Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modyfikacja chemiczna reszty tryptofanu w rekombinowanej domenie NCa2+-ATPazy do badania tryptofanu-ANS FRET

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62770

⸱

9 października 2021

 , 
1Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

W tym artykule

Podsumowanie

ANS wiąże się z rekombinowaną domeną N Ca2+-ATPazy. Widma fluorescencyjne wykazują wzór podobny do FRET po wzbudzeniu przy długości fali 295 nm. Modyfikacja chemiczna Trp za pośrednictwem NBS wygasza fluorescencję domeny N, co prowadzi do braku transferu energii (FRET) między resztą Trp a ANS.

Streszczenie

Ca2+-ATPaza (SERCA) jest ATPazą typu P, która została skrystalizowana w różnych konformacjach. Szczegółowe informacje funkcjonalne można jednak uzyskać z izolowanych domen rekombinowanych. Zmodyfikowana (Trp552Leu i Tyr587Trp) rekombinowana domena wiążąca nukleotydy (domena N) wykazuje wygaszanie fluorescencji po związaniu liganda. Zewnętrzny fluorofor, a mianowicie 8-anilino-1-naftalenosulfonian (ANS), wiąże się z miejscem wiązania nukleotydów poprzez oddziaływania elektrostatyczne i hydrofobowe z resztą Arg, His, Ala, Leu i Phe. O wiązaniu ANS świadczy wzrost intensywności fluorescencji po wzbudzeniu przy długości fali (λ) 370 nm. Jednak po wzbudzeniu przy λ wynoszącym 295 nm, wzrost intensywności fluorescencji wydaje się być sprzężony z wygaszaniem wewnętrznej fluorescencji w domenie N. Widma fluorescencyjne wykazują wzór podobny do rezonansowego transferu energii Föstera (FRET), co sugeruje obecność pary Trp-ANS FRET, która wydaje się być wspierana przez niewielką odległość (~20 A) między Tyr587Trp a ANS. W niniejszym badaniu opisano analizę pary Trp-ANS FRET przez modyfikację chemiczną Trp (i wygaszanie fluorescencji), w której pośredniczy N-bromosuccinimid (NBS). W chemicznie zmodyfikowanej domenie N fluorescencja ANS wzrastała przy wzbudzeniu przy λ 295 nm, podobnie jak przy wzbudzeniu przy λ 370 nm. W związku z tym chemiczna modyfikacja reszty Trp za pośrednictwem NBS może być wykorzystana do zbadania braku FRET między Trp i ANS. Przy braku fluorescencji Trp nie należy obserwować wzrostu fluorescencji ANS. Modyfikacja chemiczna reszt Trp w białkach za pomocą NBS może być przydatna do badania FRET między resztami Trp, które znajdują się blisko związanego ANS. Ten test będzie prawdopodobnie przydatny również w przypadku stosowania innych fluoroforów.

Wprowadzenie

Föster resonance energy transfer (FRET) stał się standardową techniką określania odległości między strukturami molekularnymi po wiązaniu lub interakcji w badaniach struktury i funkcji białek1,2,3,4. W ATPazach typu P, FRET został wykorzystany do zbadania struktury i funkcji retikulum sarko-endoplazmatycznego Ca2+-ATPazy (SERCA)2,5,6,7,8, np. fluktuacje strukturalne podczas cyklu katalitycznego zostały przeanalizowane w całym białku przez FRET7.

Dawcy FRET są różnorodni i obejmują zarówno małe cząsteczki fluorescencyjne (zewnętrzne), a kończąc na białkach fluorescencyjnych9,10. Reszty tryptofanu (Trp) (ze względu na ich fluorescencję) są przydatne do identyfikacji zmian strukturalnych w sekwencjach aminokwasów białkowych11,12. Intensywność fluorescencji Trp zależy w dużej mierze od polaryzacji otaczającego go środowiska13,14. Wiązanie ligandów zwykle powoduje przegrupowania strukturalne w białkach/enzymach15,16. Jeśli Trp jest obecny w miejscu wiązania białka lub znajduje się w jego pobliżu, fluktuacje strukturalne często wpływają na stopień ekspozycji Trp na media wodne13,14; w ten sposób zmiana polaryzacji powoduje wygaszenie intensywności fluorescencji Trp13,14. W związku z tym właściwości fluorescencyjne Trp są przydatne do przeprowadzania badań wiązania ligandów przez enzymy. Inne zjawiska fizyczne mogą również prowadzić do wygaszania fluorescencji Trp17,18,19,20, np. FRET i zmiany polarności medium. Przenoszenie energii ze stanu wzbudzonego Trp do fluoroforu ma również potencjalne zastosowania, np. określanie powinowactwa małych ligandów w białkach21. Rzeczywiście, Trp był przede wszystkim używany jako donor fluorescencji w badaniach FRET w białkach22,23,24, np. w badaniach FRET terbu (Tb3+) reszta Trp jest często używana jako antena do transferu energii do Tb3+ 25,26,27. Trp wykazuje różne zalety w porównaniu z innymi donorami FRET ze względu na swój nieodłączny konstytutywny charakter w strukturze białka, który eliminuje potrzebę procesów przygotowawczych, które mogą wpływać na funkcję/strukturę badanego białka24. W związku z tym identyfikacja rozpadów promieniowania (transfer energii i zmiany polarności ośrodka, które są indukowane przez przegrupowania strukturalne białek) jest ważna dla wyciągnięcia dokładnych wniosków dotyczących wiązania ligandów w badaniach strukturalnych białek13,14,19,28.

W badaniach strukturalnych białek, zewnętrzny fluorofor, a mianowicie 8-anilino-1-naftalenosulfonian (ANS), był głównie używany w eksperymentach związanych z fałdowaniem/rozwijaniem białek28,29. ANS wiąże się z białkami/enzymami w stanie natywnym, zwykle w miejscach wiązania substratów31,32,33; wzrost wydajności kwantowej fluorescencji ANS (ΦF) (czyli wzrost intensywności fluorescencji) jest indukowany przez wzbudzenie białka przy λ=370 nm, gdy zachodzą odpowiednie oddziaływania ANS z resztą Arg i His w kieszeniach hydrofobowych34,35,36,37. W różnych badaniach opisano występowanie FRET (gdy wzbudza się przy λ w zakresie 280-295 nm) między resztami Trp (donorami) a ANS (akceptorem), które opiera się na następujących zasadach: 1) nakładanie się widma emisji fluorescencji Trp i widma wzbudzenia ANS, 2) określenie odpowiedniej odległości między jedną lub kilkoma pozostałościami Trp a ANS dla transferu energii, 3) wysoka wydajność kwantowa ANS po związaniu w kieszeniach białkowych oraz 4) charakterystyczny wzór FRET w widmach fluorescencyjnych białka w obecności ANS3,17,27,37,38.

Ostatnio wiązanie ligandów z domeną wiążącą nukleotydy (domeną N) w SERCA i innymi ATPazami typu P zostało zbadane przy użyciu zmodyfikowanych rekombinowanych N-domen N40,41,42,43,44,45,46. Inżynieria molekularna domeny N SERCA została wykorzystana do przeniesienia jedynej reszty Trp (Trp552Leu) do bardziej dynamicznej struktury (Tyr587Trp), która znajduje się blisko miejsca wiązania nukleotydów, gdzie zmiany fluorescencji (wygaszanie) mogą być wykorzystywane do monitorowania zmian strukturalnych po związaniu liganda34. Wyniki eksperymentalne wykazały, że ANS wiąże się (jako ATP) z miejscem wiązania nukleotydów w oczyszczonej rekombinowanej domenie N SERCA34. Co ciekawe, fluorescencja ANS wzrasta po związaniu się z domeną N po wzbudzeniu przy λ 295 nm, podczas gdy wewnętrzna fluorescencja domeny N maleje34, tworząc w ten sposób wzór FRET, który sugeruje tworzenie pary Trp-ANS FRET.

Zaproponowano użycie NBS do określenia zawartości reszt Trp w białkach47 za pomocą testu absorbancji zmodyfikowanych białek. NBS modyfikuje wysoce absorbującą grupę indolową Trp do mniej chłonnej oksynolozy47,48. Powoduje to utratę (wygaszenie) właściwości fluorescencyjnej Trp40. W związku z tym chemiczna modyfikacja reszt Trp za pośrednictwem NBS może być stosowana jako test do określenia roli Trp (jako dawcy), gdy hipoteza dotyczy FRET.

Ten protokół opisuje chemiczną modyfikację jedynej reszty Trp przez NBS w zmodyfikowanej rekombinowanej domenie N SERCA jako model białka. Wyniki eksperymentalne pokazują, że intensywność fluorescencji ANS nadal wzrasta w chemicznie zmodyfikowanej przez NBS N-domain34, która nie ma wewnętrznej fluorescencji. W związku z tym test jest przydatny do wykazania braku FRET między resztą Trp a ANS po związaniu z domeną N34,40,49. W związku z tym ten test (chemiczna modyfikacja Trp NBS) jest przydatny w udowodnieniu obecności pary Trp-ANS FRET w białkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Określenie (in silico) interakcji ANS i SERCA w domenie N

  1. Wygeneruj trójwymiarową (3D) strukturę białka (domena N serca) poprzez modelowanie molekularne przy użyciu preferowanego oprogramowania do modelowania białek50.
  2. Zidentyfikuj reszty aminokwasowe, które tworzą miejsce wiązania nukleotydów, korzystając z preferowanej struktury molekularnej software51, i określ obecność reszt Arg i Lys35; są one wymagane do wiązania ANS i zwiększenia intensywności fluorescencji (wydajności kwantowej).
  3. Wykonaj dokowanie molekularne (przy użyciu preferowanego oprogramowania do dokowania)52,53,54, aby określić interakcje ATP, izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) (który tworzy wiązanie kowalencyjne z Lys515 znakującym miejsce wiązania nukleotydów) i ANS z resztą aminokwasów w miejscu wiązania nukleotydów (Rysunek 1).
  4. Obliczyć odległość molekularną (A) między pozostałością Trp a związanym ANS za pomocą narzędzia pomiarowego w preferowanym oprogramowaniu.
  5. Wykonaj symulację dynamiki molekularnej kompleksu ANS-domena N, aby określić stabilność interakcji52,54. Następnie należy przeprowadzić eksperymenty in vitro, gdy stabilność kompleksu zostanie potwierdzona.

2. Ekspresja i oczyszczanie rekombinowanej domeny N

  1. Zsyntetyzuj gen kodujący dla N-domain40.
  2. Zaprojektuj i skonstruuj plazmid, który zawiera syntetyczny gen kodujący domenę N40.
  3. Ekspresja i oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa (Ni-NTA), zmodyfikowanej rekombinowanej domeny N. Wykonaj SDS-PAGE oczyszczonego białka, aby określić czystość (Rysunek 2)40.
  4. Określ stężenie białka, badając absorbancję przy λ wynoszącej 280 nm ze współczynnikiem ekstynkcji domeny N (ε= 11,960 M-1·cm-1)40.

3. Monitoruj tworzenie kompleksu ANS-domena N na podstawie zmian intensywności fluorescencji ANS i domeny N.

  1. Przygotować roztwór podstawowy ANS w N,N-dimetyloformamidzie.
    1. Odważyć niewielką ilość (1-5 mg) ANS i rozpuścić ją w 1 ml końcowej objętości N,N-dimetyloformamidu, np. 3,2 mg (10,69 mM stężenie końcowe).
    2. Przygotować 100 μM wodny roztwór podstawowy ANS przy użyciu roztworu ANS w N,N-dimetyloformamidzie, np. dodać 9,4 μl 10,69 mM roztworu ANS do 990,6 μl 50 mM buforu fosforanowego o pH 8,0, aby uzyskać końcową objętość 1 ml.
    3. Wymieszaj roztwory, wirując 3 - 5 razy przez 15 s.
      UWAGA: W poniższym eksperymencie należy używać wyłącznie wodnego roztworu podstawowego ANS. Świeżo przygotować wodny roztwór podstawowy ANS przed rozpoczęciem doświadczeń.
  2. Przygotować roztwór podstawowy NBS w N,N-dimetyloformamidzie.
    1. Odważyć niewielką ilość (1-5 mg) NBS i rozpuścić ją w 1 ml N,N-dimetyloformamidu, np. 5,3 mg w 1 ml (stężenie końcowe 29,78 mM).
    2. Przygotować 1 mM wodnego roztworu podstawowego NBS przy użyciu roztworu NBS w N,N-dimetyloformamidzie, np. dodać 3,36 μl 29,78 mM roztworu NBS do 96,64 μl 50 mM buforu fosforanowego o pH 8,0, aby uzyskać końcową objętość 0,1 ml.
    3. Wymieszaj roztwory, wirując 3 - 5 razy przez 15 s.
      UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentów należy przygotować świeżo wodny roztwór podstawowy NBS.
  3. Miareczkować domenę N za pomocą ANS i rejestrować widma fluorescencji przez wzbudzenie przy λ=295 nm w temperaturze 25 °C.
    1. Uzyskaj linię bazową widma fluorescencji.
      1. Umieść 1 ml 50 mM buforu fosforanowego o pH 8,0 w 1 ml fluorescencyjnej kuwecie kwarcowej.
      2. Umieścić ogniwo w termicznej komorze celi (25 °C) spektrofluorometru i ustawić wzbudzenie λ na 295 nm.
      3. Zapisać widmo fluorescencji (305 - 550 nm).
        UWAGA: Widmo fluorescencji buforu fosforanowego o pH 50 mM o pH 8,0, który służy jako próbka ślepa, jest odejmowane od wszystkich uzyskanych widm fluorescencji.
    2. Uzyskaj wewnętrzne widmo fluorescencji domeny N.
      1. Umieścić 900 μl 50 mM buforu fosforanowego o pH 8,0 w fluorescencyjnej kuwecie kwarcowej.
      2. Dodać 100 μl zawiesiny w domenie N (10 μM), aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM w domenie N w końcowej objętości 1 ml.
      3. Delikatnie homogenizować za pomocą mikropipety 20 razy, aby zapewnić jednorodność roztworu.
        UWAGA: Białko powinno być świeżo oczyszczone w celu uzyskania wysokiej jakości wewnętrznych widm fluorescencji, np. oczyszczona rekombinowana domena N może być używana tylko przez tydzień po oczyszczeniu.
      4. Umieścić ogniwo w termicznej komorze celi (25 °C) spektrofluorometru i ustawić wzbudzenie λ na 295 nm.
      5. Zapisz wewnętrzne spektrum fluorescencji w domenie N (305-550 nm).
    3. Dodać ANS i otrzymać widmo fluorescencji przez wzbudzenie przy λ=295 nm.
      1. Dodać 2 μl podwielokrotności 100 μM wodnego roztworu podstawowego ANS do zawieszonej domeny N (1 μM), aby uzyskać końcowe stężenie 0,2 μM ANS.
      2. Delikatnie homogenizować za pomocą mikropipety 20 razy, aby zapewnić jednorodność roztworu.
      3. Umieścić celę w termostabilnej komorze celi (25 °C) spektrofluorometru i ustawić wzbudzenie λ na 295 nm.
      4. Zapisz widmo fluorescencji (305-550 nm).
      5. Powtórzyć dodawanie ANS i zapis widm fluorescencyjnych powyżej stosunku molowego 1:1 ANS:N-domena.
      6. Odejmij ślepe widmo od każdego widma za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
      7. Wykreśl wszystkie widma na jednym wykresie.
      8. Określ, czy widma tworzą wzór podobny do FRET. Widma fluorescencji w domenie ANS-N tworzą wzór podobny do fret (Rysunek 3A).

4. Miareczkowanie fluorescencji wewnętrznej w domenie N za pomocą modyfikacji chemicznej Trp za pomocą NBS.

  1. Powtórz kroki 3.3.1 i 3.3.2.
  2. Dodać 1 μl podwielokrotności 1 mM wodnego roztworu podstawowego NBS do zawieszonej domeny N (1 μM), aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM NBS.
  3. Delikatnie homogenizować za pomocą mikropipety 20 razy, aby zapewnić jednorodność roztworu.
  4. Umieścić celę w termostabilnej komorze celi (25 °C) spektrofluorometru i ustawić wzbudzenie λ na 295 nm.
  5. Zapisz widmo fluorescencji (305-550 nm) (Rysunek 3B).
  6. Powtarzaj dodawanie NBS i zapis widm fluorescencji, aż do momentu zaobserwowania minimalnego wewnętrznego wygaszania fluorescencji w domenie N40. W domenie N zwykle występuje to przy stosunku molowym 5-6 NBS/N-domena40.
    UWAGA: NBS szybko wygasza (<5 s) wewnętrzną fluorescencję domeny N; Obserwuje się spadek intensywności fluorescencji. Przejdź natychmiast do następnego kroku, ponieważ NBS może również reagować z innymi resztami aminokwasowymi47.
  7. Odejmij ślepe widmo od każdego widma za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
  8. Wykreśl wszystkie widma na jednym wykresie (Rysunek 3B).

5. Miareczkować zmodyfikowaną przez NBS domenę N za pomocą ANS, rejestrując widma fluorescencji w temperaturze 25 °C.

  1. Wykonaj krok 3.3.3, używając zmodyfikowanej domeny N usługi NBS, która została wygenerowana w kroku 4.
  2. Odejmij ślepe widmo od każdego widma za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
  3. Wykreśl wszystkie widma na jednym wykresie (Rysunek 3C).
  4. Wygenerowane widma fluorescencji (Rysunek 3C) potwierdzają lub obalają występowanie FRET, tj. gdy występuje FRET, fluorescencja ANS nie wzrasta i odwrotnie.

6. Dowód na wiązanie ANS z chemicznie zmodyfikowaną domeną N poprzez wzbudzenie przy λ=370 nm.

  1. Wykonaj krok 3.3.3, używając zmodyfikowanej domeny N NBS, która została wygenerowana w kroku 4, ale zmieniając wzbudzenie λ na 370 nm.
  2. Odejmij ślepe widmo od każdego widma za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
  3. Wykreśl wszystkie widma na jednym wykresie (Rysunek 3D).
  4. Potwierdź wiązanie ANS z domeną N, obserwując wzrost intensywności fluorescencji ANS. Wiązanie ANS z domeną N wykazuje wzrost fluorescencji po wzbudzeniu przy λ=370 nm (Rysunek 3D). Jako kontrolę, widmo fluorescencji ANS (samego) w buforze fosforanowym 50 mM o pH 8,0 uzyskano wzbudzenie przy λ 295 i 370 nm (Rysunek 4, nie pokazany na filmie).
    UWAGA: Zależność stechiometryczna NBS:Trp, która jest wymagana do modyfikacji chemicznej, zależy od stopnia zakopania resztek Trp w badanym białku46,47,55,56. Dlatego zaleca się wcześniejsze określenie stosunku molowego NBS:białko/(Trp).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dokowanie molekularne wykazuje wiązanie ANS z miejscem wiązania nukleotydów domeny N poprzez oddziaływania elektrostatyczne oraz hydrofobowe (Rycina 1). Odległość molekularna (20 Å) między resztą Trp a ANS (związanym z miejscem wiązania nukleotydów) potwierdza występowanie FRET (Rycina 1). Zaprojektowana (zmodyfikowana) rekombinowana domena N została uzyskana z wysoką czystością za pomocą chromatografii powinowactwa (Rycina 2) i był...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Widma fluorescencyjne kompleksu ANS-domena N wykazują wzór podobny do FRET, gdy są wzbudzone przy λ 295 nm, podczas gdy odległość molekularna (20 A) między resztą Trp a ANS wydaje się potwierdzać występowanie FRET (Figura 1). Modyfikacja chemiczna Trp przez NBS powoduje mniej fluorescencyjną domenę N (Rysunek 3B, Widmo f); W związku z tym transfer energii nie jest możliwy. Widma fluorescencji ANS są podobne do widm niezmodyfikowanej domeny N, gdy są wzbudzone pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca została częściowo sfinansowana przez grant FAI-UASLP numer C19-FAI-05-89.89 oraz grant CONACYT numer 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). Autorzy dziękują za pomoc techniczną Juliana E. Mata-Moralesa w edycji wideo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AkrylamidBio-Rad1610107SDS-PAGE
Nadsiarczan amonuBio-Rad1610700SDS-PAGE
Kwas 8-anilino-1-naftalenosulfonowySigma-AldrichA1028Fluorofor
Bis-akryloamidBio-Rad1610125SDS-Page
N-BromosuccinimideSigma-AldrichB81255Chemiczny modyfikacja
N,N-dimetyloformamidJ.T. Baker9213-12Przygotowanie roztworu podstawowego
Izotiocyjanian fluoresceinySigma-AldrichF7250Etykieta fluorescencji chemicznej
Kuweta fluorescencyjnaHellmaZ801291Test fluorescencji
Spektrofluorometr fluorescencyjnyShimadzuRF 5301PCTest fluorescencji
HisTrap™ FFGE Healtcare11-0004-59Oczyszczanie białek
IPTG, bez dioksanuAmerican BionalyticalAB00841-00010Ekspresja białka
ImidazoleSigma-AldrichI5513-25GOczyszczanie białek
Pożywka LBFisher Scientific10000713Hodowla komórkowa
Pipetman L P10LGilsonFA10002MFluorescencja test
Pipetman L P100LGilsonFA10004MTest fluorescencyjny
Pipetman L P200LGilsonFA10005MTest fluorescencyjny
Pipetman L P1000LGilsonFA10006MTest fluorescencyjny
Pipetman L P5000LGilsonFA10007Test fluorescencyjny
Precision plus stdBio-Rad1610374SDS-PAGE
Dodecylosiarczan soduBio-Rad1610302SDS-PAGE
Fosforan sodu dwuzasadowyJ.T. Baker3828-19Przygotowanie buforu
Fosforan sodu jednozasadowyJ.T. Baker3818-01Przygotowanie buforu
Filtr strzykawkowy 0,2 umMiliporyGVWP04700Filtracja roztworu
TemedBio-Rad1610801STRONA SDS
TrisBio-Rad1610719SDS-STRONA

Bibliografia

  1. Munishkina, L. A., Fink, A. L. Fluorescence as a method to reveal structures and membrane-interactions of amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1768 (8), 1862-1885 (2007).
  2. Dong, X., Thomas, D. D. Time-resolved FRET reveals the structural mechanism of SERCA-PLB regulation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 449 (2), 196-201 (2014).
  3. Szilvay, G. R., Blenner, M. A., Shur, O., Cropek, D. M., Banta, S. A FRET-based method for probing the conformational behavior of an intrinsically disordered repeat domain from Bordetella pertussis adenylate cyclase. Biochemistry. 48 (47), 11273-11282 (2009).
  4. Sun, Y., Wallrabe, H., Booker, C. F., Day, R. N., Periasamy, A. Three-color spectral FRET microscopy localizes three interacting proteins in living cells. Biophysical Journal. 99 (4), 1274-1283 (2010).
  5. Cornea, R. L., et al. High-throughput FRET assay yields allosteric SERCA activators. Journal of Biomolecular Screening. 18 (1), 97-107 (2013).
  6. Gruber, S. J., et al. Discovery of enzyme modulators via high-throughput time-resolved FRET in living cells. Journal of Biomolecular Screening. 19 (2), 215-222 (2014).
  7. Dyla, M., et al. Dynamics of P-type ATPase transport revealed by single-molecule FRET. Nature. 551 (7680), 346-351 (2017).
  8. Corradi, G. R., Adamo, H. P. Intramolecular fluorescence resonance energy transfer between fused autofluorescent proteins reveals rearrangements of the N- and C-terminal segments of the plasma membrane Ca2+ pump involved in the activation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (49), 35440-35448 (2007).
  9. Piston, D. W., Kremers, G. -J. Fluorescent protein FRET: The good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
  10. Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
  11. Chen, Y., Barkley, M. D. Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. Biochemistry. 37 (28), 9976-9982 (1998).
  12. Zelent, B., et al. Tryptophan fluorescence yields and lifetimes as a probe of conformational changes in human glucokinase. Journal of Fluorescence. 27 (5), 1621-1631 (2017).
  13. Callis, P. R. Binding phenomena and fluorescence quenching. I: Descriptive quantum principles of fluorescence quenching using a supermolecule approach. Journal of Molecular Structure. 1077, 14-21 (2014).
  14. Callis, P. R. Binding phenomena and fluorescence quenching. II: Photophysics of aromatic residues and dependence of fluorescence spectra on protein conformation. Journal of Molecular Structure. 1077, 22-29 (2014).
  15. Agarwal, P. K., Geist, A., Gorin, A. Protein dynamics and enzymatic catalysis: Investigating the peptidyl-prolyl cis-trans isomerization activity of cyclophilin A. Biochemistry. 43 (33), 10605-10618 (2004).
  16. Deng, H., Zhadin, N., Callender, R. Dynamics of protein ligand binding on multiple time scales: NADH binding to lactate dehydrogenase. Biochemistry. 40 (13), 3767-3773 (2001).
  17. van de Weert, M. Fluorescence quenching to study protein-ligand binding: common errors. Journal of fluorescence. 20 (2), 625-629 (2010).
  18. van de Weert, M., Stella, L. Fluorescence quenching and ligand binding: A critical discussion of a popular methodology. Journal of Molecular Structure. 998 (1-3), 144-150 (2011).
  19. Stella, L., van de Weert, M., Burrows, H. D., Fausto, R. Fluorescence spectroscopy and binding: Getting it right. Journal of Molecular Structure. 1077, 1-3 (2014).
  20. Credi, A., Prodi, L. Inner filter effects and other traps in quantitative spectrofluorimetric measurements: Origins and methods of correction. Journal of Molecular Structure. 1077, 30-39 (2014).
  21. Lee, M. M., Peterson, B. R. Quantification of small molecule-protein interactions using FRET between tryptophan and the pacific blue fluorophore. ACS Omega. 1 (6), 1266-1276 (2016).
  22. Zhang, Y., et al. Comparison of FÖrster-resonance-energy-transfer acceptors for tryptophan and tyrosine residues in native proteins as donors. Journal of Fluorescence. 23 (1), 147-157 (2013).
  23. Xie, Y., Maxson, T., Tor, Y. Fluorescent ribonucleoside as a FRET acceptor for tryptophan in native proteins. Journal of the American Chemical Society. 132 (34), 11896-11897 (2010).
  24. Ghisaidoobe, A. B. T. T., Chung, S. J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins: A focus on Förster resonance energy transfer techniques. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 22518-22538 (2014).
  25. Goryashchenko, A. S., et al. Genetically encoded FRET-sensor based on terbium chelate and red fluorescent protein for detection of caspase-3 activity. International Journal of Molecular Sciences. 16 (7), 16642-16654 (2015).
  26. Arslanbaeva, L. R., et al. Induction-resonance energy transfer between the terbium-binding peptide and the red fluorescent proteins DsRed2 and TagRFP. Biophysics. 56 (3), 381-386 (2011).
  27. Di Gennaro, A. K., Gurevich, L., Skovsen, E., Overgaard, M. T., Fojan, P. Study of the tryptophan-terbium FRET pair coupled to silver nanoprisms for biosensing applications. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (22), 8838-8844 (2013).
  28. Hawe, A., Poole, R., Jiskoot, W. Misconceptions over Förster resonance energy transfer between proteins and ANS/bis-ANS: Direct excitation dominates dye fluorescence. Analytical Biochemistry. 401 (1), 99-106 (2010).
  29. Ghosh, U., Das, M., Dasgupta, D. Association of fluorescent probes 1-anilinonaphthalene-8-sulfonate and 4,4´-dianilino-1,1´-binaphthyl-5,5´-disulfonic acid with T7 RNA polymerase. Biopolymers. 72 (4), 249-255 (2003).
  30. Vreuls, C., et al. Guanidinium chloride denaturation of the dimeric Bacillus licheniformis BlaI repressor highlights an independent domain unfolding pathway. The Biochemical Journal. 384, 179-190 (2004).
  31. Möller, M., Denicola, A. Study of protein-ligand binding by fluorescence. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (5), 309-312 (2002).
  32. Chang, L., Wen, E., Hung, J., Chang, C. Energy transfer from tryptophan residues of proteins to 8-anilinonaphthalene-1-sulfonate. Journal of Protein Chemistry. 13 (7), 635-640 (1994).
  33. Togashi, D. M., Ryder, A. G. A fluorescence analysis of ANS bound to bovine serum albumin: Binding properties revisited by using energy transfer. Journal of Fluorescence. 18 (2), 519-526 (2008).
  34. Dela Cruz-Torres, V., Cataño, Y., Olivo-Rodríguez, M., Sampedro, J. G. ANS interacts with the Ca2+-ATPase nucleotide binding site. Journal of Fluorescence. 30 (3), 483-496 (2020).
  35. Gasymov, O. K., Glasgow, B. J. ANS fluorescence: Potential to augment the identification of the external binding sites of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1774 (3), 403-411 (2007).
  36. Matulis, D., Lovrien, R. 1-anilino-8-naphthalene sulfonate anion-protein binding depends primarily on ion pair formation. Biophysical Journal. 74 (1), 422-429 (1998).
  37. Samukange, V., Yasukawa, K., Inouye, K. Interaction of 8-anilinonaphthalene 1-sulphonate (ANS) and human matrix metalloproteinase 7 (MMP-7) as examined by MMP-7 activity and ANS fluorescence. Journal of Biochemistry. 151 (5), 533-540 (2012).
  38. Qin, J., et al. Selective and sensitive homogenous assay of serum albumin with 1-anilinonaphthalene-8-sulphonate as a biosensor. Analytica Chimica Acta. 829, 60-67 (2014).
  39. Malik, A., Kundu, J., Karmakar, S., Lai, S., Chowdhury, P. K. Interaction of ANS with human serum albumin under confinement: Important insights and relevance. Journal of Luminescence. 167, 316-326 (2015).
  40. Páez-Pérez, E. D., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. G. Nucleotide binding in an engineered recombinant Ca2+-ATPase N-domain. Biochemistry. 55 (49), 6751-6765 (2016).
  41. Sampedro, J. G., Nájera, H., Uribe-Carvajal, S., Ruiz-Granados, Y. G. Mapping the ATP binding site in the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Journal of fluorescence. 24 (6), 1849-1859 (2014).
  42. Abu-Abed, M., Millet, O., MacLennan, D. H., Ikura, M. Probing nucleotide-binding effects on backbone dynamics and folding of the nucleotide-binding domain of the sarcoplasmic/endoplasmic-reticulum Ca2+-ATPase. The Biochemical Journal. 379, Pt 2 235-242 (2004).
  43. Abu-Abed, M., Mal, T. K., Kainosho, M., MacLennan, D. H., Ikura, M. Characterization of the ATP-binding domain of the sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase: probing nucleotide binding by multidimensional NMR. Biochemistry. 41 (4), 1156-1164 (2002).
  44. Sazinsky, M. H., Mandal, A. K., Argüello, J. M., Rosenzweig, A. C. Structure of the ATP binding domain from the Archaeoglobus fulgidus Cu+-ATPase. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11161-11166 (2006).
  45. Liu, L., et al. Crystallization and preliminary X-ray studies of the N-domain of the Wilson disease associated protein. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 65 (6), 621-624 (2009).
  46. Banci, L., et al. The binding mode of ATP revealed by the solution structure of the N-domain of human ATP7A. Journal of Biological Chemistry. 285 (4), 2537-2544 (2010).
  47. Spande, T. F., Witkop, B. Determination of the tryptophan content of proteins with N-bromosuccinimide. Methods in Enzymology. 11, 498-506 (1967).
  48. Spande, T. F., Green, N. M., Witkop, B. The Reactivity toward N-bromosuccinimide of tryptophan in enzymes, zymogens, and inhibited enzymes. Biochemistry. 5 (6), 1926-1933 (1966).
  49. Rawat, U. B., Rao, M. B. Purification, kinetic characterization and involvement of tryptophan residue at the NADPH binding site of xylose reductase from Neurospora crassa. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1293 (2), 222-230 (1996).
  50. Zaki, M. J., Bystroff, C. Protein Structure Prediction. , Humana Press. Totowa, NJ. (2008).
  51. Wang, Z., et al. Comprehensive evaluation of ten docking programs on a diverse set of protein-ligand complexes: The prediction accuracy of sampling power and scoring power. Physical Chemistry Chemical Physics. 18 (18), 12964-12975 (2016).
  52. Pagadala, N. S., Syed, K., Tuszynski, J. Software for molecular docking: A review. Biophysical Reviews. , 91-102 (2017).
  53. Dolatkhah, Z., Javanshir, S., Sadr, A. S., Hosseini, J., Sardari, S. Synthesis, Molecular Docking, Molecular Dynamics Studies, and Biological Evaluation of 4 H -Chromone-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylate Derivatives as Potential Antileukemic Agents. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (6), 1246-1257 (2017).
  54. Forli, S., et al. Computational protein-ligand docking and virtual drug screening with the AutoDock suite. Nature Protocols. 11 (5), 905-919 (2016).
  55. Lindahl, E. R. Molecular dynamics simulations. Molecular Modeling of Proteins. Methods in Molecular Biology. 443, 3-23 (2008).
  56. Turk, T., Maček, P., Gubenšek, F. The role of tryptophan in structural and functional properties of equinatoxin II. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Protein Structure and Molecular. 1119 (1), 1-4 (1992).
  57. Peterman, B. F., Laidler, K. J. Study of reactivity of tryptophan residues in serum albumins and lysozyme by N-bromosuccinamide fluorescence quenching. Archives of Biochemistry and Biophysics. 199 (1), 158-164 (1980).
  58. Divita, G., Goody, R. S., Gautheron, D. C., Di Pietro, A. Structural mapping of catalytic site with respect to α-subunit and noncatalytic site in yeast mitochondrial F1-ATPase using fluorescence resonance energy transfer. Journal of Biological Chemistry. 268 (18), 13178-13186 (1993).
  59. Horrocks, W. D., Holmquist, B., Vallee, B. L. Energy transfer between terbium (III) and cobalt (II) in thermolysin: a new class of metal-metal distance probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 4764-4768 (1975).
  60. Chakraborty, J., Das, N., Halder, U. C. Unfolding diminishes fluorescence resonance energy transfer (FRET) of lysine modified β-lactoglobulin: Relevance towards anti-HIV binding. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 102 (1), 1-10 (2011).
  61. Sirangelo, I., Malmo, C., Casillo, M., Irace, G. Resolution of Tryptophan-ANS Fluorescence Energy Transfer in Apomyoglobin by Site-directed Mutagenesis. Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 381-384 (2007).
  62. Ribeiro, A. J. M., Tyzack, J. D., Borkakoti, N., Holliday, G. L., Thornton, J. M. A global analysis of function and conservation of catalytic residues in enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 314-324 (2020).
  63. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Exposure of tryptophanyl residues in proteins. Quantitative determination by fluorescence quenching studies. Biochemistry. 15 (3), 672-680 (1976).
  64. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Fluorescence quenching of indole and model micelle systems. The Journal of Physical Chemistry. 80 (5), 486-493 (1976).
  65. Kinsley, N., Sayed, Y., Mosebi, S., Armstrong, R. N., Dirr, H. W. Characterization of the binding of 8-anilinonaphthalene sulfonate to rat class Mu GST M1-1. Biophysical Chemistry. 137 (2-3), 100-104 (2008).
  66. Mohsenifar, A., et al. A study of the oxidation-induced conformational and functional changes in neuroserpin. Iranian Biomedical Journal. 11 (1), 41-46 (2007).
  67. Gonzalez, W. G., Miksovska, J. Application of ANS fluorescent probes to identify hydrophobic sites on the surface of DREAM. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (9), 1472-1480 (2014).
  68. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Fluorescence quenching studies with proteins. Analytical Biochemistry. 114 (2), 199-227 (1981).
  69. Poulos, T. L., Price, P. A. The identification of a tryptophan residue essential to the catalytic activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease. The Journal of biological chemistry. 246 (12), 4041-4045 (1971).
  70. Hu, J. -J., He, P. -Y., Li, Y. -M. Chemical modifications of tryptophan residues in peptides and proteins. Journal of Peptide Science An Official Publication of the European Peptide Society. 27 (1), 3286(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Modyfikacja tryptofanuwi zanie ANStest FRETwygaszanie N bromosuccynimidemdomena N pompy SERCAspektroskopia fluorescencyjnawygaszanie fluorescencji bia ekdokowanie molekularnemiejsce wi zania ATPoczyszczanie bia ek rekombinowanych
Modyfikacja chemiczna reszty tryptofanu w rekombinowanej domenie NCa2+-ATPazy do badania tryptofanu-ANS FRET
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.