Skalowalna metoda badania przeżycia neuronów w pierwotnej hodowli neuronalnej z rozdzielczością pojedynczej komórki i w czasie rzeczywistym

Ángela Rodríguez-Prieto; Ana González-Manteiga; Yaiza Domínguez-Canterla; Carmen Navarro-González; Pietro Fazzari

doi:10.3791/62759

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Skalowalna metoda badania przeżycia neuronów w pierwotnej hodowli neuronalnej z rozdzielczością pojedynczej komórki i w czasie rzeczywistym

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62759

⸱

26 lipca 2021

Ángela Rodríguez-Prieto^*¹ , Ana González-Manteiga^*¹ , Yaiza Domínguez-Canterla¹ , Carmen Navarro-González¹ , Pietro Fazzari¹

¹Laboratory of Cortical Circuits in Health and Disease, Centro de Investigación Príncipe Felipe

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy prostą, skuteczną i wszechstronną metodologię badania przeżywalności neuronów w przypadku stresu cytotoksycznego w pierwotnych neuronach korowych z rozdzielczością komórkową w czasie rzeczywistym lub w ustalonym materiale.

Streszczenie

Utrata neuronów jest podstawą wielu neuropatologii, w tym udaru, choroby Alzheimera i choroby Parkinsona. Opracowano różne metody badania procesu przeżywania neuronów w warunkach stresu cytotoksycznego. Większość metod opiera się na podejściach biochemicznych, które nie pozwalają na rozdzielczość pojedynczych komórek lub obejmują złożone i kosztowne metodologie. Przedstawiono tutaj wszechstronny, niedrogi i skuteczny eksperymentalny paradygmat do badania przeżycia neuronów. Metoda ta wykorzystuje rzadkie znakowanie fluorescencyjne neuronów, a następnie obrazowanie na żywo i automatyczną kwantyfikację. W tym celu neurony są elektroporowane w celu ekspresji markerów fluorescencyjnych i hodowane wspólnie z neuronami nieelektroporowanymi, aby łatwo regulować gęstość komórek i zwiększać przeżywalność.

Rzadkie etykietowanie za pomocą elektroporacji pozwala na prostą i solidną automatyczną kwantyfikację. Ponadto znakowanie fluorescencyjne można połączyć z koekspresją genu będącego przedmiotem zainteresowania w celu zbadania określonych szlaków molekularnych. W tym miejscu przedstawiamy model udaru mózgu jako model neurotoksyczny, a mianowicie test deprywacji tlenowo-glukozowej (OGD), który został przeprowadzony w niedrogiej i solidnej domowej komorze hipoksyjnej. Na koniec opisano dwa różne przepływy pracy przy użyciu IN Cell Analyzer 2200 lub ImageJ o otwartym kodzie źródłowym do analizy obrazu w celu półautomatycznego przetwarzania danych. Ten przepływ pracy można łatwo dostosować do różnych eksperymentalnych modeli toksyczności i zwiększyć w celu przeprowadzenia badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Podsumowując, opisany protokół zapewnia przystępny, przystępny cenowo i skuteczny model neurotoksyczności in vitro, który może być odpowiedni do testowania ról określonych genów i szlaków w obrazowaniu na żywo oraz do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków.

Wprowadzenie

Badanie zaburzeń neuronalnych wymaga eksperymentalnych modeli, które są podatne na analizy genetyczne, molekularne i komórkowe. Pierwotne neurony korowe są bardzo silnym modelem do badania przeżywalności i toksyczności neuronów^1,²^,³^,⁴. W odpowiednich warunkach neurony pierwotne będą stopniowo rozwijać kontakty synaptyczne i prezentować cechy dojrzałych neuronów. Dlatego model ten jest bardziej wiarygodny niż unieśmiertelnione linie komórkowe w modelowaniu fizjologii neuronów i bardziej podatny na manipulacje niż modele zwierzęce. Jednak w po....