Test fluorescencyjny do oceny przepuszczalności bariery śródbłonka mikronaczyniowego serca w szczurzym modelu niedokrwienia/reperfuzji

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę funkcjonalnej oceny bariery śródbłonkowej mikronaczyń serca po uszkodzeniu niedokrwiennym/reperfuzyjnym poprzez pomiar średniej intensywności fluorescencji wynaczynionego 70 000 Da FITC-dekstranu w porównaniu z błękitem Evansa.

Streszczenie

Terapie rewaskularyzacyjne dla tętnic winowajców, niezależnie od przezskórnej interwencji wieńcowej i pomostowania aortalno-wieńcowego, są uważane za najlepszą strategię poprawy rokowania klinicznego pacjentów z ostrym zespołem wieńcowym (OZW). Niemniej jednak reperfuzja mięśnia sercowego po skutecznej rewaskularyzacji może spowodować znaczną śmierć kardiomiocytów i zapadnięcie śródbłonka wieńcowego, znane jako niedokrwienie mięśnia sercowego/uszkodzenie reperfuzyjne (MIRI). Zwykle komórki śródbłonka i ich ścisłe połączenia międzykomórkowe współpracują ze sobą utrzymując barierę śródbłonka mikronaczyniowego i jej stosunkowo niską przepuszczalność, ale zawodzą w obszarach reperfuzji.

Nadmierna przepuszczalność śródbłonka mikronaczyniowego wywołana niedokrwieniem/reperfuzją (IR) przyczynia się do obrzęku mięśnia sercowego, zwiększonej infiltracji komórek prozapalnych i nasilenia krwotoku śródmięśniowego mięśnia sercowego, co może pogorszyć rokowanie w OZW. Znacznik użyty w tym badaniu - 70 000 Da FITC - dekstran, rozgałęziona cząsteczka glukozy znakowana izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) - wydaje się zbyt duży, aby naciekać śródbłonek mikronaczyniowy serca w normalnych warunkach. Jest jednak w stanie przeniknąć do uszkodzonej bariery po MIRI. Zatem im wyższa przepuszczalność śródbłonka, tym więcej FITC-dekstranu gromadzi się w pozanaczyniowej przestrzeni międzykomórkowej. Zatem intensywność fluorescencji z FITC może wskazywać na przepuszczalność bariery śródbłonka mikronaczyniowego. Protokół ten wykorzystuje FITC-dekstran do funkcjonalnej oceny bariery śródbłonka mikronaczyniowego serca, która jest wykrywana przez zautomatyzowany system obrazowania ilościowego patologii.

Wprowadzenie

Fakt, że coraz większa liczba pacjentów z chorobami niedokrwiennymi serca od dziesięcioleci korzysta z terapii rewaskularyzacyjnej, nie neguje śmiertelnych konsekwencji MIRI. Jak opisali Yellon i Hausenloy, około 30% końcowego rozmiaru zawału można przypisać MIRI¹. Dysfunkcja śródbłonka mikronaczyniowego serca jest podstawowym mechanizmem leżącym u podstaw MIRI i zjawiska "no-reflow" i jest celem wielu środków kardioprotekcyjnych i klasycznych szlaków kardioprotekcyjnych². Co więcej, nadmierna przepuszczalność śródbłonka mikronaczyń może wywołać obrzęk mięśnia sercowego³ i nadmierną infiltrację komórek prozapalnych, w tym neutrofili⁴, makrofagów i ertrocytów⁵.

Stres oksydacyjny wywołany przez MIRI i nadekspresja cytokin prozapalnych, takich jak członkowie rodziny czynników martwicy nowotworów⁶ i rodziny interleukin⁷, aktywują szlaki sygnałowe apoptozy komórek, aby przyspieszyć śmierć niedokrwiennego mięśnia sercowego. Erytrocyty przenikają przez wrażliwą barierę śródbłonka i gromadzą się w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), tworząc krwiak wewnątrzmięśniowy mięśnia sercowego⁸. Metaloproteinazy macierzy pochodzące z makrofagów i neutrofili rozkładają kolagen w ECM, co zwiększa ryzyko powikłań mechanicznych i tętniaka komorowego po zawale 9. Tak więc przepuszczalność bariery śródbłonkowej jest kluczowym znakiem dla oceny prognostycznej ostrego zawału mięśnia sercowego i do pewnego stopnia określa nasilenie MIRI.

FITC-dekstran to szereg polisacharydów składający się z różnych długości rozgałęzionych cząsteczek glukozy o masie cząsteczkowej od 4 000 Da do 70 000 Da. Jest szeroko stosowany jako standardowy znacznik w celu wykazania przepuszczalności błon komórkowych, funkcjonalnych barier fizjologicznych, takich jak bariera krew-mózg¹⁰ i błony śluzowe¹¹ w określonych zabiegach i warunkach patologicznych. Przepuszczalność jednej konkretnej membrany różni się dla różnych substancji w zależności od ich masy cząsteczkowej. Zwykle albumina jest ograniczona do mikronaczyń serca; jednak może przenikać do śródbłonka we wczesnym stadium IR, powodując obrzęk mięśnia sercowego. Ponieważ masa cząsteczkowa albuminy wynosi około 68 000 Da, 70 000 Da FITC-dekstran byłby odpowiednim środkiem wykazującym nadprzepuszczalność śródbłonka po IR. Co więcej, dekstran jest szeroko stosowany w celu utrzymania objętości krwi i koloidalnego ciśnienia osmotycznego u pacjentów ze wstrząsem, a znaczniki znakowane FITC są stosowane w licznych badaniach in vivo lub in vitro z niewielkimi skutkami niepożądanymi.

Oprócz FITC-dekstranu, przepuszczalność śródbłonka została zmierzona za pomocą barwienia Evans Blue (EB). Po wstrzyknięciu do krwiobiegu, EB ściśle wiąże się z albuminą surowicy i tworzy complex¹². Tak więc ten kompleks albuminy EB, a nie sam EB, może być używany do pomiaru przepuszczalności, co oznacza, że na dokładność takiej metody opartej na EB mogą mieć wpływ różne stężenia albuminy w surowicy u osób eksperymentalnych. Ponadto donoszono, że EB zatruwa narządy zwierząt doświadczalnych, zwłaszcza serce, wątrobę i płuca, poprzez zwyrodnienie komórek i zwiększoną przepuszczalność naczyń krwionośnych¹³. Śródbłonek poddawany niedokrwieniu/reperfuzji byłby bardziej wrażliwy na takie szkodliwe skutki niż normalny śródbłonek, co może zakłócić znaczenie wyników eksperymentalnych.

W porównaniu do barwnika EB, FITC-dekstran jest egzogenny, a powinowactwo wiązania do albuminy jest znikome. W związku z tym FITC-dekstran pozostaje w stanie wolnym i nie jest wiązany przez makrocząsteczki, takie jak albuminy i białka tkankowe. Tak więc, jeśli jest podawany w zależności od masy ciała, FITC-dekstran może działać przy równym stężeniu krwi i nie mają na niego wpływu indywidualne różnice w stężeniu albuminy w surowicy i objętości krwi. Tongxinluo (TXL), tradycyjna medycyna chińska, została wykorzystana do zbadania czułości diagnostycznej tej metody. TXL zmniejsza MIRI poprzez utrzymanie ultrastruktury komórkowej śródbłonka i integralności bariery śródbłonka¹⁴. TXL jest również stosowany w leczeniu dławicy piersiowej i klinicznie poprawia brak odpływu mięśnia sercowego po zawale¹⁵. Zawiera żeń-szeń Radix, Buthus martensi, Hirudo, Eupolyphaga seu steleophaga, Scolopendra subspinipes, Periostracum cicadae, Radix paeoniae rubra, Semen ziziphi spinosae, Lignum dalbergiae odoriferae, Lignum santali albi i Borneolum syntheticum. Wykazano, że TXL chroni śródbłonek mikronaczyniowy poprzez szlak MEK/ERK¹⁶ i śródbłonkowe mechanizmy syntazy tlenku azotu5^,17 i łagodzi niedokrwienie/uszkodzenie reperfuzyjne (IRI) narządów¹⁸, zwłaszcza serca, w sposób zależny od dawki. W tym przypadku szczury karmiono proszkiem TXL o sile 0,5 g/kg (dawka równoważna do dawki stosowanej klinicznie u ludzi) zgodnie z opisem¹⁹. W artykule przedstawiono metodę funkcjonalnej oceny bariery śródbłonkowej mikronaczyń serca po IR poprzez pomiar całkowitej intensywności fluorescencji wynaczynionego 70 000 Da FITC-dekstranu w porównaniu z EB.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z "Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych" wydanym przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (Bethesda, MD, USA, NIH Publication No. 85-23, poprawione w 1996 roku) oraz "Regulacją opieki i użytkowania zwierząt doświadczalnych" Pekińskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (1996). Protokół badania został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Doświadczalnymi Szpitala Fuwai. W badaniu wykorzystano samce szczurów Sprague-Dawley klasy SPF (szczury SD) o wadze 150-180 g.

1. Przygotowanie odczynników, materiałów i sprzętu

1. Przygotuj odczynniki i roztwory, w tym 70% etanol, FITC-dekstran (70 000 Da, rozpuszczony w lodowatej soli fizjologicznej, aby uzyskać 10% w/v roztwór do użycia), krem do depilacji, podłoże montażowe z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI, 0,5-10 μg/ml), 1% w/v EB/roztwór soli fizjologicznej i 5% w/v roztwór sodu/soli fizjologicznej pentobarbital (przechowywany w 4 °C w ciemności).
2. Wcześniej wysterylizuj wszystkie narzędzia i materiały chirurgiczne, w tym taśmę chirurgiczną, gaziki, rękawice chirurgiczne, rurkę dotchawiczą 16 G, strzykawkę insulinową, nożyczki operacyjne, duże, zakrzywione kleszcze preparacyjne, proste kleszcze preparacyjne, proste kleszcze do komarów, zakrzywione kleszcze do komarów, zwijacze (rozpiętość 30 mm), 5 cm uchwyty na mikroigły, szew polipropylenowy 3-0 (igła stożkowa) i szew polipropylenowy 6-0 (okrągła igła).
3. Sprawdź i upewnij się, że wszystkie urządzenia, w tym system ogrzewania w stałej temperaturze, system oświetlenia, respirator, zautomatyzowany system obrazowania patologii ilościowej i krajalnica do zamrażania w ultrafiolecie, są w dobrym stanie.

2. Przygotowanie szczurów do zabiegów chirurgicznych

1. Podziel losowo wszystkie szczury SD na grupę pozorną, grupę IR i grupę TXL (grupa IR+TXL).
   UWAGA: W tym protokole sześć szczurów zostało losowo przydzielonych do każdej grupy, n = 6.
2. Zważyć każdego szczura SD, zapisać wagę i obliczyć dawkę TXL, która ma być podana każdemu szczurowi.
3. Każdemu szczurowi należy podawać ibuprofen w dawce 30 mg/kg przez zgłębnik co najmniej 12 godzin przed torakotomią w celu złagodzenia bólu i dystresu przedoperacyjnego.
4. Podawać bardzo drobny proszek TXL w dawce 0,5 g / kg przez zgłębnik przez 12 godzin i 1 godzinę każdemu szczurowi SD w grupie IR+TXL przed znieczuleniem, zgodnie z opisem¹⁹.
5. Zdezynfekuj stół operacyjny 70% etanolem i umieść wysterylizowane narzędzia i materiały chirurgiczne na dezynfekowanej powierzchni.
6. Dostosuj temperaturę systemu ogrzewania o stałej temperaturze, aby utrzymać temperaturę ciała szczurów na poziomie 37 ± 1 °C.

3. Ustal szczurzy model niedokrwienia/reperfuzji serca

1. Wstrzyknąć 5% w/v pentobarbitalu roztworu soli fizjologicznej/buforowanego fosforanem (PBS) w dawce 50 mg/kg (0,1 ml/100 g masy ciała) do jamy brzusznej w celu znieczulenia szczura. Przygotuj miejsce operacji, ostrożnie usuwając sierść od szyi do klatki piersiowej za pomocą golenia lub kremu do depilacji.
2. W razie potrzeby delikatnie dostosuj pozycję języka za pomocą wysterylizowanej pęsety i przetrzyj wydzielinę z dróg oddechowych wysterylizowanymi wacikami. Utrzymuj głośnię wyraźnie w zasięgu wzroku i delikatnie włóż rurkę dotchawiczą do tchawicy.
3. Podłącz rurkę dotchawiczą do respiratora krążącego z prędkością 65-80 oddechów na minutę i wyreguluj objętość oddechową na poziomie 4-5 ml, mocując głowę i kończyny szczura.
4. Umieść sterylną serwetę na szczurze, zdezynfekuj obszar operacyjny nalewką jodową, a następnie 70% etanolem i powtórz tę procedurę trzy razy.
5. Wykonać lewe nacięcie przymostkowe na poziomie czwartej przestrzeni międzyżebrowej, aby odsłonić lewy mięsień piersiowy większy i mięsień piersiowy mniejszy.
6. Wypreparuj powięź między mięśniem piersiowym większym a mięśniem piersiowym mniejszym, stosując technikę sekcji, aby odsłonić lewą czwartą przestrzeń międzyżebrową.
   UWAGA: Unikaj nadmiernego uszkodzenia tkanek i uszkodzeń naczyń krwionośnych, które spowodują silne krwawienie i śmierć pooperacyjną.
7. Rozetnij mięśnie międzyżebrowe, umieść zwijacz klatki piersiowej w czwartej przestrzeni międzyżebrowej, a następnie rozłóż żebra.
8. Rozerwij osierdzie i usuń przyczepioną tkankę tłuszczową.
   UWAGA: Unikaj uszkadzania innych narządów ostrymi narzędziami chirurgicznymi, zwłaszcza płuc. Uszkodzenie płuc może spowodować rozwój odmy opłucnowej i odmy opłucnowej podczas operacji, powodując konsekwencje kakoetyczne, od zaburzeń hemodynamicznych po zmniejszoną przeżywalność zwierząt.
9. Manipuluj pozycją grasicy i delikatnie odsłaniaj aortę wstępującą i lewe przedsionki. Zidentyfikuj i podwiąż proksymalną lewą tętnicę przednią zstępującą (LAD) przejściowo przez 45 minut za pomocą szwu polipropylenowego 6-0 (patrz Rysunek 1 A-D).
   UWAGA: Ta procedura jest identyczna dla szczurów kontrolnych pozorowanych, z wyjątkiem tego, że LAD nie jest podwiązany.
10. Zdejmij zwijacz klatki piersiowej i ściągnij żebra razem w przerwany wzór szwu za pomocą szwu polipropylenowego 3-0.
11. Przywróć ujemne ciśnienie w klatce piersiowej, aby zapewnić efektywne oddychanie.
    UWAGA: W celu przywrócenia ujemnego ciśnienia w klatce piersiowej można zastosować dwie metody: i) przed zamknięciem jamy klatki piersiowej naukowcy mogą zatkać wylot powietrza z respiratora na 2 cykle, aby napompować płuca. ii) Powietrze pozostające w jamie klatki piersiowej można odciągnąć strzykawką po zamknięciu przestrzeni międzyżebrowej.
12. Po depilacji i dezynfekcji należy wykonać nacięcie w prawej kończynie dolnej i wypreparować powięź powierzchowną z prawej żyły udowej.
13. Poluzować podwiązanie i sprawdzić warunki oddychania i krążenia po wywołaniu niedokrwienia mięśnia sercowego przez 45 minut.
14. Wstrzyknąć 10% (w/v) roztwór dekstranu FITC/soli fizjologicznej do żyły udowej w stężeniu 0,15 ml/100 g masy ciała i uciskać żyłę udową przez 1 minutę sterylnymi wacikami, aby zatamować krwawienie (Rysunek 2A,B).
    UWAGA: Alternatywnie wstrzyknąć 1% w/v roztworu EB/soli fizjologicznej do żyły udowej w dawce 0,5 ml/100 g masy ciała.
15. Zszyj nacięcia szwem polipropylenowym 3-0 i zdezynfekuj nacięcia, a następnie wykonaj analgezję pooperacyjną ibuprofenem, jak opisano powyżej.

4. Przygotowanie zamrożonych wycinków tkanek do pomiaru fluorescencji

1. Wstrzyknąć 5% w/v roztworu pentobarbitalu sodu/PBS w dawce 150 mg/kg (0,3 ml/100 g masy ciała) dootrzewnowo w celu głębokiego znieczulenia szczurów po 3 godzinach reperfuzji mięśnia sercowego.
2. Rozciąć jamę brzuszną i odsłonić aortę brzuszną i żyłę główną (patrz w Rysunek 3A).
3. Wstrzyknij 50 ml lodowatego PBS do żyły głównej, przetnij aortę brzuszną, aby wypłukać krew z mięśnia sercowego i zbierz serce.
   UWAGA: Obserwuj zmiany w płucach i wątrobie. Pocenie się wątroby sugeruje, że sól fizjologiczna jest dokładnie wstrzykiwana do żyły głównej (patrz w Ryc. 3C), a blade płuco jest uważane za oznakę dobrze ukrwionego mięśnia sercowego (patrz w Rycina 3B).
4. W ciemnym pomieszczeniu delikatnie opłucz serce lodowatą solą fizjologiczną lub PBS, aby usunąć pozostałą krew i FITC-dekstran (lub EB) z komór serca.
5. Odetnij serce od podwiązania i wyrzuć mięsień sercowy powyżej podwiązania.
6. Zanurzyć serce w foremkach z masą do zatapiania, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C.
7. Wyładować zamrożone tkanki z form do zatapiania i załadować je na uchwyty na próbki do wstępnie schłodzonej komory o temperaturze -20 °C krajalnicy do zamrażania.
8. Dostosuj grubość pojedynczego plasterka do 5-8 μm i pokrój tkankę mniej więcej w środku osi podstawa-wierzchołek (np. w środku niedokrwienia).
9. Załaduj pokrojoną tkankę na samoprzylepne szkiełka mikroskopowe i uszczelnij każdą warstwę jedną kroplą (około 40 μl) fluorescencyjnego podłoża montażowego zawierającego DAPI.
10. Przechowuj szkiełka w suchym i ciemnym pudełku.
    UWAGA: Jeśli szkiełek nie można zeskanować od razu, przechowuj je w suchym, chłodnym i ciemnym miejscu, aby zapobiec tworzeniu się wody kondensacyjnej i wygaszaniu fluorescencji.

5. Pomiar fluorescencji i analiza danych

1. Skonfiguruj system obrazowania i sprawdź oprogramowanie podłączone do skanera.
2. Załaduj szkiełka do półek na prowadnice i włóż je do skanera.
3. Otwórz oprogramowanie skanera slajdów (patrz tabela materiałów) i ustaw nowy protokół naświetlania, klikając Edytuj protokół | Nowy....
   UWAGA: Jeśli skaner lub powiązane z nim oprogramowanie nie jest dostępne, alternatywą dla automatycznego ilościowego skanera fluorescencyjnego może być laserowy mikroskop konfokalny (patrz Spis materiałów) lub inne zwykłe skanery do slajdów z trybem fluorescencji (patrz Spis materiałów).
4. Zmień nazwę protokołu i badania, a następnie wybierz tryb fluorescencji.
5. Definiowanie całego skanu slajdu | Rozdzielczość pikseli i obszary wielospektralne | Rozdzielczość pikseli wynosi odpowiednio 0,25 μm (40x).
6. Kliknij Edytuj filtry i pasma..., aby wybrać kolumnę Filtry skanowania całego slajdu i kolumnę Pasma regionów wielospektralnych.
   UWAGA: Jeśli używany jest EB, wybierz Filtry skanowania całego slajdu | DAPI i Texas Red lub AF495. Jeśli używany jest FITC-dekstran, wybierz Pasma regionów wielospektralnych | DAPI i FITC lub AF488.
7. Kliknij Edytuj ekspozycje... i załaduj nośnik.
8. Wybierz miejsce docelowe i kliknij Przejmij przegląd.
   UWAGA: Spowoduje to wykonanie skanu w jasnym polu każdej sekcji serca. Wybierz mięsień sercowy do ustawiania ostrości lub wybierz obszar na ślepo.
9. Wybierz slajd docelowy, ustaw wysokość stolika na około -50 μm i kliknij Auto Focus.
10. Kliknij Cała ekspozycja skanowania (ms)-DAPI | Autoexpose.
    UWAGA: Czas naświetlania DAPI dla każdego szkiełka nie musi być taki sam, ponieważ obrazy z DAPI są używane do zilustrowania przekrojów serca, które są wygodne do zarysowania obszaru mięśnia sercowego, ale nie do obliczenia gęstości fluorescencji.
11. Kliknij Cała ekspozycja skanowania (ms)-FITC | Autoexpose.
    UWAGA: Kliknij Cała ekspozycja skanowania (ms)-Texas Red | Automatyczna ekspozycja, jeśli używasz EB. Ważne jest, aby pamiętać i upewnić się, że czas ekspozycji FITC lub Texas Red jest taki sam we wszystkich skanach slajdów.
12. Kliknij ponownie Autofokus i upewnij się, że slajd jest ostry.
13. Kliknij Wstecz i zapisz protokół.
14. Powtórz kroki 5.7-5.14 dla każdego slajdu.
15. Wróć do strony głównej i kliknij Skanuj slajdy.
16. Wybierz miejsce, zmień nazwy wszystkich slajdów i wybierz odpowiedni protokół ekspozycji dla każdego slajdu.
17. Zeskanuj slajdy i uchwyć obrazy.
18. Otwórz obrazy za pomocą oprogramowania do przeglądania slajdów dla skanów (patrz Spis materiałów).
19. Powiększ wszystkie obrazy w stosunkowo równym stopniu.
20. Rób migawki i zapisuj obrazy jako .tiff.
    UWAGA: Lepiej jest zapisywać obrazy z paskami skali i bez nich w tym samym czasie. Obrazy ze skalami mogą być używane do publikacji, natomiast te bez podziałek liniowych mogą być używane do analizy statystycznej.
21. Otwórz oprogramowanie ImageJ, kliknij Analizuj i wybierz Ustaw pomiar.
22. Wybierz obszar | Zintegrowana gęstość.
23. Otwórz obraz w kanale FITC za pomocą obrazu J.
24. Kliknij ponownie Analizuj i zapisz wartość liczbową gęstości zintegrowanej (IntDen), która się pojawi.
    UWAGA: Ponieważ podziałki liniowe na obrazach mogą być mylone przez komputery ze skalą szarości fluorescencji, do pomiaru IntDen należy używać obrazów bez podziałek liniowych.
25. Zamknij obraz FITC i otwórz obraz w kanale DAPI.
26. Nakreśl przekrój mięśnia sercowego.
27. Kliknij Analizuj i zbieraj dane obszaru.
28. Oblicz stosunek IntDen/Area (średnia fluorescencji) dla każdego serca.
29. Wprowadź wszystkie wskaźniki w oprogramowaniu do analizy statystycznej.

Wyniki

Przed wykonaniem testu FITC-dekstranu w celu oceny zmian w przepuszczalności śródbłonka serca po IR, zdecydowanie zalecamy przeprowadzenie eksperymentów przez tego samego badacza specjalizującego się w tworzeniu modelu IR mięśnia sercowego u szczurów, aby potwierdzić, że tętnice wieńcowe są skutecznie zamknięte w tej samej pozycji, a stosunek powierzchni niedokrwiennej do całkowitej powierzchni jest stały u wszystkich szczurów. Jak pokazano w Rysunek 1A,B, serce (oznaczone żółtą strzałką) zostało odsłonięte, a pętla (oznaczona zieloną strzałką) powstała w mięśniu sercowym znajdującym się w przedniej ścianie lewej komory, około 2 mm poniżej krawędzi wyrostka lewego przedsionka z silikonową rurką kapilarną o średnicy 0,5 mm (średnica wewnętrzna) i szwem 6-0. Jak widać na Rysunek 1C, gdy pętla została zapięta, niedokrwienny mięsień sercowy natychmiast zmienił kolor z różowego na szaroróżowy (oznaczony białą strzałką).

Ponadto, mięsień sercowy uległ reperfuzji i odzyskał swój różowy kolor natychmiast po poluzowaniu pętli, jak pokazano w Rysunek 1D. Po poluzowaniu pętli wykonano nacięcie równoległe do długiej osi kości udowej w wewnętrznej stronie uda. Żyła udowa została odsłonięta i przebita strzykawką insulinową, jak pokazano na Rysunek 2A,B. Po 3-godzinnej reperfuzji wykonano nacięcie w kształcie litery "V" w dolnej części brzucha, a aorta brzuszna i żyła główna zostały wycięte z otrzewnej (Ryc. 3A). Zimną sól fizjologiczną delikatnie wstrzyknięto do żyły głównej, a aortę brzuszną przecięto, aby zapobiec nadmiernemu rozciągnięciu ściany komory z powodu ciśnienia śródkomorowego, które wpłynęłoby na jej strukturę histopatologiczną. Wybielone płuca (czerwona strzałka w Rycina 3B) i wątroba w Rycina 3C wskazują, że tkanka była dobrze przepuszczalna solą fizjologiczną.

W związku z tym nie było znaczącej różnicy w polu przekroju między trzema grupami: 1,00 ± 0,08 w grupie Sham vs. 0,97 ± 0,08 w grupie IR vs. 1,02 ± 0,04 w grupie IR+TXL (Rysunek 4A, n = 6 w każdej grupie, p > 0,05 między dowolnymi dwiema grupami). Jak pokazano w Rysunek 4B,C, średnia intensywność zielonej fluorescencji w całych sekcjach od szczurów Sham była bardzo niska. Natomiast fluorescencja emitowana przez wynaczyniony FITC-dekstran znacznie wzrosła w grupie IR, znormalizowanej do grupy Sham (5,52 ± 0,85 w grupie IR vs. 1,00 ± 0,19 w grupie Sham, n = 6, p < 0,05). Co więcej, bardzo drobny proszek TXL, znany z ochrony śródbłonka mikronaczyniowego serca^14,16, znacznie odwrócił wyższą intensywność fluorescencji indukowaną przez IR (2,87 ± 0,52 w grupie IR+TXL w porównaniu z 5,52 ± 0,85 w grupie IR, n = 6, p < 0,05). Obrazy regionalnego mięśnia sercowego wykazały, że dekstran FITC w przeważającej mierze gromadził się w macierzy zewnątrzkomórkowej, ale nie w mikronaczyniach, oraz że TXL poprawił funkcję bariery śródbłonkowej (Ryc. 5).

W porównaniu z dekstranem FITC, EB może być nieoptymalną alternatywą, ponieważ EB jest gorszy od 70 000 Da FITC-dekstranu zarówno pod względem jakości obrazu, jak i czułości. Podobnie nie stwierdzono istotnej różnicy w polu przekroju poprzecznego między trzema grupami: 1,00 ± 0,08 w grupie Sham vs. 0,97 ± 0,08 w grupie IR vs. 0,98 ± 0,05 w grupie IR+TXL (rysunek uzupełniający S1A, n = 6 w każdej grupie, p > 0,05 między dowolnymi dwiema grupami). Jak pokazano na rysunku uzupełniającym S1B,C, średnia intensywność czerwonej fluorescencji w całych przekrojach u szczurów Sham była stosunkowo wyższa, zwłaszcza w wsierdziu i nasierdziu. Chociaż czerwona fluorescencja emitowana przez EB gwałtownie wzrosła w grupie IR (4,41 ± 0,66 w grupie IR vs. 1,00 ± 0,22 w grupie Sham, n = 6, p < 0,05), różnica między grupami IR+TXL i IR nie była istotna (3,73 ± 0,47 w grupie IR+TXL vs. 4,41 ± 0,66 w grupie IR, n = 6, p = 0,0956).

Ponadto, ta metoda została przetestowana na modelu zawału mięśnia sercowego (MI) (Rysunek uzupełniający S2). W grupie I zawału I wsierdzia Ipierwszej (MII) roztwór FITC-dekstranu (w tym samym stężeniu, o którym mowa wcześniej) wstrzyknięto do krążenia 5 minut przed podwiązaniem LAD. Było to przeciwieństwo roztworu FITC-dekstranu wstrzykiwanego natychmiast po podwiązaniu u szczurów MIL (najpierw M yocardial Infarction Ligation) opisanego wcześniej w tym protokole. Co ciekawe, tylko niewielkie ilości dekstranu FITC-dekstranu wynaczynione do ECM uszkodzonego mięśnia sercowego u szczurów z zawałem mięśnia sercowego z obu grup, na co wskazuje słaba intensywność zielonej fluorescencji na rysunku uzupełniającym S2.

Rysunek 1: Pole widzenia torakotomii i ustalenia niedokrwienia/reperfuzji w modelu szczurzym. (A) Odsłonięcie serca szczura (oznaczone żółtą strzałką); (B) tworzenie pętli otaczającej tętnicę wieńcową (oznaczoną zieloną strzałką); (C) zaciśnięcie pętli i wywołanie niedokrwienia mięśnia sercowego na 45 minut (oznaczone białą strzałką); (D) poluzowanie pętli i umożliwienie reperfuzji mięśnia sercowego przez 3 godziny (oznaczone niebieską strzałką). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Rozwarstwienie żyły udowej i wstrzyknięcie dożylne. (A) Odsłonięcie żyły udowej (nerw udowy jest oznaczony strzałką po lewej stronie; tętnica udowa jest oznaczona strzałką pośrodku; żyła udowa jest oznaczona strzałką po prawej stronie). (B) Wstrzykiwanie roztworu FITC-dekstranu do żyły udowej za pomocą strzykawki insulinowej. Skrót: FITC = izotiocyjanian fluoresceiny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Perfuzja tkanek i objawy efektywnej perfuzji. (A) Analiza aorty brzusznej i żyły głównej (aorta brzuszna jest oznaczona białą strzałką; żyła główna jest oznaczona czarną strzałką). (B) Wybielone płuca są objawem odpowiedniego ukrwienia; (C) wybielona błona śluzowa, wybielona nerka i pocenie się wątroby są objawami odpowiedniej perfuzji (czerwona strzałka: błona śluzowa; biała strzałka: wątroba; strzałka: nerka). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy i analiza średniej intensywności fluorescencji za pomocą barwienia FITC-dekstranu. (A) Względne pole przekroju poprzecznego każdej grupy znormalizowane do pola przekroju poprzecznego grupy Sham (p > 0,05); (B) względna intensywność fluorescencji w kanale FITC każdej grupy znormalizowana do intensywności grupy Sham; (C) reprezentatywne obrazy w powiększeniu 9,5x w każdej grupie. Podziałka = 800 μm. Jednokierunkowa ANOVA z porównaniami post-hoc wielu grup Tukeya. * vs. Grupa Sham, p < 0,05; # vs. grupa IR, p < 0,05. Wykresy słupkowe pokazują średnią grupy ± SD. Skróty: IR = niedokrwienie/reperfuzja; TXL = Tongxinluo; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol; ANOVA = analiza wariancji; SD = odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Reprezentatywne obrazy obszarów zainteresowania przy 200-krotnym powiększeniu każdej grupy po barwieniu FITC-dekstranem. Podziałka = 50 μm. Skróty: FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający S1: Reprezentatywne obrazy i analiza średniej intensywności fluorescencji za pomocą barwienia Evans Blue. (A) Względne pole przekroju poprzecznego każdej grupy znormalizowane do pola przekroju poprzecznego grupy Sham (p > 0,05); (B) względna intensywność fluorescencji w kanale czerwonym Teksasu dla każdej grupy znormalizowana do intensywności grupy Sham; (C) reprezentatywne obrazy w każdej grupie. Jednokierunkowa ANOVA z porównaniami post-hoc wielu grup Tukeya. Podziałka = 800 μm. * w porównaniu z grupą pozorną, p < 0,05. Wykresy słupkowe pokazują średnią grupy ± SD. Skróty: IR = niedokrwienie/reperfuzja; TXL = Tongxinluo; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol; ANOVA = analiza wariancji; SD = odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Reprezentatywne obrazy w 9,5-krotnym powiększeniu barwienia FITC-dekstranu w modelu zawału mięśnia sercowego. Podziałka = 800 μm. Skróty: MII = wstrzyknięcie zawału mięśnia sercowego najpierw (wstrzyknąć FITC-dekstran przed zawałem mięśnia sercowego); MIL = podwiązanie zawału mięśnia sercowego najpierw (wstrzyknąć FITC-dekstran natychmiast po zawale mięśnia sercowego); FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W pracy przedstawiono protokół oceny dysfunkcji bariery śródbłonka serca po ekspozycji na MIRI. Należy zauważyć, że w tym protokole istnieje kilka kluczowych kroków, które decydują o wiarygodności i dokładności wyników. Wszystkie czynności związane z FITC-dekstranem należy wykonywać w ciemnym pomieszczeniu. Roztwory dekstranu/soli FITC-muszą być przechowywane w temperaturze 4 °C i owinięte folią aluminiową. Dodatkowo tętnice wieńcowe muszą być podwiązane, jak pokazano na rycinie 1, aby mięsień sercowy mógł zostać ponownie zreperfundowany natychmiast po poluzowaniu pętli. Naukowcy mogą wybrać szwy polietylenowe 5-0 lub 6-0, ponieważ cieńsze sznurki poniżej 7-0 są bardziej podatne na przecinanie włókien i naczyń mięśnia sercowego. Co ważne, roztwór znacznikowy powinien być wstrzykiwany do żył udowych, a nie do żył ogonowych. Każde serce powinno być dobrze ukrwione i dobrze przepłukane lodowatą solą fizjologiczną odpowiednio przed i po złożeniu w ofierze.

Wielu badaczy specjalizujących się w MIRI skłania się do badania zaburzonej subkomórkowej struktury śródbłonka we wcześniejszym etapie reperfuzji mięśnia sercowego - tworzenia ciał apoptotycznych, pęczniejących mitochondriów i nieprawidłowych połączeń międzykomórkowych - w celu udowodnienia nadmiernej przepuszczalności śródbłonka za pomocą badania mikroskopowego elektronów. Immunoblotting jest również stosowany do pomiaru przepuszczalności mikronaczyniowej, ponieważ spadek poziomu białek ściśle koniunkcyjnych jest uważany za podstawowy mechanizm uszkodzenia śródbłonka i nieprawidłowego działania bariery śródbłonkowej w czasie. Na przykład VE-kadheryna²⁰ i β-katenina²¹ są kluczowymi elementami połączeń adhezyjnych śródbłonka między komórkami, a połączenia te przyczyniają się do utrzymania integralności naczyń krwionośnych²². Połączenia ścisłe, takie jak JAM-A^23,24 i okludyna²⁵, również współpracują ze sobą w budowie bariery śródbłonkowej w układzie krążenia.

Obecnie coraz więcej badań sugeruje, że funkcja mitochondriów i homeostaza mitochondriów mogą być kluczowymi celami szlaków ochronnych przed uszkodzeniem reperfuzyjnym. Jak podano w badaniach patofizjologicznych i farmakologicznych, mitofagia może odgrywać ważną rolę w śmierci komórkowej śródbłonka i mięśnia sercowego indukowanej przez IR²⁶. Ponadto rozszczepienie mitochondriów, proteostaza mitochondriów i kontrola jakości mitochondriów mogą chronić mięsień sercowy wysokiego ryzyka na obszarach reperfundowanych^27,28. Powyższe metody koncentrują się bardziej na wykazaniu różnych mechanizmów lub przyczyn nadprzepuszczalności niż na bezpośrednim i wizualnym przedstawieniu przepuszczalności śródbłonka. Ponadto przygotowanie próbki do badania pod mikroskopem elektronowym jest skomplikowane i niebezpieczne. Roztwory aldehydu glutarowego, acetonu i kwasu osmowego stosowane w mikroskopii elektronowej prawdopodobnie ulatniają się i powodują erozję błony śluzowej, spojówek i skóry, a nawet zagrażają życiu, jeśli są stosowane w niekontrolowanym środowisku.

W porównaniu z tymi pośrednimi i zagrażającymi życiu metodami, ta metoda, która mierzy intensywność fluorescencji emitowanej przez wynaczynienie FITC-dekstranu, jest idealna do oceny przepuszczalności mikronaczyniowej serca. Po pierwsze, 70 000 Da FITC-dekstran nie może przeniknąć przez śródbłonek w normalnych warunkach fizjologicznych, ale może dostać się do przestrzeni śródmiąższowej mięśnia sercowego w podczerwieni, co pozwala na wyraźne rozróżnienie szczurów pod różnymi zabiegami. Dodatkowo roztwór FITC-dekstranu jest wstrzykiwany do krwi przez żyły udowe, co gwarantuje, że cały płyn zostanie wstrzyknięty do krążenia szczura. Natomiast wstrzyknięcie żyły ogonowej jest trudniejsze u szczurów, ponieważ żyła ogonowa jest niewyraźna i pokryta grubą warstwą. Ponadto, w przeciwieństwie do zwykłego utrwalania paraformaldehydu i zatapiania parafiny, leczenie tkanki mięśnia sercowego jest uproszczone i zoptymalizowane przy użyciu techniki szybkiego zamrażania sekcji patologicznej zastosowanej w tym badaniu. Krótki czas przechowywania, środowisko odporne na światło i kriokonserwacja mogą razem złagodzić wygaszanie fluorescencji FITC.

Co ważniejsze, ta metoda może zminimalizować błąd systematyczny selekcji podczas analizy statystycznej. Przeprowadzamy wystarczającą perfuzję serca solą fizjologiczną, aby upewnić się, że prawie cała krew zmieszana z FITC-dekstranem zostanie wydmuchiwana z mięśnia sercowego i komór serca, co może wyeliminować fluorescencję emitowaną przez FITC pozostającą w naczyniach. Jeśli tak nie jest, fluorescencję połączoną z naczyniami włosowatymi należy wykluczyć i sztucznie przyciąć. Podczas pobierania tkanek z obszarów zainteresowania nie zaobserwowano wizualnej granicy między mięśniem sercowym niedokrwiennym a odległym mięśniem sercowym, zwłaszcza po barwieniu barwnikiem EB. Utrudniało to pobieranie próbek z tych reprezentatywnych obszarów. Korzystając z opisanej tu metody, badacze mogą uzyskać obrazy całych odcinków i przeanalizować intensywność fluorescencji za pomocą ilościowego skanera suwakowego.

Co ciekawe, barwnik EB może być alternatywą, choć nieoptymalną, dla dekstranu FITC. W porównaniu ze stosunkowo trudnymi warunkami przechowywania dekstranu FITC, proszek EB lub jego roztwór może pozostać stabilny w temperaturze pokojowej przez długi czas. Ponadto EB jest stosunkowo niedrogi dla większości instytucji. Niemniej jednak pewne wady mogą ograniczać jego zastosowanie. Po pierwsze, barwienie EB wykazuje niższą czułość niż FITC-dextran, co może zaniżać różnice między grupami i zwiększać wielkość próby każdej grupy. Poza tym EB wykazuje silniejszą adhezję do białek. Wsierdzie i nasierdzie są łatwiej barwione przez EB, co może wpływać na wyniki gęstości fluorescencji. Co więcej, oczywiste wady wypełnienia w obszarze reperfuzji znacznie obniżają jakość obrazu, co może ograniczać stosowanie EB.

Aby rozszerzyć zastosowanie tej metody w modelu MI, metoda została przetestowana w modelu MI. Najpierw FITC-dekstran został wstrzyknięty do naczyń krwionośnych po podwiązaniu LAD. Zgodnie z oczekiwaniami z plastra wyemitowano niski poziom fluorescencji, ponieważ dekstran FITC w przepływie krwi nie może przejść przez podwiązane miejsce i żaden FITC-dekstran nie dostał się do obszaru niedokrwienia. FITC-dekstran zastosowano również na 5 minut przed podwiązaniem, aby zapewnić przejście FITC-dekstranu do wszystkich narządów. W związku z tym FITC-dekstran nie zdołał przeniknąć do śródbłonka mikronaczyniowego, prawdopodobnie dlatego, że żadne ciśnienie perfuzyjne w podwiązanych naczyniach krwionośnych nie może przepchnąć FITC-dekstranu przez śródbłonek. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta prawdopodobnie wymaga znacznie większej modyfikacji, aby spełnić jej zastosowanie w modelu MI.

Pomimo powyższych zalet ta metoda ma swoje ograniczenia. Po pierwsze, protokół ten nie był testowany na modelach IR innych zwierząt, co może ograniczać jego zastosowanie w badaniach przedklinicznych i klinicznych. Po drugie, barwniki z oznaczeniem FITC są droższe niż inne popularne barwniki, takie jak EB. Jednak w przeciwieństwie do EB, ponieważ 10% w/v roztwór FITC-dekstranu, rozcieńczony surowicą, rzadko zmienia kolor mięśnia sercowego, barwienie FITC-dekstranem i podwójne barwienie chlorkiem FITC / 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC) można przeprowadzić w tym samym sercu, co może zmniejszyć budżet w odniesieniu do liczby zwierząt i użytych barwników. Wreszcie, skaner slajdów używany w tym badaniu - ilościowy skaner do slajdów i podobne instrumenty - może nie być dostępny w niektórych laboratoriach. Podsumowując, protokół ten przedstawia uproszczoną, wiarygodną i wizualną metodę wykrywania przepuszczalności śródbłonka mikronaczyniowego serca w modelu IR u szczurów przy użyciu testu fluorescencyjnego opartego na zautomatyzowanym ilościowym systemie obrazowania patologii. Protokół ten pokazuje, że 70 000 Da FITC-dekstran działa lepiej niż EB w ocenie funkcjonalnej bariery śródbłonkowej mikronaczyń serca po urazie IR.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
16 G Angiocather	Becton Dickinson, Stany Zjednoczone	2089312
3-0 szew polipropylenowy, igła stożkowa	Ethicon, USA	KGP693
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)	Invitrogen, USA	D3571	Alternatywa dla podłoża montażowego z
niciem polipropylenowym DAPI 6-0, okrągła igła	Ethicon, USA	KGJ656
Adhezyjne szkiełka mikroskopowe	CITOTEST, Chiny	188105
Wentylator ALC-V8S	Shanghai Alcott Biotech, Chiny	ALC-V8S
System ogrzewania o stałej temperaturze	Shanghai Alcott Biotech, Chiny	ALC-HTP203
Kleszcze preparacyjne - duże Cvd	RWD life science, Chiny	F12007-10
Kleszcze preparacyjne-Str	RWD life science, Chiny	F12005-10
FITC-dextran, 70,000Da	Sigma-Aldrich, USA	53471
Krem do depilacji	Nair, USA	Nie dotyczy
Strzykawka insulinowa, 1ml	Becton Dickinson, USA	8155672
Uchwyty mikroigłowe	RWD life Science, Chiny	F31047-12
Kleszczyki do komarów-CVD	RWD life science, Chiny	F22007-12
Medium montażowe z DAPI	ZSGB-BIO, Chiny	ZLI-9557
Wielopozycyjny system oświetlacza światłowodowego	RWD life science, Chiny	76301
Nożyczki operacyjne	RWD life science, Chiny	S14014-12
Pannoramic SCAN	3DHISTECH, Budapeszt, Węgry	SC150-211305	Alternatywny skan slajdów do Vectra Polaris
Phenochart 1.0.8	PerkinElmer, Stany Zjednoczone	dotyczy	Oprogramowanie do przeglądania slajdów
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	HyClone, USA	SH30256.01
Zwijacze, 30mm Rozpiętość, 5cm	RWD life science, Chiny	F22005-45
SP8 Mikroskop konfokalny	Leica, niemiecki	TCS-SP8 SR	Alternatywa dla Vectra Polaris
Taśma chirurgiczna	3M, USA	1527C-0
Tissue-Tek O.C.T. Compound	SAKURA, Japonia	0822-00
Tongxinluo bardzo drobny proszek	Yiling, Chiny	Z19980015
Krajalnica do zamrażania w ultrafiolecie	Leica, niemieckie	oprogramowanie CM1950
Vectra Polaris 1.0.7	PerkinElmer, USA	Oprogramowanie do skanowania slajdów	bez danych
Vectra Polaris Ilościowy skaner slajdów	PerkinElmer, Stany Zjednoczone	VP1814N1068