Method Article

Przejściowa transdukcja strobilowanych form Echinococcus granulosus

DOI:

10.3791/62783

⸱

September 16th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Student Research Committee, School of Medicine, Kerman University of Medical Sciences, 2Research Center for Hydatid Disease in Iran, Kerman University of Medical Sciences, 3Department of Parasitology and Mycology, Faculty of Medicine, Kurdistan University of Medical Sciences, 4State Key Laboratory for Zoonotic Diseases, Key Laboratory of Zoonosis Research, Ministry of Education, Institute of Zoonosis, College of Veterinary Medicine, Jilin University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy technikę szybkiej transdukcji przejściowej w różnych stadiach rozwojowych Echinococcus granulosus przy użyciu wektorów lentiwirusowych trzeciej generacji.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyk torbielowaty lub choroba bąblowców jest jedną z najważniejszych chorób pasożytniczych wywoływanych przez Echinococcus granulosus, małego tasiemca występującego w jelicie psów. Istnieje pilna potrzeba stosowania badań genetycznych w celu zrozumienia mechanizmów patogenezy oraz kontroli i zapobiegania chorobom. Jednak brak skutecznego systemu oceny genów utrudnia bezpośrednią interpretację genetyki funkcjonalnej pasożytów tasiemca, w tym gatunku Echinococcus. Niniejsze badanie pokazuje potencjał przejściowej transdukcji genu lentiwirusa w metacestodach i strobilowanych formach E. granulosus. Protoskopety (PSC) wyizolowano z torbieli bąblowcowych i przeniesiono do określonych dwufazowych pożywek hodowlanych, aby przekształcić się w robaletki strobilacyjne. Robaki zostały przetransfekowane pobranym lentiwirusem trzeciej generacji wraz z komórkami HEK293T w celu kontroli procesu transdukcji. U ustroboskopowych robaków wykryto wyraźną fluorescencję w ciągu 24 godzin i 48 godzin, co wskazuje na przejściową transdukcję lentiwirusową w E. granulosus. Niniejsza praca przedstawia pierwszą próbę transdukcji przejściowej opartej na lentiwirusie u tasiemców i demonstruje obiecujące wyniki z potencjalnymi implikacjami w badaniach eksperymentalnych nad biologią płazińców.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyk torbielowaty (CE) jest jedną z najważniejszych chorób robaków wywoływanych przez Echinococcus granulosus, małego tasiemca z rodziny Taeniidae1,2. Przeprowadzono szeroko zakrojone badania nad immunodiagnostyką i opracowaniem szczepionki przeciwko E. granulosus. Jednak niewystarczająca wiedza na temat molekularnych podstaw biologii pasożytów stwarza poważne ograniczenia w diagnozowaniu, leczeniu i zapobieganiu chorobie bąblowcowej3,4,5,6.

W ostatnich latach, dzięki rozwojowi metod sekwencjonowania genomu i metod transkryptomicznych, kilka grup badawczych przeprowadziło szeroki zakres badań molekularnych na płazińcach7,8,9. Jednak w świecie pasożytów postęp w technologii transferu genów u pasożytniczych płazińców jest nadal ograniczony w porównaniu z wysoce powtarzalnymi metodami transdukcji przejściowej opracowanymi dla niektórych pierwotniaków10,11,12.

Wykorzystanie systemów dostarczania wirusów stało się podstawowym narzędziem do dostarczania transgenów i badań nad genami/białkami w ciągu ostatnich dwóch dekad13. Lentiwirus infekuje zarówno komórki dzielące się, jak i niedzielące się, umożliwiając w ten sposób infekowanie komórek postmitotycznych14,15,16. Najnowsze dowody wskazują, że zastosowanie systemu transdukcji opartego na lentiwirusie w komórkach ssaków daje możliwość przezwyciężenia większości ograniczeń poprzednich technik knock-in/knock-down. Projektowanie i budowa wektorów lentiwirusowych ekspresji z odpowiednimi markerami molekularnymi, takimi jak ekspresja GFP, zostały opisane wcześniej16. Dlatego oceniamy przejściową transdukcję lentiwirusową genu reporterowego GFP w protoskopiach i starobalowanych robakach E. granulosus.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zatwierdzone przez National Institute for Medical Research Development oraz Research Ethics Review Committee, nr 958680. Lentiwirusy są klasyfikowane jako organizmy BSL-2; w związku z tym wszystkie procedury hodowli laboratoryjnej w tym protokole zostały przeprowadzone przy użyciu sterylnych praktyk laboratoryjnych i przeprowadzone pod okapem z przepływem laminarnym zgodnie z wytycznymi NIH. Rysunek 1 przedstawia schematyczną prezentację protokołu badania dla różnych stadiów E. granulosus.

1. Zbieranie torbieli bąblowcowych

  1. Zbieraj torbiele bąblowców wątroby od naturalnie zakażonych owiec rutynowo zabijanych w rzeźni.
  2. Całkowicie wysterylizuj powierzchnię torbieli za pomocą sterylnej gazy i 70% alkoholu przed odessaniem protoskopecji (PSC).
  3. Odessać 20-50 ml płynu bąblowcowego do sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
  4. Po odsączeniu zetrzyj torbiel ostrym ostrzem, przenieś warstwę rozrodczą do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i potrząsaj nią przez krótki czas (~2 min), aby zwiększyć zbieranie PSC. Przenieś warstwę rozrodczą do nowej probówki o pojemności 1,5 ml w celu charakterystyki molekularnej.
  5. Przemyć PSC 3-5x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
  6. Obserwuj PSC w 0,1% eozynie przez 5 minut, aby określić żywotność PSC pod mikroskopem świetlnym. Używaj PSC o co najmniej 95% żywotności dla hodowli.
  7. Osad PSC należy traktować 2 ml pepsyny (2 mg/ml, pH 2) przez 15-20 minut.
  8. Aby wyizolować poszczególne PSC, należy ponownie zawiesić osad PSC w PBS i przepuścić go przez dwie warstwy sterylnej gazy do nowej sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Oblicz średnią z trzech zliczeń na 50 μl osadów PSC za pomocą mikroskopu świetlnego. W przypadku kolejnych prób należy użyć wartości szacunkowej do określenia PSC/μl. Każdy izolat torbieli bąblowcowej powinien być scharakteryzowany na podstawie polimorfizmów nukleotydów metodami molekularnymi, takimi jak sekwencjonowanie PCR17 lub analiza krzywej topnienia w wysokiej rozdzielczości18.

2. Dwufazowa hodowla PSC E. granulosus w celu uzyskania dorosłych robaków

UWAGA: Izolowane PSC powinny być hodowane w sterylnych warunkach w komorze laminarnej klasy II. Przygotuj oddzielnie fazę stałą i ciekłą dwufazowej pożywki hodowlanej przed przejściem do kolejnych kroków19.

  1. Przygotuj dwufazową pożywkę hodowlaną, która będzie składać się z dwóch faz.
    1. W przypadku fazy stałej dodać 10 ml surowicy bydlęcej do kolby o pojemności 25 ml i pozostawić do koagulacji w temperaturze 76 °C na 20-30 minut.
    2. W fazie ciekłej (zmodyfikowany CMRL) wymieszaj 100 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej (FCS), 36 ml 5% ekstraktu drożdżowego, 5,6 ml 30% glukozy (w wodzie destylowanej), 1,4 ml 5% żółci psa w PBS, 20 mM buforze HEPES i 10 mM NaHCO3 w 260 ml pożywki CMRL-1066. Na koniec dodać do mieszaniny penicylinę (100 j.m./ml) i streptomycynę (100 mg/ml).
  2. Dodać 10 ml pożywki w fazie ciekłej do każdej kolby hodowlanejo długości 25 cm2.
  3. Dodać ~ 5 000 PSC do kolby hodowlanej i przenieść kolbę do inkubatora CO2 (37 °C, 5% CO2 ).
  4. Po 24-48 godzinach przenieść PSC do nowej kolby z fazą stałą (surowicą bydlęcą) i dodać 1 ml tej samej świeżej pożywki fazy ciekłej na kolbę. Przenieść kolby do inkubatora CO2 (37 °C, 5 % CO2 ).
  5. Co 5-7 dni zastępować pożywkę świeżą pożywką w fazie ciekłej w oparciu o zmiany koloru pożywki hodowlanej i szacowaną proporcję zróżnicowanych PSCs.
    UWAGA: Protoskopety szybko reagują na zmiany środowiskowe po hodowli, a większość z nich ulega różnicowaniu w ciągu 2-3 tygodni. Ze względu na zużycie składników odżywczych oraz wzrost i rozwój protoskopecji zmienia się pH pożywki hodowlanej, a jej kolor zmienia się w kierunku pomarańczowego i żółtego.

3. Monofazowa hodowla PSC E. granulosus

  1. Upewnij się, że uprawa jednofazowa jest wykonywana 24-48 godzin przed transdukcją.
    1. Posiew ~ 5,000 PSC w kolbie hodowlanej o średnicy 25 cm2 z RPMI i 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
    2. Przenieść kolby do inkubatora CO2 (37 °C, 5 % CO2 ) do momentu użycia.

4. Hodowla komórkowa do produkcji i przygotowania wirusa

UWAGA: Ludzkie embrionalne komórki nerkowe 293T (HEK293T) zostały pozyskane do produkcji wektorów z Centrum Badań nad Patologią i Komórkami Macierzystymi Uniwersytetu Medycznego w Kerman.

  1. Przenieś 5 × 105 HEK293T komórek do kolby o średnicy 25cm2 zawierającej 5 ml DMEM z 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
  2. Inkubować HEK293T komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i co 48 godzin przechodzić do kompletnej pożywki hodowlanej. Na koniec użyj komórek HEK293T o niskim przejściu do transdukcji20.

5. Produkcja i przygotowanie wirusa z wektorami lentiwirusowymi trzeciej generacji

UWAGA: Wektor lentiwirusa pCDH513b (wektor transferowy) oraz PLPII, PLPI i PMD2G (wektory pomocnicze) zostały użyte do ekspresji genu reporterowego GFP. Patrz tabela materiałów i rysunek uzupełniający S1.

  1. Dzień 1:
    1. Po trypsynizacji HEK293T komórek21 na 6-dołkowych płytkach hodowlanych, wysiewaj 7 ×10 4 komórek na studzienkę świeżym DMEM bez antybiotyków zawierającym 10% FBS.
    2. Użyj komórek o konfluencji 50%-60% do transdukcji metodą fosforanu wapnia.
  2. Dzień 2:
    1. Zastąp pożywkę do hodowli komórkowej na 2-3 godziny przed eksperymentem na świeży, wolny od antybiotyków DMEM zawierający 2% FBS.
    2. W probówce o pojemności 1,5 ml wymieszaj plazmidy lentiwirusowe trzeciej generacji, w tym 7 μg/μL pCDH513b (wektor przenoszenia), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI i 2 μg/μL PMD2G (wektory pomocnicze).
    3. Dodać bufor HEPES (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES i 1,5 mM Na2HPO4; optymalny zakres pH, 7,00-7,28) do mieszaniny do objętości 422 μL.
    4. Do mieszaniny dodać 16 μl 1% buforu Tris-EDTA (TE).
    5. Dodać 62 μl 2,5 mM chlorku wapnia do probówek i dobrze wymieszać.
    6. Dodaj 500 μl 2x soli fizjologicznej buforowanej przez HEPS (HBS) do mieszaniny, kropla po kropli, w ciągu 1-2 minut za pomocą pipety Pasteura. Delikatnie mieszać, aż do uzyskania półprzezroczystego roztworu i inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Powoli dodawaj mieszaninę do każdej płytki i rozprowadzaj ją powolnymi okrężnymi ruchami.
    8. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i po 4-6 godzinach zastąpić pożywkę DMEM bez antybiotyków zawierającą 10% FBS.
  3. Dzień 3:
    1. Potwierdź udaną transdukcję przejściową i żywotność komórki za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.
  4. Dzień 4:
    1. Pobrać wirusy z pożywki hodowlanej, zbierając supernatant z każdej studzienki i przechowywać je w temperaturze -70 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Zebrane lentiwirusy mogą być zagęszczane i miareczkowane w celu precyzyjnej transfekcji22.

6. Przejściowa transdukcja różnych etapów E. granulosus z wirusem

  1. Dzień 1:
    1. Użyj 12-dołkowej płytki hodowlanej do transferu genów. Kultura 5 × 103-5 ×10 4 HEK293T komórek w trzech egzemplarzach, z kompletną pożywką DMEM jako wewnętrznym odniesieniem.
    2. Hodowla 150 świeżych PSC w trzech egzemplarzach w RPMI i 10% FBS.
    3. Hodowla 30 strobilowanych robaków w trzech egzemplarzach w DMEM zawierających 10% inaktywowanych termicznie FBS.
      UWAGA: Wszystkie media transdukcyjne muszą być wolne od antybiotyków. Utrzymuj w tym procesie trzy nieleczone studzienki kontrolne dla komórek HEK293T, PSC i robaków strobilowanych.
    4. Przygotować mieszaninę 1 × 106 wirusów z odczynnikiem do transfekcji 4 μg/ml (patrz tabela materiałów) w celu transdukcji komórek HEK293T i różnych stadiów rozwoju robaka.
    5. Powoli dodawaj mieszaninę do każdej płytki i rozprowadzaj ją powolnymi okrężnymi ruchami. Inkubować płytki przez 4-6 godzin w inkubatorze CO2 (37 °C, 5% CO2 ). Zastąp pożywkę dla każdej próbki tą samą kompletną pożywką hodowlaną, aby zminimalizować toksyczne skutki odczynnika do transfekcji.
  2. Dzień 2:
    1. Powtórz kroki 6.1.4-6.1.5, aby zwiększyć skuteczność transdukcji przejściowej dla komórek HEK293T, PSC i ślimaków.
    2. Inkubować wszystkie płytki przez 24-48 godzin w inkubatorze CO2 w tych samych warunkach hodowli w zależności od rodzaju pożywki komórkowej.
  3. Dzień 3:
    1. Sprawdź, czy transdukcja się powiodła, korzystając z mikroskopii fluorescencyjnej.
      UWAGA: Rozważ użycie dalszych testów potwierdzających, takich jak techniki PCR/qPCR20,23 lub Western blotting24 w procedurze transferu genów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy szybką i efektywną technikę transdukcji przejściowej u E. granulosus przy użyciu wektorów lentiwirusowych trzeciej generacji. Hodowaliśmy PSC w dwufazowym pożywce hodowlanej, aby uzyskać strobobilowane robaki, jak opisano wcześniej25,26. Protoskopety przekształcają się w strobotylowane robaki po 6 tygodniach in vitro. W dwufazowej pożywce hodowlanej zaobserwowano różne stadia E. granulosus, w tym wniknięte PSC (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie molekularnych podstaw nicieni i biologii Platyhelminthes ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patogeniczności pasożytów odzwierzęcych27. Brak skutecznego systemu oceny genów jest główną przeszkodą w bezpośredniej interpretacji genetyki funkcjonalnej pasożytów tasiemców, w tym gatunków Echinococcus 12,27. Niniejsze badania wskazują na doskonały potencjał lentiwirusa w transdukcji przejściowej E. granulosus.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez Elite Researcher Grant Committee pod numerem 958680 od National Institute for Medical Research Development (NIMAD), Teheran, Iran.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12-dołkowe płytki hodowlaneSPL Life Sciences30012
25 cm2 kolbahodowlana SPL Life Sciences70325
6-dołkowe płytki hodowlaneSPL Life Sciences30006
Chlorek wapniaSigma-AldrichC4901-500GStężenie robocze: 2,5  mM
CMRL 1066 mediumThermo Fisher Scientific11530037
inkubator CO2memmertICO150
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270-1KG
DMEMLife Technology12100046
Żółć psaWyizolowana od psa poddanego eutanazji i wysterylizowana przez 0,2 μ m filtr strzykawkowy
Eosin YSigma-AldrichE4009-5Gprzygotować 0,1% Eozyny do testu wykluczenia pracy
Surowica bydlęca płodu (FBS)DNAbiotechDB9723-100mlInaktywacja termiczna  z  FBS (30 min w 40 ° C)
Surowica cielęca płodu (FCS)DNAbiotechDB9724-100mlInaktywacja termiczna  z  SKO (30 min w 40 stopniach; C)
HEK293T komórekBONbiotechBN_0012.1.14Ludzka nerka embrionalna 293T
HEPES buforowana sól fizjologiczna (HBS)Sigma-Aldrich51558-50ML2x
koncentrat Mikroskop fluorescencyjny z odwróconą fluorescencjąOLYMPUSIX51
PenicylinaSigma-AldrichP3032-10MUStężenie robocze: 100 IU / ml
PepsynaRoche10108057001Stężenie robocze: 2 mg/mL, pH 2
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)DNAbiotechDB0011Ten odczynnik rozpuszcza się w mniej niż 1 minutę w DW
Polybrene (odczynnik do transfekcji)Sigma-AldrichTR-1003-G
RPMI mediumBioIdeaBI-1006-05
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761-1KG
StreptomycynaSigma-AldrichS9137-25GStężenie robocze: 100 μ g/ml
Plazmid lentiwirusowy trzeciej generacji (pCDH513b)SBI System Biosciences (BioCat GmbH)CD513B-1-SBIWektor transferowy (uzyskany komercyjnie z Wydziału Badań Medycyny Molekularnej Irańskiego Akademickiego Centrum Edukacji, Kultury i Badań (ACECR), Meszhed, Iran)
Plazmid lentiwirusowy trzeciej generacji (pLPI i pLPII)Invitrogen (Life Technologies)K4975-00Wektor pomocniczy (uzyskany komercyjnie z Wydziału Badań Medycyny Molekularnej Irańskiego Akademickiego Centrum Edukacji, Kultury i Badań (ACECR), Meszhed, Iran)
Plazmid lentiwirusowy trzeciej generacji (pMD2G)AddgenePlasmid 12259Wektor pomocniczy (uzyskany komercyjnie z Wydziału Badań Medycyny Molekularnej Irańskiego Akademickiego Centrum Edukacji, Kultury i Badań (ACECR), Meszhed, Iran)
Bufor Tris/EDTA (TE)DNAbiotechDB9713-100ml
TrypsynaSigma-AldrichT9935-50MG1x roztwory robocze (pH 7,4– 7.6)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315(2017).
  2. Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020(2021).
  3. Eckert, J., Thompson, R. C. A. Historical aspects of echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 1-64 (2017).
  4. Romig, T., et al. Ecology and life cycle patterns of Echinococcus species. Advances in Parasitology. 95, 213(2017).
  5. Craig, P. S., Hegglin, D., Lightowlers, M. W., Torgerson, P. R., Wang, Q. Echinococcosis: control and prevention. Advances in Parasitology. 95, 55(2016).
  6. Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95 (1), 315(2017).
  7. Tsai, I. I. J., et al. The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism. Nature. 496 (7443), 57-63 (2013).
  8. Koziol, U., Brehm, K. Recent advances in Echinococcus genomics and stem cell research. Veterinary Parasitology. 213 (3-4), 92-102 (2015).
  9. Zheng, H., et al. The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus. Nature Genetics. 45 (10), 1168-1175 (2013).
  10. Pérez-Victoria, J. M., Torres, A. P. T. C., Gamarro, F., Castanys, S. ABC transporters in the protozoan parasite Leishmania. International Microbiology. 4 (3), 159-166 (2001).
  11. Ehrenkaufer, G. M., Singh, U. Transient and stable transfection in the protozoan parasite Entamoeba invadens. Molecular and Biochemical Parasitology. 184 (1), 59-62 (2012).
  12. Moguel, B., Bobes, R. J., Carrero, J. C., Laclette, J. P. Transfection of Platyhelminthes. BioMed Research International. 2015, 206161(2015).
  13. Tang, Y., Garson, K., Li, L., Vanderhyden, B. C. Optimization of lentiviral vector production using polyethylenimine-mediated transfection. Oncology Letters. 9 (1), 55-62 (2015).
  14. Mann, V. H., Suttiprapa, S., Rinaldi, G., Brindley, P. J. Establishing transgenic schistosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (8), 1230(2011).
  15. Balcaitis, S., Weinstein, J. R., Li, S., Chamberlain, J. S., Möller, T. Lentiviral transduction of microglial cells. Glia. 50 (1), 48-55 (2005).
  16. Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Therapy. 9 (17), 1155-1162 (2002).
  17. Bowles, J., Blair, D., McManus, D. P. Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. Molecular and Biochemical Parasitology. 54 (2), 165-173 (1992).
  18. Rostami, S., et al. High resolution melting technique for molecular epidemiological studies of cystic echinococcosis: differentiating G1, G3, and G6 genotypes of Echinococcus granulosus sensu lato. Parasitology Research. 112 (10), 3441-3447 (2013).
  19. Mousavi, S. M., et al. Biological and morphological consequences of dsRNA-induced suppression of tetraspanin mRNA in developmental stages of Echinococcus granulosus. Parasites and Vectors. 13 (1), 190(2020).
  20. Afgar, A., et al. MiR-339 and especially miR-766 reactivate the expression of tumor suppressor genes in colorectal cancer cell lines through DNA methyltransferase 3B gene inhibition. Cancer Biology & Therapy. 17 (11), 1126-1138 (2016).
  21. Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (16), e755(2008).
  22. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1499(2009).
  23. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e4031(2012).
  24. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).
  25. Dezaki, E. S., et al. Comparison of ex vivo harvested and in vitro cultured materials from Echinococcus granulosus by measuring expression levels of five genes putatively involved in the development and maturation of adult worms. Parasitology Research. 115 (11), 4405-4416 (2016).
  26. Mousavi, S. M., et al. Calmodulin-specific small interfering RNA induces consistent expression suppression and morphological changes in Echinococcus granulosus. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
  27. Aboobaker, A. A., Blaxter, M. L. Functional genomics for parasitic nematodes and platyhelminths. Trends in Parasitology. 20 (4), 178-184 (2004).
  28. Elegheert, J., et al. Lentiviral transduction of mammalian cells for fast, scalable and high-level production of soluble and membrane proteins. Nature Protocols. 13 (12), 2991(2018).
  29. Mizukami, C., et al. Gene silencing in Echinococcus multilocularis protoscoleces using RNA interference. Parasitology International. 59 (4), 647-652 (2010).
  30. Thompson, R. C. A., Jenkins, D. J. Echinococcus as a model system: biology and epidemiology. International Journal for Parasitology. 44 (12), 865-877 (2014).
  31. Thompson, R. C. A. Biology and systematics of Echinococcus. Advances in Parasitology. Thompson, R. C. A., Deplazes, P., Lymbery, A. J. 95, 65-109 (2017).
  32. Brehm, K., Koziol, U. Echinococcus-host interactions at cellular and molecular levels. Advances in Parasitology. 95, 147-212 (2017).
  33. Moguel, B., et al. Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps. SpringerPlus. 4, 496(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Echinococcus GranulosusTransient TransductionLentiviral VectorsStrobilated WormsHydatid DiseaseProtoscoleces IsolationBiphasic CultureGene TransferFluorescence MicroscopyTapeworm Genetics

Related Articles