$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Lizat płytkowy (PL) jest otrzymywany zgodnie z wcześniejszymi opisami, zgodnie z wytycznymi instytucji3 przy użyciu świeżych kożuchów dostarczonych przez Biobank IdISBa jako materiał wyjściowy. Ich wykorzystanie w obecnym projekcie zostało zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki (IB 1995/12 BIO).
1. Izolacja EV od PL
- Usuwanie większych ciał
- Rozmrozić PL w temperaturze pokojowej.
- Odwirować PL przy 1 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić osad, ponieważ zawiera on resztki komórek.
- Zebrać supernatant i przeprowadzić dwa kolejne wirowania przy 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Granulka odpowiada większym EV, takim jak mikropęcherzyki, iw tym przypadku jest odrzucana.
- Przefiltrować supernatant najpierw przez porowatą membranę 0,8 μm, a następnie przez porowatą membranę 0,2 μm.
UWAGA: Te kroki usuwają wszystkie niepożądane pojazdy elektryczne.
- Połączyć przefiltrowany PL i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
- Chromatografia wykluczania wielkości
- Wyrównać kolumnę sprzężoną z urządzeniem chromatograficznym przy żądanym natężeniu przepływu z przefiltrowanym PBS.
UWAGA: Zastosowane natężenie przepływu zależy od charakterystyki kolumny; w tym przypadku jest ustawiony na 0,5 ml/min.
- Załaduj przetworzony PL (5 ml) za pomocą strzykawki do urządzenia.
- Wstrzyknąć PL do kolumny i rozpocząć zbieranie frakcji 5 ml w probówkach o pojemności 15 ml.
- Zebrać wzbogacone frakcje EV i przechowywać je w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
UWAGA: Wykonując eksperyment po raz pierwszy, scharakteryzuj wszystkie frakcje za pomocą kwantyfikacji białka i immunodetekcji, aby określić tę wzbogaconą o EVs3,11. W tym eksperymencie zbierana jest 9. frakcja.
- Przemyć kolumnę chromatograficzną 30 ml 0,2% roztworu NaOH i przechowywać w 20% roztworze etanolu po osiągnięciu równowagi.
Rysunek 1: Schemat ideowy izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) z lizatu płytkowego (PL). PL jest odwirowywany najpierw przy 1 500 x g, a następnie przy 10 000 x g w celu usunięcia większych ciał. Supernatant jest filtrowany przez filtry 0,8 i 0,2 μm. Przetworzony PL jest ładowany do kolumny, a EV są rozdzielane za pomocą chromatografii wykluczania wielkości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
2. Charakterystyka EV
UWAGA: Charakterystyka EVs jest niezbędna do przeprowadzenia badań funkcjonalnych12. Mikroskopia elektronowa lub charakterystyka western blot były już wcześniej zgłaszane13. W niniejszym raporcie skupimy się na podstawowych technikach charakterystyki funkcjonalizacji powierzchni Ti.
- Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)
- Rozcieńczyć EVs (1:1000) w PBS.
z filtrem 0,2 μm
UWAGA: Próbki o zbyt skoncentrowanym lub zbyt rozcieńczonym będą poza zakresem oznaczania NTA i wymagana będzie regulacja.
- Załadować 1 ml rozcieńczonych EV za pomocą strzykawki do sprzętu NTA i wstrzyknąć je do sprzętu NTA.
- Postępuj zgodnie z protokołem producenta dotyczącym określania stężenia cząstek i rozkładu wielkości.
- Stężenie białka
- Oznaczyć stężenie przy użyciu 1 μl roztworu EVs. Zmierzyć absorbancję za pomocą spektrofotometru o długości fali 280 nm.
UWAGA: EV powinny charakteryzować się niskim poziomem białek w porównaniu z liczbą cząstek.
- Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać odczyt absorbancji za pomocą spektrofotometru.
3. Funkcjonalizacja powierzchni tytanu
UWAGA: W tej metodzie używane są obrabiane maszynowo tarcze tytanowe klasy IV, o średnicy 6,2 mm i wysokości 2 mm. Krążkami można manipulować za pomocą pęsety Ti, ale ważne jest, aby nie zarysować powierzchni. Ponadto podczas całego procesu obrabiana strona musi być skierowana do góry.
- Tarcze Ti wash
UWAGA: Objętość roztworów używanych do mycia Ti powinna być wystarczająca do pokrycia krążków Ti. Umieść krążki Ti w szklanej zlewce i wlej na nie roztwory. Następnie usuń roztwór, dekantując.
- Umyj implanty Ti wodą dejonizowaną (DI), a następnie wylej wodę.
- Umyj implanty Ti etanolem 70%, a następnie zdekantuj w celu usunięcia roztworu.
- Umieścić implanty w wodzie detonowanej i poddać sonizacji w temperaturze 50 °C przez 5 minut. Wylać wodę.
- Inkubować implanty Ti w 40% roztworze NaOH w temperaturze 50 °C przez 10 minut z mieszaniem. Wyrzuć roztwór.
UWAGA: Roztwór NaOH nagrzewa się podczas przygotowywania. Roztwór jest i powinien być stosowany wewnątrz dygestorium.
- Sonikować implanty w wodzie DI o temperaturze 50 °C przez 5 minut, a następnie usunąć wodę.
- Wykonaj kilka prań wodą DI (co najmniej 5), aż osiągnie neutralne pH. Sprawdź pH za pomocą wskaźników pH.
- Sonikować implanty w wodzie demineralizowanej o temperaturze 50 °C przez 5 minut i usunąć wodę.
- Inkubować implanty Ti w 50% roztworze HNO3 w temperaturze 50 °C przez 10 minut z mieszaniem. Usuń roztwór.
UWAGA: HNO3 jest substancją i utleniającą i powinien być stosowany wewnątrz dygestoria.
- Sonikować implanty w wodzie detonowanej o temperaturze 50 °C przez 5 minut. Usunąć wodę.
- Wykonaj kilka prań wodą DI (co najmniej 5), aż do uzyskania neutralnego pH. Sprawdź pH za pomocą wskaźników pH.
- Sonikować implanty w wodzie DI o temperaturze 50 °C przez 5 minut. Usunąć wodę.
UWAGA: W tym momencie eksperyment można przerwać, przechowując implanty Ti w 70% roztworze etanolu.
- Pasywacja Ti
UWAGA: Etapy pasywacji Ti są wykonywane poprzez całkowite pokrycie tarcz Ti różnymi roztworami w kolejności podanej poniżej. Krążki Ti umieszcza się w szklanej zlewce i delikatnie wylewa się na nie roztwory. Objętości używane na wszystkich etapach mycia muszą całkowicie pokrywać implanty i są usuwane poprzez dekantację.
- Inkubować implanty Ti w 30% roztworze HNO3 przez 30 minut w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem. Usuń roztwór.
- Wykonaj kilka prań wodą DI (co najmniej 5), aż osiągnie neutralne pH. Sprawdź pH za pomocą wskaźników pH.
- Inkubuj implanty Ti przez noc w temperaturze pokojowej w wodzie DI.
- Suszyć implanty w warunkach próżni w temperaturze 40 °C przez 10 minut.
- Pojazdy elektryczne odlewane
UWAGA: W przypadku badań funkcjonalnych komórek ważne jest, aby pracować w komorze do hodowli komórkowych.
- Umieść implanty Ti w 96-dołkowej płytce, obrobioną stroną skierowaną do góry.
UWAGA: Jeśli implanty są odwrócone do góry nogami, można użyć igły, aby je odstawić.
- Rozmrozić roztwór EV i wymieszać go z mieszaniem. Użyj wiru, aby pulsować przez 3 sekundy.
- Umieść EV na powierzchni Ti. W tym badaniu krople 40 μl roztworu EVs są umieszczane na Ti w celu unieruchomienia maksymalnie 4 x 1011 EV na implant zgodnie ze stężeniem określonym przez NTA.
- Umieścić płytki zawierające Ti w warunkach próżni w temperaturze 37 °C, aż krople całkowicie wyschną (~2 h).
UWAGA: Dostosuj czas w zależności od liczby implantów i wody obecnej w komorze próżniowej.
Rysunek 2: Schemat ideowy pasywacji Ti i funkcjonalności EVs przez odlewanie kroplowe. Implanty Ti są najpierw pasywowane przez inkubację przez 30 minut w 30% roztworze HNO3 w temperaturze pokojowej. Po kilku myciach wodą DI pH osiąga neutralne. Następnie implanty Ti inkubuje się przez noc w temperaturze pokojowej w wodzie DI. Następnie implanty są suszone w warunkach próżni w temperaturze 40 °C. W celu unieruchomienia EV 40 μl roztworu EVs osadza się na implantach Ti. Następnie implanty są inkubowane w próżni przez 2 godziny, aż EV zostaną fizycznie związane z powierzchnią. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
4. Charakterystyka powierzchni Ti
- Badanie wydania
- Inkubować powierzchnię Ti z 200 μl przefiltrowanego PBS w temperaturze 37 °C.
UWAGA: PBS jest filtrowany, aby uniknąć zakłóceń w pomiarze NTA.
- Wymień PBS w różnych punktach czasowych i przechowuj w temperaturze -80 °C.
UWAGA: W tym badaniu przeanalizowano 2-, 6-, 10- i 14-dniowe punkty czasowe.
- Analizuj przechowywany PBS pod kątem badań cząstek przez NTA zgodnie z instrukcjami producenta.
UWAGA: Stężenie cząstek w PBS w różnych momentach jest reprezentacją profilu uwalniania EV w czasie.
- Badania biokompatybilności
UWAGA: Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z pępowiny (hUC-MSC) są pozyskiwane z Biobanku IdISBa zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
- Utrzymuj hUC-MSC w DMEM o niskim poziomie glukozy uzupełnionym 20% FBS do momentu użycia. Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu.
- W celu wysiewu komórek należy dwukrotnie umyć komórki w kolbach z 5 ml PBS.
- Trypsynizuj hUC-MSC, dodając 1 ml roztworu trypsyny. Upewnij się, że całkowicie zakrywa monowarstwę komórek. Usunąć roztwór trypsyny i umieścić kolbę hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C na około 2 minuty. Zobacz oderwanie komórek pod mikroskopem. Oderwane komórki będą miały okrągły kształt i będą w zawieszeniu.
- Ponownie zawiesić komórki w DMEM o niskim poziomie glukozy z 1% EV zubożonymi FBS.
UWAGA: Przygotować pożywkę uzupełnioną 1% FBS, a następnie ultrawirować przy 120 000 x g przez 18 godzin w celu usunięcia FBS-EVs. Ważne jest, aby usunąć EV, aby uniknąć zakłóceń z płytkami EV.
- Określ koncentrację komórek, zliczając liczbę komórek za pomocą komory Neubauera 14.
- Doprowadzić hUC-MSC do stężenia 50 000 komórek/ml.
- Wysiew 200 μl roztworu komórkowego na implanty Ti.
- Po 48 godzinach zebrać 50 μl pożywki i przeprowadzić oznaczenie cytotoksyczne przy użyciu zestawu do aktywności dehydrogenazy mleczanowej (LDH), zgodnie z protokołem producenta.