Analiza plwociny pod kontrolą jakości za pomocą cytometrii przepływowej

Summary

Ten protokół opisuje skuteczną metodę dysocjacji plwociny na zawiesinę pojedynczej komórki i późniejszą charakterystykę podzbiorów komórkowych na standardowych platformach cytometrycznych przepływu.

Abstract

Sputum, powszechnie używane do badania zawartości komórek i innych cech mikrośrodowiska w celu zrozumienia zdrowia płuc, jest tradycyjnie analizowane przy użyciu metodologii opartej na cytologii. Jego użyteczność jest ograniczona, ponieważ czytanie slajdów jest czasochłonne i wymaga wysoce wyspecjalizowanego personelu. Co więcej, rozległe szczątki i obecność zbyt wielu płaskonabłonkowych komórek nabłonka (SEC) lub komórek policzków często sprawiają, że próbka nie nadaje się do diagnozy. Natomiast cytometria przepływowa pozwala na wysokoprzepustowe fenotypowanie populacji komórkowych przy jednoczesnym wykluczeniu szczątków i SEC.

Protokół przedstawiony tutaj opisuje skuteczną metodę dysocjacji plwociny na zawiesinę pojedynczej komórki, barwienie przeciwciał i utrwalanie populacji komórkowych oraz pobieranie próbek na platformie cytometrii przepływowej. Przedstawiono tutaj strategię bramkowania, która opisuje wykluczenie szczątków, martwych komórek (w tym SEC) i dubletów komórkowych. Ponadto praca ta wyjaśnia również, jak analizować żywotne, pojedyncze komórki plwociny w oparciu o klaster dodatnich i ujemnych populacji różnicowania (CD)45 w celu scharakteryzowania podzbiorów linii krwiotwórczych i nabłonkowych. Środek kontroli jakości jest również zapewniony poprzez identyfikację makrofagów specyficznych dla płuc jako dowodu na to, że próbka pochodzi z płuc i nie jest śliną. Wreszcie wykazano, że metoda ta może być stosowana do różnych platform cytometrycznych, dostarczając profile plwociny od tego samego pacjenta analizowane na trzech cytometrach przepływowych; Navios EX, LSR II i Lyric. Co więcej, protokół ten może być modyfikowany w celu uwzględnienia dodatkowych markerów komórkowych będących przedmiotem zainteresowania. Przedstawiono tutaj metodę analizy całej próbki plwociny na platformie cytometrii przepływowej, która sprawia, że plwocina jest podatna na opracowanie wysokoprzepustowej diagnostyki chorób płuc.

Introduction

Postęp techniczny w sprzęcie i oprogramowaniu cytometrów przepływowych umożliwił jednoczesną identyfikację wielu różnych populacji komórek^1,2,3,4. Na przykład wykorzystanie cytometru przepływowego w badaniach nad komórkami krwiotwórczymi doprowadziło do znacznie lepszego zrozumienia układu odpornościowego² i hierarchii komórkowej układu krwiotwórczego⁵, a także diagnostycznego rozróżnienia wielu różnych nowotworów krwi^6,7,8. Chociaż większość komórek plwociny jest pochodzenia krwiotwórczego^9,10,11, cytometria przepływowa nie jest szeroko stosowana do analizy plwociny do celów diagnostycznych. Jednak kilka badań sugeruje, że ocena populacji komórek odpornościowych w plwocinie (najbardziej znaczący podzbiór komórek) może być bardzo pomocna w diagnozowaniu i/lub monitorowaniu chorób, takich jak astma i przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP)^12,13,14,15. Co więcej, istnienie markerów specyficznych dla nabłonka, które można wykorzystać w cytometrii przepływowej, pozwala na zbadanie następującego najbardziej znaczącego podzbioru komórek w plwocinie, komórek nabłonka płuc.

Oprócz możliwości analizy wielu różnych populacji komórek o różnym pochodzeniu tkankowym, cytometr przepływowy może ocenić dużą liczbę komórek w stosunkowo krótkim czasie. Dla porównania, analizy cytologiczne oparte na szkiełkach często wymagają wysoce wyspecjalizowanego personelu i/lub sprzętu. Analizy te mogą być pracochłonne, co prowadzi do tego, że analizowana jest tylko część próbki plwociny¹⁶.

Trzy krytyczne kwestie ograniczają powszechne stosowanie plwociny w cytometrii przepływowej. Pierwsza kwestia dotyczy pobierania plwociny. Plwocina jest zbierana przez kaszel, który wydala śluz z płuc do jamy ustnej, a następnie pluje do kubka zbiorczego. Ponieważ śluz przemieszcza się przez jamę ustną, istnieje duże prawdopodobieństwo zanieczyszczenia SEC. Zanieczyszczenie to komplikuje analizę próbki, ale problem można łatwo rozwiązać na platformie cytometrii przepływowej, jak pokazano w tym badaniu.

Nie każdy może wytwarzać plwocinę spontanicznie; dlatego opracowano kilka urządzeń, które pomagają w zbieraniu plwociny w sposób nieinwazyjny¹⁷. Jednym z takich urządzeń jest nebulizator, który okazał się wytwarzać wiarygodne próbki plwociny^18,19,20. Chociaż nebulizator jest bardzo skutecznym sposobem nieinwazyjnego pobierania plwociny, jego użycie nadal wymaga ustawienia w placówce medycznej z wyspecjalizowanym personelem²¹. Natomiast urządzenia przenośne, takie jak flet płucny^22,23,24 i acapella^16,25 mogą być używane w domu, ponieważ są bardzo przyjazne dla użytkownika. Te urządzenia wspomagające są zarówno bezpieczne, jak i ekonomiczne.

Dla nas, acapella dawała konsekwentnie lepsze wyniki niż flet płucny¹⁶, dlatego urządzenie acapella zostało wybrane do pobierania plwociny. Zdecydowano się na 3-dniowe pobranie próbki, ponieważ głównym celem użycia plwociny jest opracowanie testu wykrywającego raka płuc¹⁶. Wykazano, że próbka 3-dniowa zwiększa prawdopodobieństwo wykrycia raka płuc w porównaniu z próbką 1- lub 2-dniową^26,27,28. Jednak inne metody pobierania plwociny mogą być preferowane do różnych celów. Jeśli stosowana jest inna metoda pobierania plwociny niż opisana tutaj, zaleca się staranne miareczkowanie każdego przeciwciała lub barwnika używanego do analizy cytometrii przepływowej; Dostępnych jest bardzo niewiele danych na temat wpływu różnych metod pobierania plwociny na białka docelowe w cytometrii przepływowej.

Drugą kwestią tłumiącą entuzjazm do używania plwociny do diagnostyki, głównie związaną z cytometrią przepływową, jest liczba komórek. Problemem jest zebranie wystarczającej liczby żywotnych komórek do wiarygodnej analizy. Dwa badania wykazały, że próbki plwociny pobrane metodami nieinwazyjnymi, za pomocą urządzenia wspomagającego, zawierają wystarczającą ilość żywotnych komórek, które można wykorzystać w diagnostyce klinicznej lub badaniach naukowych^16,24. Jednak żadne z tych badań nie dotyczyło kwestii liczby komórek w odniesieniu do cytometrii przepływowej.

Dla badań, które stanowią podstawę tego protokołu, próbki plwociny zostały pobrane od uczestników o wysokim ryzyku zachorowania na raka płuc zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi instytucjonalnymi dla każdego ośrodka badawczego. Uczestnicy wysokiego ryzyka zostali zdefiniowani jako osoby w wieku od 55 do 75 lat, palące 30 paczkolat i nie rzucające palenia w ciągu ostatnich 15 lat. Pacjentom pokazano, jak korzystać z urządzenia acapella zgodnie z instrukcjami producenta²⁹ i pobierali plwocinę przez trzy kolejne dni w domu. Próbkę przechowywano w lodówce do ostatniego pobrania. W ostatnim dniu pobierania próbki zostały wysłane do laboratorium w nocy z zamrożonym zimnym opakowaniem. Próbki poddano obróbce w postaci zawiesiny jednokomórkowej w dniu ich otrzymania. Dzięki tej metodzie pobierania plwociny uzyskuje się więcej niż wystarczającą ilość żywotnych komórek do wiarygodnej analizy cytometrii przepływowej.

Na koniec, w związku z poprzednim problemem z numerem komórki, pojawia się pytanie, jak uwolnić komórki plwociny z jej śluzowego środowiska. W jaki sposób można utrzymać komórki przy życiu i stworzyć zawiesinę pojedynczej komórki, która nie zatyka cytometru przepływowego? Opierając się na wstępnych pracach Pizzichini et al.³⁰ i Miller et al.³¹, protokół ten opisuje łatwą i niezawodną metodę przetwarzania plwociny na zawiesinę pojedynczej komórki, która jest odpowiednia do analizy cytometrycznej przepływowej. W tej metodzie wykorzystano ugruntowane wytyczne w zakresie cytometrii przepływowej^32,33,34 w celu opracowania skutecznej strategii znakowania przeciwciał w celu identyfikacji komórek krwiotwórczych i nabłonkowych w plwocinie oraz zapewnienia ustawień instrumentu, środków kontroli jakości i wytycznych dotyczących analizy standaryzujących analizę plwociny na platformie cytometrii przepływowej.

Protocol

Wszystkie etapy przetwarzania plwociny są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej.

1. Przygotowanie odczynnika przed rozpoczęciem dysocjacji plwociny

1. Rozmrozić 1% paraformaldehydu (PFA), 25 ml na próbkę na lodzie i przechowywać w chłodzie do momentu użycia.
   UWAGA: PFA jest toksyczny przez drogi oddechowe i kontakt ze skórą. Przygotować utrwalacz zgodnie z instrukcjami producenta i zamrozić w temperaturze -20 °C w 25 ml porcji do czasu użycia.
2. Przybliżyć masę próbki i rozmrozić 0,1% ditiotreitolu (DTT) w kroku 2.2 i doprowadzić do temperatury 37 °C. (Podwielokrotności DTT należy przechowywać w temperaturze -20 °C przed użyciem).
3. Doprowadź wystarczającą ilość 0,5% N-acetylo-L-cysteiny (NAC) do 37 °C dla kroku 2.2. (NAC powinien być świeży co tydzień i przechowywany w temperaturze 4 °C przed użyciem.)

2. Dysocjacja plwociny

1. Zważyć próbkę plwociny, aby określić objętości odczynników dysocjacyjnych.
   UWAGA: Próbkę uważa się za małą, jeśli masa początkowa wynosi ≤3 g, średnią, jeśli >3 g, ale ≤8 g, dużą, jeśli >8, ale ≤16 g, i bardzo dużą, jeśli próbka waży >16 g. Oznaczenia mały, średni, duży i bardzo duży będą używane w całym protokole. Ilość odczynników wymaganych do dysocjacji i znakowania różni się w zależności od wielkości próbki plwociny.
2. Przenieś małą próbkę do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, pożywkę do czystej plastikowej jednorazowej butelki o pojemności 250 ml lub dużą i bardzo dużą próbkę do czystej plastikowej butelki jednorazowego o pojemności 500 ml. Dodać 1 ml/g masy próbki 0,5% NAC i 4 mL/g masy próbki 0,1% DTT.
3. Wiruj z maksymalną prędkością (przez 15 s), a następnie bujaj się w temperaturze pokojowej (z maksymalną prędkością) przez 15 minut.
4. Rozcieńczyć próbkę czterema objętościami zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) (w oparciu o całkowitą objętość próbki + odczynników) w celu zneutralizowania NAC i DTT; szybko wirować z maksymalną prędkością i kołysać w temperaturze pokojowej przez 5 minut z maksymalną prędkością.
5. Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko (sitka) do komórek o grubości 100 μm z siatki nylonowej do jednej lub więcej stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.
6. Odwirować komórki przy 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant, połączyć wszystkie granulki w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 ml, a następnie przemyć granulki HBSS w tych samych warunkach.
7. Zawiesić osad komórkowy w objętości buforu określonej przez początkową masę próbki plwociny.
   UWAGA: Małą próbkę zawiesza się ponownie w 250 μl HBSS. Pożywkę sample zawiesza się ponownie w 760 μl HBSS. Duże i bardzo duże próbki zawiesza się ponownie w 1460 μl HBSS.
8. Pobrać podwielokrotność zawiesiny komórek do zliczania żywych/martwych komórek za pomocą błękitu trypanowego.
   UWAGA: W przypadku małej próbki użyj 5 μl. W przypadku średniej, dużej lub bardzo dużej próbki należy użyć 10 μl. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 HBSS.
   1. Zmieszać 10 μl rozcieńczonej plwociny z 30 μl 0,4% błękitu trypanowego, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie próbki 1:40. Załaduj do komór zliczających hemocytometru w celu zliczenia komórek.
      UWAGA: Może być konieczne dostosowanie końcowego rozcieńczenia, jeśli liczba komórek jest zbyt niska lub zbyt wysoka, aby uzyskać dokładne zliczenie. Zdecydowanie zaleca się skonsultowanie się z Guiot et al.²⁰ w celu poprawnego odróżnienia komórek plwociny od SEC i zanieczyszczeń. Jest to niezbędne do dokładnego zliczania komórek.
9. Z bardzo dużej próbki usuń 50 x 10⁶ komórek z całości i dodaj do nowej probówki z wystarczającą ilością dodanego HBSS, aby uzyskać całkowitą objętość 1700 μL.
   UWAGA: Potraktuj to jako dużą próbkę dla pozostałej części protokołu. Pozostałe próbki można wyrzucić lub wykorzystać do innych celów.

3. Barwienie przeciwciałami i barwnikiem żywotności

1. Wybór przeciwciał i barwnika barwiącego
   UWAGA: Tabela 1 przedstawia przeciwciała i barwnik żywotności, które są używane w tym protokole, oraz identyfikujące przez nie populacje komórek.
   1. Oznaczyć probówki zawierające komórki plwociny (etykiety znajdują się w Tabeli 2).
   2. Użyć probówek do cytometrii przepływowej o pojemności 5 ml (kompatybilnych z zastosowanym cytometrem przepływowym) do probówki z próbką z niebarwionymi komórkami i probówki z kontrolą izotypu. Użyj stożkowych probówek o pojemności 15 ml do próbek krwi i rurki nabłonkowej.
      UWAGA: Próbki te zostaną przeniesione do probówek do cytometrii przepływowej po barwieniu i utrwaleniu przeciwciał.
2. Oznacz rurki kompensacyjne (Tabela 3).
   UWAGA: Używać probówek do cytometrii przepływowej o pojemności 5 ml kompatybilnych z używanym cytometrem przepływowym.
3. Dodać ilość HBSS, przeciwciała i/lub barwnika do każdej z probówek z komórkami plwociny i probówek kompensacyjnych, jak wskazano odpowiednio w tabeli 2 i tabeli 3.
   UWAGA: Dodaj bufor (HBBS), przeciwciała i barwnik do wszystkich probówek przed dodaniem komórek lub kulek kompensacyjnych, aby upewnić się, że czas barwienia wszystkich probówek jest spójny.
4. Dodać ilości objętości komórek plwociny wymienione w tabeli 2 do probówek.
5. Dodaj koraliki kompensacyjne do rurek kompensacyjnych, jak podano w tabeli 3.
6. Inkubować wszystkie probówki (probówki do oznaczania i kompensacji) na lodzie, chronione przed światłem, przez 35 minut. Następnie napełnić probówki lodowatym HBSS i odwirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 800 x g.
7. W przypadku probówek kompensacyjnych należy zassać supernatant jak najbliżej granulek i strzepnąć granulki, aby się poluzowały.
8. Dodać 0,5 ml zimnego HBSS do probówek kompensacyjnych, przechowywać je na lodzie w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem do czasu, gdy będą potrzebne do analizy metodą cytometrii przepływowej.
9. Odessać supernatant z niebarwionego izotypu, krwi i probówek nabłonkowych po odwirowaniu (krok 3.6 z sekcji barwienia przeciwciał) i poluzować granulki, przesuwając probówki.

4. Utrwalenie za pomocą 1% paraformaldehydu (PFA)

1. Dodaj zimny 1% PFA (który powinien być już rozmrożony) do niebarwionych probówek z izotypem, krwią i nabłonkiem; 2 ml do probówek niebarwionych i izotypowych oraz 10 ml do probówek z krwią i nabłonkiem.
2. Inkubować probówki na lodzie, chronione przed światłem przez 1 godzinę. Wirować szybko z maksymalną prędkością po 30 minutach.
3. Napełnij probówki lodowatym HBSS. Następnie odwirować probówki w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 1600 x g.
4. Odessać jak najwięcej supernatantu bez naruszania osadu komórkowego i przesunąć rurkę palcami, aby poluzować komórki.
5. Dodać 200 μl zimnego HBSS do probówek niebarwionych i izotypowych.
6. Obliczyć objętość HBSS do ponownego zawieszenia krwi i rurki nabłonkowej zgodnie z całkowitą liczbą komórek.
   UWAGA: Objętość rekompozycji = 0,15 x [całkowita liczba komórek (etap 8 dysocjacji plwociny) / 10⁶]. Użyj 50 x 10⁶ jako liczby komórek dla bardzo dużej próbki.
7. Przechowywać wszystkie probówki do pobierania próbek i kompensacji, chronione przed światłem, na lodzie w temperaturze 4 °C do czasu przeprowadzenia analizy metodą cytometrii przepływowej.
   UWAGA: Ten protokół nie został przetestowany pod kątem przechowywania przez więcej niż 24 godziny.

5. Akwizycja danych na cytometrze przepływowym

1. Zastosować odpowiednie procedury uruchamiania dla używanego cytometru przepływowego.
   UWAGA: W tej części protokołu założono, że osoba obsługująca cytometr przepływowy jest przeszkolona w zakresie korzystania z dostępnego dla niej przyrządu, w szczególności w zakresie codziennych procedur, w tym sprawdzania stabilności układów optycznych i fluidycznych, technik standaryzacji rozpraszania światła i intensywności fluorescencji, a także obliczania i stosowania prawidłowej matrycy kompensacji.
2. Użyj mieszaniny ściegów National Institute of Standards and Technology (NIST), aby upewnić się, że napięcia rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego są ustawione tak, aby koraliki NIST obejmowały całą działkę bez umieszczania ściegów zbyt blisko osi.
   UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że zanieczyszczenia mniejsze niż 5 μm mogą zostać wyeliminowane przez analizę bramkowania po akwizycji. W zależności od zastosowanego cytometru przepływowego należy pamiętać, że najmniejsze kulki nie są wykluczane za pomocą progu (w przypadku korzystania z LSR II lub Lyric) lub z wysokim dyskryminatorem (przy użyciu cytometru przepływowego Navios EX). W przypadku Navios EX zastosowano wzmocnienie 2 dla rozproszenia przedniego i bocznego, napięcie 236 dla rozproszenia do przodu i 250 dla rozproszenia bocznego. W przypadku LSR II zastosowano napięcie rozproszenia przewodzenia 165 i napięcie rozproszenia bocznego 190
.
3. Ustaw natężenie przepływu na średnie (LSR II) lub wysokie (Navios EX).
   UWAGA: Średnie lub wysokie natężenie przepływu dla większości instrumentów może być wykorzystane do uzyskania probówek plwociny. Ważne jest, aby pamiętać, że użycie zbyt małego natężenia przepływu lub zbyt rozcieńczenia próbki może spowodować osiadanie komórek, co skutkuje zwiększonym wirowaniem, co nie jest pożądane. W związku z tym przestrzeganie obliczonej objętości zawiesiny w kroku 4.6 powinno skutkować uzyskaniem gęstości komórkowej, którą można szybko uzyskać, ale nie zatkać maszyny.
4. Dostosuj napięcia dla każdego parametru używanego dla parametrów rozproszenia i fluorescencji, aby umieścić populacje komórek na skali. Użyj liczb ze strategią bramkowania jako wskazówek, jak odpowiednio dostosować napięcia.
   UWAGA: Upewnij się, że wszystkie potrzebne parametry są wybrane w oknie wyboru parametrów przed akwizycją, w przeciwnym razie dane nie zostaną pobrane.
5. Najpierw uzyskaj dane dla niebarwionej próbki plwociny, następnie próbki barwionej izotypem, a następnie probówki z krwią i rurki nabłonkowej.
   UWAGA: Jeśli zawiesina komórek jest zbyt stężona, aby cytometr przepływowy mógł uruchomić próbki bez zatykania, próbki można dodatkowo rozcieńczyć HBSS.

Results

Ten protokół został opracowany z myślą o warunkach klinicznych. Podczas opracowywania protokołu skupiono się na prostocie, wydajności i odtwarzalności. Stwierdzono, że najbardziej czasochłonnym etapem przetwarzania plwociny było liczenie komórek. Dlatego protokół jest skonfigurowany w taki sposób, że przetwarzanie plwociny i znakowanie komórek może odbywać się niezależnie od zliczania komórek bez straty czasu. Dokładna liczba komórek, która jest nadal niezbędna do odpowiedniego rozcieńczenia próbki w celu uzyskania nieza...

Discussion

Zawartość komórkowa plwociny obejmuje dużą różnorodność komórek o szerokim zasięgu, którym często towarzyszy dużo zanieczyszczeń³⁷. Ponadto analiza plwociny wymaga kontroli jakości, która potwierdza, że próbka została pobrana z płuc, a nie z jamy ustnej³⁸. Dlatego analiza plwociny za pomocą cytometrii przepływowej nie jest tak prosta, jak na przykład w przypadku krwi, która uwalnia znacznie czystszą i jednorodną zawiesinę komórek. Protokół ten rozwiązał wszystkie te problem...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Paraformaldehyd Flow-Fix	Polysciences	25037
100 &mikro; Nylonowe sitka do komórek M, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 ml stożkowa rurka sokoła	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anty-ludzka CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anty-ludzka CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anty-ludzka cytokeratyna	BioLegend	628608
Alexa488 Izotyp PanCK, CD3 i CD19	BioLegend	400129
BV510 anty-ludzki CD45	BioLegend	304036
Izotyp CD66b FITC	BD Biosciences	555748
Koraliki kompensacyjne CompBead Plus	BD Biosciences	560497
Corning Polistyrenowa sterylna butelka jednorazowego użytku 250 ml	Fisher Scientific	09-761-4
Jednorazowa sterylna butelka z polistyrenu Corning 500 ml	Fisher Scientific	09-761-10
CS& Koraliki T	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anty-ludzki CD66b	GeneTex	GTX75907
Naprawialna plama żywotności	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
Zestaw przepływowy	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
Koraliki NIST, 05 μ M	Polysciences	64080
Koraliki NIST, 20 i mu; M	Polysciences	64160
Koraliki NIST, 30 μ M	Polysciences	64170
PE anty-ludzki CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anty-ludzki EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Izotyp	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anty-ludzki CD206	BD Biosciences	564063
Cytrynian sodu	dwuwodny EMD	SX0445-1
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%	Fisher Scientific	15250061