Opracowanie pasa immunochromatograficznego z przepływem bocznym do szybkiego i ilościowego wykrywania związków drobnocząsteczkowych

Streszczenie

Paski immunochromatograficzne (ICS) oparte na przepływie bocznym oparte na membranie są użytecznymi narzędziami do taniej autodiagnozy i zostały skutecznie zastosowane do wykrywania toksyn, indeksu fizjologicznego i biomarkerów klinicznych. W tym protokole przedstawiamy szczegółowy opis kroków prowadzących do opracowania szybkiego, czułego i ilościowego testu immunologicznego przepływu bocznego (przy użyciu AuNP jako markera i mAb jako sondy). Procedura opisuje przygotowanie i charakterystykę złota koloidalnego, syntezę koniugatu AuNP-mAb, montaż paska immunochromatograficznego oraz badanie metodologiczne testu. Wyniki pokazały, że końcowe paski mogą być dalej wykorzystywane do szybkiej i wygodnej autodiagnozy małej cząsteczki, co może stanowić alternatywne narzędzie w szybkiej i precyzyjnej analizie wskaźników fizjologicznych i biologicznych.

Wprowadzenie

Membranowe paski immunochromatograficzne do przepływu bocznego (ICS) są użytecznymi narzędziami do taniego i szybkiego wykrywania. Membrana nitrocelulozowa jako nośnik oraz koloidalne złoto jako markery w szybkich odczynnikach diagnostycznych do immunochromatografii stanowią najczęściej stosowaną metodę POCT (diagnostyki w punkcie opieki), a zakres zastosowań tego projektu jest szeroki. Od pierwotnego zastosowania w monitorowaniu ciąży, ich użycie rozszerzyło się na monitorowanie stanu krzepnięcia krwi^1,2, uszkodzeń mięśnia sercowego³, medycynę weterynaryjną⁴, pozostałości pestycydów⁵, choroby zakaźne⁶ oraz stężenia leków. Można oceniać więcej rodzajów próbek, w tym mocz, ślinę, krew pełną, surowicę i inne płyny ustrojowe^7,8,9.

W ostatnich latach opracowano wiele nowych testów do wykrywania biomarkerów w diagnostyce schorzeń, w tym HPLC, UPLC, LC-MS oraz ELISA, które charakteryzują się wysoką czułością, dokładnością, wiarygodnością i specyficznością. Metody te wymagają jednak zaawansowanej aparatury, złożonego przygotowania próbek oraz czasochłonnych procedur⁹. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania szybszej i wygodniejszej strategii diagnostyki w punkcie opieki (point-of-care) do samodzielnego wykrywania związków aktywnych leczniczo w czasie rzeczywistym^10,11.

Popularność testów immunochromatograficznych (ICS), zwłaszcza w przypadku powszechnych analiz, wynika z łatwości ich stosowania, ponieważ nie wymagają one personelu specjalistycznego ani rozbudowanej aparatury pomiarowej¹². Innymi słowy, osoby bez specjalistycznego przeszkolenia mogą obsługiwać paski testowe lub wykonywać autotesty¹³. Wyniki testu można uzyskać w ciągu 5 minut, co umożliwia ich wykorzystanie podczas inspekcji w terenie¹⁴. Ponadto, według naszych obliczeń, koszt pasków może być niższy niż 1 RMB¹⁵, co oznacza, że testy te są niedrogie w implementacji¹⁶. Zatem ICS jest stosunkowo dokładnym, prostym i tanim urządzeniem jednorazowym. Testy ICS oparte na złocie koloidalnym^17,18 są również stosowane w szybkiej detekcji COVID-19.

Zasadę działania ICS można podzielić na ICS w układzie kanapkowym oraz ICS konkurencyjny. Rycina 1A przedstawia schemat ICS w układzie kanapkowym, który jest stosowany głównie do wykrywania substancji makromolekularnych, takich jak białka, w tym markerów nowotworowych, czynników zapalnych oraz gonadotropiny kosmórkowej człowieka (HCG, antygen wczesnej ciąży). W tej metodzie wykorzystuje się pary przeciwciał skierowanych przeciwko różnym epitopom antygenu, przy czym przeciwciało wychwytujące jest osuszone na membranie NC w formie linii testowej. Przeciwciało znakowane jest osuszone na podkładce sprzęgającej, a przeciwciało wtórne służy jako linia kontrolna.

Rysunek 1B przedstawia schemat konkurencyjnego ICS, który jest stosowany głównie do wykrywania substancji małocząsteczkowych (MWCO < 2000 Da). Antygen powlekający jest unieruchomiony na membranie NC w formie linii testowej, a znakowane przeciwciało jest wysuszone na podkładce sprzęgającej. Podczas detekcji próbka oraz znakowane przeciwciało przepływają przez linię detekcyjną pod wpływem sił kapilarnych, a powlekany antygen konkurencyjnie wiąże wolny antygen w próbce, co prowadzi do wybarwienia linii detekcyjnej na czerwono.

Niedawno opisaliśmy procedurę generowania przeciwciał monoklonalnych przeciwko produktom naturalnym¹⁹. W niniejszej pracy opracowaliśmy nowatorski test immunochromatograficzny z przepływem bocznym oparty na przygotowanym przeciwciału monoklonalnym anty-SSD²⁰, przeznaczony do szybkiego wykrywania w miejscu badania. Wyniki wskazują, że test immunochromatograficzny jest niezbędnym i wygodnym narzędziem do wykrywania związków pochodzących z produktów naturalnych.

Rycina 1 Schematyczny rysunek analizy immunochromatograficznej (A) Paski testowe do immunochromatografii typu kanapkowego. (B) Paski testowe do pośredniej konkurencyjnej immunochromatografii. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Zhang et al., 2018²¹. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Protokół

Wszystkie procedury przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komisję Oceny Etyki na Pekińskim Uniwersytecie Medycyny Chińskiej (numer zatwierdzenia 2017BZYYL00120).

1. Przygotowanie i charakterystyka złota koloidalnego

UWAGA: Do syntezy złota koloidalnego, ponieważ złoto koloidalne łatwo adsorbuje się na wewnętrznej ściance naczynia i jest podatne na wytrącanie się zanieczyszczeń, naczynie do syntezy i przechowywania złota koloidalnego powinno być dokładnie oczyszczone i namoczone w kwasie (40 ml wody destylowanej, 360 ml stężonego kwasu siarkowego, 20 g dwuchromianu potasu) lub poddane obróbce pasywacji powierzchniowej. Do syntezy złota koloidalnego zastosowano metodę redukcji kwasem cytrynowym.

1. Włączyć mieszadło magnetyczne i umieścić kolbę (250 ml) na mieszalniku.
2. Przygotować odpowiednio 4% roztwór kwasu chlorku złota i 1% roztwór cytrynianu sodu.
3. Dodać 120 ml wody destylowanej do kolby okrągłodennej i podgrzać do wrzenia na termostatycznym mieszadle magnetycznym.
4. Gotuj dalej i szybko dodaj 0,5 ml 4% kwasu chloroaurowego i 5 ml 1% cytrynianu sodu.
5. Obserwuj kolor roztworu. Bladożółty roztwór kwasu chloroaurowego zmienia kolor wina na czerwony w ciągu kilku minut.
6. Kontynuuj podgrzewanie przez 10 minut, aż roztwór zmieni się z bezbarwnego na przezroczysty kolor wina czerwonego.
7. Wyłącz zasilanie termostatycznego miksera magnetycznego, ostudź do temperatury pokojowej i przenieś mieszaninę do czystej butelki. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
8. Określ rozmiar i morfologię AuNP za pomocą spektroskopii ultrafioletowej i obrazowania TEM.
   UWAGA: Różne rozmiary cząstek złota koloidalnego do różnych zastosowań można uzyskać, zmieniając proporcje cytrynianu sodu i kwasu chloroaurowego.

2. Synteza koniugatu AuNPs-mAb

UWAGA: Ponieważ przeciwciała wiążą się ze złotem koloidalnym poprzez adsorpcję elektrostatyczną, ładunki na powierzchni białek i złoto koloidalne bezpośrednio wpływają na intensywność wiązania; dlatego wartość pH buforu jest ważnym czynnikiem wpływającym na stabilność koniugatu przeciwciało-złoto koloidalne. Dyski mAb SSD i anty-SSD są używane jako przykłady w tym protokole.

1. Ocena pH sprzężenia
   1. Dodać 100 μl roztworu NaCl (10% m/v) do ośmiu probówek.
   2. Roztwory AuNP należy dostosować przy pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 i 12 za pomocą 0,1 M K₂CO₃ .
   3. Dodać 100 μl koloidalnego roztworu złota (pH dostosowane do 5-12) do ośmiu probówek zawierających NaCl.
   4. Po zmiksowaniu odstaw roztwory na kilka minut. Obserwuj zmianę koloru każdego roztworu probówki i zapisz probówkę, która pozostaje czerwona.
   5. Wybierz wartość pH z najmniejszym dodatkiem_K2CO3 i stabilnym kolorem roztworu jako optymalną wartość pH do przygotowania koniugatów AuNP-mAb.
      UWAGA: Nie używaj pH-metru, ponieważ sonda może zostać zniszczona przez AuNPs.
2. Ocena ilości przeciwciał
   1. Dodać 100 μl roztworu NaCl (10% m/v) do ośmiu probówek.
   2. Do każdej probówki dodać 100 μl roztworu złota koloidalnego o optymalnym pH.
   3. Dodać roztwory przeciwciał monoklonalnych (stężenie białka 0,1 mg/ml-3,2 mg/ml) do wyżej wymienionych ośmiu probówek.
   4. Po zmiksowaniu odstaw roztwory na kilka minut. Obserwuj zmianę koloru każdego roztworu probówki i zapisz probówkę, która pozostaje czerwona.
   5. Jako optymalną ilość mAb do przygotowania koniugatów AuNP-mAb należy wybrać ilość przeciwciała o najniższym stężeniu mAb i stabilnym kolorze roztworu.
3. Przygotować bufor do sporządzania zawiesiny: dodać 1 M Tris-HCl (pH 8,8), 1% (w/v) BSA, 0,5% (v/v) Tween 20 i 1% (v/v) PEG 20000 i dobrze wymieszać.
4. Synteza koniugatu AuNP-mAb
   1. Weź 10 ml roztworu złota koloidalnego i użyj 0,1 M K₂CO₃ w celu dostosowania roztworu do optymalnej wartości pH.
   2. Powoli dodawaj mAb SSD w odpowiednich stężeniach i wstrząsaj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
   3. Odwirować mieszaninę przy 83 x g (1 000 obr./min) przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć osad zawierający zanieczyszczenia lub wytrącone złoto koloidalne.
   4. Odwirować mieszaninę przy 8,330 x g (10 000 obr./min) przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, a osadem jest koloidalny koniugat złoto-mAb.
   5. Dodać bufor do ponownego zawieszenia, aby oddzielić opady.

3. Montaż listwy

UWAGA: W przypadku późniejszych testów immunologicznych przepływu, wybór i wstępna obróbka materiału membranowego będą miały bezpośredni wpływ na test, który powinien zostać zbadany. Pasek immunochromatograficzny składa się z podkładki na próbkę, podkładki sprzężonej, membrany nitrocelulozowej (NC), podkładki chłonnej i płyty PCV (Rysunek 1). Materiał membrany powinien zostać sprawdzony i oceniony za pomocą stereomikroskopii w celu wyeliminowania niejednorodności.

1. Membranę NC należy przykleić na płycie PCV w odległości 2 cm od krawędzi końcówki ssącej płyty.
2. Dodawać SSD-BSA (2 mg/ml) kroplami do membrany NC (w odległości 2 cm od górnej krawędzi) jako linię testową (o szerokości 1 mm) i dodawać kroplami kozią anty-mysią IgG (1,5 mg/ml) na membranę NC (w odległości 2 cm od dolnej krawędzi) jako linię kontrolną (o szerokości 1 mm). Kontroluj ilość dodawanego białka.
3. Przymocuj wkład chłonny do arkusza PVC nad membraną NC i załóż go na membranę NC na 2 mm.
4. Zanurz membranę z włókna szklanego w sprzężonym roztworze AuNPs-mAb. Wysuszyć mokrą membranę w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
5. Przytnij membranę z włókna szklanego do 5 cm długości i 2 cm szerokości i użyj jej jako podkładki sprzężonej.
6. Wklej wstępnie obrobioną podkładkę sprzężoną pod membranę NC. Długość zakładki z membraną NC powinna wynosić 0,1 cm.
   UWAGA: Membrana z włókna szklanego ma silną zdolność wiązania i uwalniania białek.
7. Przytnij membranę Fusion 3 do 1,8 cm długości i 3,5 cm szerokości i użyj jej jako podkładki na próbkę.
8. Wklej podkładkę próbki na płytę PCV i nałóż ją na końcówkę sprzężoną na 2 mm.
9. Pokrój zmontowaną tekturę na paski o szerokości 3,5 mm za pomocą maszyny do cięcia i zagęść ją za pomocą systemu laminowania wsadowego.
10. Na koniec umieść paski testowe w skorupie, zamknij je w torbie z folii aluminiowej zawierającej środek osuszający i przechowuj z dala od światła. Systemy ICS są teraz zmontowane.
    UWAGA: Powyższe jest procedurą laboratoryjną. W produkcji sprzęt do natryskiwania złota i instrumenty z membraną krzyżową są używane do natryskiwania złota i wykonywania linii T i C.

4. Detekcja ilościowa

1. Upuść 50 μl roztworu próbki na otwór próbki, aby obserwować proces chromatografii.
   UWAGA: W wyniku działania kapilarnego napędzanego przez wkładkę chłonną, roztwór próbki migruje na drugi koniec paska. Gdy roztwór próbki dotrze do podkładki sprzężonej, SSD (antygen) w próbce reaguje z AuNPs-mAb wstępnie załadowanym na elektrodę. Gdy roztwór migruje i dociera do linii T, AuNPs-mAb bez SSD może być selektywnie wychwytywany przez SSD-BSA (koniugat białka antygen-nośnik), widoczny jako czerwony kolor na linii T. Następnie roztwór migruje do linii C, gdzie AuNPs-mAb są wychwytywane przez kozie anty-mysie IgG w regionie, pokazując się w ten sposób jako czerwony kolor na linii C.
2. Przeanalizuj paski za pomocą przenośnego czytnika pasków. Maszyna może zapewnić stosunek linii testowej do linii kontrolnej (T / C).
3. Oceń specyficzność, czułość, powtarzalność i stabilność testu ICS.
   UWAGA: W przypadku wykrywania jakościowego jedna czerwona linia oznacza wynik pozytywny (linia kontrolna). Dwie czerwone linie oznaczają wynik ujemny (linie testowe i kontrolne). Jeśli przewód kontrolny nie jest obecny, test uważa się za nieważny.

Wyniki

Charakteryzacja złota koloidalnego
Przygotowane roztwory złota koloidalnego miały barwę czerwono-bursztynową. Analizy TEM wykorzystano do określenia morfologii i kształtu AuNP.Rycina 2A-D). Rycina 2A i Rycina 2B ujawniają, że cząstki mają kształt wielościanu i są równomiernie rozmieszczone. Średnia średnica AuNPs wynosiła około 14 nm (Rycina 2C). Przedstawiono obraz...

Dyskusja

W niniejszej pracy przedstawiamy protokół przygotowania mAb przeciwko małym cząsteczkom pochodzącym z naturalnych produktów. Przedstawiono podstawowe kroki i kwestie wymagające uwagi w procedurze, a także wykazaliśmy użyteczność tego protokołu na przykładzie małocząsteczkowego dysku SSD. Przykładowe widma, obrazy TEM, wyniki ilościowe i badania metodologiczne przedstawiono w reprezentatywnych danych. W związku z tym wykazaliśmy, że przedstawiona tutaj produkcja złota koloidalnego, koniugacja AuNP-mAb i strategia składani...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwór kwasu chloroaurowego (HAuCl4)	Fabryka odczynników chemicznych Tianjin Fu Chen	JY-SJ102
albumina surowicy bydlęcej	AMRESCO	332
15 ml
50 ml
, 96 dołków	NUNC	655101
Bibuła filtracyjna	Sinopharm	H5072
Membrany z włókna szklanego	Jieyi	XQ-Y6
kozie przeciwciało anty-myszy IgG	applygen	C1308
Membrany nitrocelulozowe	Millipore	millipore 180
albumina jaja kurzego	Pekin BIODEE	5008-25g
PEG20000	Sigma Aldrich
Pipeta RNBC6325 10 ml	COSTAR	4488
Pipeta 25 ml	FALCON	357525
półsztywne arkusze PVC	Jieyi	JY-C104
Cytrynian sodu	Beijing Chemical Works	C1034
periodynian sodu	Sinopharm	Chemical BW-G0008
Sulfo-GMBS	Perbio Science Niemcy	22324
TipOne Tips 1,000 µ L	Starlab	S1111-2021
Tris-HCl	Solarbio	77-86-1
TWEEN 20	Solarbio	9005-64-5

Probówka wirówkowa Probówka wirówkowa Corning 430645 Płytki ELISA Corning 430828