: Proces analizy obrazu opisaliśmy w Obrazie J.
  2. Zainstaluj wtyczkę Bioformats w ImageJ.
    1. Alternatywnie wyeksportuj plik w formacie domyślnym do .tif w celu zapewnienia zgodności plików w ImageJ. Funkcja eksportu w ZEN2 powoduje, że poszczególne klatki obrazu są osobnymi plikami .tif. Unikamy tej metody, aby zapobiec tworzeniu dużej liczby plików.
  3. Otwórz obraz w formacie ".czi" bezpośrednio na obrazie J za pomocą wtyczki "Bioformats". Obraz zostanie otwarty jako stos wielu obrazów. Jeśli korzystasz z funkcji "eksportuj" domyślnego oprogramowania, odtwórz obrazy jako stos wielu obrazów, korzystając z następującego przepływu pracy w ImageJ: ImageJ Program > Menu obrazu > Podmenu Stosy > Obrazy do ułożenia w stos.
  4. Podgląd obrazu jako filmu można wyświetlić za pomocą ikony Odtwórz w lewym dolnym rogu okna obrazu. Komety mogą być postrzegane jako jasne, ruchome punkty w ciele komórki i procesy neuronu PLM. Jeśli komety są wyraźnie widoczne, przejdź do kroku 8, w przeciwnym razie wykonaj kroki 5-7 z tej sekcji.
  5. Przekonwertuj profil kolorów obrazu za pomocą tabeli przeglądowej (LUT) na obraz w skali szarości: program ImageJ > menu Obraz > podmenu Tabele przeglądów > Wybierz odcienie szarości.
  6. Odwróć profil LUT obrazu, aby ułatwić wizualizację: Program ImageJ > menu Obraz > podmenu Tabele przeglądowe > Odwróć LUT.
  7. Dostosuj jasność i kontrast obrazu, aby zobaczyć komety: Program ImageJ > menu Obraz > podmenu Dostosuj > Jasność/Kontrast.
    1. Przesuń suwaki Minimum, Maksimum, Jasność i Kontrast, aby uzyskać żądane skalowanie intensywności na obrazie. Określiliśmy ilościowo obrazy z wyraźnie widocznymi kometami.
  8. Podstawowa wersja ImageJ ma narzędzia startowe reprezentowane jako ikony. Zlokalizuj i kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę z linią, aby otworzyć menu rozwijane i wybierz linię podzieloną na segmenty. Narysuj linię podzieloną na segmenty w obszarach zainteresowania (ROI), które mają swój początek w ciele komórki neuronu lub w jej pobliżu.
    1. Do późniejszych rozważań zapisz podzielony na segmenty zwrot z inwestycji za pomocą menedżera zwrotu z inwestycji, korzystając z następującego przepływu pracy: ImageJ > Analyze > Tools > Menedżer ROI > Wybierz narysowany ślad na obrazie i kliknij przycisk Dodaj w oknie Menedżer ROI > Więcej w oknie menedżera ROI > Zapisz.
  9. Przed wygenerowaniem kimografu, ponieważ skale przestrzenne i czasowe są różne, usuń skalowanie, aby uzyskać pomiary w pikselach, korzystając z następujących metod:
    ImageJ > Analizuj > Ustaw skalę > Kliknij, aby usunąć skalę > Ok.
  10. Korzystając z funkcji Reslice w menu rozwijanym Image > Stacks (Obraz stosy), wygeneruj kimograf. Kymograf jest reprezentacją segmentowego zwrotu z inwestycji w czasie. Oś pozioma reprezentuje odległość, a oś pionowa reprezentuje czas. Ślady po przekątnej reprezentują poruszające się komety. Ogólnie rzecz biorąc, kimograf przyjmuje profil kolorów obrazu, w przeciwnym razie przypisuje profil kolorów zgodnie z opisem w poprzednich krokach 5-6 w celu wizualizacji śladów po przekątnej.
  11. Korzystając z funkcji Linia prosta w menu rozwijanym narzędzia Linia (patrz krok 9 w tej sekcji), narysuj linie proste na każdym ze śladów ukośnych i dołącz je w menedżerze ROI.
  12. Na karcie Analiza przejdź do pozycji Ustaw pomiary i wybierz parametry Średnia intensywność i Prostokąt ograniczający do pomiaru śladów.
  13. W oknie menedżera ROI kliknij przycisk Zmierz, co spowoduje otwarcie okna Wynik, w którym uzyskane zostaną średnie intensywności ROI, współrzędne X i Y śladów linii, szerokość, wysokość, kąt i długość śladów linii. To okno można zapisać w formacie .csv, a następnie zaimportować do programu do analizy danych.
  14. W programie arkusza kalkulacyjnego otwiera się okno wyników z wartościami rozłożonymi w wierszach i kolumnach. Odpowiednimi wartościami są szerokość, wysokość i kąt ścieżek. Szerokość oznacza przemieszczenie śladu, wysokość określa czas trwania, a kąt reprezentuje wektor. Ponieważ wartości szerokości i wysokości są wyrażone w pikselach, pomnóż je odpowiednio przez skale przestrzenne i czasowe, aby uzyskać standardowe mierzalne parametry.
  15. Ponieważ lewa strona kimografu jest bliższa ciału komórki, w zależności od kąta, klasyfikuj komety jako plus-koniec-koniec lub minus-koniec-koniec (tj. odpowiednio od ciała komórki lub w kierunku ciała komórki). Klasyfikuj kąty od 1° do -89° i od -91° do -179° odpowiednio jako plus-koniec-koniec i minus-koniec. Zbierz dane z wielu kimografów w arkuszu kalkulacyjnym na potrzeby badania i przedstaw je statystycznie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jako reprezentatywny przykład opisaliśmy obserwacje in vivo komet EBP w aksonach w stanie stacjonarnym oraz regenerujących się neuronów PLM. Neurony PLM znajdują się w regionie ogona nicienia, posiadając długi wypust przedni, który tworzy synapsę, oraz krótki wypust tylny. Neurony PLM rosną w kierunku przednio-tylnym w pobliżu nabłonka i odpowiadają za odczuwanie lekkiego dotyku u nicieni. Ze względu na uproszczoną strukturę oraz podatność na obrazowanie i mikrochirurgię, neurony PLM były szeroko badane pod kątem cytoszk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zrozumienie dynamiki mikrotubul było od lat kluczowym celem w dziedzinie badań nad cytoszkieletem. Mikrotubule ulegają zarodkowaniu i katastrofie wraz z ciągłym procesem dynamicznej niestabilności 44,45,46,47. Wiele z tych informacji uzyskano za pomocą testów in vitro, takich jak odczyty rozpraszania światła wolnej i spolimeryzowanej tubuliny, testy wzrostu mikrotub...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Yishi Jin i Andrew Chisholm za początkowe wsparcie i szczep użyty w badaniu. Szczep bakteryjny OP50 został komercyjnie wykorzystany w Caenorhabditis Genetics Center (CGC) finansowanym przez NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Dziękujemy również Dharmendrze Puri za standaryzację procedur eksperymentalnych. Badanie jest finansowane z grantu podstawowego Narodowego Centrum Badań nad Mózgiem (wspieranego przez Departament Biotechnologii rządu Indii), DBT/Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA/E/18/1/504331) dla S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA/I/13/1/500874) dla A.G.-R oraz grantu z Science and Engineering Research Board (SERB: CRG/2019/002194) do A.G.-R.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CZ18975 szczep robakaYishi Jin labCZ18975Wygenerowany przez Anindya Ghosh-Roy
AgaroseSigmaA9539Ślimaki montażowe
Szkiełko nakrywkowe (18 mm x 18 mm)Zeiss474030-9010-000Ślimaki montażowe
Sucha kąpiel z blokiem grzewczymNeolabŚlimaki montażowe
Prowadnice szklane (35 mm x 25 mm)Blue StarŚlimaki montażowe
Roztwór kulek polistyrenowych (4,55 x 10^13 cząstek/ml w środowisku wodnym z minimalną ilością środka powierzchniowo czynnego)Polysciences Inc.00876Ślimaki montażowe
ProbówkiŚlimaki montażowe
Szczep bakteryjny OP50Caenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50Obsługa robaków
60mm płytki PetriegoPraveen Scientific20440Obsługa robaków
Aspirator/kapilaraVWR53432-921Inkubator do obsługi robaków
PanasonicMIR554EObsługa ślimaków
platynowyObsługa ślimaków
Mikroskop stereoskopowy z przystawką fluorescencyjnąLeicaM165FCObsługa robaków
0,3% Chlorek soduSigma71376Pożywka dla nicieni
0,25% PeptonT M Media1506Pożywka dla nicieni
10 mg / ml CholesterolSigmaC8667Pożywka dla nicieni
1mM Dwuwodny chlorek wapniaSigma223506Pożywka dla nicieni
1mM Siedmiowodny siarczan magnezuSigmaM2773Pożywka dla nicieni
2% AgarT M Pożywka1202Pożywka dla nicieni
25mM Monozasadowy diwodorofosforan potasuSigmaP9791Pożywka dla nicieni
0,1 M Monozasadowy diwodorofosforan potasuSigmaP97911X Bufor
M9 0,04 M Chlorek soduSigma713761X M9 bufor
0,1 M Chlorek amonuFisher Scientific214051X M9 bufor
0,2M dwuzasadowy wodorofosforan disodowy siedmiowodnySigmaS93901X Bufor M9
Butelki szklaneBorosilPrzechowywanie buforowe
Laser 488 nmObiektyw ZeissImaging
5XObiektyw ZeissImaging
63Xdo obrazowaniaZeiss
FotometriaEvolve 512 Delta
Imaging System komputerowy do jednostki Spinning DiskHPIntel ® Xeon CPU E5-2623 Obrazowanie 3,00 GHz
Mikroskop epifluorescencyjnyZeissObserver.Z1Obrazowanie
Lampa halogenowaZeissObrazowanie
Lampa łukowa rtęciObrazowanie Zeiss
Wirująca jednostka dyskowaYokogawaCSU-X1Oprogramowanie do obrazowania
ZEN2ZeissImaging
J (Fidżi Wersja)Analiza i przetwarzanie obrazu
Adobe Creative CloudAdobeAnaliza i przetwarzanie obrazów
System komputerowy do analizy obrazuDellIntel ® Rdzeń i handel; Procesor i7-9700 3,00 GHzPrzetwarzanie/reprezentacja obrazu
Drut Aparat

Bibliografia

  1. Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
  2. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  3. Tas, R. P., Kapitein, L. C. Exploring cytoskeletal diversity in neurons. Science. 361 (6399), 231-232 (2018).
  4. Kirkpatrick, L. L., Brady, S. T. Molecular Components of the Neuronal Cytoskeleton. Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical Aspects, 6th edition. , (1999).
  5. Muñoz-Lasso, D. C., Romá-Mateo, C., Pallardó, F. V., Gonzalez-Cabo, P. Much More Than a Scaffold: Cytoskeletal Proteins in Neurological Disorders. Cells. 9 (2), 358(2020).
  6. Menon, S., Gupton, S. L. Building Blocks of Functioning Brain: Cytoskeletal Dynamics in Neuronal Development. International Review of Cell and Molecular Biology. 322, 183-245 (2016).
  7. Lasser, M., Tiber, J., Lowery, L. A. The role of the microtubule cytoskeleton in neurodevelopmental disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 165(2018).
  8. Konietzny, A., Bär, J., Mikhaylova, M. Dendritic Actin Cytoskeleton: Structure, Functions, and Regulations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 147(2017).
  9. Helfand, B. T., Mendez, M. G., Pugh, J., Delsert, C., Goldman, R. D. A Role for Intermediate Filaments in Determining and Maintaining the Shape of Nerve Cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (12), 5069-5081 (2003).
  10. Lariviere, R. C., Julien, J. P. Functions of Intermediate Filaments in Neuronal Development and Disease. Journal of Neurobiology. 58 (1), 131-148 (2004).
  11. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13, 83-117 (1997).
  12. Nogales, E., Wolf, S. G., Downing, K. H. Structure of the αβ tubulin dimer by electron crystallography. Nature. 391 (6663), 199-203 (1998).
  13. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. Journal of Cell Science. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  14. Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
  15. Perez, F., Diamantopoulos, G. S., Stalder, R., Kreis, T. E. CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell. 96 (4), 517-527 (1999).
  16. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  17. Rolls, M. M., Satoh, D., Clyne, P. J., Henner, A. L., Uemura, T., Doe, C. Q. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2 (1), 7(2007).
  18. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and Tubulin Posttranslational Modifications Regulate Microtubule Growth in Axon Regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  19. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  20. Tran, L. D., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development (Cambridge). 139 (19), 3644-3652 (2012).
  21. Tirnauer, J. S., Grego, S., Salmon, E. D., Mitchison, T. J. EB1-Microtubule Interactions in Xenopus Egg Extracts: Role of EB1 in Microtubule Stabilization and Mechanisms of Targeting to Microtubules. Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3614-3626 (2002).
  22. Maniar, T. A., et al. UNC-33 (CRMP) and ankyrin organize microtubules and localize kinesin to polarize axon-dendrite sorting. Nature Neuroscience. 15 (1), 48-56 (2012).
  23. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global Up-Regulation of Microtubule Dynamics and Polarity Reversal during Regeneration of an Axon from a Dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  24. Puri, D., Ponniah, K., Biswas, K., Basu, A., Lundquist, E. A., Ghosh-Roy, A. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13 Family Microtubule Depolymerizing Factor. SSRN Electronic Journal. , (2019).
  25. CZ18975 (strain). WormBase Nematode Information Resource. , Available from: https://wormbase.org/species/c_elegans/stran/WBStrain00005443#03–10 (2021).
  26. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and tubular post translational modifications regulate microtubule growth in axon regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  27. Chuang, M., Goncharov, A., Wang, S., Oegema, K., Jin, Y., Chisholm, A. D. The microtubule minus-end-binding protein patronin/PTRN-1 is required for axon regeneration in C. elegans. Cell Reports. 9 (3), 874-883 (2014).
  28. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  29. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , Springer. (2006).
  30. Chalfie, M., Thomson, J. N. Organization of neuronal microtubules in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 82 (1), 278-289 (1979).
  31. Murthy, K., Bhat, J. M., Koushika, S. P. In vivo imaging of retrogradely transported synaptic vesicle proteins in Caenorhabditis elegans neurons. Traffic. 12 (1), 89-101 (2011).
  32. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884(2008).
  33. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  34. Ghosh-Roy, A., Chisholm, A. D. Caenorhabditis elegant: A new model organism for studies of axon regeneration. Developmental Dynamics. 239 (5), 1464(2010).
  35. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I. Wnt signals and Frizzled activity orient anterior-posterior axon outgrowth in C. elegans. Developmental Cell. 10 (3), 379-390 (2006).
  36. Prasad, B. C., Clark, S. G. Wnt signaling establishes anteroposterior neuronal polarity and requires retromer in C. Elegant. Development. 133 (9), 1757-1766 (2006).
  37. Puri, D., et al. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13. Journal of Cell Biology. 220 (9), (2021).
  38. Chen, C. H., Chen, Y. C., Jiang, H. C., Chen, C. K., Pan, C. L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (0), (2013).
  39. Toth, M. L., et al. Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).
  40. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. Elegant. Optics Express. 15 (14), 8521-8531 (2007).
  41. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., ToliĆ-NØrrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. Journal of Microscopy. 234 (1), 1-8 (2009).
  42. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical Review Letters. 99 (15), (2007).
  43. Steinmeyer, J. D., et al. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature Protocols. 5 (3), 395-407 (2010).
  44. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (57), e3331(2011).
  45. Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo laser axotomy in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (51), e2707(2011).
  46. Basu, A., et al. let-7 miRNA controls CED-7 homotypic adhesion and EFF-1-mediated axonal self-fusion to restore touch sensation following injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 10206-10215 (2017).
  47. Horio, T., Murata, T., Murata, T. The role of dynamic instability in microtubule organization. Frontiers in Plant Science. 5, (2014).
  48. Michaels, T. C. T., Feng, S., Liang, H., Mahadevan, L. Mechanics and kinetics of dynamic instability. eLife. 9, 1-29 (2020).
  49. Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
  50. Aher, A., Akhmanova, A. Tipping microtubule dynamics, one protofilament at a time. Current Opinion in Cell Biology. 50, 86-93 (2018).
  51. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  52. Harterink, M., et al. Local microtubule organization promotes cargo transport in C. elegans dendrites. Journal of Cell Science. 131 (20), 223107(2018).
  53. Yogev, S., Maeder, C. I., Cooper, R., Horowitz, M., Hendricks, A. G., Shen, K. Local inhibition of microtubule dynamics by dynein is required for neuronal cargo distribution. Nature Communications. 8, (2017).
  54. Liang, X., et al. Growth cone-localized microtubule organizing center establishes microtubule orientation in dendrites. eLife. 9, 1-28 (2020).
  55. Yan, J., et al. Kinesin-1 regulates dendrite microtubule polarity in Caenorhabditis elegans. eLife. 2013 (2), 133(2013).
  56. Wang, S., et al. NOCA-1 functions with γ-tubulin and in parallel to Patronin to assemble non-centrosomal microtubule arrays in C. elegans. eLife. 4, (2015).
  57. Castigiioni, V. G., Pires, H. R., Bertolini, R. R., Riga, A., Kerver, J., Boxem, M. Epidermal par-6 and pkc-3 are essential for larval development of C. elegans and organize non-centrosomal microtubules. eLife. 9, 1-37 (2020).
  58. Taffoni, C., et al. Microtubule plus-end dynamics link wound repair to the innate immune response. eLife. 9, (2020).
  59. Motegi, F., Velarde, N. V., Piano, F., Sugimoto, A. Two phases of astral microtubule activity during cytokinesis in C. elegans embryos. Developmental Cell. 10 (4), 509-520 (2006).
  60. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 53419(2013).
  61. Agarose immobilization of C. elegans. , Available from: http://wbg.wormbook.org/2009/12/01/agarose-immobilization-of-c-elegans/ (2021).
  62. Breton, S., Brown, D. Cold-induced microtubule disruption and relocalization of membrane proteins in kidney epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (2), 155-166 (1998).
  63. Weber, K., Pollack, R., Bibring, T. Antibody against tubulin: the specific visualization of cytoplasmic microtubules in tissue culture cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (2), 459-463 (1975).
  64. Weisenberg, R. C. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).
  65. Tilney, L. G., Porter, K. R. Studies on the microtubules in heliozoa. II. The effect of low temperature on these structures in the formation and maintenance of the axopodia. The Journal of Cell Biology. 34 (1), 327-343 (1967).
  66. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: Evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  67. Wang, X., et al. In vivo imaging of a PVD neuron in Caenorhabditis elegans. STAR Protocols. 2 (1), 100309(2021).
  68. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  69. Portman, D. S. Profiling C. elegans gene expression with DNA microarrays. WormBook. , 1-11 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Orientacja mikrotubulneurony C. elegansobrazowanie in vivoregeneracja aksonówbiałka wiążące końce mikrotubulreportery fluorescencyjnemikroskopia dysku rotującegoobrazowanie poklatkoweanaliza kymograficzna
In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.