Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Znakowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu monitorowania migracji i wychwytu w eksplantatach chrząstki

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62780

⸱

4 października 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Therapy and Tissue Engineering Group, Research Institute on Health Sciences (IUNICS), University of the Balearic Islands, 2Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa), 3Cellomics Unit, Institut Universitari d'Investigació en Ciències de la Salut (IUNICS), Universitat de les Illes Balears, 4Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (FBSTIB)

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z lizatu płytkowego w celu monitorowania ich migracji i pobierania w eksplantatach chrząstek, używanych jako model choroby zwyrodnieniowej stawów.

Streszczenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) są używane w różnych badaniach, aby udowodnić ich potencjał jako leczenie bezkomórkowe, ze względu na ich ładunek pochodzący ze źródła komórkowego, takiego jak lizat płytkowy (PL). Oczekuje się, że w przypadku stosowania w leczeniu EV dotrą do komórek docelowych i wywołają z nich odpowiedź. W tym badaniu EV pochodzące z PL zostały zbadane jako bezkomórkowe leczenie choroby zwyrodnieniowej stawów (OA). W związku z tym stworzono metodę znakowania EV i testowania ich wchłaniania na eksplantatach chrząstek. EV pochodzące z PL są znakowane lipofilowym barwnikiem PKH26, dwukrotnie przemywane przez kolumnę, a następnie testowane w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów in vitro napędzanym stanem zapalnym przez 5 godzin po kwantyfikacji cząstek za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Co godzinę eksplantaty chrząstki są utrwalane, parafinowane, cięte na sekcje 6 μm w celu zamontowania na szkiełkach i obserwowane pod mikroskopem konfokalnym. Pozwala to na weryfikację, czy EV dostają się do komórek docelowych (chondrocytów) w tym okresie i analizę ich bezpośredniego działania.

Wprowadzenie

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) jest chorobą zwyrodnieniową stawów, która implikuje postępujące i nieodwracalne zapalenie oraz zniszczenie macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki stawowej1. Chociaż różne formy zapalenia stawów mają liczne metody leczenia2,3,4, są one ograniczone przez ich skutki uboczne i ograniczoną skuteczność. Techniki inżynierii tkankowej wykorzystujące autologiczną implantację chondrocytów są rutynowo stosowane do leczenia regeneracyjnego uszkodzonej chrząstki we wczesnych uszkodzeniach chrząstki zwyrodnieniowej stawów4. Terapie komórkowe są ograniczone głównie ze względu na ograniczoną liczbę fenotypowo stabilnych chondrocytów lub chondroprogenitorów zdolnych do skutecznej naprawy chrząstki3. Dlatego tak ważne jest opracowanie nowych strategii terapeutycznych zapobiegających postępowi choroby i regeneracji dużych zmian w chrząstce.

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) zostały zasugerowane jako metoda leczenia choroby zwyrodnieniowej stawów przez różnych autorów5,6. EV są błoniastymi ciałami wydzielanymi przez większość typów komórek, biorą udział w sygnalizacji międzykomórkowej i wykazano, że wywierają terapeutyczne działanie komórek macierzystych7,8,9, dzięki czemu ostatnio wzbudziły zainteresowanie medycyną regeneracyjną10. EV pochodzące z mezenchymalnych komórek zrębowych (MSC) są głównymi terapeutycznymi EV badanymi pod kątem choroby zwyrodnieniowej stawów, chociaż jako źródła EV stosowano inne komórki związane ze stawami, np. chondroprogenitory lub komórki odpornościowe11,12.

Koncentraty płytek krwi, takie jak lizaty płytkowe (PL), są używane do przyspieszenia gojenia się ran w różnych urazach, takich jak owrzodzenia rogówki13,14,15 lub w regeneracji tkanek ścięgien16, ze względu na hipotezę, że składnik EV koncentratów płytek krwi może być odpowiedzialny za te efekty17. Niektóre badania związane z chorobami związanymi ze stawami wykorzystują płytki krwi (PL-EVs) jako leczenie w celu złagodzenia stanów zwyrodnieniowej stawów. PL-EV poprawiają proliferację chondrocytów i migrację komórek poprzez aktywację szlaku Wnt/β-kateniny 18, promowanie ekspresji markerów chondrogennych w chondrocytach z chorobą zwyrodnieniową stawów19, lub wykazywanie wyższych poziomów białek chondrogennych i mniej nieprawidłowości tissular u królików z chorobą zwyrodnieniową stawów leczonych PL-EVs18.

EV zawierają białka, lipidy i kwasy nukleinowe, które są uwalniane do komórki docelowej, ustanawiając komunikację między komórkami, co jest główną cechą związaną z ich zastosowaniami terapeutycznymi20. Skutki działania pojazdów elektrycznych zależą od ich dotarcia do ogniw i późniejszego uwolnienia ładunku. Efekt ten może być potwierdzony pośrednio przez zmiany zachodzące w komórkach, takie jak aktywność metaboliczna czy modyfikacja ekspresji genów. Metody te nie pozwalają jednak na wizualizację, w jaki sposób EV docierają do komórek, aby pełnić swoją funkcję. W związku z tym w niniejszym artykule przedstawiono metodę oznaczania tych EV pochodzących z PL, które mają być stosowane w leczeniu eksplantatów chrząstki zwyrodnieniowej stawów wywołanych stanem zapalnym. Mikroskopię konfokalną wykorzystano do monitorowania wychwytu EV i progresji do chondrocytów obecnych w eksplantatach w czasie poklatkowym wynoszącym 5 godzin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Eksplantaty chrząstek zostały uzyskane z IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi po etycznym zatwierdzeniu projektu przez CEI-IB (IB 3656118 PI).

1. Przygotowanie kolumny

  1. Wyrównać kolumny zgodnie z instrukcjami producenta lub w następujący sposób:
    1. Zdejmij nasadkę kolumny i wyrównaj kolumnę. Usuń bufor pamięci masowej przez elucję.
    2. Przemyć kolumnę 3 razy 2,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Podczas każdego prania poczekaj, aż kolumna wchłonie całą objętość.
      UWAGA: Nie pozwól, aby kolumna wyschła.
    3. Przykryj kolumnę nasadką po ostatnim płukaniu i do czasu przygotowania próbki.

2. Oznakowanie EV

UWAGA: Ten protokół oznaczania EV wykorzystuje próbkę PL-EV wcześniej wyizolowaną metodą chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) z poprzednio opisanymi warunkami21,22. Jednak każda próbka EV z dowolnego źródła może być używana z tym protokołem.

  1. Zagęścić próbkę EV i próbkę kontrolną (PBS) za pomocą rurki zagęszczającej.
    1. Umieścić próbki w probówce zagęszczającej o pojemności 15 ml lub 500 μl, w zależności od początkowej objętości próbki EV. Odwirować probówki zgodnie z instrukcjami producenta, aż do uzyskania prawie suchej próbki.
      UWAGA: Próbka kontrolna jest niezbędna do sprawdzenia, czy nie ma tła barwnika. Chociaż metoda ta nie wymaga określonej objętości początkowej, należy wziąć pod uwagę, że około 10% cząstek zostanie utraconych podczas etapów oczyszczania.
  2. Zawiesić zagęszczone próbki rozcieńczalnikiem C. Zawiesić próbki EV w 200 μl, a grupę kontrolną w 100 μl i przenieść je do nowych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
  3. Rozdzielić próbkę EV na dwie podwielokrotności po 100 μl. Oznaczyć jedną z nich barwnikiem i użyć jako obróbki (PKH-PL-EV); drugą pozostawić nieoznaczoną, ale przetworzyć ją (NTA-PL-EV) jak próbkę EV i użyć jej do ilościowego określenia stężenia EV przez NTA.
  4. Przygotować 2x roztwór barwnika, w wyniku czego otrzymamy 8 μM roztworu PKH26 w rozcieńczalniku C.
  5. Zmieszać 1 μl 1 mM łącznika PKH26 na 125 μl rozcieńczalnika C w próbce. Przygotować objętość wymaganą do dodania do próbek w stosunku 1:1.
  6. Dodać 2x roztwór barwnika do PKH-PL-EV i próbek kontrolnych w stosunku 1:1, aby uzyskać 1x stężenie barwnika i 4 μM stężenie PKH26. Dodać tę samą objętość PBS do próbki NTA-PL-EV. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Dodać 5% roztwór albuminy bydlęcej-PBS do próbek w stosunku 1:1 i upewnić się, że końcowa objętość wynosi ~400 μL.
    UWAGA: Ten krok umożliwia usunięcie niespecyficznych interakcji barwnika lub barwnika niezwiązanego.
  8. Kontynuuj oddzielanie oznakowanych EV od niezwiązanego barwnika i niespecyficznych interakcji barwnika z kolumną.

3. Izolacja oznaczona jako EV

  1. Zdjąć nakrętkę z kolumny, dodać 400 μl próbki (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV lub kontrolnej) i wyrzucić całą eluowaną ciecz.
  2. Poczekaj, aż próbka całkowicie wejdzie do kolumny, zanim przejdziesz do następnego kroku. Dodać 600 μl PBS i wylać cały eluowany płyn.
  3. Poczekaj, aż PBS całkowicie wejdzie do kolumny, zanim przejdziesz do następnego kroku. Dodaj 600 μl PBS i zbierz frakcję 600 μl w 1,5. probówka wirówkowa o pojemności ml (EV lub kontrolna).
    UWAGA: Te kroki są potrzebne, aby usunąć nadmiar barwnika z próbek. Kolejna separacja według kolumn jest potrzebna do uzyskania czystszych EV. W związku z tym następujące kroki należy wykonać w nowej kolumnie zrównoważonej (krok 4.1.) lub w tej samej kolumnie po wstępnym etapie mycia (krok 4.2).
  4. Przygotuj kolumnę do nowego etapu separacji EV, aby uzyskać czystsze EV. Jeśli jest to nowa kolumna, powtórz kroki 2.1. oraz 2.2. Jeśli jest to ta sama kolumna, przemyć ją 2,5 ml 20% izopropanolu, a następnie powtórzyć kroki 2.1 i 2.2.
  5. Dodać 600 μl wcześniej eluowanych EV otrzymanych w kroku 2.5 do kolumny i wyrzucić wymywaną objętość. Poczekaj, aż ciecz całkowicie dostanie się do kolumny, zanim przejdziesz do następnego kroku.
  6. Dodać 400 μl PBS i wyrzucić całą eluowaną objętość. Poczekaj, aż ciecz całkowicie dostanie się do kolumny, zanim przejdziesz do następnego kroku.
  7. Dodać 600 μl PBS i zebrać frakcję 600 μl w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wykorzystać EV i próbki kontrolne do dalszych analiz lub przechowywać je przez noc w temperaturze 4 oC.
  8. Przechowuj używane kolumny do wykorzystania w przyszłości.
    1. Przemyć kolumnę 25 ml 20% izopropanolu i wyrzucić wymytą objętość. Przemyć kolumnę 3 razy 2,5 ml PBS.
    2. Dodaj bufor magazynu usunięty w kroku 1.1.1 i poczekaj, aż bufor wejdzie do kolumny. Przykryć kolumnę nakrętką i przechowywać w temperaturze 4 oC do następnego użycia.

4. Kwantyfikacja EV

  1. Przygotować rozcieńczenia w stosunku 1:1 000 próbki NTA-PL-EV i początkowej próbki PL-EV zgodnie z opisem w poniższych dwóch krokach.
    1. Przygotować 1 ml rozcieńczonego w stosunku 1:10 NTA-PL-EV i 1 ml rozcieńczonego w stosunku 1:10 początkowego PL-EV z PBS przefiltrowanym przez filtr 0,2 μm.
    2. Przygotować 1 ml rozcieńczonych wcześniej próbek w stosunku 1:100 z PBS przefiltrowanym przez filtr 0,2 μm.
  2. Wstrzyknąć rozcieńczoną w stosunku 1:1 000 próbkę NTA-PL-EV lub początkową próbkę PL-EV za pomocą sterylnej strzykawki do pompy NTA. Postępuj zgodnie z instrukcjami i zaleceniami producenta dotyczącymi oznaczania stężenia cząstek i rozkładu wielkości.
    UWAGA: Ponieważ stężenie EV zależy od objętości startera próbki, może być konieczne odczytanie pośrednich rozcieńczeń i dokonanie regulacji w celu uzyskania prawidłowego oznaczenia NTA.

5. EV stosowane w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów wywołanej stanem zapalnym

  1. Chrząstkę należy dwukrotnie przemyć PBS i wyciąć za pomocą stempla do biopsji o średnicy 3 mm w sterylnych warunkach.
    UWAGA: Wykonaj procedurę od kroków 5.1 do 5.6 w kapturze do hodowli komórkowych.
  2. Umieść eksplantaty na 96-dołkowych płytkach hodowlanych z pożywką DMEM-F12 uzupełnioną 1% penicyliną-streptomycyną w temperaturze 37 oC, 5% CO2 i wilgotności 80%.
    1. Aby ustalić model choroby zwyrodnieniowej stawów wywołany stanem zapalnym, należy uzupełnić pożywkę do hodowli komórkowej o 10 ng/ml onkostatyny M i czynnika martwicy nowotworu alfa (TNFα) o stężeniu 2 ng/mL.
  3. Potraktuj eksplantaty 1 × 109 cząstkami/basenik znakowanych EV (PKH-PL-EV) lub kontrolą w pożywce do hodowli komórkowej uzupełnionej onkostatyną M i TNFα.
    UWAGA: Zmierzyć objętość próbki zawierającej 1 × 109 cząstek/basenik i użyć tej samej objętości do kontroli.
  4. Usunąć pożywkę z 96-dołkowych płytek do hodowli komórkowych zawierających eksplantaty chrząstek. Dodać 200 μl pożywki do hodowli komórkowych opisanej w kroku 5.3 do każdego dołka.
    UWAGA: Jeśli 96-dołkowe płytki miały kontakt z płodową surowicą bydlęcą (FBS), przemyj każdą studzienkę trzykrotnie 200 μl PBS, aby usunąć wszelkie EV z FBS.
  5. Test in vitro należy przerwać w różnych momentach: 0, 1, 2, 3, 4 i 5 godzin.
  6. Studzienki hodowli komórkowych zawierające eksplantaty chrząstki należy przemyć dwukrotnie 200 μl PBS.
  7. Dodać 100 μl 4% paraformaldehydu (PFA) do tkanki, aby utrwalić ją przez 3 godziny w temperaturze 4 oC.
    UWAGA: Czynności związane z PFA należy wykonywać w dygestoriach zgodnie z zaleceniami zawartymi w karcie charakterystyki.
  8. Usunąć PFA, dodać 100 μl PBS, przechowywać utrwaloną tkankę w temperaturze 4 °C i przetworzyć próbki w ciągu 48 godzin.

6. Przygotowanie i wizualizacja mikroskopii

UWAGA: Ta procedura histologiczna składa się z etapów odwodnienia, zatapiania parafiny i nawadniania. Kroki te mogą zmniejszyć ogólną fluorescencję barwnika (ograniczenie wymienione w karcie katalogowej PKH26). Dlatego inne procedury, takie jak zamrożone sekcje, mogą być bardziej odpowiednie do wizualizacji EV za pomocą mikroskopii konfokalnej.

  1. Osadź utrwalone tkanki w blokach parafinowych. Pokrój tkankę na odcinki o grubości 6 μm.
  2. Odparafinować skrawki tkanek.
    UWAGA: Wszystkie czynności z użyciem ksylenu należy wykonywać pod wyciągiem.
    1. Zanurz skrawki tkanki w ksylenie na 30 min, 100% etanolu na 2 min, 96% etanolu na 2 min, 75% etanolu na 1 min, a na koniec w wodzie destylowanej na 30 s.
  3. Przepuszczalność skrawków tkanki.
    1. Przygotuj 0,1% roztwór cytrynianu sodu Triton-0,1%, aby przeniknąć do tkanki. Dodaj kroplę o objętości 20 μl do każdej sekcji tkanki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj każdą sekcję dwukrotnie 20 μl PBS.
  4. Na szkiełku mikroskopowym dodać kroplę podłoża montażowego zawierającego 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) z wodnym podłożem montażowym w celu zachowania fluorescencji. Zakryj szkiełko zawierające 3 skrawki tkanki z kroku 6.3.1.
  5. Inkubować szkiełka przez noc w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
  6. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu mikroskopii konfokalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schematyczny przegląd znakowania EV i monitorowania ich pobierania przedstawiono w Rysunek 1Stężenie cząstek i wielkość EV wyznaczone za pomocą NTA w Tabela 1 wykazano, że stężenie EV spada w trakcie procesu z powodu dwukrotnego przeprowadzenia etapu oczyszczania kolumnowego po znakowaniu. Niemniej jednak otrzymana ilość mieści się w optymalnym zakresie liczby cząstek do zastosowania w terapii. Stężenie cząstek to jest wykorzystywane do obliczenia objętości PKH-PL-EV oraz ko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obrazowanie EV pomaga zrozumieć właściwości EV, takie jak mechanizmy ich uwalniania i wychwytywania. Ich obrazowanie pozwala na monitorowanie ich biodystrybucji i scharakteryzowanie ich właściwości farmakokinetycznych jako nośników leków. Jednak obrazowanie i śledzenie EV może być trudne ze względu na ich niewielkie rozmiary, chociaż opracowano wiele urządzeń do obrazowania i technik znakowania, aby pomóc naukowcom monitorować EV w warunkach in vitro i in vivo 23,24,25.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, współfinansowane przez EFS Europejski Fundusz Społeczny i Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego EFRR (MS16/00124; CP16/00124); przez PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finansowany z podatku od zrównoważonej turystyki na Balearach; Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); w ramach programu podoktorskiego FOLIUM (FOLIUM 17/01) w ramach FUTURMed, finansowanego w 50% z podatku od zrównoważonej turystyki Balearów i w 50% z EFS; oraz przez Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiał
1,5 ml Probówka wirówkowaSPL nauki przyrodniczePLC60015
1 ml Strzykawka BD PlastipakBD303174
2-Propanol (Isopropanol)Panreac AppliChem1.310.901.211Przygotowany w 20% z wodą Milli-Q
96-dołkowa płytka hodowlanaSPL nauki przyrodnicze
Etanol absolutny PharmpurScharlabET0006005PSłuży do przygotowania 96% i 75% etanolu z wodą Milli-Q
Dziurkacz do biopsji z tłokiem 3 mmScandidactMTP-33-32
Surowica bydlęca  Albumina (BSA)Sigma-AldrichA7030Przygotowana w 5% z PBS
Eksplantaty chrząstkiIdISBa Biobank
Probówka zagęszczająca 15 ml Nanosep 100 kD OmegaPallMCP100C41
Rurka zagęszczająca 500 µ L Nanosep 100 kD OmegaPallOD003C33
Szkło nakrywkowe 24 x 60 mmDeltalabD102460
DMEM-F12 -GlutaMAX mediumBiowestL0092
Dulbecco's PBS (1x)Capricorn ScientificPBS-1A
Wbudowane bloki tkanki parafinowejBiobankOpłata za usługę
Kolumny Exo-spin mini-HDSystemy prowadzenia komórekEX05
Feather S35 Microtome BladeFeather43037
Filtropur S 0,2 µ m filtr strzykawkowySarstedt83.1826.001
Fluoroshield z DAPISigma-AldrichF-6057
Oncostatin M HumanSigma-AldrichO9635-10UGPrzygotować roztwór podstawowy do końcowego stężenia 0,1 &mikro; g/&mikro; L rozcieńczony w PBS-0,1%
BSA ParaformaldehydSigma-Aldrich8.18715.1000Przygotowany w stężeniu 4% z PBS i przechowywany w temperaturze 4 & deg; C
Roztwór penicyliny-streptomycyny 100xBiowestL0022
PKH26 Zestaw łączników komórek czerwonej fluorescencji do ogólnego znakowania błon komórkowychSigma-AldrichMINI26PKH26 i Dliuent C w zestawie
Dwuwodny cytrynian soduScharlabSO019911000
Szkiełka mikroskopowe Superfrost PlusThermo ScientificJ1800AMNZ
TNF&alfa;R& Systemy D210-TA-005Przygotować roztwór podstawowy do końcowego stężenia 0,01 &mikro; g/&mikro; L rozcieńczony w PBS-0,1% BSA
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Służy do przygotowania 0,1% roztworu cytrynianu sodu Triton-0,1% z wodą Milli-Q
KsylenScharlabXI0050005P
Sprzęt
Wirówka 5430 RWirnik Eppendorf5428000210F-45-48-11
NanoSight NS300Urządzenie MalvernNS300z wbudowanym laserem o długości λ= 532 nm i kamerą sCMOS
Shandon Finesse 325 Instrukcja obsługi MicrotomeThermo Scientific™
Mikroskop konfokalny A78100101 TCS-SPE5200000271Leica Microsystems
PLC30096 IdISBa

Bibliografia

  1. Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
  2. Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T. Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering. In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).
  3. Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).
  4. Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
  5. Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
  6. Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clinical and Translational Medicine. 5 (1), e27(2016).
  7. Doeppner, T. R., et al. Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).
  8. Bruno, S., et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).
  9. Bruno, S., Camussi, G. Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair. Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).
  10. Théry, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15(2011).
  11. D'Arrigo, D., et al. Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867(2019).
  12. Ryan, S. T., et al. Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).
  13. El Backly, R., et al. Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response. Tissue Engineering. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).
  14. Yuta, K., et al. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).
  15. Del Bue, M., et al. Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes. Veterinary Research Communications. 31 (Suppl 1), 289-292 (2007).
  16. Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212(2018).
  17. Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).
  18. Liu, X., et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470(2019).
  19. Otahal, A., et al. Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050(2020).
  20. Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment. International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).
  21. Ortega, F. G., et al. Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014(2019).
  22. de Miguel Pérez, D., et al. Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  23. Morelli, A. E., et al. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).
  24. Feng, D., et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
  25. Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25, 91(2018).
  26. Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432(2001).
  27. Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029(2015).
  28. Takahashi, Y., et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection. Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).
  29. Askenasy, N., Farkas, D. L. Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).
  30. Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model. Inflammation and Regeneration. 36, 26(2016).
  31. Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
  32. Skardelly, M., et al. Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).
  33. Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. , https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html (2021).
  34. Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
  35. Morales-Kastresana, A., et al. Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
  36. Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).
  37. Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Znakowanie EVmigracja EVpobieranie EVmikroskopia konfokalnaEV z lizatu płytek krwiśledzenie nanocząsteczekmodel OA in vitropobieranie przez chondrocyty
Znakowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu monitorowania migracji i wychwytu w eksplantatach chrząstki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.