Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja całkowitego RNA z Pseudomonas aeruginosa w biofilmach w celu pomiaru ekspresji genów

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62755

⸱

24 września 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, 3Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine, Hospital for Sick Children, 4Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Hospital for Sick Children

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia metodę izolacji RNA z biofilmów Pseudomonas aeruginosa hodowanych na szkiełkach komorowych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.

Streszczenie

Pseudomonas aeruginosa to oportunistyczny patogen bakteryjny, który powoduje infekcje dróg oddechowych pacjentów z mukowiscydozą (CF). P. aeruginosa jest znana ze swojej zdolności do tworzenia biofilmów, które są chronione przez matrycę egzopolisacharydów. Matryca ta pozwala mikroorganizmom być bardziej odpornymi na czynniki zewnętrzne, w tym leczenie antybiotykami. Jedną z najczęstszych metod wzrostu biofilmu w badaniach jest stosowanie na płytkach do mikromiareczkowania lub szkiełkach z komorą. Zaletą tych systemów jest to, że pozwalają na testowanie wielu warunków wzrostu, ale ich wadą jest to, że wytwarzają ograniczone ilości biofilmu do ekstrakcji RNA. Celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowego, krok po kroku protokołu, w jaki sposób wyodrębnić całkowite RNA z niewielkich ilości biofilmu o jakości i ilości wystarczającej do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Protokół ten pozwala na badanie ekspresji genów w tych systemach biofilmu.

Wprowadzenie

Większość przewlekłych infekcji bakteryjnych, takich jak infekcje płuc u pacjentów z mukowiscydozą (CF) i infekcje związane z protezami, charakteryzują się wzrostem organizmów w biofilmach. Biofilmy1 to społeczności bakterii zamknięte w matrycy złożonej głównie z polisacharydów2. Bakterie w biofilmach mogą rosnąć powoli, metabolicznie uśpione i znajdować się w warunkach beztlenowych, niedotlenienia. Biofilmy są bardziej odporne na antybiotyki ze względu na takie czynniki, jak zmniejszona penetracja antybiotyków, zwiększona ekspresja pomp wypływowych leków i zmniejszony podział komórek3. Z tych i innych powodów cieszą się dużym zainteresowaniem badawczym.

Aby dokładnie zbadać uporczywe infekcje, takie jak przewlekłe infekcje Pseudomonas aeruginosa u pacjentów z mukowiscydozą, warunki wzrostu obserwowane przy tworzeniu biofilmu muszą być dokładnie odzwierciedlone in vitro. Powszechną, wysokoprzepustową metodą jest hodowanie ich w szkiełkach komórkowych lub płytkach do mikromiareczkowania i monitorowanie tworzenia biofilmu za pomocą mikroskopii konfokalnej4. Wiadomo, że kluczowym regulatorem w przejściu od planktonowego lub swobodnie pływającego do bakteryjnego trybu życia biofilmu jest wtórny przekaźnik, cyclic-di-GMP5. Zwiększone poziomy cyklicznego di-GMP zwiększają ekspresję określonych genów, które sprzyjają wzrostowi biofilmu. Małe niekodujące regulatorowe RNA i quorum sensing również odgrywają ważną rolę w regulacji tworzenia biofilmu5. Pomiar ekspresji genów biofilmu poprzez sekwencjonowanie wyekstrahowanego bakteryjnego RNA może być wyzwaniem. Na przykład P. aeruginosa wytwarza trzy egzopolisacharydy (Psl, Pel i alginian), które są wytwarzane w znacznych ilościach w biofilmach6,7. Te polisacharydy mogą zakłócać ekstrakcję i oczyszczanie RNA, prowadząc do zanieczyszczonych preparatów zawierających niski poziom bakteryjnego mRNA8. Dostępne na rynku zestawy do ekstrakcji RNA są w stanie wytworzyć wysokiej jakości RNA z kultur bakterii planktonowych, ale mogą nie działać tak dobrze z kulturami biofilmu9,10,11. Istnieje kilka komercyjnych zestawów do ekstrakcji RNA, które twierdzą, że działają w przypadku biofilmów, z których jednego używamy w tej metodzie.

W tym manuskrypcie opisujemy procedury hodowli biofilmów P. aeruginosa w szkiełkach komorowych i ekstrakcji bakteryjnego mRNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości12,13. Wykorzystując izolaty kliniczne pobrane z próbek plwociny od pacjentów z mukowiscydozą, wykazaliśmy, że metody te można stosować do izolatów o różnej charakterystyce wzrostu. W porównaniu z wcześniejszymi publikacjami, protokół ten jest szczegółowo opisany, aby umożliwić lepsze wyniki w badaniu ekspresji genów biofilmu bakteryjnego11,14,15,16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Komisja Etyki Badań (REB) jest wymagana do pobierania i przetwarzania próbek plwociny od ludzi. Badanie to zostało zatwierdzone przez Szpital dla Chorych Dzieci (REB#1000019444). Rada ds. Etyki Badań Naukowych (REB) jest zobowiązana do pobierania i przechowywania próbek plwociny od ludzi. Badania te zostały zatwierdzone przez Szpital dla Chorych Dzieci REB#1000058579.

1. Tworzenie biofilmu

  1. Izolaty Pseudomonas aeruginosa uzyskane z próbek plwociny pacjentów z mukowiscydozą użytych w tym badaniu na płytkach agarowych Luria Broth (LB) w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez noc.
    UWAGA: Właściwa technika smugowania jest ważna dla uzyskania pojedynczych kolonii bakteryjnych. Smugi podczas obracania płytki rozcieńczą komórki bakteryjne na tyle, aby mogły rosnąć pojedyncze kolonie.
    1. Smugi bakterii za pomocą pętli inokulacyjnej w zygzakowaty wzór na górnym końcu świeżej płytki LB, aż około 1/4 płytki zostanie pokryta.
    2. Obróć płytkę o około 60°. Weź nową pętlę inokulacyjną i przełóż ją raz przez obszar pokryty smugami i do drugiego, czystego obszaru płytki, powtarzając zygzakowaty wzór.
    3. Powtórz krok 1.1.2 z nową pętlą w trzecim obszarze płytki. Załóż pokrywę i odwróć płytkę podczas umieszczania w inkubatorze.
  2. Użyj sterylnej pętli zaszczepiającej, aby wybrać pojedynczą kolonię bakteryjną z płytki agarowej (zawierającej pojedynczy szczep bakteryjny) i zaszczepić probówkę hodowlaną wypełnioną 5 ml sterylnego podłoża LB. Za każdym razem, używając nowej pętli, zaszczepij dwie dodatkowe probówki hodowlane wypełnione 5 ml pożywki LB z tej samej płytki.
  3. Powtórz tę samą procedurę inokulacji dla różnych szczepów bakterii. Hoduj kultury przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 220 obr./min.
    UWAGA: Każda płytka agarowa zawierająca pojedynczy szczep bakterii służy do inokulacji 3 niezależnych probówek hodowlanych. Trzy probówki reprezentują kontrpróby biologiczne w trzech egzemplarzach dla jednego szczepu i są traktowane jako oddzielne próbki. Różni się to od kontrprób technicznych, które wymagałyby 3-krotnej ekstrakcji RNA z pojedynczej probówki hodowlanej.
  4. Przygotować rozcieńczenia nocnych kultur w stosunku 1:100, przenosząc 50 μl nocnej kultury do nowej probówki hodowlanej zawierającej 4,95 ml nowej pożywki LB.
  5. Rozcieńczone kultury należy hodować przez kolejne 3 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 220 obr./min lub do momentu, gdy średnica zewnętrzna600 osiągnie 0,1 lub więcej. Zmierz gęstość komórek na spektrofotometrze przy średnicyzewnętrznej 600.
  6. W nowej probówce do mikrofuge o pojemności 1,7 ml dostosuj OD600 do 0,1 (wczesna faza logarytmiczna) w całkowitej objętości 1,5 ml ze świeżym LB.
  7. Delikatnie wymieszaj przez odwrócenie. Przenieś 300 μl każdej dostosowanej kultury do 4 dołków 8-dołkowego szkiełka podstawowego, aby uzyskać 2 różne próbki na szkiełko (Rysunek 1).
  8. Umieścić szkiełka w spokoju w inkubatorze o temperaturze 37 °C na noc na 24 godziny. Aby zapobiec parowaniu, umieść szkiełka na wilgotnym ręczniku papierowym w małej plastikowej tacy.

2. Odzyskiwanie biofilmu

UWAGA: Każdy szkiełko zawiera osiem oddzielnych studzienek. Pojedyncza próbka składa się z czterech studzienek z biofilmami, które zostaną połączone17. Ten protokół ekstrakcji dotyczy 1 próbki (4 dołki), w której biofilmy są odzyskiwane z 2 dołków jednocześnie. Ekstrakcje RNA są wykonywane przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji RNA, który zawiera etap ubijania kulek i czyszczenie oparte na kolumnie, z modyfikacjami. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi przygotowania odczynnika.

  1. W okapie z przepływem laminarnym powoli usuń media z 2 z 4 dołków za pomocą końcówki do pipety. Przechylić szkiełko pod kątem 45° i wypipetować pożywkę z dolnego rogu studzienek, aby zapobiec oderwaniu się biofilmów.
  2. Trzymając szkiełko przechylone, zmyj komórki planktonu, delikatnie pipetując 300 μl wody wolnej od RNaz do dolnego rogu dwóch opróżnionych studzienek. Usuń wodę, delikatnie ją pipetując, zgodnie z opisem w kroku 2.1. Powtórz etap prania, usuwając jak najwięcej wody.
  3. Dodać 300 μl odczynnika chroniącego RNA (patrz tabela materiałów) do każdej z dwóch opróżnionych studzienek z biofilmami u podstawy. Umieść szkiełko komory na szklanej płycie, aby zapobiec pękaniu studzienek, a następnie zeskrob biofilmy w 2 dołkach małą, wolną od nukleaz, sterylną metalową szpatułką, aby ponownie zawiesić bakterie biofilmu. Odstawić do czasu, aż biofilmy zostaną odzyskane z 2 pozostałych nietkniętych studzienek z tej samej próbki.
    UWAGA: Dodanie odczynnika chroniącego RNA zapewnia stabilność próbek biofilmu w zeskrobanych studzienkach w temperaturze otoczenia podczas przetwarzania pozostałych dwóch studzienek tej samej próbki. Odczynnik ochronny RNA powoduje lizę komórek i inaktywację nukleaz i czynników zakaźnych, co skutkuje zachowaniem RNA.
  4. Aby odzyskać biofilmy z pozostałych 2 studzienek dla próbki (przypomnienie: jedna próbka składa się z 4 studzienek), należy usunąć pożywkę LB z pozostałych 2 nowych studzienek w taki sam sposób, jak opisano w kroku 2.1. Powtórz krok 2.2, aby zmyć komórki planktonowe wodą wolną od RNaz z obu nowych studzienek, tak jak poprzednio.
  5. Wróć do pierwszych 2 studzienek ze zeskrobanymi biofilmami w odczynniku ochronnym, wygenerowanymi na końcu kroku 2.3, i powoli pipetować, aby wymieszać 300 μl ponownie zawieszonego biofilmu z jednego zeskrobanego dołka, starając się nie tworzyć zbyt wielu pęcherzyków.
    1. Przenieś całą zawartość ze studni do jednej z nowo umytych, opróżnionych studzienek. Wymieszać i przenieść 300 μl ponownie zawieszonego biofilmu z drugiej studzienki zeskrobanej do pozostałej, świeżo umytej, opróżnionej studzienki.
      UWAGA: Zamiast dodawać nowy odczynnik ochronny RNA do 2 nowo umytych studzienek z biofilmami, przenieś wcześniej zeskrobane biofilmy już w odczynniku ochronnym do tych świeżo umytych studzienek. Dzięki temu łączna objętość próbki będzie wystarczająco niska, aby spełnić wymagania wejściowe dla komercyjnego zestawu do ekstrakcji RNA. Zobacz schemat Rysunek 1.
  6. Powtórz zeskrobywanie biofilmów w nowych studzienkach, jak w kroku 2.3, umieszczając szkiełko komory na szklanej płycie i zeskrobując biofilmy w 2 nowych studzienkach za pomocą małej, wolnej od nukleaz, sterylnej metalowej szpatułki w celu ponownego zawieszenia bakterii biofilmu.
  7. Połącz cały ponownie zawieszony biofilm z 2 nowych studzienek w jedną probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,5 ml bez RNaz i niskiej wiązalności. Zmierz objętość, która powinna wynosić ~500 - 600 μL całko.
    UWAGA: Połączona zawiesina biofilmu z tej drugiej pary nowych studzienek będzie zawierać cały materiał biofilmu z oryginalnych 4 studzienek próbki.

3. Całkowita izolacja RNA i ocena jakości

UWAGA: Ekstrakcja RNA jest wykonywana przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji RNA, który twierdzi, że działa na biofilmy. Poszczególne elementy są zawarte w Tabeli materiałów, jeśli to możliwe. W miarę możliwości wyjaśnione są mechanizmy stojące za każdym etapem oczyszczania.

  1. Dodać tyle odczynnika chroniącego RNA, aby uzyskać w probówce łącznie 750 μl. Przenieść całą objętość do probówki do ubijania kulek o pojemności 2 ml zawierającej kulki o średnicy 0,1 i 0,5 mm (patrz tabela materiałów). Ubijaj przez 2 1/2 minuty w ubijaku do koralików z maksymalną prędkością.
    UWAGA: Połączenie kulek o wysokiej gęstości 0,1 mm i 0,5 mm oraz szybkie mieszanie na ubijaku do kulek zapewnia dokładną homogenizację ścian komórkowych drobnoustrojów.
  2. Wirować przy 16 000 x g przez 1 minutę, aby granulować kulki. Przenieś supernatant do nowej probówki do mikrowirówki, minimalizując przenoszenie wszelkich kulek, co ułatwi wykonanie kroku 3.3. Zmierz głośność.
  3. Dodać równą objętość buforu do lizy RNA (~450 μL) i dobrze wymieszać. Przenieść do 800 μl próbki, unikając przenoszenia jakichkolwiek kulek, do kolumny krzemionkowej w probówce zbiorczej i odwirować przy 16 000 x g przez 30 s. Zapisz przepływ, ponieważ zawiera RNA, podczas gdy DNA jest związane z kolumną.
    UWAGA: Bufor do lizy RNA zawiera tiocyjanian guanidyny i detergent N-lauroilosarkozynę do lizy komórek. Tiocyjanian guanidyny jest środkiem chaotropowym, który również dezaktywuje nukleazy, a w obecności krzemionki, znajdującej się w kolumnie spinowej, sprzyja wiązaniu DNA z krzemionką 18. Brak etanolu pozwala na preferencyjne wiązanie DNA, a nie RNA, z krzemionkowym spin-column19. Celem kroku 3.3 jest związanie i usunięcie genomowego DNA. Chcemy zachować RNA, które jest zawarte w części przepływowej.
  4. Jeśli pozostanie więcej próbki, przenieś kolumnę do nowej probówki zbiorczej i ponownie załaduj pozostałą częścią próbki. Wirować przy 16 000 x g przez 30 s. Utrzymuj przepływ z RNA i połącz z pierwszą podwielokrotnością.
  5. Zmierzyć łączną objętość przepływu, dodać równą objętość 100 % etanolu i dobrze wymieszać. Przenieść do 800 μl roztworu do nowej, drugiej kolumny wirowej z krzemionki w probówce zbiorczej i odwirować przy 16 000 x g przez 30 s. Wyrzuć przepływ.
    UWAGA: Dodanie etanolu do chaotropowego roztworu soli zawierającego RNA zwiększa wiązanie RNA z krzemionkową kolumną spinową19.
  6. W przypadku roztworów > 800 μl ponownie załadować kolumnę wirującą i odwirować, aż cały roztwór zostanie przewirowany. Wyrzuć przepływ po każdym wirowaniu.
  7. Dodać 400 μl buforu płuczącego do kolumny i odwirować przy 16 000 x g przez 30 sekund, aby usunąć część soli. Odrzuć przepływ.
  8. Przygotować mieszaninę reakcyjną DNazy I zgodnie z instrukcjami producenta i przeprowadzić obróbkę DNazą w kolumnie w celu usunięcia wszelkich pozostałości DNA.
  9. Ponownie zawiesić liofilizowaną DNazę I w 275 μl wody wolnej od RNaz, aby uzyskać roztwór o stężeniu 1 U/μL. Wymieszaj przez delikatne odwrócenie.
  10. Połączyć 5 μl rozcieńczonej DNazy I z 75 μl dostarczonego buforu do mineralizacji DNazy. Delikatnie wymieszaj przez odwrócenie.
  11. Dodać 80 μl przygotowanego roztworu bezpośrednio na matrycę kolumny. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  12. Dodać 400 μl buforu przygotowawczego RNA do kolumny i odwirować przy 16 000 x g przez 30 s. Odrzucić przepływ.
  13. Dodać 700 μl buforu do płukania RNA do kolumny i powtórzyć wirowanie. Odrzuć przepływ.
  14. Dodać 400 μl buforu płuczącego RNA i odwirować kolumnę przez 2 minuty, aby całkowicie usunąć resztki buforu.
    UWAGA: Istnieją 2 różne etapy mycia w celu usunięcia zanieczyszczeń z kolumny. Bufor przygotowawczy zawiera słabą sól chaotropową zmieszaną z etanolem w celu usunięcia resztek białek. Następnie bufor płuczący służy do przemywania etanolem w celu usunięcia soli. Wszelki pozostały etanol musi zostać usunięty, aby umożliwić skuteczną eliminację RNA19,20.
  15. Ostrożnie przenieść kolumnę do nowej probówki do mikrowirówki o niskim poziomie wiązania.
  16. Dodać 50 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio do matrycy kolumny i inkubować przez 5 minut. Wirować przy 16 000 x g przez 1 minutę w celu elucji RNA.
  17. W celu dodatkowego oczyszczenia w celu usunięcia inhibitorów PCR, umieść filtr inhibitora PCR w nowej probówce zbiorczej. Dodać 600 μl dostarczonego roztworu do przygotowania inhibitora (patrz tabela materiałów).
  18. Wirować przy 8 000 x g przez 3 minuty w celu umycia filtra. Przenieś umyty filtr do nowej probówki mikrowirówkowej o niskim poziomie wiązania.
  19. Przenieś wymyty RNA z kroku 3.13 do przemytego filtra i odwiruj przy 16 000 x g przez 3 min.
    UWAGA: RNA może być zużyte natychmiast lub przechowywane w temperaturze -80 °C.
  20. Określ stężenie RNA za pomocą systemu fluorometrycznego o wysokiej czułości21.
    UWAGA: Systemy te pozwalają na czułe ilościowe oznaczanie niewielkiej ilości RNA w roztworze, który jest specyficzny dla celu będącego przedmiotem zainteresowania.
    1. Oceń jakość RNA za pomocą zautomatyzowanego systemu elektroforezy, który może dostarczyć RIN (liczbę integralności RNA), która jest miarą jakości RNA22,23.

4. Zubożenie rybosomalnego RNA i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

  1. Prześlij RNA do centrum genomu Centre for the Analysis of Genome Evolution and Function (CAGEF) na Uniwersytecie w Toronto (Toronto, Kanada) (https://www.cagef.utoronto.ca/) w celu wyczerpania bakteryjnego rRNA i kierunkowego przygotowania biblioteki RNA (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Zubożenie bakteryjnego rRNA jest ukierunkowane na usunięcie rRNA 5S, 16S i 23S24.
  2. Zuboż rRNA za pomocą komercyjnego zestawu do dezubożenia bakteryjnego rRNA. Postępuj zgodnie z protokołem wprowadzania 10 ng - 1 μg nienaruszonego lub częściowo zdegradowanego całkowitego RNA.
  3. Zbuduj biblioteki sekwencjonowania RNA za pomocą zestawu do przygotowania biblioteki kierunkowej RNA z różnymi indeksami dołączonymi do każdej biblioteki.
  4. Zbierz równomolowe ilości każdej biblioteki RNA i wykonaj sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości za pomocą 100-zasadowych sparowanych końców reads25.

5. Ocena jakości odczytów sekwencjonowania

UWAGA : Sprawdź jakość odczytów sekwencjonowania za pomocą darmowego programu FastQC26, dostępnego na darmowej platformie open-source, Galaxy27.

  1. Przejdź do https://usegalaxy.org/. Kliknij menu Zaloguj się lub Zarejestruj i zaloguj się za pomocą danych uwierzytelniających lub utwórz konto.
  2. Kliknij łącze Prześlij dane w lewym górnym rogu strony, w menu Narzędzia, i prześlij fastq.gz pliki sekwencjonowania. Poczekaj, aż nazwy plików pojawią się po prawej stronie strony, w panelu Historia.
  3. Wybierz FASTQ Quality Control w menu Narzędzia, aby wyświetlić listę programów. Wybierz opcję FastQC, która wypełni środkowy panel ekranu.
  4. W obszarze Krótkie dane odczytu z bieżącej historii wybierz z menu rozwijanego przesłane pliki fastq.gz.
  5. Wybierz opcję Execute (Wykonaj), aby uruchomić program.
  6. Wyświetl wyniki w panelu Historia (Tabela 2).
    UWAGA: Aby uzyskać bardziej szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z Galaxy, odwiedź stronę pomocy technicznej pod adresem https://galaxyproject.org/support/.

6. Mapowanie odczytów sekwencyjnych

UWAGA : Na liście znajduje się podstawowy potok do przycinania adapterów i mapowania odczytu dla danych sekwencyjnych RNA. Sekwencje adapterów są przycinane z odczytów za pomocą Trimmomatic28. Przycięte odczyty są mapowane do genomu referencyjnego P. aeruginosa PAO1 (NC_002516.2), uzyskanego z NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)29przy użyciu BWA30 i Samtools31. Dla uproszczenia para odczytów nazywa się PA_1.fq i PA_2.fq; Plik odczytu adaptera, który ma zostać przycięty, nazywa się adapter.fa; a sekwencja referencyjna PAO1 nazywa się PAO1.fasta. Wszystkie narzędzia są open source i działają w środowisku UNIX/LINUX. Zdecydowanie zaleca się zapoznanie się z podstawami systemu UNIX/LINUX w celu wykonania tych poleceń.

  1. Otwórz okno w systemie UNIX/LINUX.
  2. Zainstaluj Javę, Trimmomatic, BWA i Samtools.
  3. Przejdź do folderu, w którym znajduje się plik trimmomatic-0.39.jar.
  4. Odetnij wszystkie sekwencje adapterów od odczytów, wpisując polecenie:
    Java -jar PA_1.fq PA_2.fq PA_1_paired.fq PA_1_unpaired.fq PA_2_paired.fq PA_2_unpaired.fq ILLUMINACLIP: adapters.fa
    UWAGA: Usuwane są tylko sekwencje adapterów. Odczyty nie zostały przycięte dla jakości32.
  5. Przenieś plik referencyjny PAO1.fasta do tego samego folderu.
  6. Indeksuj odniesienie za pomocą BWA za pomocą polecenia:
    Indeks Bwa PA01.fasta
  7. Zamapuj sparowane odczyty na genom referencyjny, wpisując następujące 4 polecenia. Wpisz każde polecenie po zakończeniu poprzedniego.
    Bwa -mem PA01.fasta PA_1_paired.fq PA2_2_paired.fq > PA_R1R2_map.mem.sam
    >Samtools view -S -b PA_R1R2_map.mem.sam > PA_R1R2.bam
    >Samtools sortują PA_R1R2.bam -o PA_R1R2_sorted.bam
    Indeks Samtools PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam
  8. Wyświetl statystyki mapowania, wpisując polecenie:
    Samtools flagstat PA_R1R2_sorted.bam
    UWAGA: Trzeci wiersz statystyk podaje proporcję odczytów, które są mapowane na genom referencyjny.
  9. Oblicz średnią głębokość odczytu i zakres pokrycia za pomocą następujących 2 poleceń33, odpowiednio:
    samtools głębokość -a PA_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; s+=$3}END{print s/c}'
    samtools głębokość -a PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; if($3>0) total+=1}END{print (total/c)*100}'

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ogólny opis metody przedstawiono na Rysunku 1. Wcześniej wykorzystywaliśmy szkiełka z 8 komorami do hodowli biofilmu P. aeruginosa i poddawania go działaniu antybiotyków, a następnie analizowaliśmy je za pomocą mikroskopii konfokalnej w różnych punktach czasowych12,13. Niniejszą metodę można zastosować do bezpośredniej ekstrakcji całkowitego RNA z biofilmów wyhodowanych w tym systemie w celu zbadania zmian w ekspresji genów ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Całkowite RNA udało się wyekstrahować z 17 różnych próbek biofilmu bakteryjnego w trzech egzemplarzach, uzyskując w sumie 51 próbek. Czterdzieści dziewięć bibliotek RNA zostało połączonych i pomyślnie zsekwencjonowanych. Ogólnie rzecz biorąc, potwierdza to nasze kryteria jakości z 96% skutecznością, mimo że ponad połowa próbek jest uważana za mało obfite i o nieoptymalnej jakości 34,35,36,37.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do zadeklarowania.

Podziękowania

Wkład autora: P.W., Y.Y. i V.W byli zaangażowani w konceptualizację badania. K.G., L.J., A.M. i P.W. zoptymalizowali protokoły laboratoryjne. Finansowanie dla K.G. zostało wsparte przez dotację z Programu Praktyk Studenckich za pośrednictwem BioTalent Canada.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bioanalizator Agilent 2100AgilentG2939BAAutomatyczna elektroforeza biomolekuł
Zestaw Agilent RNA 6000 picoAgilent5067-1513Układ do elektroforezy RNA o wysokiej czułości do generowania
buforu do lizy RIN DNA/RNA ZymoResearchD7001-1-50Tiocyjanian guanidyny i bufor do lizy na bazie N-lauroilosarkozyny sprzedawane jako część zestawu do oczyszczania kwasów nukleinowych
Bufor do przygotowania DNA/RNAZymo ResearchD7010-2-10Bufor HCl guanidyny i etanolu stosowany do oczyszczania DNA i RNA
DNA/RNA ShieldZymo ResearchR1100-50Odczynnik do konserwacji/ochrony DNA i RNA
Bufor do płukania DNA/RNAZymo ResearchD7010-3-6Bufor soli i etanolu stosowany do oczyszczania DNA i RNA
DNBSEQ G-400RSMGIG-400RSSekwencer o wysokiej przepustowości
MGIEasy RNA Directional Library Prep SetMGI1000006386Generuj biblioteki dla platform sekwencjonowania MGI o wysokiej przepustowości z całkowitego RNA.
Mini-Beadbeater-96BioSpec1001Wysokoenergetyczny, wysokowydajny zakłócacz komórek
NEBNext rRNA Depletion Kit (bakterie)New England BiolabsE7850XWydajne i specyficzne zubożenie bakteryjnego rRNA (5S, 16S, 23S)
szkiełek komorowych Nunc Lab-Tek IIThermo Fisher Scientific1545348-dołkowa szkiełko komorowe z wyjmowanymi studzienkami
FluorometrkubitowyThermo Fisher ScientificQ33238Fluorometr do DNA, RNA i białek
Zestaw testowy Qubit RNA HSThermo Fisher ScientificQ32852fluorometryczny o wysokiej czułości do pomiaru stężenia RNA
Filtry spin-awayZymo ResearchC1006-50-FKolumna wirowa na bazie krzemionki, używana głównie do wiązania lub usuwania genomowego DNA
Sterylne pętle inokulacyjne, 1 uLSarstedt86.1567.050Sterylne, jednorazowe pętle inokulacyjne do manipulacji mikroorganizmami
ZR BashingBead Probówki do lizyZymo ResearchS6003-502 ml zawierające matrycę do lizy kulek 0,1 i 0,5 mm do homogenizacji próbek biologicznych
Kolumny Zymo Spin IIICGZymo ResearchC1006-50-GKolumna wirowa na bazie krzemionki do oczyszczania DNA i RNA
Filtry Zymo-Spin III-HRCZymo ResearchC1058-50Usuń inhibitory, takie jak związki polifenolowe, kwasy humusowe/fulwowe, garbniki, melanina itp.
Zymobiomics DNA/RNA Miniprepkit Zymo ResearchR2002Zestaw do podwójnej ekstrakcji DNA i RNA
Zymobiomics HRC Prep roztwórZymo ResearchD4300-7-30Do stosowania z filtrami Zymo-Spin III-HRC w celu usunięcia inhibitorów PCR
System Test

Bibliografia

  1. Beaudoin, T., Waters, V. Infections With Biofilm Formation: Selection of Antimicrobials and Role of Prolonged Antibiotic Therapy. The Pediatric Infectious Disease Journal. 35 (6), 695-697 (2016).
  2. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).
  3. Folsom, J. P., et al. Physiology of Pseudomonas aeruginosa in biofilms as revealed by transcriptome analysis. BMC Microbiology. 10, 294(2010).
  4. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  5. Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (10), 791-808 (2013).
  6. Colvin, K. M., et al. The Pel and Psl polysaccharides provide Pseudomonas aeruginosa structural redundancy within the biofilm matrix. Environmental Microbiology. 14 (8), 1913-1928 (2012).
  7. Hentzer, M., et al. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. Journal of Bacteriology. 183 (18), 5395-5401 (2001).
  8. Cury, J. A., Koo, H. Extraction and purification of total RNA from Streptococcus mutans biofilms. Analytical Biochemistry. 365 (2), 208-214 (2007).
  9. Francavilla, M., et al. Extraction, characterization and in vivo neuromodulatory activity of phytosterols from microalga Dunaliella tertiolecta. Current Medicinal Chemistry. 19 (18), 3058-3067 (2012).
  10. Atshan, S. S., et al. Improved method for the isolation of RNA from bacteria refractory to disruption, including S. aureus producing biofilm. Gene. 494 (2), 219-224 (2012).
  11. Franca, A., Melo, L. D., Cerca, N. Comparison of RNA extraction methods from biofilm samples of Staphylococcus epidermidis. BMC Research Notes. 4, 572(2011).
  12. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. The Journal of Visusalized Experiments. (47), e2481(2011).
  13. Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. Visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model. The Journal of Visusalized Experiments. (118), e54819(2016).
  14. Cockeran, R., et al. Biofilm formation and induction of stress response genes is a common response of several serotypes of the pneumococcus to cigarette smoke condensate. The Journal of Infection. 80 (2), 204-209 (2020).
  15. Bisht, K., Moore, J. L., Caprioli, R. M., Skaar, E. P., Wakeman, C. A. Impact of temperature-dependent phage expression on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. npj Biofilmsand Microbiomes. 7 (22), (2021).
  16. Harrison, A., et al. Reprioritization of biofilm metabolism is associated with nutrient adaptation and long-term survival of Haemophilus influenzae. NPJ Biofilms and Microbiomes. 5 (1), 33(2019).
  17. Sousa, C., Franca, A., Cerca, N. Assessing and reducing sources of gene expression variability in Staphylococcus epidermidis biofilms. BioTechniques. 57, 295-301 (2014).
  18. Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
  19. Coppin, C. Re: How do silica based RNA spin columns only bind RNA and not DNA. , Available from: https://www.researchgate.net/post/How_do_silica_based_RNA_spin_columns_only_bind_RNA_and_not_DNA/60b017bffa5c4151cac1c/citation/download (2021).
  20. Kennedy, S. A complete guide to how nucleic extraction kits work. , Available from: https://bitesizebio.com/13516/how-dna-extraction-rna-miniprep-kits-work/ (2021).
  21. Qubit RNA HS Assay Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FQubit_RNA_HS_Assay_UG.pdf&title=VXNlciBHdWlkZTogUXViaXQgUk5BIEhTIEFzc2F5IEtpdHM (2015).
  22. Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA Integrity Number (RIN) - Standardization of RNA Quality Control (Application report # 5989-1165EN). , Available from: https://www.agilent.com/cd/library/applications/5989-1165EN.pdf (2016).
  23. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).
  24. Culviner, P. H., Guegler, C. K., Laub, M. T. A Simple, Cost-Effective, and Robust Method for rRNA Depletion in RNA-Sequencing Studies. mBio. 11 (2), (2020).
  25. MGIEasy RNA Directional Library Prep Set User Manual verA2. MGI Tech Co. , Available from: https://en.mgi-tech.com/products/reagents_info/14/ (2020).
  26. Andrews, S. FastQC: A Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  27. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).
  28. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina Sequence Data. Bioinformatics. , (2014).
  29. NCBI Resource Coordinators. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 44 (1), (2016).
  30. Li, H. Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM. arXiv. , (2013).
  31. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), (2009).
  32. Liao, Y., Shi, W. Read trimming is not required for mapping and quantification of RNA-seq reads at the gene level. NAR Genomics and Bioinformatics. 2 (3), (2020).
  33. Penir, S. Calculating Mapping Statistics from a SAM/BAM file using SAMtools and awk. , Available from: https://sarahpenir.github.io/bioinformatics/awk/calculating-mapping-stats-from-a-bam-file-using-samtools-and-awk/ (2019).
  34. Haile, S., et al. Evaluation of protocols for rRNA depletion based RNA sequencing of nanogram inputs of mammalian total RNA. PLoS ONE. 14 (10), 0224578(2019).
  35. Schuierer, S., et al. A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples. BMC Genomics. 18 (442), (2017).
  36. Shanker, S., et al. Evaluation of Commercially Available RNA Amplification Kits for RNA Sequencing Using Very Low Input Amounts of Total RNA. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), (2015).
  37. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10, 623-629 (2013).
  38. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biology. 17 (13), (2016).
  39. Illumina, Inc. Coverage depth recommendations. , Available from: https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/plan-experiments/coverage.html (2021).
  40. What is a good sequencing depth for bulk RNA-Seq. ECSEQ Bioinformatics. , Available from: https://www.ecseq.com/support/ngs/what-is-a-good-sequencing-death-for-bulk-rna-seq (2019).
  41. Bedre, R. Sequencing coverage and breadth of coverage. , Available from: https://www.reneshbedre.com/blog/sequencing-coverage.html (2021).
  42. Dotsch, A., et al. The Pseudomonas aeruginosa transcriptome in planktonic cultures and static biofilms using RNA sequencing. PLoS One. 7 (2), 31092(2012).
  43. Chen, Y., et al. Population dynamics and transcriptomic responses of Pseudomonas aeruginosa in a complex laboratory microbial community. npj Biofilms and Microbiomes. 5 (1), (2019).
  44. Thoming, J. G., et al. Parallel evolutionary paths to produce more than one Pseudomonas aeruginosa biofilm phenotype. NPJ Biofilms and Microbiomes. 6, 2(2020).
  45. Soares, A., et al. Understanding ciprofloxacin failure in Pseudomonas aeruginosa biofilm: persister cells survive matrix disruption. Frontiers in Microbiology. 10, 2603(2019).
  46. Whiteley, M., et al. Gene expression in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Nature. 413, (2001).
  47. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 1, (2006).
  48. Liu, Y., Zhou, J., White, K. P. RNA-seq differential expression studies: more sequence or more replication. Bioinformatics. 30 (3), (2014).
  49. Wieczorek, D., Delauriere, L., Schagat, T. Methods of RNA Quality Assessment. , Available from: https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment/ (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja RNA z biofilmuekstrakcja całkowitego RNAtworzenie biofilmumacierz egzopolisacharydowabiofilmy na płytkach mikrotitracyjnychsekwencjonowanie wysokoprzepustowepatogen bakteryjnymukowiscydoza

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.