Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ręczne zamrażanie próbek biologicznych metodą blot and plunge do kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

6.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62765

⸱

7 lutego 2022

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt przedstawia metodę ręcznego zamrażania próbek biologicznych do kriogenicznej mikroskopii elektronowej z pojedynczymi cząstkami.

Streszczenie

Obrazowanie próbek biologicznych za pomocą elektronów w celu określenia struktury w wysokiej rozdzielczości za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczej cząstki (cryoEM) wymaga cienkiej warstwy szklistego lodu zawierającego interesujące biomolekuły. Pomimo licznych postępów technologicznych w ostatnich latach, które sprawiły, że krioEM pojedynczych cząstek wysunął się na czoło biologii strukturalnej, metody, za pomocą których próbki są witryfikowane do obrazowania w wysokiej rozdzielczości, często pozostają krokiem ograniczającym szybkość. Chociaż liczne niedawne wysiłki dostarczyły środków do pokonania przeszkód często napotykanych podczas witryfikacji próbek, w tym opracowania nowatorskich nośników próbek i innowacyjnego oprzyrządowania do witryfikacji, tradycyjny ręcznie obsługiwany tłok pozostaje podstawą w społeczności krioEM ze względu na niski koszt zakupu i łatwość obsługi. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe metody użycia standardowego, ręcznie obsługiwanego urządzenia typu gilotyny do witryfikacji próbek biologicznych w celu obrazowania w wysokiej rozdzielczości za pomocą krioEM-u z pojedynczymi cząstkami. Ponadto opisano również często spotykane problemy i zalecenia dotyczące rozwiązywania problemów, gdy standardowy preparat nie daje odpowiedniej próbki.

Wprowadzenie

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa jednocząsteczkowa (cryoEM) to potężna technika strukturalna, która może być używana do rozwiązywania struktur dynamicznych próbek biologicznych do rozdzielczości bliskiej atomowi1,2,3,4. Rzeczywiście, ostatnie postępy w technologiach bezpośrednich detektorów elektronów4,5,6,7,8,9,10, ulepszenia źródeł elektronów4,11,12,13,14, oraz stabilność soczewek elektromagnetycznych15, w połączeniu z ciągłym rozwojem akwizycji danych16,17 i pakiety oprogramowania do analizy18,19, umożliwiły naukowcom rutynowe określanie struktur dobrze zachowujących się próbek z rozdzielczością 3 A lub lepszą4,11,13,14,20,21,22,23. Pomimo tych ulepszonych możliwości obrazowania i przetwarzania danych, przygotowanie siatki krioEM pozostaje największą przeszkodą w pomyślnym określeniu struktury w wysokiej rozdzielczości i często służy jako znaczne wąskie gardło w przepływie pracy EM24,25,26,27.

CryoEM polega na obrazowaniu próbek biologicznych w roztworach wodnych, które są zamrażane w celu utworzenia cienkiej warstwy "szklistego" lodu - proces znany jako witryfikacja - który zachowuje natywny stan biochemiczny. Witryfikacja próbek biologicznych do krioEM sięga ponad 40 lat wstecz28,29,30 a wiele technik i urządzeń, które zostały opracowane dla tego procesu, opiera się na pierwotnie szczegółowej metodzie blot and plunge31,32,33,34,35, przy czym niewielką objętość próbki (np. 1–5 μl) nakłada się na specjalistyczną siatkę elektromagnetyczną przed usunięciem nadmiaru roztworu za pomocą fizycznej interakcji siatki z bibułą. Czas tego procesu jest zwykle określany empirycznie dla każdej próbki, ponieważ krytycznym składnikiem zamrażania próbek jest grubość szklistej warstwy lodu - jeśli lód jest zbyt gruby, jakość obrazowania pogarsza się dramatycznie z powodu zwiększonego rozpraszania wiązki elektronów, podczas gdy lód, który jest zbyt cienki, może ograniczać orientację białek i/lub wykluczać cząstki ze środka otworów foliowych siatki36. To poleganie na idealnej grubości lodu dla krioEM pojedynczych cząstek doprowadziło do powstania szerokiej gamy technik i urządzeń, które mogą zamrażać próbki, w tym robotyki37,38, microfluidics42 oraz urządzenia ultradźwiękowe lub natryskowe27,39,40,41,42,43,44. W ostatnich latach niektóre z najpopularniejszych urządzeń do przygotowywania próbek opierają się na wykorzystaniu robotyki do automatycznego zamrażania próbek przy użyciu techniki blot and plunge 45. Chociaż urządzenia te są zaprojektowane tak, aby w sposób powtarzalny wytwarzać odpowiednią grubość lodu do obrazowania, często pozostają one zbyt drogie dla poszczególnych laboratoriów do zakupu i obsługi i zwykle znajdują się w obiektach krioEM po stawkach godzinowych za użytkowanie. W ostatnich latach pierwotna technika ręcznego blot and plunge powróciła do coraz częstszego użytku3,47,48,49,50,51,52. Rzeczywiście, ręcznie obsługiwane urządzenie do blottingu i zanurzania może osiągnąć wysokiej jakości siatki cryoEM za ułamek kosztów zrobotyzowanych odpowiedników. Co więcej, ręczne blotting oferuje również użytkownikom większą kontrolę nad blottingiem, ponieważ badacze mogą dostosować rodzaj blottingu (tj. back-blotting siatki, front-blotting siatki itp.) oraz czas blottingu w oparciu o każdą pojedynczą próbkę i pytania badawcze.

W tym artykule szczegółowo opisujemy, jak skutecznie zamrażać próbki biologiczne za pomocą tradycyjnego ręcznego urządzenia do witryfikacji metodą blot and plunge w połączeniu z specjalnie zaprojektowaną platformą Dewara53. Podano najlepsze praktyki, w tym przygotowanie kriogenu, obsługę siatki, nakładanie próbek i blotting, a także typowe pułapki i zalecenia dotyczące pokonywania tych przeszkód. Omówiono porady dotyczące zwiększania odtwarzalności grubości lodu między preparatami siatkowymi oraz modyfikowania blottingu próbki w zależności od typu próbki biologicznej. Biorąc pod uwagę niskie koszty związane z zakupem i eksploatacją ręcznego tłoka opisanego w tym manuskrypcie, laboratoria na całym świecie mogą przygotować próbki biologiczne do krioEM w opłacalny i powtarzalny sposób.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotuj środowisko ręcznego zanurzania

UWAGA: Szacowany czas pracy: 5-30 minut

  1. Umieść ręczny tłok w chłodni o temperaturze 4 °C, w której można umieścić nawilżacz, aby utrzymać wilgotność względną w pomieszczeniu zbliżoną do 100% (RH) (Rysunek 1A).
    UWAGA: Proszę zapoznać się z wytycznymi instytucji dotyczącymi ochrony środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, aby uzyskać informacje na temat bezpiecznej lokalizacji tłoka ręcznego i zalecanych operacji.
  2. Przed przygotowaniem kratki włącz nawilżacz w chłodni, aby upewnić się, że wilgotność względna komory chłodni wynosi ≥ 95%.
    UWAGA: Przygotowanie siatki w niskiej wilgotności może spowodować odwodnienie cienkich warstw, zmianę składników bufora w wyniku parowania oraz zmniejszenie odtwarzalności między siatkami46. Nie zaleca się zamrażania rusztów przy wilgotności względnej <80
    3. %.
  3. Upewnij się, że temperatura w chłodni wynosi 4 °C.
  4. Umieść tłok ręczny z dala od silnych prądów powietrza (tj. z dala od otworów wentylacyjnych klimatyzatora), ponieważ mogą one prowadzić do turbulencji w pobliżu kratek i/lub wyraźnego gromadzenia się lodu na zimnych powierzchniach.

2. Przygotuj materiały i akcesoria do nurkowania

UWAGA: Szacowany czas pracy: 1-5 minut

  1. Użyj czystych nożyczek, aby pociąć kółka bibuły na paski o szerokości 1-1,5 cm i długości ~9 cm. Unikaj dotykania środka bibuły i wyrzuć mniejsze końcówki. Ważne jest, aby upewnić się, że paski bibuły są suche, czyste i wolne od zanieczyszczeń. Oddziel paski i umieść je na szalce Petriego o średnicy 100 mm.
  2. Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach kwadratowych 22x22 mm w osobnej szklanej szalce Petriego o średnicy 60 mm. Ta szklana szalka Petriego zawierająca szkiełko nakrywkowe będzie używana do przechowywania, przenoszenia i wyładowywania jarzeniowego.
    UWAGA: Zaleca się użycie puszki do kurzu w celu usunięcia wszelkich widocznych zanieczyszczeń ze zjeżdżalni przed dodaniem kratek. Pistolet antystatyczny może być również używany do usuwania nagromadzonej elektryczności statycznej.
  3. Zmontuj i oznacz pudełka do przechowywania siatki.
  4. Zaopatrz się w 4 do 6 czystych i suchych pęset zaciskowych i umieść je w ręcznym tłoku. Sprawdź wzrokowo każdą pęsetę przed zanurzeniem, aby upewnić się, że nie są uszkodzone i są wolne od zanieczyszczeń.

3. Przygotuj dewara kriogenu i ręczny tłok

UWAGA: Szacowany czas pracy: 5-15 minut

  1. Zamontuj podstawę platformy na dole zanurzającego się dewara. Umieść naczynie dewara z etanem na podstawie platformy, dodaj mosiężne naczynie na etan, a następnie zainstaluj platformę do przechowywania siatki obrotowej.
    1. Po dodaniu ciekłego azotu (LN2) do zagłębiającego dewara nie można już regulować wysokości podstawy platformy. Upewnij się, że podstawa kratki jest prawidłowo zainstalowana i wypoziomowana, aby ograniczyć uszkodzenie siatki i/lub pęsety z powodu niewłaściwej wysokości tłoka.
  2. Przed zamrożeniem należy sprawdzić ręczny tłok i wszystkie urządzenia pomocnicze, aby upewnić się, że działają prawidłowo, aby ograniczyć straty próbki i/lub siatki.
  3. Przed każdą sesją zamrażania należy wymienić taśmę na ręcznym ramieniu tłoka używanym do przytrzymywania pęsety. Wysoka wilgotność w pomieszczeniu może uszkodzić klej taśmowy i zmniejszyć zdolność taśmy do trzymania pęsety, zwiększając prawdopodobieństwo uszkodzenia pęsety i/lub utraty siatki.
  4. Wyreguluj lamp(y) w pobliżu tłoka ręcznego, aby upewnić się, że jest wystarczająca ilość światła do monitorowania odprowadzania próbki i zapewnić łatwą wizualizację transferu siatki, aby zapobiec uszkodzeniu i/lub utracie siatki (patrz krok 3.7). Użyj lampy pierścieniowej bezpośrednio za tłokiem, aby uwidocznić ruch cieczy, oraz lampy roboczej z elastycznym ramieniem w pobliżu dewara, aby oświetlić zamrożone siatki.
  5. Wyreguluj napięcie pedału nożnego, aby upewnić się, że ramię wgłębne Dewara jest bezpiecznie utrzymywane na miejscu, gdy znajduje się w pozycji podniesionej i jest całkowicie zwolnione, gdy pedał jest wciśnięty. Wykonaj kilka "suchych" przebiegów przed nałożeniem próbki, aby upewnić się, że tłok działa prawidłowo.
    UWAGA: Niewłaściwa regulacja napięcia pedału nożnego spowoduje przedwczesne zwolnienie ramienia wgłębnego (tj. naprężenie jest ustawione zbyt nisko) i utratę siatki lub niepełne zanurzenie siatki w zbiorniku etanu (tj. naprężenie jest ustawione zbyt wysoko).
  6. Umieść zanurzający się dewar u podstawy tłoka ręcznego bezpośrednio pod ramieniem wgłębnym i zabezpiecz go na miejscu. Przymocuj pęsetę do ramienia wgłębnego za pomocą dołączonej taśmy. Trzymając ręczne ramię wgłębne, naciśnij pedał nożny, aby ostrożnie opuścić ramię wgłębne i wyreguluj skok ramienia wgłębnego, aby upewnić się, że kratka znajdzie się pośrodku naczynia z etanem.
  7. Użyj ogranicznika uderzeniowego w górnej części ramienia wgłębnego, aby określić ostateczną pozycję ramienia zanurzającego, gdy pedał nożny jest całkowicie wciśnięty (Rysunek 1B). Dostosuj wysokość odbojnika na ramieniu wgłębnym, aby dostosować położenie kratki w zbiorniku na etan (Rysunek 1C).
    UWAGA: Nieprawidłowe ustawienie wysokości ramienia zanurzającego może prowadzić do uszkodzenia siatki i/lub pęsety (np. wysokość ramienia zanurzającego jest ustawiona zbyt nisko) lub nieodpowiedniej witryfikacji (np. wysokość ramienia zanurzającego jest ustawiona zbyt wysoko).
  8. Umieść dewara poza chłodnią i przystąp do przygotowania ciekłego etanu (krok 4).

4. Przygotuj kriogen

UWAGA: Szacowany czas pracy: 10-30 minut

  1. Oceń zbiornik etanu, regulator, rurki i końcówkę dozującą etan pod kątem oznak uszkodzenia. Przed kontynuowaniem należy natychmiast zgłosić i usunąć wszelkie oznaki uszkodzeń.
    UWAGA: Sprężony etan i mieszaniny etanu: propanu są łatwopalne i mogą stanowić poważne zagrożenie dla życia i/lub spowodować obrażenia w przypadku niewłaściwego obchodzenia się z nimi. Skonsultuj się z ekspertem, jeśli nie masz pewności, jak obsługiwać lub obchodzić się ze zbiornikami sprężonego gazu. Podczas obchodzenia się z łatwopalnymi sprężonymi gazami należy zapoznać się z wytycznymi instytucji dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego. Ponadto skroplony etan jest silnym kriogenem, który może stanowić poważne zagrożenie dla życia i/lub obrażeń, jeśli nie jest odpowiednio traktowany. Podczas obchodzenia się z kriogenicznymi roślinami należy zapoznać się z wytycznymi instytucji dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego.
  2. Zaopatrz się w wystarczającą ilość LN2 w odpowiednim dewarze do obsługi LN2 (tj. 3-4 l jest typowe dla przygotowania i magazynowania siatki).
    UWAGA: LN2 jest kriogenem, który może stanowić poważne zagrożenie dla życia i/lub obrażeń, jeśli nie jest odpowiednio obsługiwany.
    1. Upewnij się, że wszystkie środki ochrony osobistej są używane, aby zminimalizować ryzyko obrażeń. Opary LN2 są środkiem duszącym i należy się z nimi obchodzić w dobrze wentylowanych pomieszczeniach. Skonsultuj się z ekspertem, jeśli nie masz pewności, jak obsługiwać lub obchodzić się ze zbiornikami kriogenicznymi i kriogenicznymi. Podczas obchodzenia się z kriogenicznymi roślinami należy zapoznać się z wytycznymi instytucji dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego. W sytuacjach, w których nie można użyć ciekłego azotu w chłodni, zalecamy zamrażanie wgłębne w chłodnym i dobrze wentylowanym pomieszczeniu.
  3. Na zewnątrz chłodni schłodzić zanurzający się dewar, wlewając LN2 bezpośrednio do mosiężnego naczynia na etan, aż poziom ciekłego azotu osiągnie górną część naczynia etanowego (tj. tuż nad platformą). W razie potrzeby uzupełnić LN2 na zewnątrz zbiornika na etan. Przejdź do następnego kroku, gdy LN2 przestanie gwałtownie bulgotać (około 5 minut).
    1. Dodać LN2 bezpośrednio do mosiężnego naczynia na etan, aby wystarczająco schłodzić naczynie przed kondensacją gazowego etanu. Brak odpowiedniego chłodzenia mosiężnego naczynia z etanem znacznie wydłuży czas potrzebny do skroplenia etanu.
    2. Gdy dewar osiągnie temperaturę LN2, unikaj przepełniania dewara, aby LN2 rozlał się do naczynia etanu.
  4. Etan występuje w postaci sprężonego gazu i przed użyciem musi zostać skroplony. Zbiornik etanu wykorzystuje dwustopniowy regulator o wysokiej czystości do kontrolowania przepływu gazu. Podłącz rurkę do zaworu wylotowego regulatora i użyj płaskiej metalowej końcówki dozującej o średnicy 14 por. podłączonej na końcu do dozowania etanu.
  5. Przed otwarciem zaworu głównego zbiornika etanu upewnij się, że pokrętło regulacji ciśnienia i zawór wylotowy są całkowicie zamknięte. Całkowicie otwórz główny zawór zbiornika, a następnie otwórz zawór wylotowy do ~50%. Powoli otwieraj pokrętło regulacji ciśnienia, aż zaobserwujesz powolny przepływ gazu. Użyj zaworu wylotowego, aby precyzyjnie dostroić przepływ gazu.
    UWAGA: Zawsze kieruj metalową końcówkę dozującą z dala od siebie podczas otwierania zaworów lub dokonywania regulacji przepływu gazu.
  6. Powoli rozpocznij przepływ gazu i oceń natężenie przepływu, wkładając końcówkę przewodu gazowego etanu do małej zlewki z wodą dejonizowaną. Dostosuj przepływ gazu, aż natężenie przepływu umiarkowanie zakłóci wodę.
    1. Dostosuj natężenie przepływu gazu, aby zapewnić prawidłową kondensację etanu - zbyt wolne natężenie przepływu spowoduje zestalenie się etanu w końcówce dozującej, a zbyt szybkie natężenie przepływu spowoduje intensywne bulgotanie i zapobiegnie zamarzaniu.
  7. Przed włożeniem końcówki przewodu gazowego etanu do mosiężnego naczynia z etanem wyczyść i wytrzyj końcówkę dozującą delikatnymi chusteczkami roboczymi, aby usunąć wodę.
  8. Płynnym i szybkim ruchem zlokalizuj końcówkę dozującą gaz na dnie mosiężnego naczynia z etanem i zacznij przesuwać końcówkę dozującą w powolnym okręgu po dnie naczynia na etan. Stały etan tworzy się natychmiast, ale szybko skrapla się w miarę dodawania/kondensacji większej ilości etanu.
    1. Kontynuuj przesuwanie metalowej końcówki dozującej etan na dnie naczynia na etan, aby skroplić stały etan. Napełnij naczynie etanu do 3/4 objętości ciekłym etanem (2-3 nitki od góry). Zatrzymaj przepływ etanu, ostrożnie wyjmując metalową końcówkę dozującą etan z mosiężnego naczynia na etan i zamykając zawór wylotowy.
  9. Uzupełnij zanurzający się dewar LN2 delikatnie wylewając na bok dewara, aby uniknąć dodawania LN2 do mosiężnego naczynia etanu, aż poziom cieczy dotknie mosiężnego naczynia etanu. Umieść piankową pokrywkę na zanurzającym się dewarze, aby ułatwić zestalanie etanu.
    1. LN2 musi mieć bezpośredni kontakt z mosiężnym naczyniem na etan, aby pomóc w krzepnięciu etanu. Po około 5 minutach etan w mosiężnym naczyniu stanie się całkowicie zamrożony. Dodaj więcej LN2, aż dotknie naczynia z etanem i przejdź do następnego kroku.
  10. Jeśli etan nie zamarzł w stanie stałym, oznacza to, że mosiężne naczynie z etanem nie jest wystarczająco zimne dla pozostałych etapów. Dodaj więcej LN2, aż dotknie naczynia z etanem i odczekaj dodatkowe 5 minut. Upewnij się, że etan w mosiężnym naczyniu jest całkowicie zamrożony.
  11. Otwórz zawór wylotowy gazu, aby wytworzyć przepływ etanu z podobną szybkością, jak określono w kroku 4.6. Umieść pionowo metalową końcówkę dozującą etan w stałym etanie i kontynuuj przesuwanie końcówki dozującej etan ruchem okrężnym, aby stopić stały etan.
    1. Kontynuuj dodawanie etanu, aż zrówna się z górną częścią mosiężnego naczynia z etanem. Powoli wyjmij końcówkę z naczynia na etan i zamknij zawór wylotowy zbiornika etanu. Przykryj dewara pokrywką na ~ 1-4 minuty, aby etan zestalał się wokół krawędzi mosiężnego naczynia z etanem.
      UWAGA: Idealny zbiornik na etan będzie miał symetryczny pierścień stałego etanu o średnicy 2-3 mm na obwodzie mosiężnego naczynia z etanem z ciekłym etanem pośrodku (Rysunek 1D i Rysunek 2).
    2. Upewnij się, że etan jest tak zimny, jak to możliwe, bez krzepnięcia, aby zapewnić prawidłowe zeszklenie próbki biologicznej. Niewłaściwe przygotowanie ciekłego etanu może skutkować nieodpowiednią zeszkleniem próbki, nagromadzeniem lodu i/lub utratą próbki, co przyczynia się do pogorszenia jakości próbki do obrazowania.
    3. Jeśli po 2-3 minutach nie utworzy się stały pierścień etanu, dodaj więcej LN2 do dewara i przykryj na 2-5 minut.
    4. Jeśli etan krzepnie zbyt szybko, użyj dużej pary czystych pęset, aby delikatnie ogrzać naczynie z etanem i/lub stały etan, aby zapobiec całkowitemu zestaleniu etanu. Gdy etan i LN2 ustabilizują się, zamknij wszystkie zawory zbiornika etanu i zlokalizuj zanurzający się dewar do ręcznego tłoka. Przymocuj zanurzający dewar do tłoka ręcznego.
      UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność podczas przenoszenia dewara, ponieważ LN2 może rozlać się do naczynia z etanem i zestalić ciekły etan. W razie potrzeby można użyć czystego zestawu pęsety do stopienia dowolnego stałego etanu w środku naczynia.
  12. Przetestuj położenie etanu dewara za pomocą pustej pęsety, aby upewnić się, że końcówka pęsety znajduje się w środku naczynia z etanem i jest wystarczająco dużo miejsca na siatkę i końcówkę pęsety wewnątrz ciekłego etanu (Rysunek 1D).
    1. Jeśli pierścień z stałego etanu jest zbyt gruby, aby można go było łatwo przenosić za pomocą siatki, użyj pęsety do czyszczenia w temperaturze pokojowej, aby stopić stały etan i stworzyć większą powierzchnię zamarzania w środku naczynia z etanem.

5. Przygotuj siatki EM

UWAGA: Szacowany czas pracy: 1-5 minut

  1. Dodaj skrzynkę (skrzynki) do schowka siatkowego do dewara, odkręć pokrywę (pokrywy) schowka siatkowego i upewnij się, że każda pokrywa może się swobodnie obracać do nowego gniazda siatki.
  2. Ostrożnie przenieś siatki ze skrzynki do przechowywania siatki na krawędź kwadratowego szklanego szkiełka nakrywkowego, tak aby ~30-40% siatki odsunęło się od krawędzi szkiełka. Upewnij się, że folia kratowa jest skierowana do góry. Upewnij się, że kratki są zakryte, gdy nie są używane. Umieszczenie kratek nad krawędzią kwadratowego szklanego szkiełka nakrywkowego zapewnia łatwość obsługi siatki i zmniejsza ryzyko zgięcia lub uszkodzenia siatki podczas przenoszenia.
    UWAGA: Zazwyczaj przygotowuje się 4-6 siatek na raz.
  3. Renderuj siatki hydrofilowe za pomocą wyładowarki żarowej lub myjki plazmowej.
    UWAGA: Proszę zapoznać się z zalecanymi wytycznymi dotyczącymi czyszczenia siatki dostarczonymi przez producenta wyładowcy żarowego/odkurzacza plazmowego.
    1. Kratki należy zużyć w ciągu 10 minut od czyszczenia plazmowego, ponieważ kratki tracą hydrofilowość, a odtwarzalność między kratkami spada po tym czasie.

6. Przygotuj próbkę cryoEM przez zamrażanie wgłębne

UWAGA: Szacowany czas pracy: >10 minut (~1-3 minuty na siatkę)

  1. Użyj czystej i suchej pęsety zaciskowej, aby podnieść oczyszczoną siatkę, przesuń plastikowy zacisk w dół, aby zamocować siatkę na miejscu, i delikatnie postukaj pęsetą, aby upewnić się, że siatka jest odpowiednio zabezpieczona.
    1. Chwytaj kratki za pierścień zewnętrzny, aby zapobiec uszkodzeniu folii siatki.
  2. Nanieść od 1 do 5 μl próbki na przygotowaną stronę (np. przednią lub foliową) siatki.
    UWAGA: Optymalna objętość i czas blottingu zależą od próbki i muszą być zoptymalizowane dla każdej próbki; Większe objętości i bardziej lepkie próbki wymagają dłuższego czasu osuszania.
  3. Przymocuj zespół pęsety-siatki-próbki do ręcznego ramienia zanurzającego, owijając taśmę wokół uchwytu pęsety.
    1. Skierować próbkę w stronę użytkownika w celu tradycyjnego osuszania przedniego. Jeśli próbka wymaga osuszania wstecznego, zlokalizuj ją z dala od użytkownika.
  4. Trzymaj czysty, suchy, pocięty kawałek bibuły między kciukiem a palcem wskazującym każdej ręki.
    1. Z bibułą należy obchodzić się wyłącznie od krawędzi i nigdy nie dotykać środka, ponieważ oleje i inne zanieczyszczenia z rąk/rękawiczek mogą pogorszyć jakość siatki.
  5. Oprzyj ręce na krawędzi zanurzającego się dewara, aby ustalić stabilną pozycję. Umieść bibułę równolegle do powierzchni siatki w odległości około 1 cm od powierzchni siatki.
    1. Użyj środkowej części bibuły, aby zapewnić pełną mobilność płynów i równomierne odprowadzanie wilgoci po powierzchni siatki.
  6. Delikatnie przesuń i obróć kciuk i palec serdeczny do siebie, aby zgiąć bibułę w kierunku siatki i zainicjować bibułę. Utrzymuj kontakt między bibułą a powierzchnią siatki podczas całego procesu bibuły.
    1. Bezpośrednio stykaj bibułę z powierzchnią siatki i utrzymuj stały kontakt na powierzchni siatki.
    2. Delikatne zginanie bibuły zmniejsza wyginanie się siatki i/lub uszkodzenie powierzchni siatki, a także skutkuje bardziej jednolitym lodem na siatce (Rysunek 3A).
  7. Obserwuj ruchomy czoło płynu, a gdy przestanie on wchodzić w bibułę, zacznij liczyć przez 4 do 6 sekund.
    UWAGA: Liczenie może nastąpić, gdy bibuła zetknie się z powierzchnią siatki, ale może wystąpić mniejsza odtwarzalność między siatkami. Całkowity czas blot będzie zależał od rodzaju siatki, rodzaju folii, stężenia próbki i rodzaju próbki (np. białka rozpuszczalne w porównaniu z błonowymi lub nitkowatymi). W przypadku próbek o większej lepkości wymagany będzie dłuższy czas osuszania (np. 5 do 7 sekund).
    1. Ważne: Opracuj niezawodny i spójny schemat liczenia, aby znacznie zwiększyć odtwarzalność podczas procesu zamrażania.
  8. Przesuń lewy, prawy kciuk i palec wskazujący w przeciwnych kierunkach, aby usunąć bibułę "ruchem przyciągającym" z powierzchni siatki. Natychmiast naciśnij pedał nożny, aby zwolnić ramię wgłębne i zanurzyć siatkę w ciekłym etanie.
    1. Jednocześnie wyjmij bibułę i naciśnij pedał nożny, aby jak najszybciej zanurzyć siatkę w etanie, aby uzyskać najlepsze wyniki zamrażania. Im dłuższy czas między usunięciem bibuły a zanurzeniem, tym bardziej nastąpi odparowanie cienkich warstw i zmniejszy się odtwarzalność między siatkami.
  9. Jedną ręką ustabilizowaj pęsetę zaciskową, ostrożnie odwiń taśmę z okolic pęsety i ręcznego ramienia wgłębnego.
    1. Zawsze utrzymuj kontakt z pęsetą, aby zapobiec przesuwaniu się siatki pęsety i ograniczyć uszkodzenia siatki, które mogą wystąpić w wyniku uderzenia siatki o stały etan.
  10. Gdy pęseta zaciskowa zostanie uwolniona z ręcznego ramienia wgłębnego, trzymaj pęsetę w jednej ręce spoczywającej na wierzchu zanurzającego się dewara, upewnij się, że siatka pozostaje w ciekłym etanie. Ostrożnie zsuń plastikowy zacisk z dala od siatki, aby siatka mogła zostać przeniesiona. Utrzymuj nacisk na pęsetę, aby utrzymać siatkę.
    1. Jednym szybkim ruchem szybko przenieś siatkę ze zbiornika etanu do zbiornika LN2. Ostrożnie umieść siatkę w skrzynce do przechowywania siatki.
      UWAGA: Część etanu może zestalać się na powierzchni siatki. Lekkie otwarcie pęsety spowoduje rozbicie etanu i pozwoli na upuszczenie siatki do skrzynki z siatką.
  11. Owiń końcówkę pęsety delikatną chusteczką zadaniową, aby zapobiec gromadzeniu się szronu. Odstawić, aż pęseta powróci do temperatury pokojowej.
    1. Miej pod ręką od 4 do 6 pęset, aby ułatwić użycie. Każda pęseta będzie używana do zamrażania próbek i podgrzewana przed kolejnym użyciem.
  12. Powtórz kroki 6.1-6.11 dla każdej siatki.
  13. Po osiągnięciu punktu kulminacyjnego zamrażania bezpiecznie zamknij skrzynkę kratową i przenieś do odpowiedniego miejsca przechowywania.
  14. Ostrożnie zutylizować ciekły etan i LN2 i przechowywać wszystkie materiały w suchym miejscu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Prawidłowe wykonanie opisanego tutaj protokołu blot-and-plunge pozwoli na uzyskanie cienkiej, jednorodnej warstwy lodu witryfikowanego, wolnej od lodu heksagonalnego, zanieczyszczeń oraz dużych gradientów lodu nieprzydatnego do analizy, co można zaobserwować pod mikroskopem elektronowym (Rycina 3). Niestabilny kontakt papieru odsączającego z powierzchnią siatki, zbyt wczesne usunięcie papieru lub jego przesuwanie podczas kontaktu z siatką mogą obniżyć jakość lodu witryfikowanego i prowadzić ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Witryfikacja próbek biologicznych do obrazowania za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek (cryoEM) pozostaje niezwykle ważnym krokiem w skutecznym określeniu struktury. Opisana w niniejszym protokole ręczna metoda blot and plunge stanowi opłacalną, niezawodną i solidną metodę szybkiego zamrażania próbek biologicznych w cienkich warstwach lodu szklistego do obrazowania krioEM. Korzystając z metod opisanych w manuskrypcie, naukowcy będą w stanie zmontować i obsługiwać ręczny tłok, przygotować k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy członkom laboratorium Herzik za krytyczne myślenie i dostarczenie opinii na temat tego manuskryptu i treści wideo. M.A.H.Jr. jest wspierany przez NIH R35 GM138206 oraz jako stypendysta Searle. H.P.M.N jest wspierany przez Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326). Chcielibyśmy również podziękować Billowi Andersonowi, Charlesowi Bowmanowi i dr Gabrielowi Landerowi z Instytutu Badawczego Scripps za pomoc w zaprojektowaniu, montażu i przetestowaniu ręcznego tłoka pokazanego na filmie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-szczelinowy schowek siatkowyTed Pella160-40
Płaska metalowa końcówka dozująca o grubości 14 AmazonB07M7YWWLT
22x22 mm kwadratowa szklana szkiełko nakrywkoweSigmaC9802-1PAK
60 mm szklana szalka Petriego do przechowywania siatekFisher08-747A Szklana
szalka Petriego 100 mm do przechowywania papieru WhatmanFisher08-747D
Szklana szalka Petriego 150 mm do przechowywania papieru WhatmanFisher08-747F
Zlewka 250 mlFisher02-555-25B
Niebieski styropian dewarSpear LabFD-500
Mosiężne naczynie etanoweLasco17-4075
Pęseta zaciskowaTed Pella38825
Delikatne chusteczki do zadańFisher06-666
Dwustopniowy regulator z zaworem sterującymAirgasY12N245D580-AG
Podstawa kratki DewerUCSD
Platforma etanuUCSD
Zbiornik na etanPraxairET PR50ZU-Getan (50%) : propan (50%) w zbiorniku wysokociśnieniowym
Zbiornik etanuPraxairUN1035etan (100%)
Elastyczna lampa robocza ramieniaAmscopeLED-11CR
Siatki (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)Mikroskopia elektronowa SciencesQ325AR1.3
NawilżaczTarget719438
HigrometrThermoProB01H1R0K68
Fartuchlaboratoryjny UCSD
Ciekły azot dewarWorthingtonLD4
Rękawice z ciekłym azotemFisher19-059-925
Ręczny stojak na tłok (stojak + pedał nożny)UCSD
Mark 5 (platforma wgłębna)UCSD
Rękawice nitrylowePipeta VWR82026-424
P20Eppendorf13-690-029
Probówki do PCREppendorf
Końcówki do pipetibis scientific63300005
Lampa pierścieniowaAmazonB07HMR4H8G
Okulary ochronneUCSD
NożyczkiAmazonFiskars 01-004761J
ŚrubokrętIronside354711
TapeFisher15-901-10R
Pęseta do skrzynki transferowejAmazonLTS-3
Rurka TygonFisher14-171-130
Bibuła WhatmanFisher1001-090
E0030124286

Bibliografia

  1. Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
  2. Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of the Spliceosome: Structural Insights into a Dynamic Ribonucleoprotein Machine. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (10), 791-799 (2017).
  3. Hirschi, M., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the Lysosomal Calcium-Permeable Channel TRPML3. Nature. 550 (7676), 411-414 (2017).
  4. Nakane, T., et al. Single-Particle Cryo-EM at Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  5. Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of Electron Dose Rate on Electron Counting Images Recorded with the K2 Camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
  6. Campbell, M. G., et al. Movies of Ice-Embedded Particles Enhance Resolution in Electron Cryo-Microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  7. Brilot, A. F., et al. Beam-Induced Motion of Vitrified Specimen on Holey Carbon Film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  8. McMullan, G., et al. Experimental Observation of the Improvement in MTF from Backthinning a CMOS Direct Electron Detector. Ultramicroscopy. 109 (9), 1144-1147 (2009).
  9. Feathers, J. R., Spoth, K. A., Fromme, J. C. Experimental evaluation of super-resolution imaging and magnification choice in single-particle cryo-EM. Journal of Structural Biology: X. 5, 100047(2021).
  10. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: Anisotropic Correction of Beam-Induced Motion for Improved Cryo-Electron Microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  11. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-Resolution Protein Structure Determination by Cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  12. Fislage, M., Shkumatov, A. V., Stroobants, A., Efremov, R. G. Assessing the JEOL CRYO ARM 300 for High-Throughput Automated Single-Particle Cryo-EM in a Multiuser Environment. IUCrJ. 7 (4), 707-718 (2020).
  13. Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving Individual Atoms of Protein Complex by Cryo-Electron Microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
  14. Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-Electron Microscopy Methodology: Current Aspects and Future Directions. Trends in Biochemical Sciences. 44 (10), 837-848 (2019).
  15. Herzik, M. A. Jr Cryo-Electron Microscopy Reaches Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 39-40 (2020).
  16. Cheng, A., et al. Leginon: New Features and Applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
  17. Suloway, C., et al. Automated Molecular Microscopy: The New Leginon System. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  18. de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A Software Framework toward Integration, Reproducibility and Validation in 3D Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  19. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for Rapid Unsupervised Cryo-EM Structure Determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  20. Danev, R., Tegunov, D., Baumeister, W. Using the Volta Phase Plate with Defocus for Cryo-EM Single Particle Analysis. eLife. 6, 23006(2017).
  21. Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with Sub-1 Å Specimen Movement. Science. 370 (6513), 223-226 (2020).
  22. Watson, Z. L., et al. Structure of the Bacterial Ribosome at 2 Å Resolution. eLife. 9, 60482(2020).
  23. Josephs, T. M., et al. Structure and Dynamics of the CGRP Receptor in Apo and Peptide-Bound Forms. Science. 372 (6538), (2021).
  24. Tan, Y. Z., et al. Addressing Preferred Specimen Orientation in Single-Particle Cryo-EM through Tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  25. D'Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein Denaturation at the Air-Water Interface and How to Prevent It. eLife. 8, 42747(2019).
  26. Han, Y., et al. High-Yield Monolayer Graphene Grids for near-Atomic Resolution Cryoelectron Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  27. Dandey, V. P., et al. Time-Resolved Cryo-EM Using Spotiton. Nature Methods. 17 (9), 897-900 (2020).
  28. McDowall, A. W., et al. Electron Microscopy of Frozen Hydrated Sections of Vitreous Ice and Vitrified Biological Samples. Journal of Microscopy. 131 (1), 1-9 (1983).
  29. Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
  30. Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron Microscopy of Frozen-Hydrated Bacteria. Journal of Bacteriology. 155 (1), 381-390 (1983).
  31. Depelteau, J. S., Koning, G., Yang, W., Briegel, A. An Economical, Portable Manual Cryogenic Plunge Freezer for the Preparation of Vitrified Biological Samples for Cryogenic Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 26 (3), 413-418 (2020).
  32. Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. Methods in Enzymology. 481, 63-82 (2010).
  33. Cavalier, A., Spehner, D., Humbel, B. M. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 15 (5), 469-470 (2009).
  34. Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of Macromolecular Complexes for Cryo-Electron Microscopy. Nat. Protoc. 2 (12), 3239-3246 (2007).
  35. Carragher, B., et al. Current Outcomes When Optimizing 'Standard' Sample Preparation for Single-particle Cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
  36. Noble, A. J., et al. Routine Single Particle CryoEM Sample and Grid Characterization by Tomography. eLife. 7, 34257(2018).
  37. Resch, G. P., Brandstetter, M., Konigsmaier, L., Urban, E., Pickl-Herk, A. M. Immersion Freezing of Suspended Particles and Cells for Cryo-Electron Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 803-814 (2011).
  38. Resch, G. P., et al. Immersion Freezing of Biological Specimens: Rationale, Principles, and Instrumentation. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 778-782 (2011).
  39. Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A Prototype for an Integrated Inkjet Dispense and Vitrification System for Cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
  40. Razinkov, I., et al. A New Method for Vitrifying Samples for CryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
  41. Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
  42. Lu, Z., et al. Monolithic Microfluidic Mixing-Spraying Devices for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 168 (3), 388-395 (2009).
  43. Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
  44. Rubinstein, J. L., et al. Shake-It-off: A Simple Ultrasonic Cryo-EM Specimen-Preparation Device. Acta Crystallographica Section D. 75 (12), 1063-1070 (2019).
  45. Lawson, C. L., et al. EMDataBank.Org: Unified Data Resource for CryoEM. Nucleic Acids Res. 39, 456-464 (2011).
  46. Frederik, P. M., Hubert, D. H. Cryoelectron Microscopy of Liposomes. Methods in Enzymology. 391, 431-448 (2005).
  47. Dambacher, C. M., Worden, E. J., Herzik, M. A., Martin, A., Lander, G. C. Atomic Structure of the 26S Proteasome Lid Reveals the Mechanism of Deubiquitinase Inhibition. eLife. 5, 13027(2016).
  48. Zubcevic, L., et al. Conformational Ensemble of the Human TRPV3 Ion Channel. Nature Communications. 9 (1), 4773(2018).
  49. Zubcevic, L., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the TRPV2 Ion Channel. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (2), 180-186 (2016).
  50. Yoo, J., Wu, M., Yin, Y., Herzik, M. A. Jr, Lander, G. C., Lee, S. -Y. Cryo-EM Structure of a Mitochondrial Calcium Uniporter. Science. 361 (6401), 506-511 (2018).
  51. Fribourgh, J. L., et al. Dynamics at the Serine Loop Underlie Differential Affinity of Cryptochromes for CLOCK:BMAL1 to Control Circadian Timing. eLife. 9, 55275(2020).
  52. Hirschi, M., et al. AcrIF9 Tethers Non-Sequence Specific DsDNA to the CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex. Nature Communications. 11 (1), 2730(2020).
  53. Herzik, M. A. Jr Manual-Plunging CryoEM Grids | Herzik Lab. Herzik Lab UCSD. , Available at: https://herziklab.com/manual-plunge.html (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kriomikroskopia elektronowa pojedynczych cząstekmanualne zamrażanie metodą zanurzeniowąprzygotowywanie lodu witryfikowanegotransmisyjna mikroskopia elektronowaprzygotowywanie siatek do kriomikroskopii elektronowejzamrażanie w ciekłym etanietechnika osuszania papierem filtracyjnymwitryfikacja preparatów biologicznych
Ręczne zamrażanie próbek biologicznych metodą blot and plunge do kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.