Budowa i implementacja układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych nagrań in vivo

Podsumowanie

Ten protokół opisuje procedurę konstruowania układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych zapisów elektrofizjologicznych in vivo u myszy (Mus musculus) i fretki (Mustela putorius furo) z wielu obszarów mózgu. Każdy krok, po zakupie surowych włókien węglowych do implantacji matrycy mikroelektrodowej, jest szczegółowo opisany, z naciskiem na budowę matrycy mikroelektrodowej.

Streszczenie

Wielokanałowe układy elektrod oferują wgląd w działający mózg i służą do wyjaśnienia procesów neuronowych na poziomie pojedynczej komórki i obwodu. Rozwój tych narzędzi ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia złożonych zachowań i funkcji poznawczych oraz dla rozwoju zastosowań klinicznych. Wyzwaniem pozostaje jednak dendencyjne gęste pobieranie danych z populacji komórek w sposób stabilny i ciągły przez długi czas. Wiele popularnych elektrod, takich jak tetrody i matryce krzemowe, ma duże średnice poprzeczne, które powodują uszkodzenia po wprowadzeniu i wywołują przewlekłe reaktywne reakcje tkanek związane ze śmiercią neuronów, utrudniając rejestrację stabilnej, ciągłej aktywności neuronalnej. Ponadto większość wiązek przewodów wykazuje duże odstępy między kanałami, co wyklucza jednoczesne nagrywanie z dużej liczby komórek zgrupowanych na małym obszarze. Układy mikroelektrod z włókna węglowego opisane w tym protokole oferują przystępne rozwiązanie tych problemów. Badanie dostarcza szczegółowej metody wytwarzania układów mikroelektrod z włókna węglowego, które mogą być używane zarówno do ostrych, jak i przewlekłych zapisów in vivo. Właściwości fizyczne tych elektrod sprawiają, że idealnie nadają się one do stabilnych i ciągłych długoterminowych zapisów przy dużej gęstości komórek, umożliwiając badaczowi dokonywanie solidnych, jednoznacznych nagrań z pojedynczych jednostek przez wiele miesięcy.

Wprowadzenie

Elektrody i tablice elektrod są cennymi narzędziami do zrozumienia, jak mózg przetwarza informacje na poziomie neuronalnym. Chociaż zapisy elektrofizjologiczne są osiągalne od ponad dwóch stuleci¹, nadal nie jest możliwe jednoczesne mierzenie aktywności całych obwodów neuronalnych w rozdzielczości przestrzennej i czasowej wymaganej do uchwycenia impulsów pojedynczych neuronów. Chociaż metody nieinwazyjne, takie jak elektroencefalografia², topografia emisji pozytonów³ i funkcjonalne obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego⁴ pozwalają na pomiary całego mózgu, nie są w stanie osiągnąć rozdzielczości przestrzennej i czasowej niezbędnej do rozdzielenia aktywności obwodów neuronalnych^2,5. W przeciwieństwie do tego, metody obrazowania, takie jak obrazowanie optyczne przy użyciu barwników wrażliwych na napięcie lub genetycznie kodowanych wskaźników wapnia, mogą osiągnąć jednojednostkową rozdzielczość przestrzenną, ale stwarzają problemy, takie jak niska rozdzielczość czasowa i słaba selektywność^3,4,5^,6. Nagrania elektryczne są potężną alternatywą dla tych metod. Elektrody rejestrujące zapewniają niezrównaną rozdzielczość czasową i pozwalają użytkownikowi na wykonywanie pomiarów z precyzją w czasie skoku w dowolnym obszarze mózgu⁷. Dodatkowo, chronicznie wszczepione matryce wieloelektrodowe (MEA) umożliwiają rejestrację na dużą skalę (dziesiątki do setek komórek) pojedynczych komórek u zachowujących się zwierząt w okresie od dni do miesięcy^8,9. Jednak sondy krzemowe, które rejestrują przy większej gęstości, mają duży ślad węglowy i są wysoce inwazyjne, a przewlekle wszczepione matryce często generują reakcję zapalną, enkapsulację tkanek i śmierć neuronów^10,11,12,13.

Ograniczenia istniejących elektrod zaowocowały ostatnimi innowacjami, które pozwalają na stabilne, długotrwałe nagrania w wysokiej rozdzielczości. Typowe elektrody składają się z metalowego przewodnika, takiego jak wolfram lub platyno-iryd, lub są na bazie krzemu lub polimeru. Podczas gdy matryce mikrodrutowe na bazie metalu mogą utrzymywać długotrwałe, stabilne zapisy, mają znacznie większą powierzchnię, a średnica pojedynczego przewodu waha się od 10 do 200 μm¹⁴. W przeciwieństwie do tego, matryce elektrod na bazie krzemu dają nagrania o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, ale ze względu na ich stosunkowo sztywną konstrukcję zazwyczaj nie są w stanie utrzymać sygnału i zapisu z tych samych neuronów przez wiele miesięcy¹⁵. Ostatnie osiągnięcia w dziedzinie matryc opartych na krzemie zaowocowały elektrodami, które mogą niezawodnie wykonywać przewlekłe zapisy, ale te matryce nie mogą być używane do nagrywania z głębokich obszarów mózgu u większych zwierząt i są przeznaczone do zapisów liniowych⁹. Postępy w dziedzinie matryc polimerowych zaowocowały zwiększoną elastycznością i stabilnością zapisu pojedynczych jednostek i oferują potencjał do nagrywania o dużej gęstości w najbliższej przyszłości, ale obecnie z ograniczoną dostępnością^8,16,17. Włókna węglowe pozwalają na nagrania o dużej gęstości z gotowych materiałów, które są tutaj opisane.

Mikroelektrody rejestrujące z włókna węglowego są używane od dziesięcioleci, a pierwsze elektrody z włókna węglowego składają się z pojedynczego włókna węglowego umieszczonego w szklanej mikropipecie. Mikroelektrody te były używane do jednojednostkowych nagrań zewnątrzkomórkowych i chociaż stosunek sygnału do szumu był porównywalny z najlepszymi mikroelektrodami wolframowymi w szkle, były one korzystne ze względu na ich elastyczność, niższe wartości impedancji i prostotę produkcji^18,19. Wysiłki zmierzające do opracowania układów elektrod z włókna węglowego przyspieszyły ostatnio ze względu na możliwości biodetekcji włókien węglowych. Oprócz zwiększonej biokompatybilności i wyjątkowej przewodności elektrycznej, charakteryzują się unikalnym zestawem właściwości, w tym odpornością na wysoką temperaturę, niską gęstością względną, wysoką wytrzymałością na rozciąganie, niską sztywnością na zginanie, wysoką czułością wykrywania i małym polem przekroju poprzecznego^10,12. Wszystkie te właściwości zmotywowały do opracowania układów mikroelektrod z włókna węglowego (CFEA), które ułatwiają przewlekłe, stabilne i wysokowydajne zapisy pojedynczych neuronów. Takie CFEA mogą być teraz wytwarzane ręcznie^20,21 (Rysunek 1), co daje układy mikroelektrod, które mogą przechowywać pojedyncze neurony przez wiele miesięcy. Opisano tutaj dostępny proces budowy CFEA, który został zaadaptowany na dwa sposoby do ostrych i przewlekłych zapisów pojedynczych neuronów u dwóch gatunków.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Uniwersytet Brandeis lub Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Waszyngtońskiego. Pokazane dane zebrano od jednej samicy fretki i jednego samca myszy.

1. Przygotowanie włókien węglowych i narzędzi

1. Przygotowanie komercyjnych włókien węglowych
   1. Wytnij 8 cm paski z wiązki włókien epoksydowych. Ułóż paski równolegle w tyglu i piecz w piecu w temperaturze 400 °C przez 6 godzin, aby usunąć żywicę epoksydową z włókien dostępnych w handlu. Następnie przechowuj upieczone włókna na standardowej szalce Petriego lub stożkowej tubie.
      UWAGA: Zastosowano włókna o średnicy 7 μm. Inne grupy używały włókien 4 μm^20,21.
   2. Przygotuj kasety do przechowywania pojedynczych włókien. Użyj drukarki 3D lub wycinarki laserowej, aby utworzyć kasety i powiązany z nimi uchwyt kasety (patrz Rysunek 2).
   3. Załaduj włókna na kasety. Zacznij od ułożenia kawałka taśmy dwustronnej na dwóch dłuższych bokach kasety, wyrównując krawędź taśmy z wewnętrzną krawędzią kasety. Oddziel poszczególne włókna od upieczonej wiązki i ułóż je równolegle do krótszego boku kasety, zachowując 2-3 mm między włóknami. Upewnij się, że na każdej kasecie zmieści się 20-30 włókien. Uszczelnij włókna na miejscu, kładąc przezroczystą taśmę na taśmie z podwójnym klejem. Umieść napełnione kasety w uchwycie kasety.
      UWAGA: Dla doświadczonego budowniczego wypełnienie jednej kasety włókien zajmie ~1 godzinę. Dla początkującego budowniczego proces ten zajmie prawdopodobnie ~1,5-3 godziny. W pudełku znajduje się dziesięć kaset, a w komorze osadzania parylenu mieszczą się dwa uchwyty kaset.
   4. Pokryj poszczególne włókna parylenem C za pomocą komercyjnej komory do osadzania próżniowego. Do powlekania potrzebny jest pojedynczy przebieg. Odmierz 2,3 g parylenu na każdy bieg. W komorze mieszczą się jednocześnie dwa uchwyty kasetowe. Procedura powlekania trwa ~2 h na przebieg.
      UWAGA: Pomiar 2,3 g parylenu C daje około 1 μm powłoki. Włókna powlekane można przechowywać w nieskończoność.
2. Przygotowanie narzędzia do manipulacji włóknem węglowym
   1. Owiń mały kawałek elastycznej folii samoprzylepnej wokół igły 30 G, tworząc ostry, ale elastyczny punkt z folią samoprzylepną.
      UWAGA: Owinięcie końcówki igły parafilmem i rozciągnięcie w ten sposób parafilmu tworzy łagodny efekt klejenia, który pozwala użytkownikowi podnosić i manewrować pojedynczymi włóknami.

2. Projektowanie i produkcja

1. Wybierz odpowiednią konstrukcję przyrządu niezbędną w oparciu o specyfikację elektrody, która ma być zbudowana. Będzie to zależało od liczby potrzebnych kanałów wraz z wszelkimi dodatkami projektowymi.
   UWAGA: Przyrząd odnosi się do wydrukowanego w 3D bloku, który zapewnia kotwicę dla elektrod i połączeń elektrycznych.
2. Utwórz lub zmień specyficzny projekt przyrządu za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD).
3. Użyj firmy zajmującej się drukiem 3D lub laboratorium twórców instytucjonalnych, aby wydrukować przyrządy za pomocą drukarki 3D SLA o wysokiej rozdzielczości.

3. Montaż układu mikroelektrod z włókna węglowego (CFEA)

UWAGA: Ten krok zajmuje ~2 godziny dla doświadczonego budowniczego i ~6 godzin dla początkującego budowniczego. Wykonaj wszystkie etapy montażu CFEA i etapy wiązania światłowodów pod 10-krotnym mikroskopem stereoskopowym. Kompletny montaż CFEA w środowisku o minimalnym ruchu powietrza, ponieważ może to zakłócić proces budowy.

1. Wybierz odpowiedni przyrząd potrzebny do zbudowania żądanej elektrody.
2. Za pomocą nożyc do drutu metalowego wytnij dwa kawałki drutu wolframowego o średnicy 0,003 cala (76,2 μm) o długości około 7 cm.
3. Przeprowadź każdy przewód przez odpowiedni kanał na końcu złącza przyrządu (GND i REF). Przełóż wystarczająco dużo, aż oba końce będą równej długości, a następnie skręć je razem, aby zabezpieczyć je na przyrządzie.
   UWAGA: W przypadku 16-kanałowej konstrukcji ostrej upewnij się, że metalowy drut pasuje do grzbietu w przyrządzie.
   1. Nałóż cement dentystyczny utwardzany promieniami UV, aby zabezpieczyć drut. Upewnij się, że cement dentystyczny nie dostanie się do otwartego kanału, przez który przechodzi drut.
      UWAGA: Użytkownik powinien nosić okulary z filtrem UV podczas wszystkich zabiegów związanych z UV, aby zapobiec potencjalnemu uszkodzeniu oczu. Wiele różdżek utwardzanych promieniami UV ma wbudowane filtry podglądu.
   2. Za pomocą szczoteczki do utwardzania UV utwardzaj cement dentystyczny przez 20 sekund.
   3. Zabezpiecz przyrząd w imadle jubilerskim za pomocą jednego z ramion przyrządu. Ustaw przyrząd tak, aby jedna z powierzchni bocznych była równoległa do podłoża.
   4. Ustaw przyrząd i imadło pod mikroskopem tak, aby koniec złącza, miska i końcówka lejka były widoczne. Ustaw przyrząd tak, aby lejek był skierowany w stronę przeciwną do użytkownika, a koniec łącznika był skierowany w stronę użytkownika.
   5. Zbierz narzędzia z włókna węglowego i ostro zakończoną igłę 25 G.
   6. Umieść kasetę z włóknami pokrytymi parylenem-C na białym arkuszu papieru, taśmą do góry, tak aby włókna nie znajdowały się bezpośrednio na papierze.
   7. Użyj igły 25 G, aby wyciąć pojedyncze włókno węglowe z kasety. W tym celu należy dosunąć końcówkę igły do kasety, z której wyłania się włókno, które ma zostać usunięte.
      1. Jeśli budujesz przy użyciu połówek włókien, odetnij jeden koniec włókna, jak opisano powyżej. Ustaw włókno tak, aby było proste, a następnie za pomocą igły przetnij włókno na pół, przecinając włókno na papierze. Aby przeciąć drugą połowę, która jest nadal połączona z kasetą, przytrzymaj wolną końcówkę włókna za pomocą wykonanego wcześniej narzędzia z włókna węglowego, a następnie użyj igły, aby przeciąć włókno nadal połączone z kasetą, jak opisano powyżej.
      2. Jeśli budujesz przy użyciu pełnych włókien, odetnij jeden koniec włókna, jak opisano powyżej. Użyj wcześniej wykonanego narzędzia z włókna węglowego i przytrzymaj wolny koniec włókna, które właśnie zostało przecięte. Za pomocą igły odetnij drugi koniec włókna od kasety.
   8. Podnieś włókno węglowe za pomocą wcześniej wykonanego narzędzia z włókna węglowego. Podnieś włókno tak, aby jeden koniec miał około 1 cm długości od narzędzia.
   9. Użyj narzędzia z włókna węglowego z dołączonym włóknem i przełóż krótszy koniec włókna przez lejek ze środkowej miski przyrządu. Użyj mikroskopu do wizualizacji.
      1. Kontynuuj podawanie włókna przez lejek jigowy, aż większość długości włókna zostanie przeprowadzona (patrz Rysunek 3A).
      2. Przeprowadź tylną część włókna przez dostępny kanał za pomocą wcześniej wykonanego narzędzia z włókna węglowego. Przełóż włókno przez plecy, aż około 5 mm włókna wystanie z tyłu. W razie potrzeby przyciąć na wymiar (patrz Rysunek 3B).
         UWAGA: Nie wprowadzaj włókien do kanałów, w których znajdują się metalowe druty.
   10. Wypełnij pozostałe kanały włóknami po jednej stronie przyrządu, postępując zgodnie ze wskazówkami podanymi powyżej.
       UWAGA: Podczas podawania włókien do lejka, podawaj połowę włókien do każdego podziału lejka, przy czym prawa połowa kanałów znajduje się w prawej części, a lewa połowa kanałów w lewej części. Gdy włókna są w bliskim kontakcie w lejku, występuje niekorzystne tarcie między włóknami, które prowadzi do tego, że istniejące włókna są albo luźne, albo pękane podczas podawania nowych włókien do przyrządu. Ten podział na cztery sekcje zapewnia pewną ulgę, ponieważ włókna są trzymane w mniejszych wiązkach do późniejszego etapu.
   11. Użyj standardowej zapalniczki z kołem zapłonowym i szybko przełóż płomień przez odsłonięte włókna na końcu złącza. Upewnij się, że izolacja wszystkich włókien została usunięta na końcach (patrz Rysunek 3C).
       UWAGA: Część włókien, która została wystawiona na działanie płomienia, powinna wydawać się nieco cieńsza niż reszta włókna.
   12. Przeprowadź płomieniowane włókno przez przyrząd tak, aby część włókna wystawiona na działanie płomienia znajdowała się teraz w kanale. Upewnij się, że żadne włókna nie wystają z tyłu przyrządu (patrz Rysunek 3D).
       UWAGA: Użyj narzędzia z włókna węglowego, aby chwycić włókno z wnętrza miski i przeciągnąć płomieniowane włókno przez przyrząd. Nie dotykaj części włókien wystawionej na działanie płomienia, ponieważ ta część jest bardziej delikatna.
   13. Nałóż cement dentystyczny utwardzany promieniami UV na włókna w misce przyrządu. Napełnij całą miskę, aby zakryć otwory kanałów i otwór lejka (patrz Rysunek 3E).
       1. Użyj światła UV i utwardź cement dentystyczny przez 20 s. Utwardź przez dodatkowe 20 s, jeśli cement dentystyczny nie jest całkowicie utwardzony.
          UWAGA: Upewnij się, że cement dentystyczny nie przemieszcza się wewnątrz kanałów.
   14. Wyjmij przyrząd z imadła, odwróć go i zabezpiecz przyrząd w imadle zgodnie z wcześniejszymi zabezpieczeniami. Upewnij się, że strona zawierająca włókna jest teraz skierowana w dół.
   15. Wypełnij pustą stronę przyrządu włóknami węglowymi dokładnie tak, jak opisano powyżej.
   16. Gdy wszystkie kanały mają włókna, a włókna są zabezpieczone cementem dentystycznym, wyjmij przyrząd z imadła i ustaw go tak, aby lejek był skierowany w dół. Zamocuj przyrząd w imadle tak, aby koniec złącza był skierowany do góry.
   17. Weź igłę 25 G z ostrą końcówką, strzykawkę o pojemności 1 ml, srebrną farbę przewodzącą, aplikatory z bawełnianą końcówką, rozcieńczalnik do farb, chusteczki higieniczne i odpowiedni łącznik do sceny czołowej.
       UWAGA: Upewnij się, że farba przewodząca srebro jest dobrze wymieszana i jest jednorodnym roztworem. Nie pozwól, aby farba wyschła.
   18. Pobrać 0,3 ml srebrnej farby do strzykawki o pojemności 1 ml, a następnie założyć ostro zakończoną igłę 25 G.
   19. Ostrożnie włóż igłę do jednego kanału, aż zostanie zatrzymana przez cement dentystyczny. Powoli wciskaj strzykawkę, jednocześnie wyjmując igłę z kanału, aby wypełnić kanał farbą (patrz Rysunek 3E).
   20. Zetrzyj farbę z igły, a następnie przejdź do następnego kanału.
       1. Wypełnij wszystkie kanały farbą.
          UWAGA: Mogą być konieczne dodatkowe przejścia do kanałów, ponieważ farba zastyga w kanałach przez pierwsze kilka minut.
   21. Zanurz aplikator z bawełnianą końcówką w rozcieńczalniku do farb, a następnie oczyść podstawę przyrządu z dowolnej farby na powierzchni. W tym celu może być potrzebnych kilka aplikatorów z bawełnianą końcówką.
       UWAGA: Aplikatory z bawełnianą końcówką, które nie są zanurzone w rozcieńczalniku do farb, mogą być również przydatne do czyszczenia przyrządu.
   22. Włóż złącze headstage we właściwej orientacji, wyrównując styki z kanałami. Upewnij się, że złącze headstage jest osadzone prosto w pozycji pionowej i jest jak najbardziej zlicowane z przyrządem (patrz Rysunek 3F).
   23. Pozostaw przyrząd do utwardzenia przez 24 godziny.
   24. Przymocuj złącze headstage do przyrządu za pomocą cementu dentystycznego utwardzanego promieniami UV, nakładając cement dentystyczny wzdłuż krawędzi, w której łącznik headstage styka się z przyrządem. Utwardzanie UV za pomocą światła UV przez 20 s.

4. Opakowanie z włókna

UWAGA: Wykonanie tego kroku zajmuje około 30 minut. Wykonaj ten krok dla elektrod używanych w modelach zwierzęcych z grubą warstwą pia mater. Wzmocnij wiązkę włókien, aby zminimalizować zginanie. W procedurach myszy ten krok może nie być konieczny.

1. Połącz wiązkę włókien w jednym trzonie za pomocą naprężenia wody. Użyj pipety transferowej, aby przepuścić kroplę wody z końcówki lejka do końcówki wiązki, podczas gdy elektroda jest zamocowana pionowo w imadle.
2. Zacznij od nałożenia warstwy cementu dentystycznego o grubości około 1,5 mm wokół wiązki na końcu lejka. Utwardź cement dentystyczny za pomocą 20 s światła UV.
   UWAGA: W przypadku nagrań korowych nie jest potrzebne dodatkowe pakowanie. W przypadku głębszych obszarów mózgu zabezpiecz rurkę prowadzącą wokół wiązki.
3. Budowa rury prowadzącej i włożenie wiązki do rury prowadzącej
   1. Zmierz i przytnij żądaną długość rurki poliimidowej. Upewnij się, że długość rurki poliamidowej pozostawia wolne 2 mm końcówek z włókna węglowego. Odmierz i wytnij kawałek metalowej rurki o gramaturze 30 G, o 2 mm krótszej niż rurka poliimidowa. Użyj narzędzia obrotowego, aby usunąć wszelkie ostre krawędzie metalowej rurki. Włóż rurkę poliamidową do wnętrza metalowej rurki.
   2. Umieść elektrodę w imadle tak, aby wiązka włókna węglowego była skierowana do góry. Przymocuj zmontowaną rurkę do mikromanipulatora i za pomocą mikroskopu ostrożnie opuść ją na wiązkę włókien. Przymocuj rurkę do istniejącej podstawy z cementu dentystycznego za pomocą dodatkowej warstwy cementu dentystycznego. Utwardź cement dentystyczny za pomocą 20 s światła UV.
      UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać proces budowy.

5. Przygotowanie końcówki elektrody

UWAGA: Wykonanie tego kroku zajmuje około 30 minut na tablicę.

1. Przytnij elektrody na żądaną długość.
   1. Przygotowując się do przecięcia końcówki elektrody, ułóż karteczki samoprzylepne, aby zbudować platformę o wysokości około 1,5 mm. Zmierz od krawędzi platformy żądaną długość elektrody i zaznacz tę odległość. Platforma będzie pełnić funkcję przewodnika do cięcia.
   2. Opuść elektrodę do zlewki z wodą dejonizowaną lub destylowaną, aż końcówka lejka zostanie całkowicie zanurzona, końcówką do przodu i trzymana normalnie do powierzchni. Połącz poszczególne włókna węglowe, wyjmując elektrodę z wody. Napięcie powierzchniowe zbliży wiązkę (wiązki) do siebie. Pozostaw elektrodę do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut.
   3. Przymocuj ostrze skalpela #10 do uchwytu. Zamrozić skalpel i elektrodę, umieszczając je w zamrażarce o temperaturze -18 °C na co najmniej 5 minut.
   4. Ułóż elektrodę tak, aby włókna leżały równo na powierzchni prowadnicy (przygotowanej w kroku 5.1.1). Przytnij włókna na żądaną długość za pomocą skalpela, wykonując ruch toczny. Wykonaj ten krok szybko, aby upewnić się, że elektroda i skalpel są nadal zamrożone (patrz Rysunek 3G).
2. Wstrzyknij prąd dodatni, aby zmniejszyć impedancję końcówek elektrod.
   1. Przymocuj elektrodę do testera impedancji wieloelektrodowej za pomocą odpowiedniego adaptera (patrz Tabela materiałów). Dolna końcówka elektrody ~2 mm do probówki mikrowirówki z 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Włóż przewód uziemiający do probówki mikrowirówki.
   2. Wstrzyknij prąd o wybranej amplitudzie i czasie trwania.
      UWAGA: Ten krok ma na celu zmniejszenie wartości impedancji na końcówce CFEA. W tym badaniu do graficznego interfejsu użytkownika oprogramowania do galwanizacji wprowadzono następujące parametry: Prąd: 0,100 μA; Czas trwania: 10 s; Pauza: 1 s. Proces ten można powtarzać w razie potrzeby, dla każdego kanału, aż impedancje elektrod osiągną pożądane wartości (patrz Rysunek 4C).
   3. Gdy wartości impedancji będą zgodne z oczekiwaniami, opłucz włókna w wodzie dejonizowanej lub destylowanej, aby oczyścić.
3. Galwanizacja w roztworze do złocenia.
   UWAGA: Ten krok należy wykonać na krótko przed implantacją (tego samego dnia).
   UWAGA: Niektóre substancje chemiczne używane do przygotowania końcówek CFEA są, w tym roztwór do złocenia. Przed użyciem należy zapoznać się z kartą charakterystyki i określić odpowiednie środki ostrożności, które należy podjąć, aby bezpiecznie obchodzić się z roztworem.
   UWAGA: Aby zapewnić sztywność wiązki włókien, użytkownik może stworzyć roztwór do złocenia, najpierw rozpuszczając PEG8000 w wodzie dejonizowanej lub destylowanej o stężeniu 1 mg/ml. Następnie połącz 625 μl rozpuszczonego PEG8000 i 375 μl roztworu do złocenia i roztworu wirowego przez 10 sekund do mieszania. PEG8000 rozpuści się po wprowadzeniu włókien do mózgu.
   1. Opuść końcówkę wiązki elektrod ~2 mm do probówki mikrowirówki mieszaniny galwanicznej. Włóż przewód uziemiający do probówki mikrowirówki.
   2. Ustaw odpowiednie parametry do galwanizacji. W tym badaniu do graficznego interfejsu użytkownika oprogramowania do galwanizacji wprowadzono następujące parametry: Prąd: -0,05 μA; Czas trwania: 30 s; Pauza: 5 s.
   3. Dokładnie spłucz włókna wodą dejonizowaną lub destylowaną. W tym momencie ponownie zmierz wartości impedancji, jeśli chcesz.

6. Wprowadzenie do mózgu: Chirurgia przetrwania, mysz (Mus musculus) i chirurgia nieprzeżywalna, fretka (Mustela putorius furo)

UWAGA: Zabiegi chirurgiczne powinny przebiegać zgodnie ze standardowym protokołem zgodnym z IACUC. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz Ma et al.²² dla protokołu operacji przetrwania i Popovic et al.²³ dla protokołu operacji nieprzeżycia. Postępuj zgodnie z aseptycznymi procedurami chirurgicznymi zgodnie z wytycznymi ASC dotyczącymi operacji przeżycia u gatunków gryzoni. Obejmują one autoklawowanie wszystkich narzędzi i materiałów chirurgicznych w temperaturze 135 °C przez 15 minut oraz traktowanie aparatu stereotaktycznego i obszaru operacyjnego 70% etanolem. Podczas zabiegu należy używać sterylnych rękawiczek chirurgicznych, jednorazowego fartucha i maski na twarz.

1. Chirurgia przetrwania, mysz (Mus musculus).
   1. Znieczulaj myszy 2,5% izofluranem w pudełku indukcyjnym przez ~1 min, aż częstość oddechów osiągnie 55-65 oddechów/min. Następnie podaj 2,0% izofluranu przez stożek nosowy, aby utrzymać znieczulenie. Nałóż maść weterynaryjną na oba oczy, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby sprawdzić prawidłowy stopień znieczulenia.
   2. Po weryfikacji postępuj zgodnie z procedurami chirurgii przetrwania opisanymi w Ma et al.²². Monitoruj częstość oddechów i utrzymuj ją na poziomie 60 oddechów/min. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 °C za pomocą termostatycznie sterowanej poduszki grzewczej. Zobacz kroki 6.3-6.5 (szczegółowo opisane poniżej), aby uzyskać instrukcje dotyczące przygotowania czaszki do kraniotomii, durotomii i implantacji elektrod.
   3. Po operacji należy umieścić myszy w klatce regeneracyjnej, wyposażonej w poduszkę grzewczą o temperaturze 37 °C, odizolowanej od innych zwierząt.
   4. Zakryj rany pooperacyjne maścią z antybiotykiem. Monitorować zwierzęta do momentu, aż odzyskają wystarczającą przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą mostka i pozwolić im dojść do siebie przez okres 2-5 dni. Trzymaj je pojedynczo i stale monitoruj pod kątem oznak infekcji lub dyskomfortu. W dniu zabiegu należy podać zwierzętom jedną dawkę buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu przez 72 godziny (0,5-1,0 mg/kg) jako środek przeciwbólowy.
2. Chirurgia nieprzeżywalna, fretka (Mustela putorius furo)
   1. Znieczulić fretkę początkowo ketaminą (20 mg/kg, i.m.), a następnie przewietrzyć 1,0%-2,0% izofluranem w mieszaninie podtlenku azotu i tlenu w proporcji 2:1 przez maskę. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby sprawdzić prawidłowy stopień znieczulenia.
   2. Po weryfikacji postępuj zgodnie z procedurami chirurgicznymi nieprzeżycia opisanymi w Popovic et al.²³. Wykonaj tracheostomię i przewietrz zwierzęta 1,0%-2,0% izofluranu w mieszaninie podtlenku azotu i tlenu w proporcji 2:1. Nałóż maść weterynaryjną na oba oczy, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki.
   3. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 °C za pomocą termostatycznie sterowanej poduszki grzewczej. Monitoruj tętno, końcowo-oddechowy poziom CO₂ i częstość oddechów. Utrzymuj częstość oddechów w odpowiednim zakresie fizjologicznym (3,5%-4,0%). Zobacz kroki 6.3-6.5 (szczegółowo opisane poniżej), aby uzyskać instrukcje dotyczące przygotowania czaszki do kraniotomii, durotomii i implantacji elektrod.
   4. Należy stale monitorować EKG zwierzęcia, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie i zwiększyć procentową zawartość izofluranu, jeśli EKG wskazuje na jakikolwiek niepokój.
   5. Po zakończeniu eksperymentu należy podać fretce 1 ml roztworu pentobarbitalu sodu i fenytoiny sodowej i monitorować do momentu, gdy tętno i CO na końcu oddechu osiągną wartość 0.
3. Przygotowanie czaszki
   1. Za pomocą wiertła 0,8 mm wywierć pojedynczą kraniotomię 4 mm x 4 mm w żądanym miejscu do implantacji. W przypadku myszy wywierć dodatkowy otwór na zadziory w miejscu po przeciwnej stronie do wkręcenia uziemiającej ze stali nierdzewnej.
      UWAGA: Nie wykonuj durotomii, dopóki elektroda nie będzie gotowa do implantacji.
   2. Ustal podstawę/odniesienie. W ostrych eksperymentach z fretkami użyj igły 18 G, aby przebić skórę i warstwę mięśni otaczających czaszkę po stronie głowy zwierzęcia przeciwnej do kraniotomii. Włóż drucianą końcówkę elektrody referencyjnej Ag/Cl do końcówki igły, a następnie wycofaj igłę z mięśnia/skóry, tak aby osad był teraz bezpiecznie osadzony między mięśniem a czaszką. W myszy owiń srebrny przewód uziemiający wokół uziemiającej ze stali nierdzewnej. Zabezpiecz cementem dentystycznym utwardzanym promieniami UV.
   3. Przymocuj elektrodę do uchwytu elektrody za pomocą cienkiego paska taśmy opisowej i przymocuj uchwyt elektrody do mikromanipulatora. Podłącz przewód uziemiający do źródła uziemienia za pomocą zacisku krokodylkowego. Podłącz przewód odniesienia do elektrody referencyjnej osadzonej w mięśniu zwierzęcia.
4. Durotomia i penetracja pia
   1. Usuń oponę twardą z kraniotomii za pomocą szpikulca do opony twardej.
   2. Stwórz małą dziurę w pia. Aby to zrobić, włóż i wyjmij metalową mikroelektrodę (zalecaną we fretce). Alternatywnie, obniż CFEA ortogonalnie do powierzchni mózgu, aby uniknąć unaczynienia. Po ustaleniu tej lokalizacji podnieś elektrodę i delikatnie nacinaj powierzchnię mózgu w tym miejscu kilofem do opony twardej, ciągnąc w górę kilofem (zalecane u myszy).
5. Implantacja elektrod
   1. Opuść końcówkę elektrody w to samo miejsce i w trybie precyzyjnym zacznij wbijać elektrodę do mózgu z szybkością ~2 μm/s. Użyj mikroskopu, aby upewnić się, że elektroda wchodzi płynnie i nie wygina się.
      UWAGA: Jeśli elektroda nie wchodzi płynnie, wyjmij ją z mózgu i ponownie wyreguluj kąt. Jeśli nadal wygina się bez płynnego wchodzenia, dostosuj lokalizację i powtórz proces nacinania powierzchni mózgu w nowym miejscu wejścia.
   2. Wykonaj przewlekłą i ostrą implantację, wykonując następujące kroki.
      1. W przypadku przewlekłej implantacji: Zacementuj elektrodę za pomocą cementu dentystycznego utwardzanego promieniami UV.
         1. Zamknij nacięcie za pomocą szwów chirurgicznych 5-0 i zbuduj główkę.
         2. Aby zbudować nasadkę, dodaj dodatkowy cement dentystyczny wokół miejsca implantu. Upewnij się, że zakrywasz nos przyrządu.
         3. Pociągnij skórę do góry i wokół nasadki. Zszyj nacięcie za nasadką za nasadką za pomocą szwów chirurgicznych 5-0.
         4. Zastosuj krem z lidokainą i maść z antybiotykiem.
         5. Przerwij znieczulenie i postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami rekonwalescencji.
      2. W przypadku ostrej implantacji: Po opuszczeniu elektrody i osiągnięciu żądanej głębokości należy odczekać co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem zapisu elektrofizjologicznego, aby elektroda mogła się ustabilizować.

Wyniki

Wraz z zakończeniem tego protokołu, możliwe będą stabilne zapisy aktywności skokowej pojedynczej jednostki. Te układy mikroelektrod można dostosować pod względem materiału, liczby kanałów i adaptera headstage w zależności od potrzeb badacza. Galwanizacja włókien w kolorze złotym powoduje zmniejszenie impedancji odpowiednich do nagrywania (Rysunek 4 i Rysunek 5). Jeśli użytkownik zamierza nagrywać przewlekle, pomiary można wykonać po powrocie zwierzęcia do zdrowia po zabiegu chirurgicznym. Przewlekłe procedury skutkowały stabilnymi, pojedynczymi zapisami przez co najmniej 120 dni. Reprezentatywne nagranie jest pokazane w Rysunek 6, ilustrujący stabilną 64-kanałową aktywność elektrofizjologiczną w korze zaśledziłowej swobodnie zachowującego się, dorosłego samca myszy. Jeśli planowane jest ostre przygotowanie, zapisy mogą rozpocząć się wkrótce po implantacji (~30 min). Da to czas na osadzenie się elektrody w mózgu. Rysunek 7 przedstawia reprezentatywny przykład ostrego 16-kanałowego zapisu CFEA uzyskanego z pierwszorzędowej kory wzrokowej dorosłej samicy fretki. Sortowanie szczupli u myszy i fretki przeprowadzono za pomocą oprogramowania do sortowania szczupli (patrz Tabela materiałów).

Rysunek 1: Anatomia 16- i 32-kanałowych układów mikroelektrod z włókna węglowego (CFEA). (A) Schematy 32-kanałowych (na górze) i 16-kanałowych (na dole) CFEA z trzech różnych widoków. 16-kanałowy CFEA ma rozszerzoną konstrukcję do celów obsługowych. 32-kanałowa konstrukcja ma płaską powierzchnię, która pozwala na połączenie dwóch przyrządów w 64-kanałowy CFEA. Oba diagramy mają struktury identyfikujące oznaczone wymiarami. Koniec złącza wskazuje miejsce włożenia złącza, a kanały GND/REF wskazują, gdzie włożony jest przewód uziemiający. Miska lejka odnosi się do miejsca, przez które przechodzą włókna, aby pokryć je cementem dentystycznym utwardzanym światłem UV, a końcówka lejka oznacza miejsce, z którego włókna wychodzą z przyrządu. Końcówka lejka jest podzielona na ćwiartki, aby zminimalizować przyleganie włókien do siebie i tworzenie uszkodzeń. Włókna są następnie wciągane w jedną wiązkę za pomocą cementu dentystycznego. Przyrządy są drukowane w 3D przy użyciu drukarek żywicznych SLA. Diagramy są powiększone, aby pokazać szczegóły. b) Skonstruowany CFEA. Diagram ma oznaczone struktury identyfikujące. Niebieska końcówka wiązki reprezentuje segment włókien węglowych, które uzyskują pomiary rejestracyjne. Szary kolor w misce lejka i wokół złącza wskazuje na cement dentystyczny utwardzany światłem UV, który utrzymuje włókna węglowe na miejscu w misce lejka i mocuje łącznik do przyrządu. Fioletowy przewód reprezentuje przewód uziemiający. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Ładowanie surowych włókien węglowych do kaset w celu powlekania parylenem C. (A) Włókna węglowe są ładowane na wkłady pokryte dwoma paskami taśmy dwustronnej (niebieskiej). Każda kaseta jest załadowana ~25 włóknami. (B) Kasety są ładowane do wycinanego laserowo uchwytu (szary) w celu przygotowania do nałożenia parylenu C. Każdy z nich mieści dziesięć kaset. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schemat budowy wiązki mikroelektrod z włókna węglowego (CFEA). (A) 16 pojedynczych, powlekanych włókien węglowych (czarnych) jest przewlekanych przez 32-kanałowy przyrząd wydrukowany w 3D (szary). (B) Końcówki z włókna węglowego są cięte mikronożyczkami, pozostawiając nadmiar włókna równy wysokości podstawy jigowej, wystającej z podstawy jigowej. (C) Standardowa zapalniczka z plastikowym kołem zapłonowym jest szybko przesuwana przez nadmiar włókna w celu usunięcia izolacji parylenu C. Schemat w prawym górnym rogu przedstawia usuwanie parylenu z 9 z 12 włókien. (D) Włókna są ponownie wkładane do przyrządu, aż koniec włókna zrówna się z podstawą. Schemat w prawym górnym rogu pokazuje ponowne wstawienie 9 włókien z nieizolowanymi (szarymi) końcówkami włókien umieszczonymi wewnątrz podstawy przyrządu. Przyrząd jest następnie odwracany, a kroki A-D są powtarzane, aby przegwintować przeciwległe 16 kanałów. (E) Przyrząd jest wypełniony cementem dentystycznym w celu zabezpieczenia włókien. Srebrny nadruk jest wstrzykiwany do każdego dołka podstawy przyrządu. (F) Złącze męskie jest włożone do podstawy przyrządu. G) CFEA i skalpel zamraża się w zamrażarce w temperaturze -20 °C. Końcówka matrycy jest przycinana na żądaną długość, pozostawiając 32 równe włókna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Obróbka końcówki i galwanizacja. (A) Końcówki elektrod są najpierw umieszczane w 0,1 M PBS, gdzie prąd przepływa przez każdą elektrodę. Końcówki są następnie płukane i przenoszone do roztworu do złocenia, gdzie są galwanizowane prądem. (B) Obrazy SEM przygotowanego włókna węglowego pokazują roztwór złocenia skoncentrowany na końcówce. Podziałka odpowiada 4 μm. (C) Wartości impedancji ze 168 kanałów po wstępnym przecięciu (fioletowy; 3,11 MΩ ± 0,42 MΩ, mediana ± SE, n = 168 włókien), wtrysk dodatniego prądu (różowy; 1,23 MΩ ± 0,36 MΩ, mediana ± SE, n = 168 włókien) oraz galwanizacja (pomarańczowy; 0,19 MΩ ± 0,15 MΩ, mediana ± SE, n = 168 włókien) wykazują zmniejszone wartości impedancji po każdym etapie przetwarzania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Umiarkowany czas galwanizacji złotem powoduje powstawanie małych, zaokrąglonych osadów na końcówkach wiązek włókien węglowych. Przedstawione na zdjęciu końcówki z włókna węglowego pochodzą z różnych układów mikroelektrod, odzwierciedlając różne czasy wstrzykywania prądu w celu zmniejszenia impedancji lub pozłacania. Na zdjęciach dodatkowo przedstawiono powłokę parylenu C, która izoluje włókna węglowe i zapobiega pozyskiwaniu sygnału z miejsca innego niż końcówki włókien. (A) Obraz ze skaningowej mikroskopii elektronowej końcówek z włókna węglowego po zamrożeniu i wykonaniu pojedynczego cięcia żyletką. Podziałka skali reprezentuje 10 μm. (B) Taka sama jak A, ale następnie następuje wtrysk dodatniego prądu przez 10 s. (C) Taka sama jak B, ale następnie galwanizowana złotem przez 5 s. (D) Taka sama jak B, ale następnie galwanizowana złotem przez 15 s. (E) Taka sama jak B, ale następnie galwanizowana złotem przez 30 s. (F) Taki sam jak B, ale następnie galwanizowany złotem przez 120 s. Stwierdziliśmy, że galwanizacja przez 30 s przy prądzie -0,05 μA była optymalna dla zapisów elektrofizjologicznych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Przewlekłe nagrania zewnątrzkomórkowe w swobodnie zachowującej się korze zaśledziony myszy z układami mikroelektrod z włókna węglowego wykazują trwałą, stabilną aktywność neuronalną. (A) Jedenaście ścieżek napięcia przepustowego zostało zarejestrowanych jednocześnie. Kolejne ślady zarejestrowane z pierwszego kanału (górny wiersz) są wykreślane w B, aby pokazać trwałość w czasie. Pozostałe dziesięć wierszy pokazuje stałą jakość nagrywania i wykazuje solidną aktywność w całej tablicy. Podziałka liniowa po lewej stronie każdej ścieżki reprezentuje potencjał 200 μV. (B) Dane pasmowo-przepustowe z tego samego włókna, co w górnym śladzie w A, rozszerzone, aby pokazać solidną aktywność w ciągu 120 dni ciągłego zapisu. (C) Grupowanie ujawnia solidną detekcję pojedynczych jednostek na przestrzeni miesięcy. Ślady reprezentują średni przebieg stale obserwowalnej reprezentatywnej pojedynczej jednostki w ciągu 120 dni, wyodrębnionej z włókna wykreślonego w B w każdym punkcie czasowym. (D) Średnie, nieznormalizowane przebiegi szczytowe od C ułożone w stos, aby wykazać spójność w czasie. (E) Nagrania z włókna węglowego wykazują stabilny poziom hałasu przez wiele miesięcy. Odchylenie standardowe poziomu szumu (ślad minus aktywność impulsowa) w B nie wskazuje na postępującą zmianę hałasu. Słupki reprezentują średnie zanieczyszczenie. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. (F) Rysunek w skali myszy z przewlekle wszczepionym CFEA i stopniem głowy. (G) Ślad napięcia surowego (u góry) 11 miesięcy po implantacji wykazuje solidny LFP. Ślad napięcia przepustowego pasma (na dole) pokazuje stałą aktywność neuronalną. (H) Średni przebieg impulsu neuronu zarejestrowany na włóknie z C, podłożony przez pierwsze 1000 przypadków aktywności impulsowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Nagrania z matrycy mikroelektrod z włókna węglowego (CFEA) z pierwszorzędowej kory wzrokowej fretki. (A) Przebiegi pojedynczych jednostek sortowanych przez spajki zarejestrowanych z 16-kanałowego CFEA. Potencjały czynnościowe z pojedynczych neuronów były często widoczne na wielu kanałach przy nieco różnych amplitudach. (B) Krzywe strojenia kierunku z wybranych neuronów. Kolory odpowiadają zarejestrowanym jednostkom w A. Strzałki wskazują kierunek ruchu bodźca. Paski skali wskazują wskaźnik odpowiedzi. Słupki błędów wskazują średnią odpowiedź z błędem standardowym. Pozioma linia przerywana reprezentuje szybkość spontanicznego wyzwalania tej samej komórki podczas ekspozycji na pusty ekran. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Protokół ten opisuje każdy krok niezbędny do skonstruowania funkcjonalnego CFEA zarówno do stosowania ostrego, jak i przewlekłego. Opisany proces można dostosować do potrzeb badacza, co czyni go dostępną i niedrogą opcją monitorowania pojedynczych neuronów przez miesiące. Protokół demonstruje wykonalność rejestrowania zarówno silnej aktywności pojedynczej jednostki w ciągu kilku minut od implantacji u znieczulonego zwierzęcia, jak i przez cztery miesiące u przytomnego, zachowującego się zwierzęcia, ilustrując potencjał tych CFEA do badania krótko- i długoterminowych zmian w odpowiedziach neuronalnych.

Kroki opisanego protokołu zostały dokładnie przetestowane i ulepszone z biegiem czasu, aby uzyskać wydajną procedurę, którą można szybko wykonać, przy niskim koszcie krańcowym (100,00 < USD), z możliwością rejestrowania jednoznacznych pojedynczych jednostek, gęsto i stabilnie przez miesiące. Etapy budowy mogą zostać ukończone w czasie krótszym niż jeden dzień i będą wytwarzać sygnały elektrofizjologiczne, które są porównywalne z każdą wiodącą komercyjną matrycą. CFEA mają również znacznie mniejszą powierzchnię (16-kanałowa wiązka włókien ma średnicę ~26 μm) niż podobne komercyjne matryce, a ich biokompatybilność sprawia, że nadają się do długotrwałego użytkowania¹³. Co ważne, istnieje kilka krytycznych kroków i instrukcji, których należy przestrzegać, aby uzyskać działający CFEA o porównywalnej wydajności.

Ze względu na kruchość włókien węglowych należy obchodzić się z nimi z najwyższą ostrożnością. Obchodzenie się z nimi ostrymi kleszczami lub innymi narzędziami może spowodować pęknięcie włókien. Dodatkowo ważne jest, aby konstruować CFEA w przestrzeni o ograniczonym ruchu powietrza, aby włókna nie zostały zdmuchnięte. Podczas spalania tylnej części włókien, zapalniczkę wystarczy przesunąć ruchem w przód iw tył bardzo krótko, przez około 1 s. Kroki następujące po usunięciu izolacji mają kluczowe znaczenie dla budowy elektrody z kanałami roboczymi. Płomieniowane końcówki należy wprowadzać do przyrządu bez dodatkowego kontaktu. Następnie, podczas napełniania umywalki cementem dentystycznym, ważne jest, aby cement został starannie nałożony i całkowicie wypełnił kanały i umywalkę lejka, zamykając otwory bez ich wypełniania. Przed przystąpieniem do dalszych czynności cement dentystyczny należy całkowicie utwardzić światłem UV. Po zakończeniu srebrną farbę należy wstrzyknąć do każdego kanału, aż do całkowitego wypełnienia, ale nie rozlewania się. Jest to najbardziej zmienny krok w procesie. Każde przepełnienie może spowodować przesłuchy między kanałami, a niewystarczające wypełnienie może spowodować awarię połączenia. Jeśli nie można wstrzyknąć srebrnej farby za pomocą igły 25 G, prawdopodobnie roztwór jest zbyt lepki i w takim przypadku można dodać niewielką ilość rozcieńczalnika do farby, aby uzyskać bardziej płynny roztwór. Po wypełnieniu wszystkich kanałów i włożeniu złącza headstage, ważne jest, aby umożliwić utwardzenie matrycy przez 24 godziny przed zabezpieczeniem złącza cementem dentystycznym. Okazało się, że niezastosowanie się do tego zmniejszyło liczbę podłączonych kanałów. Zastosowanie dużej ilości cementu dentystycznego jest również ważne, aby złącze nie rozłączyło się podczas łączenia z systemem akwizycji sygnału. W przypadku ich odłączenia możliwa jest próba ponownego połączenia z wielokrotnym wypełnieniem kanałów srebrną farbą, ale użytkownik powinien przetestować wartości impedancji CFEA, aby ocenić liczbę podłączonych kanałów. Pozostawienie cementu dentystycznego do utwardzenia przez noc służy również zapobieganiu potencjalnemu oderwaniu.

Pomiar impedancji elektrody zapewni dokładne oszacowanie podłączonych kanałów. Można to zrobić po zanurzeniu przewodów uziemiających i odniesienia oraz końcówek z włókna węglowego w PBS. Zaobserwowaliśmy, że wysoka impedancja (>15 MΩ) wskazuje na otwarty, niepodłączony kanał. Przed wstrzyknięciem prądu i galwanotechniką podłączony kanał może mieć szereg wartości impedancji, które powinny znacznie się zmniejszyć w tym procesie. Średnia liczba podłączonych kanałów (impedancja < 4 MΩ po wstrzyknięciu prądu) przypadająca na elektrodę 16-kanałową wynosiła 12,96 ± 2,74 (średnia ± SD; N = 48 elektrod). Przetestowano szereg czasów galwanizacji, a 30 s zapewniło lepszą izolację sygnału między miejscami nagrywania (ilustracja 5). Chociaż powszechnie wiadomo, że PEDOT-pTS 12,24,25,26 i PEDOT-TFB 21 zapewniają niezawodne opcje przygotowania miejsc zapisu z włókna węglowego, stwierdziliśmy, że powlekanie złotem jest sprawdzoną i niezawodną metodą galwanizacji elektrod do przewlekłej implantacji ^27,28, zwiększyło łatwość implantacji i zapobiegło zbijaniu się końcówek elektrod. Uzyskując końcowe wartości impedancji poniżej średnio poniżej 0,2 MΩ, metoda ta okazuje się porównywalna z wartościami uzyskanymi przy użyciu PEDOT-TFB²¹ i PEDOT-pTS²⁶.

Podczas wszczepiania układu mikroelektrod ważne jest, aby wizualnie śledzić wkładanie końcówek z włókna węglowego pod mikroskopem. Pomyślne włożenie powinno być widoczne, bez zginania włókien. Jeśli włókna wydają się wyginać, jest mało prawdopodobne, że uda im się dostać do mózgu. W takim przypadku kąt sondy należy wyregulować do drugiej próby. Ten proces może być kontynuowany, dopóki włożenie sondy nie powiedzie się. Gdy elektroda znajdzie się na żądanej głębokości, stwierdziliśmy, że odczekanie co najmniej 30 minut pozwoli sondzie ustabilizować się w optymalnym pozyskiwaniu sygnału (ostre nagrania).

Opisywane CFEA, oprócz niewielkich rozmiarów i biokompatybilności, stanowią solidną, konfigurowalną alternatywę dla komercyjnych macierzy ze względu na ich łatwość budowy i niski koszt. Największym ograniczeniem dla CFEA wyszczególnionych w tym protokole jest ich skalowalność. Ze względu na ręczny charakter ich budowy, skalowanie do projektów z setkami miejsc nagrywania może nie być praktyczne. Ponadto postępy w wytwarzaniu matryc mikroelektrod z wykorzystaniem nanotechnologii umożliwią rejestrację populacji na większą skalę niż metody opisane tutaj. Jednak protokół ten zapewnia CFEA dostęp do laboratoriów zainteresowanych produkcją elektrod z włókna węglowego na stołach. Nie zaobserwowaliśmy utraty stabilności ani zmniejszonej odporności amplitudy skoków w czasie trwania 120-dniowych przewlekłych eksperymentów, na co wskazuje reprezentatywny pojedynczy kanał typowy dla naszych obserwacji w tej skali czasowej (Rysunek 6A-E). Dodatkowo, CFEA wykazują zdolność do trwałej aktywności pojedynczej jednostki, ponieważ cztery pojedyncze jednostki pozostały rozpoznawalne 11 miesięcy po implantacji u myszy (Figura 6G, H). Możliwe jest również uzyskanie stabilnych, jednojednostkowych zapisów (ryc. 7), co daje przewagę nad wieloma innymi komercyjnymi elektrodami do badania pojedynczych neuronów w krótkich okresach czasu. W przyszłości opracowanie takich elastycznych, biokompatybilnych sond o minimalnych średnicach umożliwi badanie złożonych procesów. Narzędzia te zapewnią znaczną użyteczność w rozwoju technologii neuronowej, w tym zastosowań w interfejsach mózg-maszyna (BMI), które wymagają ciągłej, długoterminowej stabilności²⁹.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
#10 ostrze skalpela	Fisher Scientific	14-840-15	Narzędzie budowlane
16-kanałowe CFEA Jig Realize	Inc.		Komponent CFMA
16-kanałowe złącze Omnetics	Omnetics	A79014-001	Komponent CFMA
Igła 25 G	Fisher Scientific	14-840-84	Narzędzie budowlane -
igła 30 G	Fisher Scientific	14-841-03	Narzędzie budowlane
31 G Rura okrągła podskórna 304 ze stali nierdzewnej Small	Parts Inc	B000FMYN38	Do rury prowadzącej
32-kanałowy przyrząd CFEA	Realize Inc.		Komponent CFMA
32-kanałowe złącze Omnetics	Omnetics	A79022-001	Komponent CFMA
6 w aplikatorach z końcówką bawełnianą	Fisher Scientific	22-363-156	Narzędzie budowlane
Aceton	Fisher Scientific	A16P4	Narzędzie do budowania
Oprogramowanie do drukowania 3D AutoCad Autodesk			Narzędzie do projektowania wspomaganego komputerowo / oprogramowanie do modelowania 3D
Autodesk Fusion 360	Autodesk		Narzędzie do projektowania wspomaganego komputerowo / oprogramowanie do modelowania 3D
Jednorazowe strzykawki BD	Fisher Scientific	14-823-30	1 mL
Włókna węglowe	Good Fellow USA	C 005725	7 μ
m Kasety i uchwyt			Do powlekania włókien
Przezroczysta taśma	Scotch		Do powlekania surowych włókien
Woda			dejonizowana Komponent galwaniczny
Taśma dwustronna	Scotch		Do powlekania surowych włókien
Płynny kompozyt dentystyczny	Pentron	Flow-It ALC	Komponent CFMA / UV utwardzony cement dentystyczny
Roztwór do złocenia	Sifco ASC	5355	10,0-20,0% glicerol, 1,0-5,0% etylenodiaminy, 1,0-5,0% kwasu octowego (etylenodinitrylo)tetra-, sól dipotasowa kwasu octowego, 5,0-10,0% kwasu butanowego, sól sodowa merkapto-monozłota(1+), 1,0– 5,0% pirosiarczynu potasu, 55,0-82,0% wody
Zacisk jubilerski	Amazon	B00GRABH9K	Narzędzie budowlane
Oprogramowanie do sortowania kolców	JRClust
Zapalniczka	BIC	LCP62DC	Narzędzie budowlane
Mikromanipulator	Scientifica	PS-7000C	Do rurki prowadzącej
Mikronożyczki	Fisher Scientific	08-953-1B	Narzędzie do budowania
MountainSort			Oprogramowanie do sortowania kolców myszy
NanoZ 16-kanałowy adapter	Systemy wielokanałowe	ADPT-nanoZ-NN-16	Komponent galwaniczny
NanoZ 32-kanałowy adapter NanoZ	Biała materia	NZA-OMN-32 rev	A Komponent galwaniczny
Wieloelektrodowy tester impedancji NanoZ	Istota		Komponent
galwanicznyParafilm	Fisher Stockroom	13-374-10	Półprzezroczysta, elastyczna folia o właściwościach adhezyjnych
Parylene 'C'	Dimer Specialty Coating Systems	980130-C-01LBE	Do powlekania włókien surowych
PEG 8000	Fisher Scientific	25322-68-3	Komponent galwaniczny
Sól			Komponent
galwanicznyRurka poliimidowa	MicroLumen	BRAUNI001	Do rurki prowadzącej
Narzędzie obrotowe	Dremel	300124	Do rurki prowadzącej
Rękojeść skalpela	Narzędzia do nauki precyzyjnej	10003-12	Narzędzie budowlane
Srebrna powłoka przewodząca	MG Chemicals	842AR Komponent Super Shield	CFMA
Mikroskop stereoskopowy o zasięgu 6,7:1	Motic	SMZ-168	Budynek narzędzie
Karteczki samoprzylepne	Narzędzie do budowania	karteczek samoprzylepnych
Chusteczki higieniczne	Kimtech Science	34155	Narzędzie
budowlane Drut wolframowy	Systemy AM	797550	Składnik CFMA
Różdżka do utwardzania UV	Dzięcioł		Narzędzie budowlane
Komora do osadzania próżniowego	Specjalistyczne systemy		Labcoter 2 (PDS 2010)