Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Skalowalna metoda badania przeżycia neuronów w pierwotnej hodowli neuronalnej z rozdzielczością pojedynczej komórki i w czasie rzeczywistym

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62759

⸱

26 lipca 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cortical Circuits in Health and Disease, Centro de Investigación Príncipe Felipe

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy prostą, skuteczną i wszechstronną metodologię badania przeżywalności neuronów w przypadku stresu cytotoksycznego w pierwotnych neuronach korowych z rozdzielczością komórkową w czasie rzeczywistym lub w ustalonym materiale.

Streszczenie

Utrata neuronów jest podstawą wielu neuropatologii, w tym udaru, choroby Alzheimera i choroby Parkinsona. Opracowano różne metody badania procesu przeżywania neuronów w warunkach stresu cytotoksycznego. Większość metod opiera się na podejściach biochemicznych, które nie pozwalają na rozdzielczość pojedynczych komórek lub obejmują złożone i kosztowne metodologie. Przedstawiono tutaj wszechstronny, niedrogi i skuteczny eksperymentalny paradygmat do badania przeżycia neuronów. Metoda ta wykorzystuje rzadkie znakowanie fluorescencyjne neuronów, a następnie obrazowanie na żywo i automatyczną kwantyfikację. W tym celu neurony są elektroporowane w celu ekspresji markerów fluorescencyjnych i hodowane wspólnie z neuronami nieelektroporowanymi, aby łatwo regulować gęstość komórek i zwiększać przeżywalność.

Rzadkie etykietowanie za pomocą elektroporacji pozwala na prostą i solidną automatyczną kwantyfikację. Ponadto znakowanie fluorescencyjne można połączyć z koekspresją genu będącego przedmiotem zainteresowania w celu zbadania określonych szlaków molekularnych. W tym miejscu przedstawiamy model udaru mózgu jako model neurotoksyczny, a mianowicie test deprywacji tlenowo-glukozowej (OGD), który został przeprowadzony w niedrogiej i solidnej domowej komorze hipoksyjnej. Na koniec opisano dwa różne przepływy pracy przy użyciu IN Cell Analyzer 2200 lub ImageJ o otwartym kodzie źródłowym do analizy obrazu w celu półautomatycznego przetwarzania danych. Ten przepływ pracy można łatwo dostosować do różnych eksperymentalnych modeli toksyczności i zwiększyć w celu przeprowadzenia badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Podsumowując, opisany protokół zapewnia przystępny, przystępny cenowo i skuteczny model neurotoksyczności in vitro, który może być odpowiedni do testowania ról określonych genów i szlaków w obrazowaniu na żywo oraz do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków.

Wprowadzenie

Badanie zaburzeń neuronalnych wymaga eksperymentalnych modeli, które są podatne na analizy genetyczne, molekularne i komórkowe. Pierwotne neurony korowe są bardzo silnym modelem do badania przeżywalności i toksyczności neuronów1,2,3,4. W odpowiednich warunkach neurony pierwotne będą stopniowo rozwijać kontakty synaptyczne i prezentować cechy dojrzałych neuronów. Dlatego model ten jest bardziej wiarygodny niż unieśmiertelnione linie komórkowe w modelowaniu fizjologii neuronów i bardziej podatny na manipulacje niż modele zwierzęce. Jednak w porównaniu z liniami komórkowymi, pierwotne neurony korowe są trudne do transfekcji i stosunkowo delikatne. Co więcej, skomplikowana morfologia neuronów korowych może komplikować obrazowanie i analizę w kulturach o dużej gęstości. I odwrotnie, pierwotne kultury neuronów o niskiej gęstości są łatwiejsze do analizy, ale zwykle są bardziej kruche.

Biorąc to wszystko pod uwagę, ten artykuł przedstawia przystępny, wszechstronny i skalowalny przepływ pracy in vitro do modelowania i badania przeżycia neuronów (Rysunek 1). Kluczowymi punktami tego protokołu są: i) metoda elektroporacji neuronów in vitro za pomocą markera fluorescencyjnego, aby umożliwić rzadkie znakowanie i obrazowanie żywych komórek; ii) jego wszechstronność w różnych modelach cytotoksyczności; oraz iii) analizy półautomatycznej lub automatycznej.

System elektroporacji (zobacz Tabelę Materiałów) zapewnia otwartą i tanią procedurę, która nie wymaga zestawów i konkretnych rozwiązań4,5,6. Co więcej, metodę tę można łatwo dostosować do uzyskania optymalnej wydajności transformacji i gęstości transfekowanych neuronów, mieszając komórki elektroporowane z nieelektroporowanymi. Współhodowla z naiwnymi (nieelektroporowanymi) neuronami znacznie poprawia żywotność elektroporowanych komórek w porównaniu z kulturami o niskiej gęstości. Co więcej, umożliwia rzadkie znakowanie z regulowaną gęstością elektroporowanych neuronów, utrzymując stały poziom ekspresji genów. Ważne jest, aby dążyć do 3-5% neuronów poddanych elektroporacji w testach przeżycia.

Rzadkie etykietowanie zasadniczo ułatwia automatyzację analizy obrazu, ponieważ komórki są dobrze oddzielone i łatwo je odróżnić. Warto zauważyć, że ten eksperymentalny paradygmat może zostać zaadaptowany do testowania wielu genów będących przedmiotem zainteresowania poprzez jednoczesną kokulturację neuronów współelektroporowanych z różnymi cytozolowymi markerami fluorescencyjnymi (np. białkiem cyjanu, białkiem czerwonej fluorescencji (RFP), białkiem zielonej fluorescencji (GFP)) w tej samej studzience. Podobnie jak w przypadku innych testów cytotoksyczności (np. jodku propidyny lub dehydrogenazy mleczanowej), test opisany w niniejszym dokumencie opiera się na fakcie, że śmierci neuronów towarzyszy pęknięcie błony komórkowej. Powoduje to uwalnianie białek cytozolowych przez dyfuzję, a w konsekwencji utratę fluorescencji GFP.

Model udaru in vitro, a mianowicie model OGD, jest przedstawiony jako przykład neurotoksyczności7,8,9. Protokół ten polega na wystawieniu pierwotnych neuronów na działanie buforu solnego podobnego do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego, ale pozbawionego tlenu i glukozy. Chociaż model ten został przedstawiony jako przykład stresu neurotoksycznego, różne warunki cytotoksyczne mogą być testowane przy użyciu tego samego przepływu pracy8,9. Wreszcie, rzadkie etykietowanie z łatwością umożliwia opracowanie zautomatyzowanej analizy obrazowej. W tym przypadku ustalono protokół oparty na standardowej immunofluorescencji i analizie ImageJ w mniejszej konfiguracji. Następnie ten przepływ pracy został dostosowany i rozszerzony przy użyciu systemu obrazowania komórek, który umożliwia automatyczną analizę w obrazowaniu na żywo w trybach średniej i wysokiej przepustowości. Podsumowując, w artykule przedstawiono elastyczną, przystępną cenowo i skalowalną metodologię badania przeżycia neuronów w różnych eksperymentalnych modelach toksyczności przy użyciu obrazowania na żywo i automatycznej kwantyfikacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z wykorzystaniem zwierząt powinny być nadzorowane przez komisję ds. zwierząt bioetycznych instytutu i wykonywane zgodnie z lokalnymi przepisami. Procedury przedstawione w niniejszym dokumencie zostały zatwierdzone przez organ delegowany i są zgodne z przepisami obowiązującymi w Hiszpanii i Europie.

1. Pierwotna hodowla neuronów

UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane wewnątrz kaptura hodowlanego, przy użyciu sterylnych materiałów i roztworów w celu utrzymania sterylnych warunków.

  1. Powłoka z poli-L-lizyny (PLL)
    1. Szkiełka nakrywkowe (CV, 15 mm) umyć przez noc w 70% etanolu (o/n) w wytrząsarce orbitalnej.
      UWAGA: Prędkość wytrząsarki orbitalnej powinna być wystarczająca, aby delikatnie przesuwać CV, ale nie za szybko, aby uniknąć uszkodzenia lub zarysowania CV. Konkretne prędkości obrotowe będą się różnić w zależności od modelu shakera. CV mogą być przechowywane w etanolu przez długie okresy (miesiące).
    2. Usuń etanol i umyj dwukrotnie wodą dejonizowaną przez 10 minut każdy.
    3. Pozostawić CV do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (RT) na szalce Petriego o średnicy 100 mm (około 13 CV/płytkę). Upewnij się, że CV nie stykają się ze sobą ani z krawędziami płyty.
      UWAGA: Suche CV mogą być przechowywane w RT przez długie okresy (miesiące).
    4. Przygotować roztwór podstawowy PLL o stężeniu 5 mg/ml w wodzie, sporządzić porcje i przechowywać je w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć roztwór podstawowy w 1x PBS do stężenia roboczego 0,1 mg/mL.
      UWAGA: Można badać wyższe stężenia do 1 mg/ml PLL.
    5. Dodać minimalną objętość PLL, aby pokryć powierzchnię CV (zob. optymalne objętości PLL w tabeli 1). Roztwór PLL należy dodawać kroplami, aby ułatwić tworzenie się kropli.
      UWAGA: Posiew neuronów na CV jest wymagany do immunofluorescencji. W przypadku obrazowania poklatkowego (np. w przypadku komórki IN) komórki są posiewane bezpośrednio nad studzienką bez CV, ponieważ CV mogą się poruszać podczas upływu czasu. W takim przypadku dodaj minimalną objętość PLL, aby pokryć powierzchnię każdej studzienki.
pkt. pkt.
PowierzchniaObjętość PLL (ml)
Szkiełka nakrywkowe 15 mm0,2
Szkiełka nakrywkowe 13 mm0,18
Płytka 96-dołkowa0,07
Płytka 24-dołkowa0,3
Płytka 6-dołkowacyfra arabska
Blacha 60 mmRozdział 4.5

Tabela 1: Optymalne objętości poli-L-lizyny w zależności od powierzchni.

  1. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Okres inkubacji może być tak długi, jak o/n.
  2. Usuń PLL z CVs. Umyj CV dwukrotnie wodą dejonizowaną przez 10 minut każde. Pozostaw CV do wyschnięcia w RT.
    UWAGA: Roztwór PLL można przechowywać w temperaturze 4 °C do ponownego użycia (maksymalnie 3 razy).
  3. Przechowywać wysuszone CV na szalce Petriego w temperaturze 4 °C (przez okres do 7-10 dni) lub umieścić je w studzienkach z podłożem galwanicznym (patrz skład w tabeli 2 i objętości robocze w tabeli 3). Dodać pożywkę galwaniczną bezpośrednio do dołków płytek 12-dołkowych (Tabela 3).
    UWAGA: Neurony są bardzo wrażliwe na jakość płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Należy przetestować różne partie FBS w celu zidentyfikowania partii, w której komórki wyglądają zdrowiej. Po zidentyfikowaniu dużej ilości FBS zaleca się uzyskanie dużej ilości i przechowywanie jej w temperaturze -80 °C. Protokół ten można dostosować do innych typów CV i tablic rejestracyjnych (zob. różne objętości robocze w tabeli 3).
pkt. pkt. pkt.
Medium do powlekania
MEM42,5Ml
10% Surowica końska lub FBS*5Ml
30% glukozy (0,6% stężenia końcowego)1Ml
PS (penicylina, 10000 U/ml; streptomycyna, 10 mg/ml);0,5Ml
Medium do elektroporacji
Opti-MEM
Medium neuronalne
Podłoże neuropodstawowe48,5Ml
B-271Ml
Glutamax 200 mM0,125Ml
PS (penicylina, 10000 U/ml; streptomycyna, 10 mg/ml);0,5Ml
OGD Medium (Tasca, et al. 2014)
CaCl21Mm
KCl5Mm
NaClRozdział 137Mm
KH2PO40,4Mm
Na2HPO40,3Mm
MgCl20,5Mm
MgSO40,4Mm
WIADOMOŚCI WŁOSKIE25Mm
NaHCO34Mm

Tabela 2: Skład różnych używanych mediów.

pkt. pkt.
Powierzchnia studni i płytObjętość robocza
Płytka 96-dołkowa0,32cm20,1Ml
Płytka 24-dołkowaPytanie 1.9cm20,5Ml
Płytka 12-dołkowa3.8cm21Ml
Płytka 6-dołkowaPytanie 9,5cm2Rozdział 2.5Ml
Blacha 60 mm21,5cm26Ml

Tabela 3: Powierzchnia różnych typów płyt i objętości robocze.

  1. Przygotowanie hodowli neuronalnej
    1. Wstępnie ogrzej (37 °C) i zrównoważ (w atmosferze 5%CO2) pożywkę galwaniczną, pożywkę neuronalną i pożywkę do elektroporacji (patrz skład w tabeli 2) w częściowo otwartej butelce wewnątrz inkubatora komórkowego przez co najmniej 2 godziny. Pozwól trypsynie rozgrzać się w temperaturze pokojowej. Podgrzej 1x Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
    2. Ustaw parametry elektroporacji (Tabela 4).
Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział
WARUNKI ELEKTROPORACJI: Impuls poringowy
długośćVinterwałND. Stawkabiegunowość
Czas trwania: 2 ms17550cyfra arabska10plus
WARUNKI ELEKTROPORACJI: Impuls transferowy
długośćVinterwałND. Stawkabiegunowość
5020505Rozdział 40plus/minus

Tabela 4: Ustawienia elektroporacji dla NEPA21.

  1. Sekcja mózgu i pobieranie CD-1 myszy embryos w E15 po stosunku
    1. Złożyć w ofierze ciężarną kobietę przez zwichnięcie szyjki macicy bez sedacji. Wysterylizuj brzuch 70% etanolem; Wytnij i otwórz brzuch ostrymi nożyczkami.
    2. Wyjmij macicę i umieść ją na szalce Petriego z zimnym 1x HBSS. Pozostaw go na lodzie w kapturze do hodowli komórkowej za pomocą zwykłych kleszczy.
    3. Wyjmij zarodek z macicy za pomocą kleszczy i nożyczek i odetnij mu głowę jednym cięciem za pomocą nożyczek.
    4. Przytrzymaj głowę i wprowadź kleszcze (np. cienkie kleszcze Dumonta) do oczodołu.
    5. Używając igły (strzykawki z igłą 30 G) jako ostrza, przeciąć bregmę i przebić się przez tylną część głowy.
    6. Wprowadź ostre kleszcze przez nacięcie pionowo do bregmy i rozbij cienką warstwę skóry w przedniej części. Pociągnij kleszcze, aby podążać za podłużną szczeliną między dwiema półkulami, nie uszkadzając kory.
    7. Użyj małych kleszczy pod kątem 45°, od przedniej do tylnej części, aby usunąć mózg z głowy.
    8. Przenieś mózg na 3,5 cm szalkę Petriego z lodowatym 1x HBSS pod mikroskopem stereoskopowym.
  2. Rozwarstwienie kory mózgowej
    UWAGA: Protokół hodowli neuronów jest zaadaptowany z procedury opisanej przez Dotti i Banker10.
    1. Użyj kleszczy Dumonta (11 cm), aby przytrzymać wzgórze i igły nachylonej pod kątem 45°, aby oddzielić korę każdej półkuli od śródmózgowia. Upewnij się, że kora nie wykazuje śladów innych tkanek; Użyj ostrych kleszczy, aby usunąć opony.
      UWAGA: Opony mózgowe tworzą cienką elastyczną błonę otaczającą mózg i są łatwe do rozpoznania ze względu na ich czerwony kolor. Wykonywanie miękkich ruchów zygzakiem pomoże usunąć opony mózgowe. Upewnij się, że wszystkie opony mózgowe zostały usunięte, ponieważ są toksyczne dla kultury.
    2. Przenieś czystą korę na czystą 3,5 cm szalkę Petriego z lodowatym 1x HBSS i umieść ją na lodzie.
  3. Podziału
    1. Pokrój każdą korę na dwie połówki i użyj kleszczy lub ostrej igły (30 G), aby ułatwić działanie trypsyny w następnym kroku.
    2. Przenieść kawałki do 7 ml buforu trypsyna-EDTA w temperaturze pokojowej w probówce o pojemności 15 ml za pomocą pipety P1000 (odciąć 3-4 mm końcówki). Poczekaj, aż opadną na dno końcówki, zanim zdejmiesz je z końcówki pipety. Mieszaj przez przechylenie.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 minut w łaźni wodnej. Mieszać, przechylając co 4-5 min.
      UWAGA: Czas inkubacji może wynosić od 12 do 15 minut.
    4. Pozwól tkance opaść grawitacyjnie i ostrożnie usuń trypsynę. Umyj chusteczkę dwukrotnie 8 ml 1x HBSS i delikatnie wymieszaj, przechylając. Ostrożnie wyjmij 1x HBSS za pomocą pipety P1000, ale używając nieodciętej końcówki pipety.
    5. Umyj chusteczkę raz 5 ml podłoża galwanicznego. Mieszać przez przechylanie. Ostrożnie usunąć podłoże galwaniczne za pomocą pipety P1000.
    6. Dodać 1,5 ml podłoża galwanicznego. Zdezagregować mieszaninę mechanicznie za pomocą pipety P1000, zasysając medium z dna probówki i delikatnie uwalniając je po ściankach maksymalnie 8-12 razy.
    7. Przefiltrować przez sterylne sitko do komórek (70 μm) umieszczone na probówce o pojemności 50 ml. Dodać do probówki 10 ml lub inną żądaną objętość podłoża galwanicznego.
    8. Wprowadzić 5 μl zawiesiny komórek do komory zliczania komórek, dodać 5 μl błękitu trypanowego (0,4% w/v) i policzyć komórki.
    9. Pokryć komórki na płytkę (patrz sekcja 1.6), przenosząc odpowiednią objętość zawiesiny komórek, aby uzyskać pożądaną liczbę komórek do elektroporacji (np. 106 komórek) w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki w temperaturze 250 × g przez 5 minut. Przejdź do sekcji 1.6.
  4. Ogniwa galwaniczne
    1. Umieścić na płytce żądaną gęstość nieodwirowanej zawiesiny komórek z kroku 1.5.7 w każdym studzience zawierającej podłoże galwaniczne.
      UWAGA: W tym protokole od 100 000 do 200 000 komórek/studzienkę wysiewano na 12-dołkowej płytce. Jako odniesienie należy umieścić co najmniej 3 CV na warunki doświadczalne, aby uwzględnić zmienność doświadczalną. Typowe warunki eksperymentalne mogą obejmować obrazowanie 4-5 pól na CV (np. przy użyciu obiektywu 20x, oczekuje się, że każde pole będzie miało szerokość ~1,3mm2).
    2. Przesuń płytkę w kapturze do hodowli komórkowej we wszystkich głównych kierunkach, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
  5. Elektroporacja
    UWAGA: Można stosować inne systemy transfekcji. System NEPA21 zastosowany w tym protokole ma tę zaletę, że jest "systemem otwartym". Protokół może być modyfikowany przez użytkownika i nie wymaga specjalnych odczynników do transfekcji specjalnych kuwet używanych do elektroporacji. Ten protokół został zmodyfikowany z 5.
    1. Kontynuuj od kroku 1.5.9. Zawiesić osad komórkowy z 5 ml pożywki do elektroporacji w probówce o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o masie 250 × g przez 5 minut.
    2. Powtórz krok 1.7.1. Zawiesić za pomocą pożywki do elektroporacji, aby uzyskać stężenie 106 komórek/ml w każdej z kuwet do elektroporacji. Wymieszaj komórki z żądaną ilością DNA w kuwecie.
      UWAGA: Do ekspresji GFP użyto 3 μg plazmidu na milion komórek. Ze względu na dużą zmienność zaleca się przetestowanie optymalnego stężenia dla każdego plazmidu. Przetestowano od 2 do 24 μg plazmidu na milion komórek. Różne plazmidy można łączyć w tej samej kuwecie w celu przeprowadzenia podwójnej transfekcji. W przypadku kotransfekcji, należy przetransfekować gen będący przedmiotem zainteresowania w nadmiarze w porównaniu z GFP (np. 3:1 jest optymalnym stosunkiem, który należy przetestować), aby zapewnić, że większość komórek wykazujących ekspresję GFP koeksprymuje gen będący przedmiotem zainteresowania.
    3. Umieść kuwetę w komorze kuwety (Rysunek 2). Naciśnij przycisk Start, aby uruchomić zaprogramowany program (patrz warunki elektroporacji w Tabeli 4). Zapisz wartości prądów i dżuli wyświetlane w ramce Measurements (Pomiary).
      UWAGA: Użytkownik może zmienić określone warunki. Na przykład zmniejszenie napięcia może zmniejszyć wydajność transfekcji, ale zwiększyć przeżywalność neuronów.
    4. Wyjmij kuwetę z komory. Natychmiast po elektroporacji dodać 500 μl podłoża galwanicznego do kuwety i przenieść próbkę z kuwety do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety.
      UWAGA: Im szybsze dodawanie pożywki, tym lepsza przeżywalność po elektroporacji, ponieważ pomaga to uniknąć uszkodzenia komórek.
    5. Umieść żądaną liczbę elektroporowanych ogniw w każdej studzience.
      UWAGA: Płytka od 20 000 do 100 000 komórek w płytce 12-dołkowej. W zależności od warunków może przetrwać tylko 5-10% elektroporowanych ogniw. Dokładna liczba powinna zostać przetestowana i dostosowana przez użytkownika.
    6. Inkubować przez 2-4 godziny w standardowych warunkach (37 °C, 5% CO2, wilgotność nasycona).
      UWAGA: Po okresie inkubacji obserwuj komórki pod mikroskopem. Jeśli hodowla jest zdrowa, większość komórek przylgnęłaby do powierzchni i zaczęłaby kiełkować widoczne rozszerzenia neurytów.
    7. Zmienić pożywkę posiewową na pożywkę neuronalną (objętości i skład odpowiednio w Tabeli 1 i Tabeli 2).
  6. Utrzymanie komórek
    1. Aby odświeżyć pożywkę, należy usunąć połowę pożywki i dodać równą objętość świeżej, wstępnie zbalansowanej pożywki po 7 dniach hodowli.
    2. W 10 dniu hodowli zastąp połowę objętości świeżą pożywką neuronalną bez suplementu glutaminy (patrz Tabela Materiałów). Powtarzaj ten krok co drugi dzień po dniu 10.
      UWAGA: Po 10 dniach hodowli komórki same wytwarzają glutaminian.

2. Budowa komory hipoksyjnej

  1. W tym celu należy użyć dowolnego hermetycznego pojemnika z zakręcaną pokrywką lub równoważnego systemu uszczelniającego (Rysunek 3A). Wywierć dwa otwory w ściance plastikowego pojemnika i wprowadź plastikową rurkę do każdego z nich. Uszczelnij je silikonem, aby pojemnik był hermetycznie zamknięty (Rysunek 3).
    UWAGA: Tutaj do budowy komory użyto cylindrycznego plastikowego pojemnika (rozmiar 1 litra) z zakręcaną pokrywką. Upewnij się, że pojemnik jest wystarczająco duży, aby pomieścić CV wymagane w eksperymencie. Aby obsłużyć więcej CV w tej samej przestrzeni, plastikowe platformy można układać jedna na drugiej (Rysunek 3A).
  2. W celu przygotowania komory bulgotania (patrz ppkt 3.2), wywiercić otwór w nasadce kolby, używając dowolnego standardowego wiertarki mechanicznej z wiertłem nieco mniejszym niż rurka, i wprowadzić plastikową rurkę przez otwór do kolby. Uszczelnij otwór parafilmem, aby zachować hermetyczne uszczelnienie (Rysunek 3B).
  3. Wysterylizuj pojemnik i kolbę 70% etanolem i naświetlaj światłem ultrafioletowym przez jeden cykl przed ich użyciem.

3. Deprywacja tlenowo-glukozowa (OGD)

UWAGA: Protokół dla OGD jest zaadaptowany z Tasca et al.7

  1. Przygotować roztwór OGD z roztworem fosforanu (Tabela 2), który został uprzednio uzupełniony antybiotykami.
    UWAGA: Na każdą płytkę 35 mm użyj 5 ml; w przypadku płytki o średnicy 100 mm użyj 10 ml.
  2. Dodać roztwór OGD do komory bulgoczącej (Rysunek 3B) i umieścić go w łaźni wodnej (już podgrzanej w temperaturze 37 °C). Połączyć kolbę ze źródłem azotu (N2, 100%).
    UWAGA: Należy pamiętać, że ponieważ roztwór OGD zawiera HEPES jako bufor, nie wymaga CO2 . Jeśli roztwór OGD jest oparty na układzie buforowym wodorowęglanu, należy użyć 5% CO2 i 95% N2 do nasycenia roztworu hipoksycznego i komory.
  3. Nasącz roztwór OGD delikatnie bulgoczącym azotem. Pozostaw roztwór w stanie lekko bulgoczącym na 20-30 minut.
  4. Natychmiast przenieść kolbę do okapu do hodowli komórkowych i dodać 5 ml roztworu OGD bez tlenu na płytkach 35 mm lub 10 ml na płytkach do hodowli 100 mm.
  5. Przenieść CV z hodowanymi komórkami na płytki z OGD. Nie zakrywając płytek, przenieś je do komory hipoksji i zamknij je mocno, ale ostrożnie.
    UWAGA: Kroki 3.4 i 3.5 należy wykonać tak szybko, jak to możliwe. Utrzymuj kontrolne CV (pożywka neuronalna w normoksji) w płytkach studzienek wewnątrz inkubatora. Alternatywnie, wystawij neurony kontrolne na działanie normoksycznego podłoża OGD uzupełnionego glukozą (10 mM), aby bardziej selektywnie zbadać skutki niedotlenienia i deprywacji glukozy.
  6. Podłącz układ azotowy do komory hipoksji i sprawdź, czy rurki są otwarte. Nasycić komoręN2 przez kilka minut pod ciśnieniem 2-3 barów (np. 2-3 min; 1 bar = 750 mmHg) (Rysunek 3C).
    UWAGA: Nie zapomnij ponownie bąbelkować roztworu OGD przez 15 minut między wieloma punktami czasowymi.
  7. Zmniejsz ciśnienie azotu do 1,3-1,5 bara i zamknij obie rurki komory hipoksji (Rysunek 3C). Pozostawić komorę w inkubatorze na wymagany czas (np. 60 min) w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
    UWAGA: Czas trwania OGD może wymagać dostosowania w zależności od warunków eksperymentu i celów badawczych. Krótki czas inkubacji (np. 30 minut) symulowałby łagodne niedotlenienie. Dwie godziny OGD są zwykle bardzo surowe dla neuronów. Zaleca się, aby przed rozpoczęciem badania zbadać czas trwania OGD wynoszący od 45 do 90 minut. Oczywiście, czas trwania OGD będzie miał wpływ na całkowite przeżycie i względny początek śmierci neuronów po wyzdrowieniu z OGD. Jeśli celem jest analiza śmierci neuronów w czasie rzeczywistym, należy dążyć do osiągnięcia warunków OGD, które sprowokowałyby śmierć komórki kilka godzin po wyzdrowieniu z OGD, aby uzyskać bardziej efektywną analizę.
  8. Otwórz komorę i przenieś CV na oryginalną płytkę wielodołkową w celu odzyskania. Po tym kroku rozważ dwie alternatywy: 1) w przypadku eksperymentów na małą skalę przejdź do sekcji 4 dotyczącej immunofluorescencji i analizy obrazu; 2) W przypadku badań przesiewowych o wysokiej zawartości przejdź do sekcji 5 w celu analizy w analizatorze komórkowym (lub równoważnej platformie).
    UWAGA: Obrazowanie na żywo zapewnia bardziej elastyczne podejście, ponieważ umożliwia monitorowanie różnych punktów eksperymentalnych w czasie rzeczywistym.

4. Analiza za pomocą standardowej immunofluorescencji i ImageJ

UWAGA: Czas odzyskiwania może wahać się od 1 do 24 godzin w zależności od warunków.

  1. Umyj neurony 1x PBS przez 10 min.
    UWAGA: Ten krok jest opcjonalny, ponieważ istnieje kilka sposobów kontynuowania i analizowania obrazów.
  2. Napraw neurony 4% paraformaldehydem przez 10 minut w RT. Umyj je trzy razy 1x PBS przez 10 minut każde mycie.
    UWAGA: Ponieważ paraformaldehyd jest toksyczny, pracuj pod maską chemiczną.
  3. Uzdatniaj neurony, dodając 1x PBS zawierający 0,1% Triton X-100 przez 10 min. Szybko umyj komórki 1x PBS. Powtórz krok prania dwa razy przez 10 minut każde pranie.
  4. Dodać 350 μl roztworu blokującego (1x PBS zawierający 2% albuminy surowicy bydlęcej) do CV i pozostawić je na co najmniej 30 minut. Odwirować podstawowe przeciwciało (AB) (5 × g przez 30 s) i wymieszać go z roztworem blokującym w wymaganym rozcieńczeniu, np. anty-GFP w stosunku 1:600.
    1. Przenieś szkiełka nakrywkowe na parafilm w wilgotnej komorze (pudełko z chusteczką nasączoną wodą, aby utrzymać wilgotność i uniknąć parowania). W zależności od wielkości CV, ostrożnie dodać 60 lub 80 μl rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego do każdego CV i upewnić się, że komórki mają kontakt z przeciwciałem. Inkubować CVs o/n w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Na powierzchni CV powinna powstać kropla, która pokryje całą powierzchnię CV. Należy unikać naruszania komórek podczas pipetowania roztworu przeciwciała na CV. Czas inkubacji można skrócić do 2 godzin w temperaturze pokojowej.
  5. Przemyj CV 1x PBS przez 10 minut nad parafilmem. Powtórz krok prania dwukrotnie.
  6. Rozcieńczyć wtórny AB, np. Alexa 488 (1:500) i 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI, 1:2,000) w roztworze blokującym. W zależności od wielkości CV, dodać 60-80 μl kropli wtórnego roztworu AB na komórki. Inkubuj CV przez 1 godzinę w ciemności w RT. Umyj wtórne AB i DAPI z neuronów za pomocą 1x PBS przez 10 minut i powtórz ten krok dwukrotnie.
  7. Zamontować CV w podłożu montażowym (patrz tabela materiałów) do analizy immunofluorescencyjnej i przechowywać je w ciemności w temperaturze 4 °C po wysuszeniu.
  8. Przechwytywanie i analiza obrazów.
    UWAGA: Do wykonania zdjęć z powiększeniem 20x (Rysunek 4A, patrz Tabela Materiałów).
    1. Użyj oprogramowania ImageJ o otwartym kodzie źródłowym, aby przeanalizować obrazy i uzyskać maskę dla kanału GFP ( Rysunek 4C).
      UWAGA: Istnieje kilka sposobów obrazowania i analizowania neuronów, w zależności od dostępności sprzętu i formatu eksperymentu. Poniższy przepływ pracy jest przedstawiony jako podstawowy przykład, w którym celem jest identyfikacja somy poszczególnych neuronów wyrażających GFP obecnych na obrazie. Przedstawione tutaj konkretne wartości, takie jak wartość progowa i wielkość cząstek, powinny zostać przetestowane przez użytkownika w oparciu o jego specyficzne warunki eksperymentalne. Ponadto mogą być dodawane różne filtry i etapy przetwarzania. Na przykład filtry ImageJ Odejmuj tło i Usuń plamki często pomagają w oczyszczeniu obrazu na początku przetwarzania. Optymalizacja przepływu pracy dla określonych warunków eksperymentalnych wymaga wcześniejszego doświadczenia w analizie obrazu oraz znajomości podstawowych pojęć ilościowej analizy obrazu. Ponieważ szczegółowy przewodnik po analizie obrazu wykracza poza zakres obecnego protokołu, zalecamy następujące zasoby: Podręcznik użytkownika ImageJ, https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/; Aby zapoznać się z przykładami i samouczkami, https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.htm; Pakiet MBF ImageJ, https://imagej.net/mbf/index.htm.
    2. Do segmentacji wybierz Segmentacja intensywności z parametrami niezbędnymi do wyizolowania somy, która jest najjaśniejszym regionem neuronów.: Menu | Obraz | Dostosuj | Próg | Ustawianie minimalnego progu (np. 100) | kliknij Zastosuj.
    3. Powtórz próg z 4.8.2. do wszystkich obrazów, aby zobaczyć maskę (tj. obraz podzielony na segmenty) dla somy neuronów (Rysunek 4E).
    4. Aby uzyskać liczbę ocalałych komórek na każdym obrazie i wyeksportować wyniki do arkusza kalkulacyjnego w celu wykonania obliczeń, wybierz Menu | Analizowanie | Przeanalizuj cząstki i wprowadź niezbędne wartości parametrów (np. Rozmiar: piksel 50-nieskończoności; Cyrkularność: 0,5-1,00). Weź pod uwagę, że przy t = 0 h liczba zliczonych komórek jest całkowitą liczbą zidentyfikowanych komórek i oblicz procent komórek, które przetrwały w różnych punktach czasowych.
      UWAGA: Niższy próg rozmiaru jest przydatny do odfiltrowywania mniejszych obiektów niż soma (np. 60-80 μm2).
    5. Użyj funkcji Record Macro programu ImageJ, aby zautomatyzować i powtórzyć analizę: Menu | Wtyczki | Makra | Rekord | Kliknij Utwórz, aby wygenerować makro.

5. Analiza w czasie rzeczywistym za pomocą IN Cell Analyzer 2200

  1. Włóż 12-dołkową płytkę do analizatora komórek, podłącz system CO2 i ustaw temperaturę na 37 °C.
    UWAGA: Ten krok można łatwo przeskalować w górę na tej platformie, wykonując podobny eksperyment na neuronach posianych w płytce z 96 dołkami.
  2. Wybierz obiektyw 20x, losowo wybierz 5 pól na studzienkę (w tym przykładzie pokrywających 2,33% dołka) i ustaw je automatycznie dla każdego kanału fluorescencji (w tym przypadku izotiocyjanian fluoresceiny [FITC]). Wybierz parametry akwizycji (30 min time-lapse przez 16 h). Naciśnij Start i czekaj.
    UWAGA: Liczba pól obrazowania musi zostać określona przez badacza i powinna być wystarczająca do uwzględnienia zmienności wewnątrz pojedynczego dołka.
  3. Użyj IN Cell Developertoolbox w wersji 1.9, aby skonfigurować odpowiedni przepływ pracy do analizy.
  4. Przeanalizuj obrazy neuronów (kanał FITC), aby wygenerować maskę dla somy neuronów (Rysunek 4).
    UWAGA: Celem jest zidentyfikowanie somy poszczególnych neuronów obecnych na obrazie. Ta analiza przebiega zgodnie z krokami, które są równoważne z krokami opisanymi w sekcji 4 dla ImageJ. Zapoznaj się z sekcją 4, aby zapoznać się z przepływem pracy i uwagami ogólnymi. Próg intensywności jest określany w celu wybrania somy, która jest najjaśniejszym regionem neuronów.
    1. Do segmentacji wybierz Segmentację intensywności z niezbędnymi parametrami (w tym przypadku minimalny próg 20005.40).
    2. Do przetwarzania końcowego wybierz opcję Sito, utrzymując cele o powierzchni większej niż określona wartość (tutaj 189 pikseli (~80 μm2)).
    3. Wybierz parametr Sum, aby policzyć i zsumować wszystkie neurony zidentyfikowane w masce (neurony, które przeżyły) dla każdego pola i dla wszystkich pól studni w każdym punkcie czasowym przebiegu czasu.
    4. Wyeksportuj wyniki do arkusza kalkulacyjnego. Przy t = 0 h należy wziąć pod uwagę, że liczba zliczonych komórek to całkowita liczba zidentyfikowanych komórek i obliczyć procent komórek, które przetrwały w różnych punktach czasowych. Oblicz czas, w którym 50% komórek jest martwych, aby ułatwić porównanie warunków.
      UWAGA: Parametry etapów segmentacji i postprocessingu muszą być dostosowane przez użytkownika dla różnych kanałów fluorescencyjnych w zależności od struktur, które mają być zidentyfikowane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem niniejszego protokołu jest stworzenie modelu udaru in vitro. Ważne jest uzyskanie odpowiedniej gęstości neuronalnej, co umożliwi rozpoznanie poszczególnych neuronów poddanych elektroporacji i ich indywidualną analizę. Kluczowy jest również etap hodowli neuronalnej po wysianiu. Dojrzewanie neuronów w hodowli postępuje stopniowo. Zależność od czynników wzrostu, wzrost neurytów, łączność oraz aktywność elektrofizjologiczną będą się znacznie różnić w zależności od etapu. W tych konkretnych warunkach w dniach 4...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten pokazuje skuteczny sposób modelowania udaru mózgu in vitro. Aby osiągnąć ten cel, zaproponowaliśmy rzadkie znakowanie neuronów korowych za pomocą systemu elektroporacji NEPA215. Jest to otwarty system, który umożliwia dostosowanie protokołu przy minimalnych kosztach operacyjnych w porównaniu z innymi systemami, które wykorzystują zestawy lub określone urządzenia. Mieszana hodowla neuronów naiwnych i elektroporowanych zapewnia większą elastyczność i wytrzymałość w porównaniu z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Carlosowi Dottiemu za podzielenie się swoją wiedzą na temat hodowli neuronów. Dziękujemy również Alicii Martínez-Romero z Centro de Investigación Principe Felipe (CIPF), która jest wspierana przez europejskie fundusze FEDERER. Projekt jest wspierany przez hiszpańskie Ministerstwo Gospodarki i Konkurencyjności w zakresie (SAF2017-89020-R) odczynników, materiałów i wynagrodzeń YDC i PF. PF jest również wspierany przez grant RyC-2014-16410. CGN i PF są wspierane przez Conselleria de Sanitat z Generalitat Valenciana, a także przez AGM (ACIF/2019/015). Ángela Rodríguez Prieto jest wspierana przez hiszpańskie Ministerstwo Nauki, Innowacji i Uniwersytetów grantem PRE2018-083562.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szalki Petriego 10 cmFISHER SCIENTIFIC, S.L.1130-9283
Szalki Petriego 3,5 cmSterilin
75 cm2kolba Corning430641U
B-27Life Technologies17504-044
Płytki do hodowli komórkowychCorning incorporation Costar®3513
Inkubator komórekThermo Electron CorporationModel 371
Sitko komórkowe 70 &mikro; mFalcon352350
Zimne światłaSchott223488KL 1500
Szkiełka nakrywkowe LCD (15 mm)Marienfeld111530
CU500 Komora kuwetyNepa Gene
CU600 Uchwyt na kuwetęNepa Gene
DAPISigma-Aldrich Quimica, S. L.D9542-10MG1:2000
DMSOPanreacA3672
Kleszcze drobne DumontFST11254-20
Kleszcze drobnoziarnisteDumont FST11252-00
EC-002S Kuwety do elektroporacji NEPA, szczelina 2mmFiltr siatkowy Nepa
Falcon352350
Drobne nożyczki-ostre-FST14028-10
Drobne nożyczki-ToughCut rFST14058-09
GFP kurczak IgYAves LabsGFP-10101:600
GlukozaSigma68769-100ml
Suplement GlutaMAX-I 200 mM 100 mlFisher Scientific35050-061
HBSSThermofisher14175-095https://www.thermofisher.com/es/es/home/technical-resources/media-formulation.156.html
Hepes 1 MThermoFisher15630-080
Serum dla koniInvitrogen26050088
MEMThermofisher11095080https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11095080#/11095080
Szkiełko mikroskopowe (polilizyna)VWR631-0107Wymiary: 25 x 75 x 1 mm
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich Quimica, S. L.81381-250G
Igły żółte, 30 gaugeBD Microlance™ 3304000
NEPA21 elektroporatorNepa Gene
Komora NeubaueraBlau Marka717805
Neurobasal MediumThermoFisher21103-49
Opti-MEMInvitrogen31985-062
ParafilmCole-ParmerPM996
Paraformaldehyd (PFA), 95%Sigma-Aldrich Quimica, S. L.158127-500GUżyj roztworu: 4%
PEIPolysciences23966-1
Plazmid dla GFPpCMV-GFP-ires-Cre, opisany w Fazzari et al., Nature, 2010
Poli-L-LizynaSIGMAP2636
PS (penicylina, streptomycyna)ThermoFisher15140122
Kleszcze ząbkowaneFST11152-10
Mikroskop stereoskopowyWORLD PRECISION INSTRUMENTS
StrzykawkiBD Plastipak 1ml303176
Triton X-100Sigma-Aldrich Quimica, S. L.Numer MDL: MFCD00128254Niejonowe
ThermoFisher-EDTA25300054
15 mlFisher05-539-4
Probówki 50 mlVWR21008-242
Tupperware-Hermetyczne naczynia z zakręcaną pokrywką. SP Berner - Taper 1 L Redondo con Rosca. Każdy równoważny hermetyczny Tupperware można kupić w każdym supermarkecie.
Kąpiel wodnaSHELDON LABORATORY MODEL 12241641951
Gene probówki

Bibliografia

  1. Salazar, I. L., Mele, M., Caldeira, M., Costa, R. O., Correia, B., Frisari, S., Duarte, C. B. Preparation of primary cultures of embryonic rat hippocampal and cerebrocortical neurons. Bio-protocol. 7 (18), 2551(2017).
  2. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  3. Fazzari, P., et al. Cell autonomous regulation of hippocampal circuitry via Aph1b-γ-secretase/neuregulin 1 signalling. eLife. 3, 02196(2014).
  4. Navarro-González, C., Huerga-Gómez, A., Fazzari, P. Nrg1 intracellular signaling is neuroprotective upon stroke. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 3930186(2019).
  5. NEPA21 transfection of cell suspensions using cuvettes. NEPAGENE Co. Ldt. , Available from: http://2017.igem.org/wiki/images/3/3a/T--TECHNION-ISRAEL--Electroporation-NEPA2_for_HPC-7.pdf (2017).
  6. Larson, M. A., Gibson, K. A., Vivian, J. L. In vivo validation of CRISPR reagents in preimplantation mouse embryos. Methods in Molecular Biology. 2066, 47-57 (2020).
  7. Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods in Molecular Biology. 1254, 197-210 (2015).
  8. Holloway, P. M., Gavins, F. N. E. Modeling ischemic stroke in vitro: the status quo and future perspectives. Physiology and Behavior. 47 (2), 561-569 (2016).
  9. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
  10. Dotti, C. G., Banker, G. A. Experimentally induced alteration in the polarity of developing neurons. Nature. 330 (6145), 254-256 (1987).
  11. Fazzari, P., et al. Control of cortical GABA circuitry development by Nrg1 and ErbB4 signalling. Nature. 464 (7293), 1376-1380 (2010).
  12. Sadiq, A. A., et al. An overview: Investigation of electroporation and sonoporation techniques. 2015 2nd International Conference on Biomedical Engineering. , 1-6 (2015).
  13. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), 3044(2018).
  14. Fazzari, P., Mortimer, N., Yabut, O., Vogt, D., Pla, R. Cortical distribution of GABAergic interneurons is determined by migration time and brain size. Development. 147 (14), 185033(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

rozdzielczo pojedynczych kom rekobrazowanie w czasie rzeczywistymznakowanie fluorescencyjneelektroporacjadeprywacja tlenu i glukozykomora hipoksycznazautomatyzowana kwantyfikacjawysokoprzepustowe przesiewanie
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.