Artykuł metodologiczny

Proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania zarodków danio pręgowanego

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62767

⸱

2 sierpnia 2021

 ,  , 
1Systems Biology of Development Group, Friedrich Miescher Laboratory of the Max Planck Society, 2University of Konstanz

W tym artykule

Podsumowanie

Manipulacje embriologiczne, takie jak eksterminacja i przeszczepianie komórek, są ważnymi narzędziami do badania wczesnego rozwoju. Protokół ten opisuje proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania do wykonywania tych manipulacji w zarodkach danio pręgowanego.

Streszczenie

Klasyczne manipulacje embriologiczne, takie jak usuwanie komórek i przeszczepianie komórek wewnątrz lub pomiędzy embrionami, są potężnymi technikami do badania złożonych procesów rozwojowych. Zarodki danio pręgowanego idealnie nadają się do tych manipulacji, ponieważ są łatwo dostępne, stosunkowo duże i przezroczyste. Jednak wcześniej opracowane urządzenia do usuwania i przeszczepiania komórek są kłopotliwe w użyciu lub drogie w zakupie. Natomiast prezentowane tutaj urządzenie do przeszczepu jest ekonomiczne, łatwe w montażu i proste w użyciu. W niniejszym protokole w pierwszej kolejności wprowadzamy obchodzenie się z urządzeniem do przeszczepiania, a także jego montaż z dostępnych na rynku i powszechnie dostępnych części. Następnie przedstawiamy trzy zastosowania do jego wykorzystania: generowanie ektopowych klonów w celu badania dyspersji sygnału z lokalnych źródeł, wykorzenianie komórek w celu wytworzenia zarodków o zmniejszonej wielkości oraz przeszczepianie linii zarodkowej w celu wygenerowania mutantów matczyno-zygotycznych. Na koniec pokazujemy, że narzędzie może być również wykorzystywane do manipulacji embriologicznych u innych gatunków, takich jak japońska ryba ryżowa medaka.

Wprowadzenie

Z klasycznych eksperymentów Mangolda i Spemanna, które wykazały istnienie organizatora instruującego tworzenie osi embrionalnej1, przeszczepianie komórek między embrionami stało się uznaną techniką badania rozwoju embrionalnego2,3,4,5,6,7,8,9,10. Powszechnie stosowana konfiguracja do przeszczepów składa się z gazoszczelnej strzykawki sterowanej napędem mikrometrycznym, połączonej z uchwytem na mikropipety za pomocą elastycznej rurki i zbiornika wypełnionego olejem mineralnym12,13. W tej konfiguracji tłok strzykawki jest przesuwany przez. Wytworzone w ten sposób ciśnienie jest przenoszone do mikropipety i wykorzystywane do pobierania komórek z jednego zarodka i umieszczania ich w innym. Jednak to hydraulicznie sterowane urządzenie składa się z wielu części, a jego montaż od podstaw jest pracochłonny. Podobne urządzenia można również kupić jako kompletny zestaw roboczy, zwykle sprzedawany jako ręczne mikrowtryskiwacze, a te komercyjne wersje zwykle kosztują ponad 1500 USD. Zarówno w wersji domowej, jak i komercyjnej, mikropipeta do manipulacji zarodkami jest oddzielona od urządzenia wytwarzającego ciśnienie (gazoszczelnej strzykawki) za pomocą rurki wypełnionej olejem. W związku z tym manipulowanie mikropipetą i ruch tłoka muszą być obsługiwane oddzielnie przez różne ręce, co zmniejsza przepustowość i użyteczność. Co więcej, przygotowanie urządzeń do przeszczepu jest kłopotliwe, ponieważ rurki muszą być ostrożnie wypełnione olejem, unikając tworzenia się pęcherzyków. W tym miejscu opisujemy alternatywne pneumatycznie sterowane urządzenie do usuwania i przeszczepiania komórek, które jest niedrogie, łatwe w montażu i proste w użyciu.

Prezentowane tutaj urządzenie składa się z gazoszczelnej strzykawki o pojemności 25 μL wyposażonej w uchwyt na mikropipety i kosztuje mniej niż 80 US$. Urządzenie można łatwo zmontować, wkładając uchwyt na mikropipetę do strzykawki za pomocą złączki Luer lock (Rysunek 1A). Urządzenie jest następnie montowane bezpośrednio na mikromanipulatorze, dzięki czemu użytkownik może kontrolować zarówno jego położenie, jak i ssanie jedną ręką bezpośrednio przy mikromanipulatorze. Dzięki temu druga ręka może swobodnie stabilizować i przesuwać szalkę transplantacyjną zawierającą zarodki dawcy i gospodarza. Urządzenie działa na zasadzie bezpośredniego zasysania powietrza i nie wymaga napełniania olejem mineralnym. Ze względu na siły przyciągania między wodą a ściankami szklanej igły, duży ruch tłoka strzykawki przekłada się na mniejszy ruch poziomu wody w igle, o ile poziom wody znajduje się w zwężającym się końcu szklanej igły. Pozwala to na precyzyjną kontrolę nad liczbą odsysanych komórek i miejscem ich wprowadzenia.

Aby zademonstrować użyteczność tego urządzenia, prezentujemy trzy zastosowania w zarodkach danio pręgowanego (Danio rerio). Po pierwsze, pokazujemy, jak generować zlokalizowane źródła wydzielanych cząsteczek sygnałowych, które można wykorzystać do badania powstawania gradientów2,4,6. W tym przypadku zarodkom dawcy wstrzykuje się mRNA kodujące fluorescencyjnie znakowaną cząsteczkę sygnałową. Znakowane fluorescencyjnie komórki dawcy są następnie przeszczepiane do zarodków gospodarza typu dzikiego, gdzie można obrazować i analizować tworzenie gradientu sygnału. Po drugie, opisujemy, w jaki sposób urządzenie może być używane do usuwania komórek przez ekstypację w celu wygenerowania zarodków o zmniejszonym rozmiarze5,13. Na koniec pokazujemy, jak solidnie wytwarzać matczyno-zygotyczne mutanty poprzez przeszczepianie komórek niosących pierwotny reporter komórki rozrodczej do embrionów gospodarza, w których linia zarodkowa została ablowana6,10. W przyszłości opisane tutaj urządzenie do przeszczepu może być łatwo przystosowane do innych manipulacji embriologicznych wymagających usunięcia lub przeszczepienia komórek.

Protokół

1. Montaż i korzystanie z urządzenia do przeszczepu

  1. Montaż urządzenia do przeszczepu.
    1. Połącz gazoszczelną strzykawkę Luer tip 25 μl i uchwyt na mikropipety ze złączką Luer lock, aby zmontować urządzenie do przeszczepu (Rysunek 1A).
      UWAGA: Zwilżenie końcówki Luer cienką warstwą wody może pomóc w wzmocnieniu połączenia, utrzymując części razem dzięki przyczepności i spójności wody.
    2. Zamontuj urządzenie bezpośrednio na ręcznym mikromanipulatorze (Rysunek 1B). Urządzeniem można sterować samą ręką dominującą, uwalniając drugą rękę do dodatkowych zadań.
  2. Przygotowanie igły do przeszczepu.
    1. Pobrać igłę do przeszczepu, pociągając szklaną pipetę kapilarną (bez filamentu) za pomocą ściągacza do mikropipet.
    2. Złam końcówkę igły tak gładko, jak to możliwe, ponieważ ostre krawędzie zwiększają ryzyko zarysowania żółtka podczas przesadzania, co jest śmiertelne dla zarodka.
      UWAGA: Końcówkę można łatwo złamać żyletką o prostej krawędzi pod mikroskopem stereoskopowym. Jednak zastosowanie mikrokuźni pozwala na wygenerowanie precyzyjnego otworu o pożądanym rozmiarze. Do wytwarzania źródła ektopowego odpowiednia jest średnica zewnętrzna około 50-60 μm. W przypadku wytępienia i przeszczepu linii zarodkowej zewnętrzna średnica igły powinna wynosić około 80-90 μm, aby zwiększyć liczbę przeszczepionych komórek.
    3. Wprowadzić gotową do użycia igłę do urządzenia do przeszczepu (Rysunek 1A).
  3. Korzystanie z urządzenia do przeszczepu.
    1. Umieść mikromanipulator z urządzeniem do przeszczepu obok mikroskopu stereoskopowego (Rysunek 1B).
    2. Wyjąć tłok i opuścić igłę do przeszczepu do naczynia transplantacyjnego wypełnionego roztworem Ringera (patrz krok 2.2.1) pod kątem 45°, aż końcówka igły zostanie zanurzona (Rysunek 1B). Woda będzie pędzić w górę igły z powodu działania kapilarnego.
    3. Włóż tłok mniej więcej do połowy, aby wypłukać roztwory Ringera, pozostawiając tylko niewielką ilość wody w cienkiej, zwężającej się części igły (Rysunek 1C).
      UWAGA: Jest to pozycja neutralna i poziom wody powinien się tam stabilizować przez chwilę (>20 min). Jeśli poziom wody jest niestabilny, powietrze przecieka; ponownie podłączyć złączkę Luer lock lub wymienić strzykawkę.
    4. Używając igły do przeszczepu po raz pierwszy, pokryj jej wnętrze, pobierając żółtko z ofiarowanego zarodka, a następnie całkowicie wydalając materiał żółtkowy. Powłoka pomoże zmniejszyć przyleganie komórek do szkła podczas kolejnych zabiegów.
    5. Delikatnie ustaw zarodek dawcy za pomocą igły, a następnie ustaw otwór igły prostopadle do powierzchni zarodka (Rysunek 1D).
      UWAGA: Pozycja będzie inna dla różnych testów. W przypadku generowania ektopowego źródła molekuł sygnałowych i wykorzeniania komórek będzie to wierzchołek bieguna zwierzęcego (Rysunek 1E); w przypadku przeszczepu linii zarodkowej będzie to margines (Rysunek 1D,F).
    6. Powoli i ostrożnie pociągnąć tłok do góry, aby pobrać komórki do igły.
      UWAGA: Jeśli ogniwa zostaną pobrane zbyt szybko, mogą ulec uszkodzeniu. Jeśli zrobisz to poprawnie, komórki powinny wyjść jako cylindryczna kolumna. Należy unikać pobierania żółtka do igły, ponieważ przeszczepione żółtko jest toksyczne dla zarodka gospodarza.
    7. Zatrzymaj ssanie, delikatnie dociskając lekko tłok w dół, gdy żądana liczba komórek zostanie wciągnięta. Wyjąć igłę z zarodka, szarpiąc igłę na bok krótkimi i szybkimi ruchami. Pozostaw trochę roztworu Ringera po obu stronach kolumny komórek i ogranicz komórki do zwężającego się końca igły ( Rysunek 1C,D).
      UWAGA: Płyn znajdujący się przed kolumną komórkową pomoże rozdzielić komórki zarodków gospodarza podczas osadzania kolumny komórkowej.
    8. Usunąć wszelkie pozostałe żółtka lub resztki komórek, powoli przesuwając tłok w górę i w dół - podczas gdy igła pozostaje zanurzona - aby przemyć komórki roztworem Ringera. Jeśli zrobisz to prawidłowo, nieuszkodzone komórki pozostaną sklejone ze sobą w kolumnie, podczas gdy zanieczyszczenia zostaną zmyte.
      UWAGA: Na tym etapie należy zachować szczególną ostrożność, ponieważ poziom wody podniesie się poza zwężający się koniec igły. Spowoduje to nagły napływ wody, którą można wykorzystać do umycia komórek. Jednak gdy poziom wody przekroczy zwężający się koniec, precyzyjna kontrola za pomocą tłoka zostanie zmniejszona, a tłok będzie musiał być przesuwany wolniej i ostrożniej.
    9. Przesuń szalkę do przeszczepu ręką niedominującą, aby ustawić igłę prostopadle do powierzchni (bieguna zwierzęcego lub marginesu) zarodka gospodarza (Rysunek 1D-F).
    10. Delikatnie lekko dociśnij, a następnie wykonuj szybki, ostry ruch, aby przebić otaczającą warstwę zarodka gospodarza. Uważaj, aby nie zarysować żółtka igłą.
      UWAGA: Wywieranie lekkiego nacisku na zarodek poprzez ostrożne dociskanie go do ścianek studzienki zwiększa napięcie powierzchniowe zarodka, a tym samym ułatwia przekłucie warstwy otaczającej.
    11. Gdy igła znajdzie się w środku, delikatnie popchnij tłok, aby wytłoczyć kolumnę komórek do zarodka, jednocześnie powoli cofając igłę (Rysunek 1D-F).
  4. Czyszczenie igły do przeszczepu.
    1. Przepłukać igłę, przesuwając tłok w górę i w dół, gdy igła jest zanurzona w wodzie dejonizowanej.
      UWAGA: Jeśli igła pozostaje brudna, przepłucz ją 10 M roztworem wodorotlenku sodu przed ponownym spłukaniem wodą.
    2. Przechowywać igłę w odpowiednim pudełku do dalszego użycia.

2. Generowanie ektopowych źródeł wydzielanych cząsteczek sygnałowych w zarodkach danio pręgowanego

  1. Przygotowanie zarodków gospodarza i dawcy.
    1. Zbieraj świeżo złożone zarodki, kryjąc danio pręgowanego.
    2. Dechorionacja zarodków danio pręgowanego w stadium 1-komórkowym poprzez inkubację do 100 zarodków w 0,5 mg/ml roztworu pronazy przez około 15 minut na małej szklanej szalce Petriego (szczegółowy opis tej procedury został opublikowany przez Rogers, KW i wsp.14).
      UWAGA: Alternatywnie, zarodki mogą być również poddane dekorionacji w wysokim stadium, tuż przed przeszczepieniem (etap 2.2), ale wymaga to oddzielnej dekorionacji zarodków dawcy i zarodków gospodarza, którym wstrzyknięto zarodki.
    3. Zanurz zarodki w pożywce dla zarodków w zlewce o pojemności 200 ml.
      UWAGA: Zarodki blastuli i gastruli w stadium dechorionacji są bardzo delikatne. Ich odsłonięte żółtko przylega do plastikowych powierzchni i pęka w kontakcie z powietrzem. W związku z tym muszą one pozostać całkowicie zanurzone w pożywce zarodkowej, przeniesione za pomocą szklanej pipety i utrzymane w plastikowych naczyniach pokrytych agarozą (1% w pożywce zarodkowej) lub szklanych szalkach Petriego.
    4. Ostrożnie opróżnij większość pożywki dla zarodków i powoli napełniaj zlewkę świeżą pożywką dla zarodków. Wywołane w ten sposób łagodne pobudzenie ułatwi usunięcie osłabionej kosmówki. Powtórz ten krok 2-3 razy.
    5. Przenieść zdekorionowane zarodki za pomocą szklanej pipety Pasteura do naczynia iniekcyjnego pokrytego agarozą.
      UWAGA: Podpalenie końcówki szklanej pipety Pasteura poprzez wystawienie jej na działanie płomienia palnika Bunsena może stopić i wygładzić krawędź, pomagając zapobiec uszkodzeniu zarodków.
    6. Wstrzyknąć mRNA kodujące fluorescencyjnie znakowane białko do podzbioru zarodków (szczegółowy opis tej procedury został opublikowany przez Rogers, K. W. et al.14). Wstrzyknij mRNA do komórki, a nie żółtko, aby uzyskać prawie jednorodną ekspresję. Zarodki, którym wstrzyknięto zarodki, będą służyć jako dawcy, podczas gdy niewstrzyknięte zarodki będą służyć jako gospodarze.
      UWAGA: Ilość i rodzaj wstrzykniętego mRNA będzie zależeć od badanej cząsteczki sygnałowej i zwykle waha się od 20 do 200 pg2,4,5,6 (ale w niektórych przypadkach może wynosić nawet 1000 pg4).
    7. Przenieść wstrzyknięte zarodki do pokrytego agarozą sześciodołkowego naczynia wypełnionego pożywką dla zarodków. Inkubować w temperaturze 28 °C do momentu, gdy zarodki osiągną wczesne stadium kuli.
  2. Przeszczepianie komórek w celu wytworzenia źródeł ektopowych.
    1. Napełnić naczynie do przeszczepu (z pojedynczymi trójkątnymi studzienkami w kształcie klina, patrz Tabela Materiałów) roztworem Ringera (116 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES; przechowywać bufor HEPES w temperaturze 4 °C).
      UWAGA: Wapń zawarty w roztworze Ringera wspomaga adhezję komórek i pomaga zarodkowi goić się po zabiegu przeszczepu.
    2. Przenieś zarodki do naczynia do przeszczepu.
    3. Zarodki gospodarza i dawcy należy umieścić w naprzemiennych kolumnach, w każdym przypadku z kijem zwierzęcym skierowanym w stronę igły do przeszczepu.
    4. Przeszczepienie należy przeprowadzić w sposób opisany w punkcie 1.3. W przypadku ektopowego przeszczepu źródła należy pobrać komórki źródłowe ze szczytu słupa zwierzęcego i umieścić je w tym samym miejscu w zarodku gospodarza (Rysunek 1E).
      UWAGA: Mycie komórek roztworem Ringera, jak opisano w kroku 1.3.8, jest ważne dla generowania źródła ektopowego, aby upewnić się, że już wydzielane cząsteczki sygnałowe nie są przenoszone do gospodarza. Nie przeszczepiaj zbyt wielu komórek, aby upewnić się, że źródło nie jest rozproszone. Kolumna o średnicy około 80 μm i długości 100 μm jest odpowiednia do wielu zastosowań.
    5. Pozwól zarodkowi gospodarza pozostać w roztworze Ringera przez 30 minut do 1 godziny, aby wyzdrowiał.
    6. Zbadaj, czy komórki zostały pomyślnie przeszczepione za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego (Rysunek 2).
    7. Po wyzdrowieniu przenieść zarodki na pokrytą agarozą sześciodołkową płytkę wypełnioną pożywką dla zarodków i inkubować je w temperaturze 28 °C.

3. Generowanie zarodków o zmniejszonej wielkości poprzez wytępienie komórek

  1. Przygotowanie zarodków do wytępienia.
    1. Zbierz świeżo złożone zarodki od danio pręgowanego o pożądanym genotypie.
    2. Inkubować zarodki w temperaturze 28 °C, aż osiągną wysoki poziom.
    3. Dekorionację zarodków należy wykonać zgodnie z opisem w krokach 2.1.2-2.1.5, gdy zarodki osiągną wysoki etap.
      UWAGA: W tym przykładzie wytępienie komórek odbywa się na etapie kuli. W związku z tym zarodki są dechorionowane około 30 minut do 1 godziny wcześniej.
  2. Opcjonalnie: Znakowanie warstwy syncytialnej żółtka (YSL).
    UWAGA: W razie potrzeby wstrzyknij fluorescencyjny dektrans do YSL przed wytępieniem komórek. Technika ta pozwala określić, czy YSL pozostaje nienaruszony po usunięciu komórek, co jest ważne dla prawidłowej embriogenezy15. Alternatywnie, syntetyzowane mRNA lub białka in vitro mogą być również wstrzykiwane do YSL.
    1. Za pomocą pipety Pasteura przenieś zdekorionowane zarodki do naczynia iniekcyjnego pokrytego agarozą wypełnionego wodą z zarodków.
    2. Ustaw zarodki na bok, z brzegiem blastodermy skierowanym w stronę igły do wstrzykiwań (Ryc. 3A).
    3. Wstrzyknąć 0,5 nL 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dekstran do YSL, dążąc do obszaru między komórkami blastodermy a żółtkiem na głębokości około jednej trzeciej średnicy zarodka. Wstrzyknąć wszystkie zarodki w jednym rzędzie.
      UWAGA: Ponieważ igła iniekcyjna nie musi przebijać kosmówki, korzystne jest małe (~4 μm) i ostre otwarcie.
    4. Obrócić zarodki o 180° tak, aby przeciwna strona brzegu blastodermy była skierowana w stronę igły do wstrzykiwań (Ryc. 3A).
    5. Wstrzyknąć kolejne 0,5 nL 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dekstran do YSL, jak opisano w kroku 3.2.3, uzyskując całkowitą objętość wstrzyknięcia 1 nL na zarodek.
      UWAGA: Wstrzykiwanie z dwóch stron pozwala na bardziej równomierne rozprowadzenie fluorescencyjnego dekstranu w YSL.
    6. Zbadaj wynik wstrzyknięcia pod stereoskopowym mikroskopem fluorescencyjnym. Jeśli zostanie to zrobione poprawnie, sygnał fluorescencyjny będzie ograniczony do YSL (Rysunek 3B) i nie będzie widoczny w przestrzeni międzykomórkowej blastodermy.
  3. Komórki wymierające
    1. Napełnij naczynie do przeszczepu roztworem Ringera (patrz krok 2.2.1).
    2. Przenieś zarodki do naczynia do przeszczepu.
    3. Ustaw zarodki tyczką zwierzęcą w kierunku igły do przeszczepu (Rysunek 3C).
    4. Ostrożnie usuń komórki z obszaru bieguna zwierzęcia, jak opisano w krokach 1.3.5-1.3.7, zmniejszając w ten sposób blastodermę do pożądanego rozmiaru.
    5. Wyrzuć usunięte komórki, usuwając je z igły do przeszczepu.
    6. Po zakończeniu zabiegu pozostaw zarodki w roztworze Ringera przez 30 minut do 1 godziny, aby mogły dojść do siebie.
    7. OPCJONALNIE: Zbadaj integralność YSL pod stereoskopowym mikroskopem fluorescencyjnym (Rysunek 3D).
    8. Przenieść zarodki na pokrytą agarozą płytkę wypełnioną pożywką dla zarodków i inkubować je w temperaturze 28 °C.

4. Tworzenie matczyno-zygotycznych mutantów poprzez przeszczep linii zarodkowej

  1. Przygotowanie zarodków gospodarza i dawcy.
    1. Zbieraj świeżo złożone zarodki zarówno od zmutowanego, jak i dzikiego danio pręgowanego. Zarodki danio pręgowanego ze zmutowanym pochodzeniem będą służyć jako dawcy, podczas gdy zarodki od danio pręgowanego o pochodzeniu dzikim będą służyć jako żywiciele.
      UWAGA: Przeszczepienie linii zarodkowej wymaga dużej liczby początkowych zarodków (~50 dla dawców, ~500 dla gospodarzy), aby zapewnić dużą liczbę udanych przeszczepów linii zarodkowej, które przetrwają do dorosłości.
    2. Przenieść zarodki do pokrytego agarozą naczynia iniekcyjnego z podłożem dla zarodków za pomocą pipety Pasteura.
      UWAGA: Wstrzyknięcia wykonuje się przed dechorionacją w celu zwiększenia przepustowości. Igły do wstrzykiwań przez kosmówkę muszą być i mieć większy otwór (~10 μm), aby zapobiec zatykaniu.
    3. Wstrzyknąć zarodkom dawcy 1 nL mRNA o stężeniu 100 ng/μl kodującym GFP z nos1 3'UTR. Wstrzyknij mRNA do żółtka, aby zwiększyć przepustowość.
      UWAGA: nos1 3'UTR ustabilizuje mRNA w pierwotnych komórkach rozrodczych, powodując, że komórki rozrodcze będą silnie fluorescencyjne podczas obrazowania 1 dzień po zapłodnieniu10.
    4. Wstrzyknąć zarodkom gospodarza 1 nL morfolino o stężeniu 0,33 mM (3 μg/μL) w ślepym zaułku (dnd). Wstrzyknąć morfolino do żółtka, aby zwiększyć przepustowość.
      UWAGA: dnd morpholino blokuje tworzenie pierwotnych komórek rozrodczych, co zapewnia, że linia zarodkowa zarodka gospodarza będzie wypełniona wyłącznie komórkami dawcy po przeszczepie10.
    5. Przenieść wstrzyknięte zarodki na plastikowe szalki Petriego z pożywką dla zarodków. Inkubować w temperaturze 28 °C aż do momentu, gdy zarodki osiągną wysoki poziom.
    6. Dechorionację zarodków należy przeprowadzić zgodnie z opisem w krokach 2.1.2-2.1.5, gdy zarodki osiągną wysoki etap.
  2. Przeszczepianie komórek rozrodczych
    1. Napełnij naczynie do przeszczepu roztworem Ringera (patrz krok 2.2.1).
    2. Przenieś zarodki w stadium pozbawionym kosmówki do sfery kopułowej do naczynia do przeszczepu.
    3. Umieść zarodki gospodarza i zarodki dawcy w naprzemiennych kolumnach, aby przeszczepić komórki z jednego zarodka dawcy do sześciu różnych zarodków gospodarza. Zwiększa to szansę na to, że komórki rozrodcze z danego zarodka gospodarza zostaną pomyślnie przeszczepione.
    4. Ustawić zarodki z marginesem w kierunku igły do przeszczepu i przeprowadzić przeszczepienie w sposób opisany w punkcie 1.3. W przypadku przeszczepów linii zarodkowej (Rysunek 1D,F), należy pobrać komórki źródłowe z marginesu (gdzie znajdują się pierwotne komórki rozrodcze) i umieścić je w tym samym miejscu w zarodku gospodarza.
      UWAGA: Przesadzenie dużej kolumny (o średnicy około 80 μm i długości 600 μm) zwiększy szansę na uzyskanie udanego przeszczepu linii zarodkowej.
    5. Pozostawić zarodek w roztworze Ringera przez 30 minut do 1 godziny, aby zregenerował się po zakończeniu przeszczepu.
      UWAGA: Jeśli nie oczekuje się, że wszystkie zarodki dawcy będą homozygotycznymi mutantami - np. jeśli pochodzą z heterozygotycznego krzyżowania - muszą zostać genotypowane po przeszczepieniu w celu określenia genotypu przyszłej linii zarodkowej przeszczepionego gospodarza. W takim przypadku należy upewnić się, że pozycje zarodków gospodarza i dawcy nie są pomieszane podczas obchodzenia się z nimi.
    6. Użyj stereomikroskopu fluorescencyjnego, aby sprawdzić, czy komórki zostały pomyślnie przeszczepione (Rysunek 4A,B).
    7. Przenieś zarodki na 24-dołkową płytkę pokrytą agarozą. Zgrupuj wszystkie zarodki gospodarza, które otrzymały komórki od tego samego dawcy, do tej samej studzienki i odpowiednio je oznacz. Inkubować je do następnego dnia w temperaturze 28 °C.
    8. W razie potrzeby przenieść zarodki dawcy do znakowanych pasków PCR w celu genotypowania.
  3. Badania przesiewowe pod kątem udanych przeszczepów linii zarodkowej
    1. Przebadaj zarodki gospodarza pod kątem udanych przeszczepów linii zarodkowej pod stereomikroskopem fluorescencyjnym około 30 godzin po zapłodnieniu (hpf). Komórki rozrodcze znajdują się w rowku nad przedłużeniem żółtka (Rysunek 4C).
      UWAGA: Typowe eksperymenty z przedstawionym tutaj urządzeniem i strategią będą miały wskaźnik sukcesu ~60%-80%, aby uzyskać co najmniej jeden zarodek gospodarza zawierający przeszczepione komórki rozrodcze na zarodek dawcy. Poprzedni raport opisywał ~10% wydajności10.
    2. W stosownych przypadkach należy odrzucić zarodki, które otrzymały komórki z zarodków dawcy o nieprawidłowym genotypie. Hoduj larwy z pomyślnie przeszczepionymi komórkami rozrodczymi do dorosłości zgodnie ze standardowymi warunkami hodowli i zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

Wyniki

Sukces lub niepowodzenie w użyciu urządzenia do transplantacji w trzech opisanych powyżej zastosowaniach można łatwo ocenić poprzez inspekcję wizualną pod stereomikroskopem. W przypadku udanych transplantacji embrion powinien wyglądać normalnie, a jego kształt i klarowność żółtka powinny być zbliżone do embrionów niepoddanych transplantacji, bez dużych rozdarć w blastodermie. Jeśli embrion jest widocznie uszkodzony (Rycina 4B), nie będzie on rozwijał się prawidłowo. W idealnych warunkach przeszczepione komórki wykazujące marker fluorescencyjny powinny widzieć się jako ciągła kolumna podczas obserwacji pod stereomikroskopem fluorescencyjnym (Rycina 2A, Rycina 4A). Jeśli kolumna jest pofragmentowana, wskazuje to, że komórki zostały rozerwane przez ssanie podczas zasysania do igły transplantacyjnej lub że osadzanie komórek zostało przeprowadzone zbyt gwałtownie. Można tego uniknąć, przesuwając tłok wolniej i delikatniej.

Choć urządzenie do transplantacji było wykorzystywane głównie u embrionów danio pręgowanego w stadium blastuli5,6, transplantacja i ekstirpacja komórek sprawdzają się równie dobrze w przypadku zdechorionowanych embrionów w stadium blastuli japońskiej rybki ryżowej medaka (Oryzias latipes) (Rysunek 2B). Poza zdechorionowaniem embrionów, które zostało opisane przez Porazinskiego, S. R. i współpracowników17, można stosować te same procedury, które opisano powyżej.

W konkretnym przypadku transplantacji linii zarodkowej prawidłowy przeszczep zaowocuje embrionem z długą poziomą kolumną komórek bezpośrednio nad brzegiem żółtka (Rysunek 4A). Jednak to, czy komórki zarodkowe zostały pomyślnie przeszczepione, można ocenić dopiero następnego dnia (Rysunek 4C-F) ze względu na tło ekspresji GFP w stadiach blastuli (Rysunek 1F). Pierwotne komórki zarodkowe będą widoczne jako małe fluorescencyjne sfery w bruździe bezpośrednio nad przedłużeniem żółtka (Rysunek 4C-E). Obecność tych komórek w odpowiednim miejscu świadczy o pomyślnej transplantacji linii zarodkowej. Komórki o innym kształcie nie są komórkami zarodkowymi (np. komórki wydłużone to zazwyczaj komórki mięśniowe, Rysunek 4F). Ponadto, jeśli pierwotne komórki zarodkowe znajdują się poza bruzdą, oznacza to, że nie migrowały prawidłowo i nie będą mogły przyczynić się do linii zarodkowej embrionu. Na koniec, ogólna morfologia przeszczepionych embrionów powinna być zbliżona do embrionów nieprzeszczepionych (Rysunek 4D); ogon nie powinien być zdeformowany, a głowa nie powinna być zapadnięta ani pozbawiona oczu (Rysunek 4E). Defekty te wynikają zazwyczaj ze zbyt wysokich stężeń morfolino lub z uszkodzenia embrionu podczas transplantacji. Eksperymenty z transplantacji linii zarodkowej opisane w niniejszym protokole zazwyczaj kończą się pomyślnym przeszczepieniem komórek zarodkowych u 1-2 z 6 embrionów biorców dla 60%-80% embrionów dawców, w zależności od doświadczenia eksperymentatora. Zatem komórki z 40-50 homozygotycznych embrionów dawców muszą zostać przeszczepione do 200-300 embrionów biorców, aby wyhodować około 30 osobników z mutantowymi komórkami zarodkowymi.

Tworzenie chimery danio pręgowanego; konfiguracja mikromanipulatora; schematy transplantacji do analizy komórek zarodkowych.
Rycina 1: Montaż i użytkowanie urządzenia do transplantacji. (A) Urządzenie do transplantacji składa się poprzez połączenie strzykawki szczelnej gazowo z uchwytem mikropipety za pomocą złączki Luer lock. Następnie szklana igła do transplantacji jest wkładana do uchwytu mikropipety. (B) Zdjęcie zmontowanego urządzenia do transplantacji zamontowanego na mikromanipulatorze (należy zauważyć, że tło i etykiety zostały usunięte z obrazu). (C) Podczas korzystania z urządzenia do transplantacji ważne jest, aby poziom wody w igle transplantacyjnej znajdował się na jej zwężonym końcu. (D) Urządzenie jest wykorzystywane pod stereomikroskopem do pobierania i wprowadzania komórek z i do embrionów ryb kostnoszkieletowych umieszczonych w poszczególnych dołkach naczynia do transplantacji. (E) W celu generowania ektopowych źródeł, komórki są pobierane z bieguna zwierzęcego embrionu donora (i-ii) i przenoszone do bieguna zwierzęcego embrionu biorcy (iii-vi). (F) W przypadku transplantacji linii zarodkowej, większą liczbę komórek pobiera się z brzegu embrionu donora (i-ii), gdzie znajdują się komórki zarodkowe. Następnie komórki te są przenoszone na brzeg embrionów biorców (iii-vi). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Embriogeneza zebrafish i medaka, klony komórek znakowane fluorescencyjnie, analiza mikroskopowa.
Rysunek 2: Generowanie klonów poprzez transplantację komórek. (A) Przykład podwójnego klonu wygenerowanego poprzez sekwencyjną transplantację komórek fluorescencyjnych (zielonych) od donora zebrafish do zarodka gospodarza zebrafish. Pojedyncze i podwójne klony mogą być wykorzystywane do badania sposobu, w jaki wydzielane cząsteczki sygnałowe tworzą gradienty czasoprzestrzenne2,4,5,6. (B) Przykład pojedynczego klonu wygenerowanego poprzez transplantację komórek od transgenicznego donora medaka (Wimbledon) wykazującego ekspresję eGFP17 do gospodarza medaka typu dzikiego. Paski skali reprezentują 100 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat wstrzykiwania do YSL i ekstirpację; proces rozwoju embrionalnego; wyniki mikroskopowe.
Rycina 3: Generowanie embrionów o zredukowanym rozmiarze poprzez ekstirpację komórek. (A) Przed usunięciem komórek metodą ekstirpacją, YSL można oznakować, wstrzykując barwniki fluorescencyjne po dwóch przeciwległych stronach YSL. (B) Przykład embrionu po wstrzyknięciu do YSL. (C) Aby uzyskać embriony o zredukowanym rozmiarze, komórki z bieguna zwierzęcego są usuwane poprzez ekstirpację5. (D) Przykład embrionu po ekstirpacji komórek. Należy zauważyć, że YSL pozostaje nienaruszone. Paski skali reprezentują 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat transplantacji pierwotnych komórek płciowych i obrazy mikroskopowe przedstawiające stadia rozwoju embrionalnego.
Rysunek 4: Transplantacja linii płciowej. (A) Przykład udanej transplantacji komórek donora (zielone) do strefy brzeżnej gospodarza. (B) Przykład nieudanej transplantacji. Żółtko zarodka gospodarza zostało poważnie uszkodzone, w związku z czym zarodek nie będzie w stanie rozwijać się prawidłowo. (C) W 30 hpf pomyślnie przeszczepione komórki płciowe będą znajdować się wyłącznie w mezodermie gonadalnej w przedniej części wyrostka żółtkowego. (D) Przykład udanej transplantacji, w której kilka oznakowanych GFP komórek płciowych donora zasiedliło przyszłą gonadę gospodarza. (E) Przykład nieudanej transplantacji. Chociaż komórki płciowe dotarły do mezodermy gonadalnej, zarodek gospodarza jest silnie zdeformowany i nie będzie rozwijał się prawidłowo. (F) Przykład nieudanej transplantacji. Fluorescencyjne komórki płciowe, które nie zmigrowały w odpowiednie miejsce, nie zasiedlą gonad. Paski skali reprezentują 100 µm. Obrazy D-F zostały wykonane przy całkowitym powiększeniu około 50x. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Powodzenie eksperymentu transplantacyjnego w dużym stopniu zależy od umiejętności motorycznych eksperymentatora. Aby pomyślnie przeprowadzić procedury, wymagana jest praktyka. Jednak prezentowany tutaj instrument jest stosunkowo łatwy do nauczenia się i obsługi w porównaniu z innymi na rynku i generalnie potrzeba tylko kilku dni praktyki.

Powodzenie procedury przeszczepu można zwiększyć, podejmując kilka środków ostrożności. Jednym z kroków jest upewnienie się, że mikromanipulator jest dobrej jakości i zdolny do płynnej pracy. Dodanie okularu o większym powiększeniu do mikroskopu stereoskopowego może pomóc w precyzyjnym ustawieniu igły względem zarodka. Korzystanie z dobrze hodowanych danio pręgowanego lub medaka w celu uzyskania zdrowych zarodków i ostrożnie, aby nie uszkodzić zarodków podczas obchodzenia się z nim (zwłaszcza w trakcie i po etapie dekorionacji) również zwiększy wskaźnik sukcesu.

Problemy z opóźnioną toksycznością mogą być trudniejsze do rozwiązania. Jeśli zarodek umrze po kilku godzinach - ale nie bezpośrednio po przeszczepie - żółtko mogło zostać uszkodzone przez igłę (np. przez zbyt głębokie wbicie do zarodka) lub być może komórki zostały wyrzucone zbyt mocno. Opóźniona toksyczność i śmierć zarodka mogą również wynikać z żółtka lub resztek komórkowych wstrzykniętych wraz z komórkami dawcy; Inną przyczyną może być pogarszający się bufor HEPES w roztworze Ringera. Problemy te można przezwyciężyć poprzez mycie komórek (patrz krok 1.3.8) lub po prostu użycie nowej partii buforu. Co więcej, zdeformowane zarodki gospodarza w eksperymentach z przeszczepem linii zarodkowej mogą wynikać z nadmiernie wysokich stężeń morfolino. Bardzo ważne jest, aby użyć wystarczającej ilości morfolinu, aby w pełni usunąć linię zarodkową typu dzikiego gospodarza, zapobiegając w ten sposób przyczynianiu się tych komórek do potomstwa - ale jednocześnie należy unikać zbyt wysokich stężeń morfolinu. Stałe ilości morfolino we wszystkich wstrzykiwanych zarodkach gospodarza (kilkaset w typowym eksperymencie) są zatem kluczem do powodzenia przeszczepów linii zarodkowej. Można w tym pomóc, uzupełniając mieszaninę iniekcyjną morfolino łatwo widocznym barwnikiem znacznikowym14, który można śledzić pod stereomikroskopem fluorescencyjnym, aby upewnić się, że wszystkie zarodki otrzymają tę samą objętość wstrzyknięcia.

Procedury opisane w tym protokole obejmują wyłącznie manipulacje komórkami w stadium blastuli lub zarodków medaki, ale w przyszłości prawdopodobnie będzie możliwe dostosowanie urządzenia do różnych etapów i gatunków poprzez zmianę średnicy i kształtu igły do przeszczepu.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ten projekt był wspierany przez Towarzystwo Maxa Plancka i otrzymał finansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji (umowa o grant nr 637840 (QUANTPATTERN) oraz umowa o grant nr 863952 (ACE-OF-SPACE)).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kapilara szklana 1,0 mm, końce cięte bez filamentuDo wykonania igły transplantacyjnej
Kapilara szklana 1,0 mm, końce odcięte włóknemDo wykonania igieł iniekcyjnych
ZlewkaDo dechoracji zarodków
24-dołkowa płytkaDo pokrycia agarozą w celu inkubacji zarodków
Szklana szalkaDo dechorionacji zarodków
6-dołkowa płytkaDo pokrycia agarozą w celu inkubacji zarodków
AgarozaDo powlekania plastikowych naczyń
dnd1 morpholinoNarzędziaSekwencja: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC
CAT
Pożywkadla zarodków250 mg/L Instant Sól oceaniczna, 1 mg/L błękit metylenowy w wodzie z odwróconej osmozy dostosowanej do pH 7 za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego NaHCO3
filtrami GFP/RFP i źródłemDo oceny iniekcji YSL i przeszczepów linii zarodkowej
Ściągacz do mikropipet szklanychSutter Instrument CompanyP-1000Aby wykonać igłę do przeszczepu
Szklana pipetaPasteuraKimble Chase (przez Fishera)63A53WTDo pipetowania zarodków; końcówki można podpalić, aby wygładzić krawędź
Inkubator pod kątem 28 stopni; CDo inkubacji zarodków danio pręgowanego Luer
tip 25 μ L Strzykawka Hamilton, seria 1700HamiltonNr ref.: 80201Część urządzenia do przeszczepu
Ręczny mikromanipulator z 3 osiami ruchuNarishigeM-152Do sterowania urządzeniem do przeszczepu
Ręczna pompa pipetującaBio-TekKat. # 641Do użytku ze szklanymi pipetami do transferu zarodków
Metalowa sondaDo przesuwania i obracania Zarodki danio pręgowanego
MicroforgeNarishigeMF2Do wykonania igły do przeszczepu
do mikroiniekcjiDo wstrzykiwania mRNA i morfoliny do zarodków Formy
mikroiniekcji, rowki trójkątne Adaptacyjnenarzędzia naukoweTU-1Do przygotowania płytek do mikroiniekcji z agarozą
Formy mikroiniekcyjne, pojedyncze dołki Adaptacyjnenarzędzia naukowePT-1Do przygotowania płytek transplantacyjnych z agarozą
Uchwyt do mikropipet ze złączką Luer do szklanej kapilary 1,0 mmWorld Precision InstrumentsMPH6S10Część urządzenia do transplantacji
mMessage mMachine Sp6
zestaw do transkrypcji		Life TechnologiesAM1340MDo generowania zamkniętego mRNA do wstrzykiwań do zarodków
Plazmid z GFP-nos1 3'UTR Plazmid, który może być transkrybowany w celu wytworzenia mRNA kodującego GFP za pomocą 3'UTR nos1
Plastikowa szalka Petriego 100 mmDo pokrycia agarozą w celu wykonania naczyń do iniekcji i przeszczepów
Proteaza z Streptomyces griseusSigmaP5147Do dechorionacji zarodka: Przygotować wywar 5 mg/ml i stosować w stężeniu 1 mg/ml do dechorionacji zarodków
Ringer' s roztwórDla 1 l: dodać 6,78 g NaCl, 0,22 g KCl, 0,26 g CaCl2 i 1,19 g HEPES; następnie napełnić do 1 l; dostosować pH do 7,2; sterylizować przez filtrację
Mikroskop stereoskopowyDo wstrzykiwań i przeszczepów
szklana 200 ml z tworzywa sztucznego Petriego o średnicy 5 cm z tworzywa sztucznego genowe z światła preparcyjna Aparat do

Bibliografia

  1. Spemann, H., Mangold, H. Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species. Archives for Microscopic Anatomy and Developmental Mechanics. 100 (3-4), 599-638 (1924).
  2. Müller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
  3. Donovan, P., et al. Paracrine Activin-A signaling promotes melanoma growth and metastasis through immune evasion. Journal of Investigative Dermatology. 137 (12), 2578-2587 (2017).
  4. Pomreinke, A. P., et al. Dynamics of BMP signaling and distribution during zebrafish dorsal-ventral patterning. eLife. 6, 25861(2017).
  5. Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signaling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
  6. Soh, G. H., Pomreinke, A. P., Müller, P. Integration of Nodal and BMP signaling by mutual signaling effector antagonism. Cell Reports. 31 (1), 107487(2020).
  7. Mahalwar, P., Walderich, B., Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Local reorganization of xanthophores fine-tunes and colors the striped pattern of zebrafish. Science. 345 (6202), 1362-1364 (2014).
  8. Frohnhöfer, H. G., Krauss, J., Maischein, H. M., Nüsslein-Volhard, C. Iridophores and their interactions with other chromatophores are required for stripe formation in zebrafish. Development. 140 (14), 2997-3007 (2013).
  9. Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
  10. Ciruna, B., et al. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germline replacement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14919-14924 (2002).
  11. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edn. , University of Oregon Press. (2000).
  12. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (29), e1394(2009).
  13. Capek, D., Müller, P. Positional information and tissue scaling during development and regeneration. Development. 146 (24), 177709(2019).
  14. Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52266(2015).
  15. Carvalho, L., Heisenberg, C. P. The yolk syncytial layer in early zebrafish development. Trends in Cell Biology. 20 (10), 586-592 (2010).
  16. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2055(2010).
  17. Centanin, L., Hoeckendorf, B., Wittbrodt, J. Fate restriction and multipotency in retinal stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 553-562 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transplantacja zarodk w rybki zebrafishtransplantacja kom rektransplantacja linii zarodkowejmanipulacje embriologicznezarodki w stadium blastuliekstirpacja kom rekmikroskopia fluorescencyjnazarodek gospodarzzarodki rybki medaka
Proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania zarodków danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.