Ten artykuł przedstawia unikalną metodę analizy interakcji gospodarz-mikrobiom przy użyciu nowatorskiego systemu hodowli narządów jelitowych do eksperymentów ex vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
System hodowli jelit i narządów do analizy interakcji między gospodarzem a mikrobiotą
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Struktura tkanki jelitowej umożliwia bliskie i wzajemne interakcje między gospodarzem a mikrobiotą jelitową. Te wzajemne rozmowy mają kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy lokalnej i ogólnoustrojowej; Zmiany w składzie mikrobioty jelitowej (dysbioza) wiążą się z wieloma chorobami u ludzi. Metody analizy interakcji między gospodarzem a mikrobiotą obejmują nieodłączny kompromis między zachowaniem fizjologicznej struktury tkanki (w przypadku stosowania modeli zwierzęcych in vivo) a poziomem kontroli nad czynnikami eksperymentalnymi (jak w prostych systemach hodowli komórkowych in vitro). Aby rozwiązać ten problem, Yissachar i in. opracowali niedawno system hodowli narządów jelitowych. System zachowuje naiwną budowę tkanki jelita grubego i mechanizmy komórkowe, a także pozwala na ścisłą kontrolę eksperymentalną, ułatwiając eksperymenty, których nie można łatwo przeprowadzić in vivo. Jest optymalna do analizowania krótkoterminowych reakcji różnych składników jelitowych (takich jak elementy nabłonkowe, immunologiczne i neuronalne) na zaburzenia świetlne (w tym drobnoustroje beztlenowe lub tlenowe, całe próbki mikrobioty myszy lub ludzi, leki i metabolity). W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis zoptymalizowanego protokołu hodowli narządowej wielu fragmentów jelita przy użyciu specjalnie wykonanego urządzenia do hodowli jelit. Reakcje gospodarza na zaburzenia świetlne można uwidocznić za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego skrawków tkanek lub całych fragmentów tkanki, fluorescencyjnej hybrydyzacji in-situ (FISH) lub obrazowania poklatkowego. System ten obsługuje szeroki zakres odczytów, w tym sekwencjonowanie nowej generacji, cytometrię przepływową oraz różne testy komórkowe i biochemiczne. Ogólnie rzecz biorąc, ten trójwymiarowy system hodowli narządów wspomaga hodowlę dużych, nienaruszonych tkanek jelitowych i ma szerokie zastosowanie w analizie i wizualizacji interakcji między gospodarzem a mikrobiotą w lokalnej rozdzielczości w lokalnym środowisku jelitowym.
Wprowadzenie
Jelitka to niezwykle złożony organ zawierający szeroką gamę typów komórek (komórki nabłonkowe, komórki układu odpornościowego, neurony i inne), zorganizowanych w specyficzną strukturę, która umożliwia komórkom interakcję i komunikację między sobą oraz z treścią światła jelita (mikrobiotą, pożywieniem itp.)1. Obecnie zestaw narzędzi badawczych dostępnych do analizy interakcji gospodarz-mikrobiota obejmuje hodowle komórkowe in vitro oraz modele zwierzęce in vivo2. Modele zwierzęce in vivo zapewniają fizjologiczną konstrukcję tkankową3, lecz charakteryzują się słabą kontrolą eksperymentalną i ograniczoną możliwością manipulowania warunkami doświadczenia. Z kolei systemy hodowli in vitro wykorzystują komórki pierwotne lub linie komórkowe, które mogą być uzupełnione o mikroby4, co oferuje ścisłą kontrolę nad parametrami eksperymentu, ale wiąże się z brakiem złożoności komórkowej i architektury tkankowej. Nowoczesne testy in vitro umożliwiają zaawansowane wykorzystanie zdrowych i patologicznych próbek tkanek ludzkich, takich jak organoidy nabłonkowe pochodzenia mysiego lub ludzkiego5,6, oraz próbek naśladujących mikrośrodowisko śluzówkowe7. Innym przykładem jest test „jelito na chipie” (gut on a chip), który obejmuje ludzką linię komórek nabłonkowych okrężnicy (Caco2), macierz zewnątrzkomórkową i kanały mikrofluidyczne, aby naśladować warunki fizjologiczne niezmiennika jelitowego8. Jednakże, mimo że próbki in vitro mogą być zaawansowane i innowacyjne, nie zachowują one normalnej architektury tkankowej ani naiwnego składu komórkowego.
Aby temu zaradzić, Yissachar i wsp. opracowali niedawno ex vivo system hodowli organów9 (Rycina 1), która pozwala na zachowanie nienaruszonych fragmentów jelita ex vivokorzystając z zalet obu tych rozwiązań in vivo i in vitro modele. To ex vivo System hodowli organów jelita opiera się na specjalnie zaprojektowanym urządzeniu do hodowli, które umożliwia wielokanałową hodowlę sześciu tkanek okrężnicy, co pozwala na badanie czynników eksperymentalnych w porównywalnych warunkach przy jednoczesnej kontroli dopływów i odpływów systemu. Niedawne prace wykazały, że system ten jest wartościowy w analizie odpowiedzi jelit na poszczególne bakterie jelitowe.9, próbki całkowitego mikrobiomu człowieka10 oraz metabolity drobnoustrojów11System ten umożliwia po raz pierwszy badanie tych wczesnych interakcji między gospodarzem a mikrobiotą przy wysokim stopniu kontroli nad komponentami gospodarza, mikrobiologicznymi oraz środowiskowymi. Ponadto pozwala on na monitorowanie i manipulowanie systemem w czasie rzeczywistym przez cały czas trwania eksperymentu.
Rycina 1: Schemat urządzenia do hodowli jelitowej. Cały fragment tkanki jelitowej jest przymocowany do portów wylotowego i wlotowego komory (góra), a pompy regulują przepływ medium wewnątrz światła oraz w zewnętrznej komorze z medium. Całe urządzenie (dół) zawiera 6 takich komór. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Yissachar et al. 2017. Kliknij tutaj, aby wyświetlić rycinię w powiększeniu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami zatwierdzonymi przez komisję etyki ds. dobrostanu zwierząt.
1. Przygotowanie do eksperymentu
- Wykonanie urządzenia do hodowli narządów jelitowych (3 dni)
- Za pomocą drukarki 3D wydrukuj plastikowe formy wielokrotnego użytku do urządzenia do hodowli narządów (urządzenie posiada 6 studzienek, z 24 małymi i dużymi otworami oraz do pokrywy urządzenia) (w załączeniu pliki 3D).
UWAGA: Te plastikowe formy mogą być używane do produkcji wielu urządzeń. - Włóż igły z końcami (22 G i 18 G) do odpowiedniej pozycji w formie urządzenia i odlej około 20 g mieszanki polidimetylosiloksanu (PDMS) (stosunek wagowy 1:10, zasada do katalizatora) na jeden zestaw urządzenia i pokrywki.
- Umieść foremki w komorze próżniowej na 30 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza z mieszanki PDMS.
- Inkubować pleśnie w temperaturze 55 °C przez noc, aby zakończyć polimeryzację PDMS.
- Po ustawieniu PDMS wyciągnij igły z formy i ostrożnie zwolnij urządzenie do hodowli i pokrywkę z plastikowych foremek.
- Usuń pozostałości PDMS z obrysu studni za pomocą ostrza chirurgicznego. Przymocuj urządzenie PDMS i pokrywę urządzenia do szkła nakrywkowego (mikroszkiełka 75 mm x 50 mm) za pomocą nietoksycznego kleju silikonowego i pozostaw części do zastygnięcia na noc (nałóż klej na gładką stronę urządzenia).
- Włóż dwanaście igieł 22 G do światła i dwanaście igieł 18 G do studzienki. Zamocuj wszystkie igły na miejscu za pomocą silikonu i pozostaw na noc. Włóż dwie igły 18 G do pokrywy, aby zapewnić prawidłowy przepływ powietrza do i z urządzenia do hodowli narządów jelitowych.
- Sprawdź wszystkie igły pod kątem wycieków za pomocą strzykawki wypełnionej wodą. Sprawdź, czy nie ma wycieków ze studni, napełniając studnie wodą.
- Umieść dwa węzły chirurgiczne na każdej igle 22 G, która zostanie połączona z okrężnicą. Umieść urządzenie i pokrywkę w papierowej torbie autoklawu i sterylizuj w autoklawie.
- Za pomocą drukarki 3D wydrukuj plastikowe formy wielokrotnego użytku do urządzenia do hodowli narządów (urządzenie posiada 6 studzienek, z 24 małymi i dużymi otworami oraz do pokrywy urządzenia) (w załączeniu pliki 3D).
- Pożywka hodowlana (0,5 h)
- W kapturze biologicznym wymieszaj następujące składniki (w probówce o pojemności 50 ml): 37 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove (IMDM), 10 ml zamiennika surowicy KSR, 1 ml suplementu B27, 0,5 ml suplementu N2, 0,5 ml 1 M buforu HEPES i 0,5 ml aminokwasów endogennych.
- Przefiltrować i przechowywać całe podłoże w temperaturze 4 °C.
- Przygotowanie rurek i narzędzi chirurgicznych
- Wytnij odpowiednią długość rurek dla światła wejściowego, studzienki wejściowej, światła wyjściowego i studni wyjściowej (12 krótkich rurek i 12 długich rurek). Podłącz odpowiedni adapter z każdej strony rurki.
- Przygotuj narzędzia chirurgiczne: proste nożyczki, 4x cienkie kleszcze i 2x ostre kleszcze.
- Umieść probówki i narzędzia chirurgiczne w papierowej torbie autoklawu i wysterylizuj je w autoklawie.
- Przygotuj wejście światła (pożądana stymulacja - bakterie, stolec, leki itp.).
- Przed eksperymentem należy określić obciążenie bakteryjne kultury bakteryjnej za pomocą seryjnych rozcieńczeń12 i hodowli w warunkach tlenowych i/lub beztlenowych.
- Po obliczeniu obciążenia bakteryjnego należy rozcieńczyć kultury bakteryjne w sterylnej pożywce do hodowli tkankowych, aby uzyskać wymagane stężenie bakterii. W przypadku próbek kału należy przefiltrować za pomocą sitka o średnicy 100 μm.
UWAGA: W przypadku stymulacji niebakteryjnej (leki, metabolity itp.) należy rozcieńczyć substancję do wymaganego stężenia za pomocą pożywki do hodowli jelit .
2. Przygotowanie do eksperymentu
- Wewnątrz inkubatora do hodowli narządów włączyć grzałkę i ustawić ją na 37 °C.
- Ustawić pompy, a także strzykawki wejściowe i wyjściowe.
- Wprowadzenie pożywki do hodowli tkankowych
- W okapie z przepływem biologicznym lub laminarnym napełnić strzykawki studzienki wejściowej kompletną pożywką hodowlaną. Ostateczna objętość zależy od czasu trwania eksperymentu i natężenia przepływu; zwykle 1 ml/h plus dodatkowa pożywka do przedmuchiwania.
- Podłączyć rurki do strzykawek za pomocą adaptera Luer-lock. Umieścić napełnione strzykawki w pompkach strzykawkowych.
- Opróżnić strzykawki wejściowe. Upewnij się, że medium studzienkowe wypływa ze wszystkich probówek do szklanki na odpady.
- Wejście luminalne
- Napełnij strzykawki z dopływem światła z leczeniem stymulującym (bakterie, leki itp.). Objętość zależy od czasu trwania eksperymentu i natężenia przepływu (zwykle 30 μl/h plus dodatkowe medium do przedmuchiwania).
- Podłączyć rurki do strzykawek za pomocą adaptera Luer-lock. Umieścić napełnione strzykawki w pompkach strzykawkowych.
- Przedmuchnąć strzykawki wejściowe. Upewnij się, że stymulacja wypływa ze wszystkich rurek do szklanki na odpady. Uważaj, aby nie zanieczyścić różnych stymulacji.
- Wyjść
- Umieścić puste strzykawki w wyjściowych pompach strzykawkowych (ustawić tryb pompy na "wycofanie").
- Konfiguracja urządzenia
- Ustaw regulator kontrolujący natężenie przepływu mieszaniny gazowej (95%O2 + 5% CO2 ), aby uzyskać delikatny, minimalny przepływ.
- Sprawdź urządzenie w okapie laminarnym.
- Przepłucz igły urządzenia sterylnym IMDM, aby umyć igły.
- Dodać 500 μl sterylnej pożywki hodowlanej do każdego dołka urządzenia.
- Przygotowanie do wypreparowania tkanek
- Umieść sterylne narzędzia chirurgiczne w kapturze laminarnym.
- Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml sterylnym IMDM i podłącz sterylną (autoklawowaną) igłę 22 G z końcem do płukania jelita grubego.
3. Hodowle narządów
- Składanie ofiar na myszach i sekcja tkanek
- W kapturze laminarnym poświęć 12-14 dniowe myszy przez ścięcie. Spryskaj myszy 70% etanolem i umieść myszy na plastikowej płytce.
- Za pomocą ostrych nożyczek i kleszczy rozetnij mysz i wyjmij przewód pokarmowy od żołądka do odbytu, przecinając cały tłuszcz i tkankę łączną. Wytnij dwukropek i umieść go na nowym talerzu.
UWAGA: Zminimalizuj kontakt z tkanką jelita grubego. Nie dotykaj środkowej części tkanki okrężnicy. Trzymaj tkankę delikatnie i tylko na krawędziach tkanki.
- Płukanie i mycie jelita grubego
- Pod mikroskopem preparacyjnym delikatnie przepłukać zawartość jelita grubego sterylnym IMDM (po stronie proksymalnej) za pomocą przygotowanej strzykawki o pojemności 10 ml (krok 2.7.2). Po usunięciu kału z tkanki jelitowej umieść okrężnicę w nowej 6-dołkowej płytce wypełnionej 0,5 ml sterylnego IMDM.
- Podłączanie dwukropka do urządzenia
- Weź chusteczkę i ostrożnie połącz ją z igłą 22 G i mocno zawiąż dwiema nitkami. W tym momencie konieczne jest utrzymanie prawidłowej orientacji jelita grubego do przepływu światła (proksymalnie = wejście, dystalnie = wyjście). Powtórz kroki 3.2-3.3 dla wszystkich 6 tkanek.
- Sprawdź, czy zamki Luer igły wejściowej są puste z podłoża. Jeśli nie, opróżnij je. Dodaj stymulacje do igły wejściowej Luer lock (aby uniknąć przedostawania się pęcherzyków powietrza do światła). Powtórz ten krok dla każdej okrężnicy z odpowiednią stymulacją.
- Sprawdź, czy wszystkie chusteczki są połączone i umieść pokrywę na górze urządzenia.
- Podłączanie urządzenia do hodowli narządów do pomp
- Umieść urządzenie w nagrzanej komorze z kontrolowaną temperaturą (37 °C).
- Podłącz przepływ gazu
- Podłącz adapter gazu do pokrywy za pomocą odpowiedniej igły wejściowej.
- Podłącz lampy wejściowe i wyjściowe do urządzenia.
UWAGA: Podłącz bliższą stronę okrężnicy do wanien wejściowych.
- Oczyść światło za pomocą wejść stymulacyjnych.
- Delikatnie przeprowadź stymulację świetlną przez jelito i sprawdź przepływ medium w rurkach wyjściowych.
- Umyj medium zewnętrzne.
- Umyj medium zewnętrzne 3 razy (ustaw pompy na szybkość 600 μl/min zarówno dla studni wejściowej, jak i wyjściowej). Każde mycie trwa 1 minutę (zaczynając od opróżnienia studzienki).
- Rozpocznij eksperyment.
- Uruchom pompy z następującymi szybkościami:
Natężenie przepływu: lumen: wejście- 30 μL/h, wyjście- 35 μL/h
Medium zewnętrzne: wejście- 1000 μL/h, wyjście- 950 μL/h
UWAGA: Czas eksperymentu może wahać się od 30 min do 24 h.
- Uruchom pompy z następującymi szybkościami:
- Koniec doświadczenia (do 24 godzin w przypadku posiewów narządów jelita grubego)
- Odłącz wszystkie rurki od urządzenia.
- Odłącz tkanki od igieł i przejdź do żądanych odczytów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
System hodowli organów jelitowych utrzymuje żywotność tkanki ex vivo. Ocenę żywotności tkanki przeprowadzono przez cały okres hodowli. Fragmenty tkanki okrężnicy inkubowano w systemie hodowli organów jelitowych i utrwalono po 2/12/24 h hodowli. Integralność warstwy komórek nabłonkowych jelit (IEC) zwalidowano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego z użyciem przeciwciał przeciwko E-kadherynie i cytokeratynie-18. Podobnie, w nabłonku okrężnicy wykryto wypełnione śluzem komórki kubkowe i wydzielanie śluzu do ś...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym artykule opisano zoptymalizowany protokół dla hodowli narządów jelitowych ex vivo , który Yissachar i wsp. opracowali niedawno (opublikowane9 i niepublikowane dane). System hodowli narządów jelitowych obsługuje multipleksowaną hodowlę nienaruszonych fragmentów jelita przy jednoczesnym utrzymaniu przepływu światła. Zapewnia pełną kontrolę nad środowiskiem wewnątrz- i zewnętrznym (w tym nad dawką stymulacji, czasem ekspozycji i szybkością przepływu) oraz zachowuje pierwotną strukturę ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy byłym i obecnym członkom laboratorium Yissachar za ich cenny wkład w optymalizację protokołu systemu hodowli narządów jelitowych. Dziękujemy Yael Laure za krytyczną redakcję rękopisu. Praca ta była wspierana przez Izraelską Fundację Naukową (grant nr 3114831), Izraelską Fundację Naukową - Wspólny Program Szerokiego Instytutu (grant nr 8165162) oraz Gassner Fund for Medical Research z Izraela.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Device | |||
| 18 igła o grubości | Mcmaster | 75165a754 | |
| 22 igła | Mcmaster | 75165a758 | |
| Uniwersalny klej Selant 100% silikon | DAP | 688 | |
| Sześcienny eksykator próżniowy VDC-21+ 2 półki | AAAD4021 | ||
| szkiełko 1 Mini | inkubator Corning | 2947-75X50 | |
| im-10 | AAH24315K | ||
| MPC 301E POMPA | VI-412711 | ||
| Plastikowe zaślepki szybkoobrotowe do rur | Mcmaster | 51525k121 | |
| plastikowe gniazda szybkozłączki rurowe | Mcmaster | 52525k211 | |
| Sylgard 184 Elastomer | silikonowy Dow | Polidimetylosiloksan, rurki PDMS | |
| Mcmaster | 6516t11 | ||
| Zortrax M200 | Zortrax | Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360 | |
| Zortrax M200 Materiały: z-ultrat | Zortrax | ||
| Medium | |||
| B27 Suplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | ||
| 17504044 HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | |
| Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's firmy Iscove z czerwienią fenolową (1x) | Thermo Fisher Scientific | 12440061 | |
| Serum do nokautowania | Suplement Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| N2 (100x) | Thermo Fisher Scientific | A1370701 | |
| Non Niezbędny aminokwas (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Narzędzia chirurgiczne | |||
| Large Nożyczki | Aseltech | 11-00-10 | |
| Ostre kleszcze | FST | 11297-10 | |
| Jedwabna pleciona nić chirurgiczna | SMI | 8010G | |
| Proste nożyczki | FST | 14091-09 | |
| Cienkie kleszcze | FST | 11051-10 | |
| Organ System | |||
| 0,1 µ m | Gen | ||
| 0,22 i mikro; m Gen | żywotności | ||
| 5 mL Strzykawka Luer Lock | BD | 309649 | |
| Mikroskop stereoskopowy Greenough | ZEISS | Stemi 305 | |
| Recyrkulacyjna precyzyjna nagrzewnica powietrza "CUBE" | CUBE-2-LIS | ||
| Pompa strzykawkowa | New Era Pump Systems Inc | NEP-NE-1600-EM |
Bibliografia
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Pearce, S. C., et al. Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors. Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).
- Hooper, L. V., et al. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine. Science. 291 (5505), 881-884 (2001).
- Haller, D., et al. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61 (7), 1007-1015 (2012).
- Gazzaniga, F. S., et al. Harnessing Colon Chip Technology to Identify Commensal Bacteria That Promote Host Tolerance to Infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 638014(2021).
- Yissachar, N., et al. An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk. Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).
- Duscha, A., et al. Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism. Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).
- Grosheva, I., et al. High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function. Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).
- Blaize, J. F., Corbo, C. P. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
- Schnupf, P., et al. Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro. Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Atarashi, K., et al. Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells. Cell. 163 (2), 367-380 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
