Method Article

Przejściowa transdukcja strobilowanych form Echinococcus granulosus

DOI:

10.3791/62783

⸱

September 16th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Student Research Committee, School of Medicine, Kerman University of Medical Sciences, 2Research Center for Hydatid Disease in Iran, Kerman University of Medical Sciences, 3Department of Parasitology and Mycology, Faculty of Medicine, Kurdistan University of Medical Sciences, 4State Key Laboratory for Zoonotic Diseases, Key Laboratory of Zoonosis Research, Ministry of Education, Institute of Zoonosis, College of Veterinary Medicine, Jilin University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy technikę szybkiej transdukcji przejściowej w różnych stadiach rozwojowych Echinococcus granulosus przy użyciu wektorów lentiwirusowych trzeciej generacji.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyk torbielowaty lub choroba bąblowców jest jedną z najważniejszych chorób pasożytniczych wywoływanych przez Echinococcus granulosus, małego tasiemca występującego w jelicie psów. Istnieje pilna potrzeba stosowania badań genetycznych w celu zrozumienia mechanizmów patogenezy oraz kontroli i zapobiegania chorobom. Jednak brak skutecznego systemu oceny genów utrudnia bezpośrednią interpretację genetyki funkcjonalnej pasożytów tasiemca, w tym gatunku Echinococcus. Niniejsze badanie pokazuje potencjał przejściowej transdukcji genu lentiwirusa w metacestodach i strobilowanych formach E. granulosus. Protoskopety (PSC) wyizolowano z torbieli bąblowcowych i przeniesiono do określonych dwufazowych pożywek hodowlanych, aby przekształcić się w robaletki strobilacyjne. Robaki zostały przetransfekowane pobranym lentiwirusem trzeciej generacji wraz z komórkami HEK293T w celu kontroli procesu transdukcji. U ustroboskopowych robaków wykryto wyraźną fluorescencję w ciągu 24 godzin i 48 godzin, co wskazuje na przejściową transdukcję lentiwirusową w E. granulosus. Niniejsza praca przedstawia pierwszą próbę transdukcji przejściowej opartej na lentiwirusie u tasiemców i demonstruje obiecujące wyniki z potencjalnymi implikacjami w badaniach eksperymentalnych nad biologią płazińców.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyk torbielowaty (CE) jest jedną z najważniejszych chorób robaków wywoływanych przez Echinococcus granulosus, małego tasiemca z rodziny Taeniidae1,2. Przeprowadzono szeroko zakrojone badania nad immunodiagnostyką i opracowaniem szczepionki przeciwko E. granulosus. Jednak niewystarczająca wiedza na temat molekularnych podstaw biologii pasożytów stwarza poważne ograniczenia w diagnozowaniu, leczeniu i zapobieganiu chorobie bąblowcowej3,4,5,6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zatwierdzone przez National Institute for Medical Research Development oraz Research Ethics Review Committee, nr 958680. Lentiwirusy są klasyfikowane jako organizmy BSL-2; w związku z tym wszystkie procedury hodowli laboratoryjnej w tym protokole zostały przeprowadzone przy użyciu sterylnych praktyk laboratoryjnych i przeprowadzone pod okapem z przepływem laminarnym zgodnie z wytycznymi NIH. Rysunek 1 przedstawia schematyczną prezentację protokołu badania dla różnych stadiów E. granulosus.

1. Zbieranie torbieli bąblowcowych

  1. Zbieraj torbiele bąblowców wątr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy szybką i efektywną technikę transdukcji przejściowej u E. granulosus przy użyciu wektorów lentiwirusowych trzeciej generacji. Hodowaliśmy PSC w dwufazowym pożywce hodowlanej, aby uzyskać strobobilowane robaki, jak opisano wcześniej25,26. Protoskopety przekształcają się w strobotylowane robaki po 6 tygodniach in vitro. W dwufazowej pożywce hodowlanej zaobserwowano różne stadia E. granulosus, w tym wniknięte PSC (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie molekularnych podstaw nicieni i biologii Platyhelminthes ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patogeniczności pasożytów odzwierzęcych27. Brak skutecznego systemu oceny genów jest główną przeszkodą w bezpośredniej interpretacji genetyki funkcjonalnej pasożytów tasiemców, w tym gatunków Echinococcus 12,27. Niniejsze badania wskazują na doskonały potencjał lentiwirusa w transdukcji przejściowej E. granulosus.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez Elite Researcher Grant Committee pod numerem 958680 od National Institute for Medical Research Development (NIMAD), Teheran, Iran.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12-dołkowe płytki hodowlaneSPL Life Sciences30012
25 cm2 kolbahodowlana SPL Life Sciences70325
6-dołkowe płytki hodowlaneSPL Life Sciences30006
Chlorek wapniaSigma-AldrichC4901-500GStężenie robocze: 2,5  mM
CMRL 1066 mediumThermo Fisher Scientific11530037
inkubator CO2memmertICO150
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270-1KG
DMEMLife Technology12100046
Żółć psaWyizolowana od psa poddanego eutanazji i wysterylizowana przez 0,2 μ m filtr strzykawkowy
Eosin YSigma-AldrichE4009-5Gprzygotować 0,1% Eozyny do testu wykluczenia pracy
Surowica bydlęca płodu (FBS)DNAbiotechDB9723-100mlInaktywacja termiczna  z  FBS (30 min w 40 ° C)
Surowica cielęca płodu (FCS)DNAbiotechDB9724-100mlInaktywacja termiczna  z  SKO (30 min w 40 stopniach; C)
HEK293T komórekBONbiotechBN_0012.1.14Ludzka nerka embrionalna 293T
HEPES buforowana sól fizjologiczna (HBS)Sigma-Aldrich51558-50ML2x
koncentrat Mikroskop fluorescencyjny z odwróconą fluorescencjąOLYMPUSIX51
PenicylinaSigma-AldrichP3032-10MUStężenie robocze: 100 IU / ml
PepsynaRoche10108057001Stężenie robocze: 2 mg/mL, pH 2
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)DNAbiotechDB0011Ten odczynnik rozpuszcza się w mniej niż 1 minutę w DW
Polybrene (odczynnik do transfekcji)Sigma-AldrichTR-1003-G
RPMI mediumBioIdeaBI-1006-05
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761-1KG
StreptomycynaSigma-AldrichS9137-25GStężenie robocze: 100 μ g/ml
Plazmid lentiwirusowy trzeciej generacji (pCDH513b)SBI System Biosciences (BioCat GmbH)CD513B-1-SBIWektor transferowy (uzyskany komercyjnie z Wydziału Badań Medycyny Molekularnej Irańskiego Akademickiego Centrum Edukacji, Kultury i Badań (ACECR), Meszhed, Iran)
Plazmid lentiwirusowy trzeciej generacji (pLPI i pLPII)Invitrogen (Life Technologies)K4975-00Wektor pomocniczy (uzyskany komercyjnie z Wydziału Badań Medycyny Molekularnej Irańskiego Akademickiego Centrum Edukacji, Kultury i Badań (ACECR), Meszhed, Iran)
Plazmid lentiwirusowy trzeciej generacji (pMD2G)AddgenePlasmid 12259Wektor pomocniczy (uzyskany komercyjnie z Wydziału Badań Medycyny Molekularnej Irańskiego Akademickiego Centrum Edukacji, Kultury i Badań (ACECR), Meszhed, Iran)
Bufor Tris/EDTA (TE)DNAbiotechDB9713-100ml
TrypsynaSigma-AldrichT9935-50MG1x roztwory robocze (pH 7,4– 7.6)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315(2017).
  2. Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Echinococcus GranulosusTransient TransductionLentiviral VectorsStrobilated WormsHydatid DiseaseProtoscoleces IsolationBiphasic CultureGene TransferFluorescence MicroscopyTapeworm Genetics

Related Articles