Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza produktów rozpadu rodziny transformujących czynników wzrostu wydzielanych do blastocoele zarodków Xenopus laevis

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62782

⸱

21 lipca 2021

 , 
1Department of Neurobiology, University of Utah, 2Departments of Neurobiology and Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Hematologic Malignancies, University of Utah, School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Gdy transformujący czynnik wzrostu ß białka prekursorowe rodziny są ektopowo wyrażane w zarodkach Xenopus laevis, ulegają one dimeryzacji, rozszczepianiu i są wydzielane do blastocoele, który zaczyna się w późnym stadium blastuli do wczesnego stadium gastruli. Opisano metodę zasysania produktów rozszczepienia z jamy blastocoele do analizy immunoblot.

Streszczenie

Dwa ramiona nadrodziny Transformującego Czynnika Wzrostu ß (Tgfß), reprezentowane odpowiednio przez ligandy Tgfß/Nodal lub Bone morphogenetic protein (Bmp), odgrywają zasadnicze role w rozwoju embrionalnym i homeostazie dorosłych. Członkowie rodziny Tgfß są wytwarzani jako nieaktywne prekursory, które dimeryzują i fałdują się w retikulum endoplazmatycznym. Prekursor jest następnie rozszczepiany na fragmenty liganda i prodomeny. Chociaż tylko dimeryczny ligand może angażować receptory Tgfß i aktywować sygnalizację w dół, rośnie świadomość, że ugrupowanie prodomenowe przyczynia się do aktywności liganda. W artykule opisano protokół, który można wykorzystać do identyfikacji produktów rozszczepienia powstających podczas aktywacji białek prekursorowych Tgfß. Prekursory Tgfß kodujące RNA są najpierw mikrowstrzykiwane do zarodków X. laevis. Następnego dnia produkty rozszczepienia są pobierane z blastocoele zarodków w stadium gastrula i analizowane na zachodnich plamach. Protokół ten można wykonać stosunkowo szybko, nie wymaga drogich odczynników i stanowi źródło skoncentrowanych produktów rozszczepienia Tgfß w warunkach fizjologicznych.

Wprowadzenie

Członkowie nadrodziny Transformującego Czynnika Wzrostu ß (Tgfß) są syntetyzowani jako nieaktywne, dimeryzowane białka prekursorowe. Prekursory są następnie rozszczepiane przez członków rodziny konwertazy proproteinowej (PC), albo w szlaku wydzielniczym, albo na zewnątrz komórek. W ten sposób powstaje aktywny, wiązany dwusiarczkiem dimer ligandu i dwa fragmenty prodomeny1. Chociaż od ponad 30 lat wiadomo, że prodomena prekursorów rodziny Tgfß jest wymagana do wygenerowania aktywnego liganda2, zrozumienie, w jaki sposób prodomeny przyczyniają się do funkcji liganda, jest niepełne.

Chociaż zrozumienie procesu aktywacji proteolitycznej członków rodziny Tgfß pozostaje niekompletne, rośnie zainteresowanie zrozumieniem, które motywy konsensusu PC są rozszczepiane in vivo, czy rozszczepienie występuje w określonym przedziale subkomórkowym czy zewnątrzkomórkowym, i czy prodomena pozostaje kowalencyjnie czy niekowalencyjnie związana z rozszczepionym ligandem3. Kilka badań wykazało, że prodomena nie tylko kieruje fałdowaniem ligandów przed rozszczepieniem4,5, ale może również wpływać na stabilność czynnika wzrostu i zakres działania6,7,8,9, napędzaj powstawanie homodimerów lub heterodimerów10, zakotwicz ligand w macierzy zewnątrzkomórkowej, aby utrzymać opóźnienie liganda11, a w niektórych przypadkach funkcjonuje jako ligand na własnych prawach, aktywując sygnalizację heterologiczną12. Heterozygotyczne mutacje punktowe w obrębie prodomeny wielu członków rodziny Tgfß są związane z wadami oczu, kości, nerek, szkieletu lub innymi wadami u ludzi3. Odkrycia te podkreślają kluczową rolę prodomeny w generowaniu i utrzymywaniu aktywnego liganda oraz podkreślają znaczenie identyfikacji i rozszyfrowania roli produktów rozszczepienia opracowanych podczas proteolitycznego dojrzewania prekursorów z rodziny Tgfß.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół zasysania produktów rozszczepienia powstających podczas dojrzewania prekursorów rodziny Tgfß z blastocoele zarodków X. laevis, a następnie analizowania ich na immunoblotach. Protokół ten może być użyty do określenia, czy jeden lub więcej motywów konsensusu PC w białku prekursorowym jest rozszczepionych in vivo10,13, zidentyfikuj endogenne PC(s), które rozszczepiają każdy motyw13,14, porównaj in vivo tworzenie homodimerów rodziny Tgfß z heterodimerami10 lub przeanalizować, czy mutacje punktowe związane z chorobą człowieka w prekursorach Tgfß wpływają na ich zdolność do tworzenia funkcjonalnych ligandów dimerycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane procedury są zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Utah. Żaby są trzymane w obiekcie zatwierdzonym przez IACUC. Samce żab są poddawane eutanazji przez zanurzenie w tricainie, a następnie przez obcięcie komory serca. Samice żab są trzymane w laboratorium przez maksymalnie 24 godziny po hormonalnym indukcji tarła, aby umożliwić pobranie jaj, a następnie wracają do placówki opiekuńczej.

1. Kolekcja X. laevis Testes

  1. Znieczulenie dojrzałego płciowo samca w 0,2% trikainy (Tabela 1) przez 30-40 minut, aż zwierzę przestanie reagować na szczypanie pazurów.
  2. Użyj kleszczy, aby odciągnąć skórę od ściany ciała. Wykonaj poziome nacięcie w skórze w poprzek dolnej części brzucha za pomocą nożyczek chirurgicznych. Wykonaj równoległe nacięcie w dolnej ścianie ciała, a następnie trzecie, prostopadłe nacięcie przez ścianę ciała w górę przez klatkę piersiową.
    1. Odchyl powstałe płaty, zlokalizuj komorę serca i przypnij podstawę, aby wykrwawić i zapewnić śmierć.
  3. Wyciągnij żółte ciała tłuszczowe z brzucha kleszczami i zlokalizuj jądra po każdej stronie, poniżej podstawy ciał tłuszczowych. Usuń każde jądro, odcinając je od ciał tłuszczowych i wszelkich przyczepionych wnętrzności za pomocą nożyczek chirurgicznych.
  4. Przenieść jądra na szalkę Petriego zawierającą 1x zmodyfikowany roztwór Bartha (MBS) (Tabela 1). Spłucz i usuń wszelkie przylegające naczynia krwionośne lub przyczepione wnętrzności.
    1. Przenieść jedno jądro na szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą bufor jąder (tabela 1) w celu natychmiastowego użycia, a drugie przechowywać w stożkowej probówce o pojemności 10 ml wypełnionej buforem jąder do późniejszego użycia. Jądro powinno być przechowywane w temperaturze 4 °C, gdy nie jest używane i zachowuje żywotność przez co najmniej dwa tygodnie.
      UWAGA: Fotografie izolacji jąder można znaleźć w Odnośniku 15.

2. Zbieranie i zapłodnienie jaj X. laevis

UWAGA: Żaby powinny być obsługiwane w rękawiczkach winylowych lub myte ręcznie przed i po kontakcie z żabami. Lateksowe rękawiczki, balsamy i pozostałości detergentów na ludzkich dłoniach uszkodzą delikatną skórę żab.

  1. Wieczorem przed tarłem wstrzyknąć 0,3 ml (1200 j.m.) ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (Tabela 1) do grzbietowego worka limfatycznego dwóch lub trzech dojrzałych samic X. laevis za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 26 G. Do każdego wstrzyknięcia należy użyć nowej igły.
  2. Po wstrzyknięciu umieścić samice w szczelnie zamkniętym pojemniku (nieszczelnym) w inkubatorze biologicznym o temperaturze 18 °C. Tarło rozpoczyna się zazwyczaj 14-16 godzin później.
    UWAGA: Plastikowe szuflady lub plastikowe pojemniki z otworami wentylacyjnymi wyciętymi w pokrywie dobrze sprawdzają się do trzymania samic przez noc. Upewnij się, że pokrywa jest dobrze założona, aby zapobiec ucieczce i wysuszeniu żab w inkubatorze.
  3. Przytrzymaj samicę nad 100-milimetrową szalką Petriego zawierającą 1x MBS i delikatnie uciskaj brzuch żaby, aby wydalić jaja do szalki.
  4. Wytnij mały kawałek jądra (~1/5) za pomocą żyletki i przenieś go do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej ~500 μL 1x MBS. Zmiażdżyć tłuczkiem do granulek lub homogenizatorem tkankowym. Otrzymaną zawiesinę nasienia należy przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C w celu późniejszego zapłodnienia tego samego dnia.
  5. Przechylić szalkę Petriego o średnicy 100 mm, aby wylać jak najwięcej 1x MBS, a pozostałą część usunąć za pomocą plastikowej pipety transferowej. Nałóż około 100 μl zawiesiny nasienia, dodaj około 1 ml 0,1x MBS i zamieszaj do wymieszania.
    1. Po 5 minutach zalać naczynie odchlorowaną wodą z kranu lub 0,1x MBS i odstawić na 30 min.
      UWAGA: Wodę można odchlorować za pomocą filtra lub miejską wodę z kranu można pozostawić bez przykrycia na co najmniej 24 godziny, aby umożliwić rozproszenie chloru w regionach, w których do wody dodaje się konwencjonalny chlor. W obszarach, w których chloramina jest dodawana w celu dezynfekcji wody pitnej, woda musi być zamiast tego uzdatniana dostępnym w handlu uzdatniaczem, który może rozkładać chloraminę.
      UWAGA: Jaja zbiera się w roztworze o wysokiej zawartości soli (1x MBS), aby zapobiec tworzeniu się galaretowatej powłoki, która stanowiłaby barierę dla zapłodnienia. Po zapłodnieniu roztwór o niskiej zawartości soli (woda odchlorowana lub 0,1x MBS) pozwala na wytworzenie się galaretowatej powłoki, a jaja będą przylegać do siebie i do naczynia. Zapłodnione jaja będą się obracać tak, że pigmentowany słup zwierzęcy będzie skierowany do góry w ciągu 30 minut. Jeśli tak się nie stanie, a jaja wyglądają zdrowo pod mikroskopem, żywotność plemników jest podejrzana i może być konieczne pobranie nowych jąder.
  6. Odlewać roztwór, który przykrywa jaja, i napełnić szalkę Petriego świeżo przygotowanym 2% roztworem cysteiny (tabela 1). Mieszaj roztwór w naczyniu przez 3-5 minut, aż galaretka się rozpuści, a jajka przestaną sklejać się ze sobą lub z potrawą.
    1. Przechyl naczynie i ostrożnie odlej roztwór cysteiny lub usuń plastikową pipetą. Zastąp na 1x wodę ze stawu DeBoera (Tabela 1). Zamieszać, aby spłukać i zdekantować.
    2. Powtórz jedno mycie roztworem DeBoera, jedno z 0,1x MBS i ponownie napełnij naczynie 0,1x MBS. Po usunięciu galaretki jaja stają się bardziej kruche i nie mogą być narażone na działanie granicy faz powietrze-ciecz.
  7. Przenieść zapłodnione jaja do inkubatora biologicznego o temperaturze 16 °C lub pozostawić je na stole w temperaturze pokojowej. W przypadku pozostawienia w temperaturze pokojowej pierwsze rozszczepienie nastąpi 1-1,5 godziny po zapłodnieniu, a kolejne rozszczepienia będą następować mniej więcej co 30 minut. Natomiast jeśli zarodki są inkubowane w temperaturze 15-16 °C, rozszczepienia będą następować mniej więcej co godzinę i możliwe będzie wstrzyknięcie większej liczby zarodków z danej zaszczepiacza.

3. Mikroiniekcja zarodków X. laevis

  1. Podgrzej i pociągnij szklane kapilary do drobnego punktu za pomocą ściągacza do mikropipet z następującymi ustawieniami: Dwustopniowe ciągnięcie; Ciepło 1: 67,4 °C; Ciepło 2: 62 °C.
    UWAGA: Te ustawienia są specyficzne dla używanego tutaj ściągacza do mikropipet i szklanych kapilar (Tabela materiałów).
  2. Pod mikroskopem preparacyjnym odetnij końcówkę wyciągniętej igły blisko końca za pomocą kleszczy Dumont #5. Igła powinna być ostra, ale nie na tyle cienka, aby końcówka zginała się w kontakcie z zarodkiem. Rysunek 1 pokazuje przykład odpowiednio wyciągniętej igły, która nie została przycięta do mikroiniekcji (A) i takiej, która została przycięta (B).
  3. Umieścić igłę w uchwycie igły podłączonym do mikrowstrzykiwacza. Przymocować uchwyt igły do mikromanipulatora. Umieść 2-4 μl syntetycznego RNA kodującego białko prekursorowe Tgfß do analizy na małym kawałku parafilmu pod mikroskopem preparacyjnym.
    1. Za pomocą mikromanipulatora opuść igłę do kropli i użyj funkcji napełniania na mikrowstrzykiwaczu, aby zassać RNA do igły. Upewnij się, że igła znajduje się poniżej powierzchni kropli i obserwuj postęp pod mikroskopem, aby uniknąć zasysania powietrza do igły.
      UWAGA: Jeśli przeciwciała rozpoznające domenę prodomenę i/lub domenę ligandową prekursora Tgfß, który ma być analizowany, nie są dostępne, sekwencja kodująca znacznik epitopu (np. V5, myc, Flag) może zostać wstawiona w ramce do cDNA, który będzie używany jako matryca do transkrypcji RNA. Bioaktywność znakowanego białka in vivo należy porównać z bioaktywnością białka nieznakowanego, aby upewnić się, że epitop nie zakłóca prawidłowego fałdowania, rozszczepienia lub aktywności.
  4. Wyrzuć kroplę roztworu RNA do powietrza i zmierz wielkość kropli za pomocą mikrometru zamontowanego na stoliku iniekcji lub w okularze mikroskopu. Dostosuj wielkość kropli do około 10 nL, korzystając z regulatorów czasu i ciśnienia na mikrowtryskiwaczu.
    UWAGA: Stężenia RNA w zakresie 5-20 ng/μL są odpowiednie do dostarczenia 50-200 pg RNA do każdego zarodka. Taka ilość RNA jest na ogół wystarczająca do wykrycia produktów rozszczepienia w aspiratach od 10-20 zarodków. Najlepiej jest dążyć do najniższej dawki RNA, która daje wykrywalny sygnał na immunoblotach. Większe ilości RNA mogą powodować wady gastrulacji, które zakłócają rozszerzanie się blastocoele.
  5. Przenieść zarodki do naczynia iniekcyjnego lub tacki zawierającej 5% Ficoll w 0,1 x MBS (Tabela 1), gdy osiągną stadium 2-4 komórek. Szalka Petriego o średnicy 35 mm wyposażona w kawałek nylonowej siatki na dnie może służyć jako niedrogie naczynie do wstrzykiwań, które utrzyma zarodki w stanie unieruchomienia. Wbić igłę w pobliże słupa zwierzęcia i wstrzyknąć 10 nL RNA do jednej komórki każdego zarodka.
    UWAGA: Zarodki można łatwo wstrzykiwać w dowolnym momencie między stadium od jednej do 16 komórek. Wstrzyknięcie zarodka po jego rozszczepieniu zapewnia, że komórka jajowa została zapłodniona, a zarodek jest zdrowy. Dokładna lokalizacja wstrzyknięcia nie jest istotna. Bardziej szczegółowy opis tarła, hodowli i mikroiniekcji RNA do zarodków X. laevis można znaleźć w piśmiennictwie 15.
  6. Przenieść wstrzyknięte zarodki na szalkę Petriego o średnicy 35 mm wypełnioną 5% Ficollem w 0,1 x MBS (Tabela 1). Umieść małe szalki w szalce Petriego o średnicy 150 mm i przykryj luźno pokrywką, aby zapobiec parowaniu pożywki hodowlanej. Hodować zarodki przez noc w temperaturze 15-16 °C.
    UWAGA: Hodowla zarodków w Ficollu pomaga w gojeniu się miejsca wstrzyknięcia. Jeśli używane są cienkie igły, wystarczy wyhodowanie w 2-3% Ficollu, podczas gdy 5% Ficoll jest preferowane, jeśli obserwuje się widoczne uszkodzenia. Trzymanie zarodków w roztworze Ficoll przez 1-2 godziny po wstrzyknięciu wystarczy, aby wspomóc gojenie, ale inkubacja przez noc nie uszkadza zarodka, o ile roztwór zostanie zmieniony przed rozpoczęciem gastrulacji.

4. Ekstrakcja i analiza blastocoele w produktach rozszczepienia Tgfß

  1. Następnego ranka po wstrzyknięciu należy usunąć roztwór Ficollu i usunąć wszelkie martwe lub umierające zarodki. Opłucz zarodki raz lub dwa razy 0,1x MBS i hoduj zarodki w 0,1x MBS na stole w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Zarodki można również umieścić z powrotem w inkubatorze biologicznym w temperaturze 16 °C w celu spowolnienia rozwoju.
  2. Podgrzej i pociągnij szklane kapilary do drobnego punktu za pomocą ściągacza do mikropipet z następującymi ustawieniami: Ciągnięcie dwustopniowe; Ciepło 1: 67,4 °C; Ciepło 2: 62 °C.
    UWAGA: Te ustawienia są specyficzne dla używanego tutaj ściągacza i szklanej kapilary (Tabela materiałów).
  3. Pod mikroskopem preparacyjnym odetnij końcówkę wyciągniętej igły za pomocą kleszczy. Aby zapobiec zatykaniu, otwór igły używanej do aspiracji blastocoele powinien być większy niż w igle używanej do mikroiniekcji. Przykład dobrze wyciągniętej i obciętej igły do aspiracji blastocoele pokazany jest w Rysunek 1C. Włożyć igłę do aspiracji do uchwytu igły podłączonego do mikrowstrzykiwacza i przymocować uchwyt igły do mikromanipulatora.
    UWAGA: Optymalna średnica igły jest określana empirycznie metodą prób i błędów. Igły o dużej średnicy napełniają się zbyt szybko i zwiększają prawdopodobieństwo, że zanieczyszczenia komórkowe dostaną się do igły. Natomiast igły o bardzo małej średnicy mogą się zatkać. Po wygenerowaniu odpowiedniej igły przydatne jest wygenerowanie wielu igieł przyciętych w tej samej pozycji.
  4. Umieścić zarodki w tacce do wstrzykiwań lub naczyniu wypełnionym 0,1 MBS, gdy osiągną wczesne lub środkowe stadium gastruli (stadium 10-11).
  5. Wbić igłę pod powierzchnię zarodka w pobliżu bieguna zwierzęcia. Naciśnij przycisk napełniania na mikrowstrzykiwaczu, patrząc przez mikroskop preparacyjny, aby mieć oko na igłę i zarodek. W ciągu kilku sekund poziom przezroczystego płynu w igle wzrośnie, a zarodek zapadnie się i stanie się wklęsły.
    1. Jeśli mętna istota biała dostanie się do igły, puść przycisk napełniania i naciśnij przycisk wstrzykiwania jeden lub więcej razy, aby usunąć mętną materię, która składa się z resztek komórkowych, które mogą zawierać proteazy.
      UWAGA: Jeśli blastocoele zapadnie się, a resztki komórek dostaną się do igły zaraz po naciśnięciu przycisku napełniania, oznacza to, że otwór w igle jest zbyt duży. Jeśli blastocoele nie zapadnie się, ale istota biała natychmiast dostanie się do igły, oznacza to, że igła została włożona zbyt głęboko i dotyka podłogi blastocoele. Wyrzuć istotę białą i przejdź do następnego zarodka. Szybkość zasysania można dokładniej kontrolować, pulsując przyciskiem napełniania, a nie naciskając go w sposób ciągły. Jest to szczególnie ważne, jeśli otwór w igle jest większy niż optymalny.
  6. Powtarzaj krok 4.5, aż płyn zostanie odessany z blastocoele 10-20 zarodków.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, płyn blastocoele pobrany z 10-20 zarodków jest wystarczający do wykrycia produktów rozszczepienia na immunoblotach. Może się to jednak różnić w zależności od jakości przeciwciał i musi być określone empirycznie.
  7. Umieść kawałek parafiny na tacce iniekcyjnej i odpipetuj na nią 1 μl wody wolnej od nukleaz. Zanurz igłę pod kroplą wody i naciśnij przycisk wstrzykiwania, aby rozproszyć płyn blastocoele do wody.
    1. Alternatywnie, wyrzuć płyn bezpośrednio na parafilm, ale w tym przypadku naciśnij pulsacyjnie przycisk wstrzykiwania, zamiast go przytrzymywać. Powoduje to wyrzucenie płynu pod niższym ciśnieniem, zapobiegając jego spłaszczaniu się na parafilmie, co utrudnia pobranie go w pipecie.
  8. Przenieś płyn blastocoele do sterylnej probówki do mikrowirówki na lodzie. Spodziewaj się zebrać około 0,3-0,5 μl płynu blastocoele na zarodek. Dodaj wodę wolną od nukleaz, aby dostosować końcową objętość do 30 μl.
  9. Przenieś zarodki pozbawione płynu blastocoele do oddzielnej probówki na lodzie. Usunąć nadmiar 0,1 x MBS i dodać 200 μl schłodzonego (4 °C) buforu lizatu zarodkowego (10 μl na zarodek) (Tabela 1). Pipetuj zarodki w górę i w dół 10-20 razy za pomocą mikropipety, aż do pełnej homogenizacji i nie pozostaną żadne grudki.
  10. Odwirować homogenizowane zarodki w mikrowirówce z chłodzeniem o sile 10 000 x g przez 10 minut. Usunąć 160 μl supernatantu za pomocą pipety P200 i przenieść do nowej probówki na lodzie, uważając, aby uniknąć białych białek żółtka i innych zanieczyszczeń komórkowych w dolnej połowie probówki.
    1. Powtórzyć mikrowirowanie jeden raz i przenieść 128 μl klarownego supernatantu do nowej probówki na lodzie. W tym momencie oczyszczone lizaty zarodkowe i płyn blastocoele mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C tak długo, jak jest to pożądane.
      UWAGA: Z kilkoma wyjątkami, białka prekursorowe Tgfß nie są wydzielane do blastocoele i mogą być wykryte tylko w zubożonych lizatach zarodkowych. Z kolei produkty łupliwości z rodziny Tgfß są widoczne przede wszystkim w płynie blastocoele. W większości przypadków pomocne jest zbieranie i analizowanie zarówno lizatów zarodkowych, jak i płynu blastocoele. Zapewnia to co najmniej kontrolę pozytywną w celu zapewnienia, że prekursor uległ solidnej translacji i był stabilny. Ponadto pozwala na porównanie względnych proporcji produktów rozszczepienia do prekursorów wśród różnych białek typu dzikiego lub zmutowanego, w celu identyfikacji mutacji, które umożliwiają wydzielanie nienaruszonych prekursorów do płynu blastocoele (np. mutacje w obrębie motywu konsensusu PC, które pozwalają na prawidłowe fałdowanie i wydzielanie bez rozszczepienia, w którym to przypadku nienaruszony prekursor jest wykrywany zarówno w zarodku, jak i w płynie blastocoele) lub mutacje, które generują nieprawidłowe fałdowanie, białka nierozszczepialne (w takim przypadku prekursor zostanie wykryty w lizacie zarodkowym, ale produkty rozszczepienia będą nieobecne w płynie blastocoele).
  11. Białka deglikozylanowe obecne w płynie blastocoele z PNGazą F w tym momencie, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Nie ma potrzeby deglikozylacji białek prekursorowych obecnych w lizacie zarodkowym, ponieważ reprezentują one retikulum endoplazmatyczne (ER) - rezydujące formy prekursora, które nie mają złożonych oligosacharydów połączonych z N usuniętych przez PNGazę F. Natomiast produkty rozszczepienia obecne w płynie blastocoele przemieściły się przez sieć trans-Golgiego (TGN), gdzie węglowodany są dalej modyfikowane i mogą być teraz usuwane przez PNGazę F. Po deglikozylacji produkty rozszczepienia migrują jako ściślej skondensowane pasmo na żelach SDS, co może pomóc w wizualizacji, ocenie ilościowej i dokładnej identyfikacji produktów dekoltu. Nie jest to ściśle wymagane, ale może być pomocne, na przykład, jeśli próbujesz rozróżnić homodimery i heterodimery na podstawie wzorców migracji lub jeśli produkt rozszczepienia zawiera niejednorodne węglowodany, które powodują jego migrację jako szerokie pasmo rozmyte.
  12. Dodać 5 μl redukującego 4x buforu próbki (Tabela 1) do 15 μl płynu blastocoele i 15 μl oczyszczonego lizatu zarodkowego. Dodać 5 μl nieredukującego 4x buforu do próbki (Tabela 1) do pozostałych 15 μl płynu blastocoele. Podgrzać do 100 °C przez 5 minut i umieścić na lodzie.
    UWAGA: Analiza białek w warunkach nieredukcyjnych jest niezbędna do analizy tworzenia rozszczepionych ligandów homodimerycznych lub heterodimerycznych, ale nie jest potrzebna, jeśli chodzi tylko o analizę miejsc rozszczepienia lub poziomów rozszczepionych białek. Z kilkoma wyjątkami fragmenty prodomeny są wydzielane jako monomery. Ponadto białka prekursorowe obecne w lizacie zarodkowym to przede wszystkim monomery rezydujące w ER. Dzięki temu nie ma potrzeby analizowania tych produktów w warunkach nieredukcyjnych.
  13. Rozpuść białka prekursorowe i produkty rozszczepienia przez elektroforezę na 15% żelach SDS/poliakrylamidowych.
  14. Przenieś białka z żelu na membranę PVDF za pomocą transferu elektroforetycznego.
  15. Inkubować błony z odpowiednimi przeciwciałami, które rozpoznają domenę prodomain i domenę liganda (lub znaczniki epitopów wstawione do tych domen), myć i inkubować z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi. Wizualizacja białek za pomocą obrazowania chemiluminescencyjnego lub fluorescencyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem opisanego poniżej eksperymentu było ustalenie, czy Bmp4 i Bmp7 tworzą heterodimery (dimery składające się z jednego ligandu Bmp4 i jednego ligandu Bmp7), homodimery (składające się z dwóch ligandów Bmp4 lub dwóch ligandów Bmp7), czy też mieszaninę obu tych form podczas ich współekspresji w X. laevis. Dane przedstawione na Rysunku 2 zostały pobrane z wcześniej opublikowanego badania10. Rysunek 2A przedstawia schemat produktó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Głównymi zaletami opisanego tutaj protokołu jest to, że można go ukończyć stosunkowo szybko, nie wymaga drogich odczynników i stanowi źródło skoncentrowanych produktów rozszczepienia Tgfß w warunkach fizjologicznych. Kolejną zaletą jest to, że pozwala analizować białka znakowane epitopami, a tym samym obejść niedobór komercyjnie dostępnych przeciwciał, które rozpoznają większość prodomen rodziny Tgfß. Chociaż możliwe jest również przeanalizowanie rozszczepienia znakowanych epitopami białek prekursorowych Tgfß w transfeko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Mary Sanchez za doskonałą opiekę nad zwierzętami. Badania autorów są wspierane przez National Institute of Child Health and Human Development of the National Institutes of Health (NIH/NICHD) granty R01HD067473-08 i R21 HD102668-01 oraz przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK/NIH) grant R01DK128068-01.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ß-merkaptoetanolFisherAC125470100
Bromofenol BlueFisherB392-5
Chlorek wapniaFisherC79-500
Azotan wapniaFisherC109-500
Jednorazowy tłuczek do granulek/młynekdo tkanek Fisher12-141-364
KleszczeDumont #5Narzędzia Fine Science11251-10
Surowica bydlęcapłodu Atlanta BiologicalsS11150H
Ficoll 400Sigma AldrichF9378-500G
Kapilara szklana, 1 X 90 mmNarshigeG-1
GlicerolFisherG33-4
HEPESFisherBP310-500
Kosmówka ludzka gonadotropinaSigma AldrichCG10-10VL
Strzykawka iniekcyjna, 1 mlFisher8881501368
L-cysteinaSigma AldrichC7352
Siarczan magnezuFisherM63-500
Igła, 26 gFisher305111
Penicylina/StreptomycynaGibco15140148
Mikrowtryskiwacz PicoliterWarner InstrumentsPLI-100A
Ściągacz do pipetNarashigePC-100
Chlorek potasuFisherP217-500
Membrana PVDFSigma AldrichIPVH00010
Wodorowęglan soduFisherS233-500
Chlorek soduFisherS271-10
Dodecylosiarczan soduFisherBP166-500
Wodorotlenek soduFisherS318-500
Trikaina-SPentairTRS5
TrisFisherBP152-5

Bibliografia

  1. Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands. Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).
  2. Gray, A. M., Mason, A. J. Requirement for activin A and transforming growth factor--beta 1 pro-regions in homodimer assembly. Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).
  3. Constam, D. B. Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing. Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).
  4. Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. Structure and activation of pro-activin A. Nature Communications. 7, 12052(2016).
  5. Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1. Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).
  6. Cui, Y., et al. The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor. Genes & Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).
  7. Goldman, D. C., et al. Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity. Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).
  8. Le Good, J. A., et al. Nodal stability determines signaling range. Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).
  9. Tilak, A., et al. Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice. Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).
  10. Neugebauer, J. M., et al. The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).
  11. Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).
  12. Zhou, F., et al. GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth. Cell Reports. 33, 108332(2020).
  13. Nelsen, S. M., Christian, J. L. Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7. Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).
  14. Birsoy, B., et al. XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development. Development. 132 (3), 591-602 (2005).
  15. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).
  16. Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. Proprotein convertase genes in Xenopus development. Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).
  17. Constam, D. B., Robertson, E. J. Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases. Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).
  18. Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).
  19. Sopory, S., Christian, J. L. Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. Whitman, M. A., Whitman, S. , CRC Press LLC. 38-55 (2006).
  20. Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).
  21. Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4. Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

rozszczepianie TGF-betapłyn blastocelezarodki Xenopusheterodimery BMPmikroiniekcja białekSDS-PAGEWestern blotlizat zarodkowyrozszczepianie proteolitycznefragment prodomeny
Analiza produktów rozpadu rodziny transformujących czynników wzrostu wydzielanych do blastocoele zarodków Xenopus laevis
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.