$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
To badanie zostało zatwierdzone przez National Institute for Medical Research Development oraz Research Ethics Review Committee, nr 958680. Lentiwirusy są klasyfikowane jako organizmy BSL-2; w związku z tym wszystkie procedury hodowli laboratoryjnej w tym protokole zostały przeprowadzone przy użyciu sterylnych praktyk laboratoryjnych i przeprowadzone pod okapem z przepływem laminarnym zgodnie z wytycznymi NIH. Rysunek 1 przedstawia schematyczną prezentację protokołu badania dla różnych stadiów E. granulosus.
1. Zbieranie torbieli bąblowcowych
- Zbieraj torbiele bąblowców wątroby od naturalnie zakażonych owiec rutynowo zabijanych w rzeźni.
- Całkowicie wysterylizuj powierzchnię torbieli za pomocą sterylnej gazy i 70% alkoholu przed odessaniem protoskopecji (PSC).
- Odessać 20-50 ml płynu bąblowcowego do sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
- Po odsączeniu zetrzyj torbiel ostrym ostrzem, przenieś warstwę rozrodczą do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i potrząsaj nią przez krótki czas (~2 min), aby zwiększyć zbieranie PSC. Przenieś warstwę rozrodczą do nowej probówki o pojemności 1,5 ml w celu charakterystyki molekularnej.
- Przemyć PSC 3-5x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
- Obserwuj PSC w 0,1% eozynie przez 5 minut, aby określić żywotność PSC pod mikroskopem świetlnym. Używaj PSC o co najmniej 95% żywotności dla hodowli.
- Osad PSC należy traktować 2 ml pepsyny (2 mg/ml, pH 2) przez 15-20 minut.
- Aby wyizolować poszczególne PSC, należy ponownie zawiesić osad PSC w PBS i przepuścić go przez dwie warstwy sterylnej gazy do nowej sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
UWAGA: Oblicz średnią z trzech zliczeń na 50 μl osadów PSC za pomocą mikroskopu świetlnego. W przypadku kolejnych prób należy użyć wartości szacunkowej do określenia PSC/μl. Każdy izolat torbieli bąblowcowej powinien być scharakteryzowany na podstawie polimorfizmów nukleotydów metodami molekularnymi, takimi jak sekwencjonowanie PCR17 lub analiza krzywej topnienia w wysokiej rozdzielczości18.
2. Dwufazowa hodowla PSC E. granulosus w celu uzyskania dorosłych robaków
UWAGA: Izolowane PSC powinny być hodowane w sterylnych warunkach w komorze laminarnej klasy II. Przygotuj oddzielnie fazę stałą i ciekłą dwufazowej pożywki hodowlanej przed przejściem do kolejnych kroków19.
- Przygotuj dwufazową pożywkę hodowlaną, która będzie składać się z dwóch faz.
- W przypadku fazy stałej dodać 10 ml surowicy bydlęcej do kolby o pojemności 25 ml i pozostawić do koagulacji w temperaturze 76 °C na 20-30 minut.
- W fazie ciekłej (zmodyfikowany CMRL) wymieszaj 100 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej (FCS), 36 ml 5% ekstraktu drożdżowego, 5,6 ml 30% glukozy (w wodzie destylowanej), 1,4 ml 5% żółci psa w PBS, 20 mM buforze HEPES i 10 mM NaHCO3 w 260 ml pożywki CMRL-1066. Na koniec dodać do mieszaniny penicylinę (100 j.m./ml) i streptomycynę (100 mg/ml).
- Dodać 10 ml pożywki w fazie ciekłej do każdej kolby hodowlanejo długości 25 cm2.
- Dodać ~ 5 000 PSC do kolby hodowlanej i przenieść kolbę do inkubatora CO2 (37 °C, 5% CO2 ).
- Po 24-48 godzinach przenieść PSC do nowej kolby z fazą stałą (surowicą bydlęcą) i dodać 1 ml tej samej świeżej pożywki fazy ciekłej na kolbę. Przenieść kolby do inkubatora CO2 (37 °C, 5 % CO2 ).
- Co 5-7 dni zastępować pożywkę świeżą pożywką w fazie ciekłej w oparciu o zmiany koloru pożywki hodowlanej i szacowaną proporcję zróżnicowanych PSCs.
UWAGA: Protoskopety szybko reagują na zmiany środowiskowe po hodowli, a większość z nich ulega różnicowaniu w ciągu 2-3 tygodni. Ze względu na zużycie składników odżywczych oraz wzrost i rozwój protoskopecji zmienia się pH pożywki hodowlanej, a jej kolor zmienia się w kierunku pomarańczowego i żółtego.
3. Monofazowa hodowla PSC E. granulosus
- Upewnij się, że uprawa jednofazowa jest wykonywana 24-48 godzin przed transdukcją.
- Posiew ~ 5,000 PSC w kolbie hodowlanej o średnicy 25 cm2 z RPMI i 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
- Przenieść kolby do inkubatora CO2 (37 °C, 5 % CO2 ) do momentu użycia.
4. Hodowla komórkowa do produkcji i przygotowania wirusa
UWAGA: Ludzkie embrionalne komórki nerkowe 293T (HEK293T) zostały pozyskane do produkcji wektorów z Centrum Badań nad Patologią i Komórkami Macierzystymi Uniwersytetu Medycznego w Kerman.
- Przenieś 5 × 105 HEK293T komórek do kolby o średnicy 25cm2 zawierającej 5 ml DMEM z 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
- Inkubować HEK293T komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i co 48 godzin przechodzić do kompletnej pożywki hodowlanej. Na koniec użyj komórek HEK293T o niskim przejściu do transdukcji20.
5. Produkcja i przygotowanie wirusa z wektorami lentiwirusowymi trzeciej generacji
UWAGA: Wektor lentiwirusa pCDH513b (wektor transferowy) oraz PLPII, PLPI i PMD2G (wektory pomocnicze) zostały użyte do ekspresji genu reporterowego GFP. Patrz tabela materiałów i rysunek uzupełniający S1.
- Dzień 1:
- Po trypsynizacji HEK293T komórek21 na 6-dołkowych płytkach hodowlanych, wysiewaj 7 ×10 4 komórek na studzienkę świeżym DMEM bez antybiotyków zawierającym 10% FBS.
- Użyj komórek o konfluencji 50%-60% do transdukcji metodą fosforanu wapnia.
- Dzień 2:
- Zastąp pożywkę do hodowli komórkowej na 2-3 godziny przed eksperymentem na świeży, wolny od antybiotyków DMEM zawierający 2% FBS.
- W probówce o pojemności 1,5 ml wymieszaj plazmidy lentiwirusowe trzeciej generacji, w tym 7 μg/μL pCDH513b (wektor przenoszenia), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI i 2 μg/μL PMD2G (wektory pomocnicze).
- Dodać bufor HEPES (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES i 1,5 mM Na2HPO4; optymalny zakres pH, 7,00-7,28) do mieszaniny do objętości 422 μL.
- Do mieszaniny dodać 16 μl 1% buforu Tris-EDTA (TE).
- Dodać 62 μl 2,5 mM chlorku wapnia do probówek i dobrze wymieszać.
- Dodaj 500 μl 2x soli fizjologicznej buforowanej przez HEPS (HBS) do mieszaniny, kropla po kropli, w ciągu 1-2 minut za pomocą pipety Pasteura. Delikatnie mieszać, aż do uzyskania półprzezroczystego roztworu i inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
- Powoli dodawaj mieszaninę do każdej płytki i rozprowadzaj ją powolnymi okrężnymi ruchami.
- Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i po 4-6 godzinach zastąpić pożywkę DMEM bez antybiotyków zawierającą 10% FBS.
- Dzień 3:
- Potwierdź udaną transdukcję przejściową i żywotność komórki za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.
- Dzień 4:
- Pobrać wirusy z pożywki hodowlanej, zbierając supernatant z każdej studzienki i przechowywać je w temperaturze -70 °C do momentu użycia.
UWAGA: Zebrane lentiwirusy mogą być zagęszczane i miareczkowane w celu precyzyjnej transfekcji22.
6. Przejściowa transdukcja różnych etapów E. granulosus z wirusem
- Dzień 1:
- Użyj 12-dołkowej płytki hodowlanej do transferu genów. Kultura 5 × 103-5 ×10 4 HEK293T komórek w trzech egzemplarzach, z kompletną pożywką DMEM jako wewnętrznym odniesieniem.
- Hodowla 150 świeżych PSC w trzech egzemplarzach w RPMI i 10% FBS.
- Hodowla 30 strobilowanych robaków w trzech egzemplarzach w DMEM zawierających 10% inaktywowanych termicznie FBS.
UWAGA: Wszystkie media transdukcyjne muszą być wolne od antybiotyków. Utrzymuj w tym procesie trzy nieleczone studzienki kontrolne dla komórek HEK293T, PSC i robaków strobilowanych.
- Przygotować mieszaninę 1 × 106 wirusów z odczynnikiem do transfekcji 4 μg/ml (patrz tabela materiałów) w celu transdukcji komórek HEK293T i różnych stadiów rozwoju robaka.
- Powoli dodawaj mieszaninę do każdej płytki i rozprowadzaj ją powolnymi okrężnymi ruchami. Inkubować płytki przez 4-6 godzin w inkubatorze CO2 (37 °C, 5% CO2 ). Zastąp pożywkę dla każdej próbki tą samą kompletną pożywką hodowlaną, aby zminimalizować toksyczne skutki odczynnika do transfekcji.
- Dzień 2:
- Powtórz kroki 6.1.4-6.1.5, aby zwiększyć skuteczność transdukcji przejściowej dla komórek HEK293T, PSC i ślimaków.
- Inkubować wszystkie płytki przez 24-48 godzin w inkubatorze CO2 w tych samych warunkach hodowli w zależności od rodzaju pożywki komórkowej.
- Dzień 3:
- Sprawdź, czy transdukcja się powiodła, korzystając z mikroskopii fluorescencyjnej.
UWAGA: Rozważ użycie dalszych testów potwierdzających, takich jak techniki PCR/qPCR20,23 lub Western blotting24 w procedurze transferu genów.