Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Funkcjonalizacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzenia płytkowego implantów Ti

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62781

⸱

5 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Therapy and Tissue Engineering Group, Research Institute on Health Sciences (IUNICS), University of the Balearic Islands, 2Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa), 3Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (FBSTIB), 4Department of Fundamental Biology and Health Sciences, University of the Balearic Islands

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z lizatów płytek krwi (PL) i ich zastosowanie do powlekania powierzchni implantów tytanowych (Ti). Opisujemy metodę powlekania metodą odlewania matrycowego, profil uwalniania EV z powierzchni oraz biokompatybilność in vitro powierzchni Ti pokrytych EV.

Streszczenie

EVs są izolowane z PL za pomocą chromatografii wykluczania wielkości, a następnie powierzchnie Ti są funkcjonalizowane za pomocą PL-EVs przez odlewanie kroplowe. Funkcjonalizacja jest udowodniona przez uwalnianie EV i jego biokompatybilność w teście uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH).

Wprowadzenie

EV to pęcherzyki błonowe (30-200 nm) wydzielane przez dowolną komórkę i odgrywają kluczową rolę w komunikacji między komórkami, dostarczając swój ładunek. Zawierają różne aktywne biomolekuły, które mogą obejmować kwasy nukleinowe, czynniki wzrostu lub bioaktywne lipidy1. Z tych powodów pojazdy elektryczne zostały ocenione pod kątem ich potencjalnego zastosowania w terapii. Pod kątem ortopedii i regeneracji kości przetestowano pojazdy elektryczne z różnych źródeł. Wśród nich wykazano, że EV pochodzące z płytek krwi wywołują efekt różnicowania komórek macierzystych przy jednoczesnym utrzymaniu niskiego profilu cytotoksycznego2,3. W związku z tym konieczne są dalsze badania w celu zbadania możliwości łączenia pojazdów elektrycznych z biomateriałami w celu wykorzystania ich w codziennej praktyce klinicznej.

Biomateriały na bazie tytanu są powszechnie stosowane jako rusztowania do klinicznych interwencji leczniczych kości ze względu na ich właściwości mechaniczne, wysoką biokompatybilność i długoterminową trwałość4. Niemniej jednak implanty Ti są materiałem biologicznym i dlatego wykazują słabą zdolność do łączenia się z otaczającą tkanką kostną5. Z tego powodu modyfikacje tytanu są badane w celu poprawy ich wydajności poprzez osiągnięcie bardziej funkcjonalnego mikrośrodowiska na jego powierzchni4,6,7. W tym sensie EV mogą być zakotwiczone w tytanie przez chemical8 lub physical interactions9,10. Unieruchomione EV pochodzące z komórek macierzystych lub makrofagów zwiększają bioaktywność Ti, promując adhezję i proliferację komórek, wywołując w ten sposób efekt osteogenny8,9,10.

Ten artykuł skupi się szczegółowo na strategii odlewania matrycowego do powlekania powierzchni Ti za pomocą EV pochodzących z PL. Ponadto ocenimy profil uwalniania EV z powlekanej powierzchni w czasie i potwierdzimy jego biokompatybilność komórkową in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Lizat płytek krwi (PL) otrzymuje się zgodnie z wcześniej opisaną procedurą, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi3, wykorzystując świeże warstwy leukocyto-trombocytarne dostarczone przez Biobank IdISBa jako materiał wyjściowy. Ich wykorzystanie w obecnym projekcie zostało zatwierdzone przez odpowiednią Komisję Etyczną (IB 1995/12 BIO).

1. Izolacja EV z PL

  1. Usuwanie większych ciałek
    1. Rozmrozić PL w temperaturze pokojowej.
    2. Odwirować PL przy 1,500 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Odrzucić osad, ponieważ zawiera on szczątki komórkowe.
    3. Zebrać supernatant i przeprowadzić dwa kolejne wirowania przy 10,000 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Osad odpowiada większym EV, takim jak mikropęcherzyki; w tym przypadku zostaje on odrzucony.
    4. Przefiltrować supernatant najpierw przez membranę porowatą 0,8 µm, a następnie przez membranę porowatą 0,2 µm.
      UWAGA: Kroki te usuwają wszystkie niepożądane EV.
    5. Połączyć przefiltrowane PL i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  2. Chromatografia do wykluczania cząsteczek
    1. Równoważyć kolumnę podłączoną do urządzenia chromatograficznego za pomocą przefiltrowanego PBS przy żądanej szybkości przepływu.
      UWAGA: Stosowana szybkość przepływu zależy od charakterystyki kolumny; w tym przypadku ustawiono ją na 0,5 mL/min.
    2. Napić przetworzone PL (5 mL) do urządzenia za pomocą strzykawki.
    3. Wstrzyknąć PL do kolumny i rozpocząć zbieranie frakcji 5 mL do probówek 15 mL.
    4. Zebrać frakcje wzbogacone w EV i przechowywać je w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Przy pierwszym przeprowadzeniu eksperymentu należy scharakteryzować wszystkie frakcje poprzez ilościowe oznaczenie białek i immunodetekcję, aby wyznaczyć frakcję wzbogaconą w EV3,11. W tym eksperymencie zbiera się 9tą frakcję.
    5. Przemyć kolumnę chromatograficzną 30 mL 0,2% roztworu NaOH i przechowywać ją w 20% roztworze etanolu po osiągnięciu stanu równowagi.

Schemat izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych; filtracja, wirowanie, kolumna Sepharose, zbieranie EV.
Rysunek 1: Schemat izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) z lizatu płytek krwi (PL). PL jest najpierw wirowany przy 1,500 x g, a następnie przy 10,000 x g w celu usunięcia większych ciałek. Nadfiltr jest filtrowany przez filtry 0,8 i 0,2 µm. Przetworzony PL jest nanoszony na kolumnę, a EV są rozdzielane za pomocą chromatografii wykluczania molekularnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Charakterystyka EV

UWAGA: Charakterystyka EV jest niezbędna do przeprowadzenia badań funkcjonalnych12. Wcześniej opisano charakterystykę z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej lub western blot13. Niniejszy raport skupi się na podstawowych technikach charakterystyki w kontekście funkcjonalizacji powierzchni Ti.

  1. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)
    1. Rozcieńczyć EV (1:1000) w PBS filtrowanym przez filtr 0,2 µm.
      UWAGA: Próbki zbyt skoncentrowane lub zbyt rozcieńczone będą poza zakresem pomiaru NTA, co będzie wymagało ich dostosowania.
    2. Pobrać 1 mL rozcieńczonych EV za pomocą strzykawki i wprowadzić je do urządzenia NTA.
    3. Postępować zgodnie z protokołem producenta w celu wyznaczenia stężenia i rozkładu wielkości cząstek.
  2. Stężenie białka
    1. Wyznaczyć stężenie, wykorzystując 1 µL roztworu EV. Zmierzyć absorbancję za pomocą spektrofotometru przy długości fali 280 nm.
      UWAGA: EV powinny wykazywać niski poziom białek w stosunku do liczby cząstek.
    2. Postępować zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać odczyt absorbancji za pomocą spektrofotometru.

3. Funkcjonalizacja powierzchni tytanu

UWAGA: W tej metodzie zastosowano obrobione mechanicznie dyski tytanowe, stop c.p. stopnia IV, o średnicy 6,2 mm i wysokości 2 mm. Dyski można przenosić za pomocą pęsety tytanowej, jednak należy zadbać o to, aby nie porysować ich powierzchni. Ponadto przez cały czas trwania procesu strona obrobiona mechanicznie musi być skierowana do góry.

  1. Mycie dysków Ti
    UWAGA: Objętość roztworów użytych do mycia Ti powinna być wystarczająca, aby całkowicie pokryć dyski Ti. Umieść dyski Ti w zlewce szklanej i wlej na nie roztwory. Następnie usuń roztwór poprzez odlanie.
    1. Umyj implanty Ti wodą dejonizowaną (DI), a następnie wylej wodę.
    2. Umyj implanty Ti 70% etanolem, a następnie odlej roztwór.
    3. Umieść implanty w wodzie DI i poddaj sonikacji w temperaturze 50 °C przez 5 min. Wylej wodę.
    4. Inkubuj implanty Ti w 40% roztworze NaOH w temperaturze 50 °C przez 10 min przy mieszaniu. Odlej roztwór.
      OSTROŻNIE: Roztwór NaOH nagrzewa się podczas przygotowywania. Roztwór jest żrący i należy go używać w dygestorium.
    5. Soniakuj implanty w wodzie DI w temperaturze 50 °C przez 5 min, a następnie usuń wodę.
    6. Przeprowadź kilka płukań wodą DI (co najmniej 5), aż do osiągnięcia obojętnego pH. Sprawdź pH za pomocą wskaźników pH.
    7. Soniakuj implanty w wodzie DI w temperaturze 50 °C przez 5 min i usuń wodę.
    8. Inkubuj implanty Ti w 50% roztworze HNO3 w temperaturze 50 °C przez 10 min przy mieszaniu. Usuń roztwór.
      OSTROŻNIE: HNO3 jest substancją żrącą i utleniającą i należy go używać w dygestorium.
    9. Soniakuj implanty w wodzie DI w temperaturze 50 °C przez 5 min. Usuń wodę.
    10. Przeprowadź kilka płukań wodą DI (co najmniej 5), aż do uzyskania obojętnego pH. Sprawdź pH za pomocą wskaźników pH.
    11. Soniakuj implanty w wodzie DI w temperaturze 50 °C przez 5 min. Usuń wodę.
      UWAGA: Na tym etapie eksperyment można przerwać, przechowując implanty Ti w 70% roztworze etanolu.
  2. Pasywacja Ti
    UWAGA: Kroki pasywacji Ti są wykonywane poprzez całkowite pokrycie dysków Ti różnymi roztworami w kolejności wymienionej poniżej. Dyski Ti umieszcza się w zlewce szklanej, a roztwory delikatnie wlewa na nie. Objętości używane we wszystkich etapach płukania muszą całkowicie pokrywać implanty i są usuwane poprzez odlanie.
    1. Inkubuj implanty Ti w 30% roztworze HNO3 przez 30 min w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu. Usuń roztwór.
    2. Przeprowadź kilka płukań wodą DI (co najmniej 5), aż do osiągnięcia obojętnego pH. Sprawdź pH za pomocą wskaźników pH.
    3. Inkubuj implanty Ti przez noc w temperaturze pokojowej w wodzie DI.
    4. Wysusz implanty w warunkach próżni w temperaturze 40 °C przez 10 min.
  3. Naniesienie kropelkowe EVs
    UWAGA: W przypadku funkcjonalnych badań komórkowych ważne jest prowadzenie prac w komorze do hodowli komórek.
    1. Umieść implanty Ti w płytce 96-dołkowej stroną obrobioną do góry.
      UWAGA: Jeśli implanty zostaną odwrócone do góry nogami, można użyć igły, aby je poprawić.
    2. Rozmroź roztwór EVs i wymieszaj go przy mieszaniu. Użyj vortexa, aby wymieszać przez 3 s.
    3. Naniesiesz EVs na powierzchnię Ti. W niniejszym badaniu na Ti naniesiono krople 40 µL roztworu EVs, aby unieruchomić maksymalnie 4 x 1011 EVs na implant, zgodnie z stężeniem określonym przez NTA.
    4. Umieść płytki zawierające Ti w warunkach próżni w temperaturze 37 °C, aż krople całkowicie wyschną (~2 h).
      ​UWAGA: Dostosuj czas w zależności od liczby implantów i ilości wody obecnej w komorze próżniowej.

Schemat pasywacji Ti i odlewania kropelkowego; proces przygotowania Ti-EV i ich osadzania na tytanie.
Rycina 2: Schemat pasywacji Ti i funkcjonalizacji EV metodą odlewania kropelkowego. Implanty Ti są najpierw pasywowane poprzez inkubację przez 30 min w 30% roztworze HNO3 w temperaturze pokojowej. Po kilku przemyciach wodą DI pH osiąga wartość neutralną. Następnie implanty Ti są inkubowane przez noc w temperaturze pokojowej w wodzie DI. Po tym czasie implanty są suszone w warunkach próżni w 40 °C. W celu immobilizacji EV, 40 µL roztworu EV jest nanoszonych na implanty Ti. Następnie implanty są inkubowane w próżni przez 2 h, aż do fizycznego związania EV z powierzchnią. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

4. Charakterystyka powierzchni Ti

  1. Badanie uwalniania
    1. Inkubować powierzchnię Ti w 200 µL przefiltrowanego PBS w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: PBS jest filtrowany, aby uniknąć zakłóceń w pomiarze NTA.
    2. Wymieniać PBS w różnych punktach czasowych i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: W niniejszym badaniu analizowano punkty czasowe: 2, 6, 10 i 14 dni.
    3. Analizować przechowywany PBS pod kątem obecności cząstek metodą NTA zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Stężenie cząstek w PBS w różnych odstępach czasu reprezentuje profil uwalniania EVs w czasie.
  2. Badania biokompatybilności
    UWAGA: Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z ludzkiej pępowiny (hUC-MSC) są pozyskiwane z Biobanku IdISBa zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
    1. Utrzymywać hUC-MSC w pożywce DMEM o niskiej zawartości glukozy z dodatkiem 20% FBS do momentu użycia. Wymieniać pożywkę dwa razy w tygodniu.
    2. Przed wysianiem komórek, przemyć komórki w kolbach 5 mL PBS dwa razy.
    3. Trypsynizować hUC-MSC, dodając 1 mL roztworu trypsyny. Upewnić się, że całkowicie pokrywa on monowarstwę komórek. Usunąć roztwór trypsyny i pozostawić kolbę z hodowlą komórkową w temperaturze 37 °C przez około 2 min. Sprawdzić odklejenie komórek pod mikroskopem. Odklejone komórki będą miały okrągły kształt i będą znajdować się w zawiesinie.
    4. Resuspendować komórki w pożywce DMEM o niskiej zawartości glukozy z 1% FBS pozbawionego EVs.
      UWAGA: Przygotować pożywkę z dodatkiem 1% FBS, a następnie poddać ją ultrawirowaniu przy 120,000 x g przez 18 h w celu usunięcia FBS-EVs. Usunięcie EVs jest istotne, aby uniknąć zakłóceń w analizie EVs pochodzących z płytek krwi.
    5. Określić stężenie komórek, licząc ich liczbę za pomocą komory Neubauera14.
    6. Dostosować stężenie hUC-MSC do poziomu 50,000 komórek/mL.
    7. Nasiać 200 µL zawiesiny komórkowej na implanty Ti.
    8. Po 48 h zebrać 50 µL pożywki i przeprowadzić oznaczenie cytotoksyczności przy użyciu zestawu do badania aktywności dehydrogenazy mleczanowej (LDH), zgodnie z protokołem producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Metoda przedstawiona w tym artykule pozwala na otrzymanie dysków tytanowych funkcjonalizowanych przez EV. EV są fizycznie związane z powierzchnią, co umożliwia ich przedłużone uwalnianie w czasie. Ilość uwalnianych EV można zmierzyć za pomocą NTA w 2., 6., 10. i 14. dniu. Pierwsze pomiary, wykonane w 2. dniu, wykazują uwolnienie około 109 EV, po czym następuje przedłużone uwalnianie w 6. dniu (~108 EV), 10. dniu (~107 EV) i 14. dniu (~107 EV). Potwierdza to proces przedłużonego...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten ma na celu dostarczenie jasnych instrukcji dotyczących funkcjonalności pojazdów elektrycznych na powierzchniach Ti. Przedstawiona metoda opiera się na strategii odlewania kroplowego, która jest funkcjonalizacją typu fizysorpcji. Istnieje uboga bibliografia dotycząca funkcjonalizacji pojazdów elektrycznych na nawierzchniach Ti, chociaż istnieje niewiele badań wykazujących różne korzyści płynące z unieruchomienia pojazdów elektrycznych na Ti10. W każdym razie, niektóre z badanych strate...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, współfinansowane przez EFS Europejski Fundusz Społeczny i Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego EFRR (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017) oraz PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finansowane z podatku od zrównoważonej turystyki na Balearach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,8 &mikro; m filtr strzykawkowySartorius16592K
1,5 ml Probówka wirówkowaSPL nauki przyrodniczePLC60015
1 ml strzykawkaBD303174
96-dołkowa płytkahodowlana SPL nauki przyrodniczePLC30096
AbsolutScharlauET0006005PSłuży do przygotowania 20 %  etanolu z wodą Milli-Q®
AKTA System oczyszczaniaGE Healthcare8149-30-0014
Wirówka Allegra X-15RWirówka Beckman Coutler392934SX4750A wirnik wahadłowy
Wirówka 5430 REppendorf5428000210F-45-48-11
Rurka stożkowa, stożkowe dno, 50mlnauk przyrodniczych
(LDH)Roche11644793001
Jednorazowe strzykawki 10 mlBecton DickinsonBDH307736
DMEM Low Glucose GlutamaxGIBCO21885025
Dulbecco's PBS (1x)Capricorn ScientificPBS-1A
Płodowa surowica bydlęca (FBS) Embrionic CertyfikowanaGIBCO16000044
Filtropur S 0,2 µ m filtr strzykawkowySarstedt83.1826.001
HiPrep  16/60 Sefakryl  S-400 HRGE Healthcare28-9356-04Prefabrykowane kolumny
ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z pępowiny (hUC-MSC)IdISBa Biobank
Spektrofotometr Nanodrop 2000ThermoFisherND-2000
NanoSight NS300 analiza śledzenia nanocząstekMalvernNS300Urządzenie z wbudowanym laserem przy λ= 532 nm i kamerą sCMOS
IgłaTerumo946077135
Kwas azotowy 69,5%ScharlauAC16071000
Optima L-100 XP UltrawirówkaBeckman Coulter8043-30-1124SW-32Ti Rotor
Roztwór penicyliny-streptomycyny 100XBiowestL0022
Paski testowe pH 4,5-10,0SigmaP-4536
Lizat płytek krwi (PL)Biobank IdISBaUzyskane z  kożuchów wyrzucanych po oddaniu krwi
Repliki implantów tytanowychImplantmedia, SANATytan klasy IV. Średnica: 6,2 mm. Wysokość: 1,95 mm
Trypsin-EDTA 1 XBiowestL0930
Tryton X100SigmaT8787
etanol SPL Zestaw do wykrywania cytotoksyczności PLC50050 Polipropylenowe wanny wirówkowe Beckman Coutler 326823 Power wave HT BioTek 10340763 Probówka z nakrętką, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, z nadrukiem Sarstedt 62554502 Hirtlenek sodu Sharlau SO04251000

Bibliografia

  1. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  2. Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity. European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).
  3. Antich-Rosselló, M., et al. Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells. Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).
  4. Li, Y., et al. New developments of Ti-based alloys for biomedical applications. Materials. 7 (3), Basel, Switzerland. 1709-1800 (2014).
  5. Lan, W. C., et al. The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors. Applied Sciences. 10 (2), 590(2020).
  6. Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. Surface modifications and their effects on titanium dental implants. BioMed Research International. 2015, 791725(2015).
  7. Damiati, L., et al. Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants. Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694(2017).
  8. Chen, L., et al. Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).
  9. Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration. Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).
  10. Wang, X., et al. Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces. Biomaterials. 230, 119571(2020).
  11. Lozano-Ramos, I., et al. Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369(2015).
  12. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  13. Liu, J., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541(2018).
  14. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2021).
  15. Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudré, C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).
  16. Córdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., González-Martín, M. L., Ramis, J. M. Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

EV pochodzące z płytek krwipęcherzyki zewnątrzkomórkowefunkcjonalizacja tytanuodlewanie kropelkowechromatografia wykluczania żelowegośledzenie nanocząsteczekregeneracja kościtest uwalniania LDHmedycyna regeneracyjnapowłoka biomateriałowa
Funkcjonalizacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzenia płytkowego implantów Ti
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.