Analiza plwociny pod kontrolą jakości za pomocą cytometrii przepływowej

Postęp techniczny w sprzęcie i oprogramowaniu cytometrów przepływowych umożliwił jednoczesną identyfikację wielu różnych populacji komórek^1,2,3,4. Na przykład wykorzystanie cytometru przepływowego w badaniach nad komórkami krwiotwórczymi doprowadziło do znacznie lepszego zrozumienia układu odpornościowego² i hierarchii komórkowej układu krwiotwórczego⁵, a także diagnostycznego rozróżnienia wielu różnych nowotworów krwi^6,7,8. Chociaż większość komórek plwociny jest pochodzenia krwiotwórczego^9,10,11, cytometria przepływowa nie jest szeroko stosowana do analizy plwociny do celów diagnostycznych. Jednak kilka badań sugeruje, że ocena populacji komórek odpornościowych w plwocinie (najbardziej znaczący podzbiór komórek) może być bardzo pomocna w diagnozowaniu i/lub monitorowaniu chorób, takich jak astma i przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP)^12,13,14,15. Co więcej, istnienie markerów specyficznych dla nabłonka, które można wykorzystać w cytometrii przepływowej, pozwala na zbadanie następującego najbardziej znaczącego podzbioru komórek w plwocinie, komórek nabłonka płuc.

Oprócz możliwości analizy wielu różnych populacji komórek o różnym pochodzeniu tkankowym, cytometr przepływowy może ocenić dużą liczbę komórek w stosunkowo krótkim czasie. Dla porównania, analizy cytologiczne oparte na szkiełkach często wymagają wysoce wyspecjalizowanego personelu i/lub sprzętu. Analizy te mogą być pracochłonne, co prowadzi do tego, że analizowana jest tylko część próbki plwociny¹⁶.

Trzy krytyczne kwestie ograniczają powszechne stosowanie plwociny w cytometrii przepływowej. Pierwsza kwestia dotyczy pobierania plwociny. Plwocina jest zbierana przez kaszel, który wydala śluz z płuc do jamy ustnej, a następnie pluje do kubka zbiorczego. Ponieważ śluz przemieszcza się przez jamę ustną, istnieje duże prawdopodobieństwo zanieczyszczenia SEC. Zanieczyszczenie to komplikuje analizę próbki, ale problem można łatwo rozwiązać na platformie cytometrii przepływowej, jak pokazano w tym badaniu.

Nie każdy może wytwarzać plwocinę spontanicznie; dlatego opracowano kilka urządzeń, które pomagają w zbieraniu plwociny w sposób nieinwazyjny¹⁷. Jednym z takich urządzeń jest nebulizator, który okazał się wytwarzać wiarygodne próbki plwociny^18,19,20. Chociaż nebulizator jest bardzo skutecznym sposobem nieinwazyjnego pobierania plwociny, jego użycie nadal wymaga ustawienia w placówce medycznej z wyspecjalizowanym personelem²¹. Natomiast urządzenia przenośne, takie jak flet płucny^22,23,24 i acapella^16,25 mogą być używane w domu, ponieważ są bardzo przyjazne dla użytkownika. Te urządzenia wspomagające są zarówno bezpieczne, jak i ekonomiczne.

Dla nas, acapella dawała konsekwentnie lepsze wyniki niż flet płucny¹⁶, dlatego urządzenie acapella zostało wybrane do pobierania plwociny. Zdecydowano się na 3-dniowe pobranie próbki, ponieważ głównym celem użycia plwociny jest opracowanie testu wykrywającego raka płuc¹⁶. Wykazano, że próbka 3-dniowa zwiększa prawdopodobieństwo wykrycia raka płuc w porównaniu z próbką 1- lub 2-dniową^26,27,28. Jednak inne metody pobierania plwociny mogą być preferowane do różnych celów. Jeśli stosowana jest inna metoda pobierania plwociny niż opisana tutaj, zaleca się staranne miareczkowanie każdego przeciwciała lub barwnika używanego do analizy cytometrii przepływowej; Dostępnych jest bardzo niewiele danych na temat wpływu różnych metod pobierania plwociny na białka docelowe w cytometrii przepływowej.

Drugą kwestią tłumiącą entuzjazm do używania plwociny do diagnostyki, głównie związaną z cytometrią przepływową, jest liczba komórek. Problemem jest zebranie wystarczającej liczby żywotnych komórek do wiarygodnej analizy. Dwa badania wykazały, że próbki plwociny pobrane metodami nieinwazyjnymi, za pomocą urządzenia wspomagającego, zawierają wystarczającą ilość żywotnych komórek, które można wykorzystać w diagnostyce klinicznej lub badaniach naukowych^16,24. Jednak żadne z tych badań nie dotyczyło kwestii liczby komórek w odniesieniu do cytometrii przepływowej.

Dla badań, które stanowią podstawę tego protokołu, próbki plwociny zostały pobrane od uczestników o wysokim ryzyku zachorowania na raka płuc zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi instytucjonalnymi dla każdego ośrodka badawczego. Uczestnicy wysokiego ryzyka zostali zdefiniowani jako osoby w wieku od 55 do 75 lat, palące 30 paczkolat i nie rzucające palenia w ciągu ostatnich 15 lat. Pacjentom pokazano, jak korzystać z urządzenia acapella zgodnie z instrukcjami producenta²⁹ i pobierali plwocinę przez trzy kolejne dni w domu. Próbkę przechowywano w lodówce do ostatniego pobrania. W ostatnim dniu pobierania próbki zostały wysłane do laboratorium w nocy z zamrożonym zimnym opakowaniem. Próbki poddano obróbce w postaci zawiesiny jednokomórkowej w dniu ich otrzymania. Dzięki tej metodzie pobierania plwociny uzyskuje się więcej niż wystarczającą ilość żywotnych komórek do wiarygodnej analizy cytometrii przepływowej.

Na koniec, w związku z poprzednim problemem z numerem komórki, pojawia się pytanie, jak uwolnić komórki plwociny z jej śluzowego środowiska. W jaki sposób można utrzymać komórki przy życiu i stworzyć zawiesinę pojedynczej komórki, która nie zatyka cytometru przepływowego? Opierając się na wstępnych pracach Pizzichini et al.³⁰ i Miller et al.³¹, protokół ten opisuje łatwą i niezawodną metodę przetwarzania plwociny na zawiesinę pojedynczej komórki, która jest odpowiednia do analizy cytometrycznej przepływowej. W tej metodzie wykorzystano ugruntowane wytyczne w zakresie cytometrii przepływowej^32,33,34 w celu opracowania skutecznej strategii znakowania przeciwciał w celu identyfikacji komórek krwiotwórczych i nabłonkowych w plwocinie oraz zapewnienia ustawień instrumentu, środków kontroli jakości i wytycznych dotyczących analizy standaryzujących analizę plwociny na platformie cytometrii przepływowej.

Wszystkie etapy przetwarzania plwociny są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej.

1. Przygotowanie odczynnika przed rozpoczęciem dysocjacji plwociny

1. Rozmrozić 1% paraformaldehydu (PFA), 25 ml na próbkę na lodzie i przechowywać w chłodzie do momentu użycia.
   UWAGA: PFA jest toksyczny przez drogi oddechowe i kontakt ze skórą. Przygotować utrwalacz zgodnie z instrukcjami producenta i zamrozić w temperaturze -20 °C w 25 ml porcji do czasu użycia.
2. Przybliżyć masę próbki i rozmrozić 0,1% ditiotreitolu (DTT) w kroku 2.2 i doprowadzić do temperatury 37 °C. (Podwielokrotności DTT należy przechowywać w temperaturze -20 °C przed użyciem).
3. Doprowadź wystarczającą ilość 0,5% N-acetylo-L-cysteiny (NAC) do 37 °C dla kroku 2.2. (NAC powinien być świeży co tydzień i przechowywany w temperaturze 4 °C przed użyciem.)

2. Dysocjacja plwociny

1. Zważyć próbkę plwociny, aby określić objętości odczynników dysocjacyjnych.
   UWAGA: Próbkę uważa się za małą, jeśli masa początkowa wynosi ≤3 g, średnią, jeśli >3 g, ale ≤8 g, dużą, jeśli >8, ale ≤16 g, i bardzo dużą, jeśli próbka waży >16 g. Oznaczenia mały, średni, duży i bardzo duży będą używane w całym protokole. Ilość odczynników wymaganych do dysocjacji i znakowania różni się w zależności od wielkości próbki plwociny.
2. Przenieś małą próbkę do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, pożywkę do czystej plastikowej jednorazowej butelki o pojemności 250 ml lub dużą i bardzo dużą próbkę do czystej plastikowej butelki jednorazowego o pojemności 500 ml. Dodać 1 ml/g masy próbki 0,5% NAC i 4 mL/g masy próbki 0,1% DTT.
3. Wiruj z maksymalną prędkością (przez 15 s), a następnie bujaj się w temperaturze pokojowej (z maksymalną prędkością) przez 15 minut.
4. Rozcieńczyć próbkę czterema objętościami zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) (w oparciu o całkowitą objętość próbki + odczynników) w celu zneutralizowania NAC i DTT; szybko wirować z maksymalną prędkością i kołysać w temperaturze pokojowej przez 5 minut z maksymalną prędkością.
5. Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko (sitka) do komórek o grubości 100 μm z siatki nylonowej do jednej lub więcej stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.
6. Odwirować komórki przy 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant, połączyć wszystkie granulki w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 ml, a następnie przemyć granulki HBSS w tych samych warunkach.
7. Zawiesić osad komórkowy w objętości buforu określonej przez początkową masę próbki plwociny.
   UWAGA: Małą próbkę zawiesza się ponownie w 250 μl HBSS. Pożywkę sample zawiesza się ponownie w 760 μl HBSS. Duże i bardzo duże próbki zawiesza się ponownie w 1460 μl HBSS.
8. Pobrać podwielokrotność zawiesiny komórek do zliczania żywych/martwych komórek za pomocą błękitu trypanowego.
   UWAGA: W przypadku małej próbki użyj 5 μl. W przypadku średniej, dużej lub bardzo dużej próbki należy użyć 10 μl. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 HBSS.
   1. Zmieszać 10 μl rozcieńczonej plwociny z 30 μl 0,4% błękitu trypanowego, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie próbki 1:40. Załaduj do komór zliczających hemocytometru w celu zliczenia komórek.
      UWAGA: Może być konieczne dostosowanie końcowego rozcieńczenia, jeśli liczba komórek jest zbyt niska lub zbyt wysoka, aby uzyskać dokładne zliczenie. Zdecydowanie zaleca się skonsultowanie się z Guiot et al.²⁰ w celu poprawnego odróżnienia komórek plwociny od SEC i zanieczyszczeń. Jest to niezbędne do dokładnego zliczania komórek.
9. Z bardzo dużej próbki usuń 50 x 10⁶ komórek z całości i dodaj do nowej probówki z wystarczającą ilością dodanego HBSS, aby uzyskać całkowitą objętość 1700 μL.
   UWAGA: Potraktuj to jako dużą próbkę dla pozostałej części protokołu. Pozostałe próbki można wyrzucić lub wykorzystać do innych celów.

3. Barwienie przeciwciałami i barwnikiem żywotności

1. Wybór przeciwciał i barwnika barwiącego
   UWAGA: Tabela 1 przedstawia przeciwciała i barwnik żywotności, które są używane w tym protokole, oraz identyfikujące przez nie populacje komórek.
   1. Oznaczyć probówki zawierające komórki plwociny (etykiety znajdują się w Tabeli 2).
   2. Użyć probówek do cytometrii przepływowej o pojemności 5 ml (kompatybilnych z zastosowanym cytometrem przepływowym) do probówki z próbką z niebarwionymi komórkami i probówki z kontrolą izotypu. Użyj stożkowych probówek o pojemności 15 ml do próbek krwi i rurki nabłonkowej.
      UWAGA: Próbki te zostaną przeniesione do probówek do cytometrii przepływowej po barwieniu i utrwaleniu przeciwciał.
2. Oznacz rurki kompensacyjne (Tabela 3).
   UWAGA: Używać probówek do cytometrii przepływowej o pojemności 5 ml kompatybilnych z używanym cytometrem przepływowym.
3. Dodać ilość HBSS, przeciwciała i/lub barwnika do każdej z probówek z komórkami plwociny i probówek kompensacyjnych, jak wskazano odpowiednio w tabeli 2 i tabeli 3.
   UWAGA: Dodaj bufor (HBBS), przeciwciała i barwnik do wszystkich probówek przed dodaniem komórek lub kulek kompensacyjnych, aby upewnić się, że czas barwienia wszystkich probówek jest spójny.
4. Dodać ilości objętości komórek plwociny wymienione w tabeli 2 do probówek.
5. Dodaj koraliki kompensacyjne do rurek kompensacyjnych, jak podano w tabeli 3.
6. Inkubować wszystkie probówki (probówki do oznaczania i kompensacji) na lodzie, chronione przed światłem, przez 35 minut. Następnie napełnić probówki lodowatym HBSS i odwirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 800 x g.
7. W przypadku probówek kompensacyjnych należy zassać supernatant jak najbliżej granulek i strzepnąć granulki, aby się poluzowały.
8. Dodać 0,5 ml zimnego HBSS do probówek kompensacyjnych, przechowywać je na lodzie w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem do czasu, gdy będą potrzebne do analizy metodą cytometrii przepływowej.
9. Odessać supernatant z niebarwionego izotypu, krwi i probówek nabłonkowych po odwirowaniu (krok 3.6 z sekcji barwienia przeciwciał) i poluzować granulki, przesuwając probówki.

4. Utrwalenie za pomocą 1% paraformaldehydu (PFA)

1. Dodaj zimny 1% PFA (który powinien być już rozmrożony) do niebarwionych probówek z izotypem, krwią i nabłonkiem; 2 ml do probówek niebarwionych i izotypowych oraz 10 ml do probówek z krwią i nabłonkiem.
2. Inkubować probówki na lodzie, chronione przed światłem przez 1 godzinę. Wirować szybko z maksymalną prędkością po 30 minutach.
3. Napełnij probówki lodowatym HBSS. Następnie odwirować probówki w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 1600 x g.
4. Odessać jak najwięcej supernatantu bez naruszania osadu komórkowego i przesunąć rurkę palcami, aby poluzować komórki.
5. Dodać 200 μl zimnego HBSS do probówek niebarwionych i izotypowych.
6. Obliczyć objętość HBSS do ponownego zawieszenia krwi i rurki nabłonkowej zgodnie z całkowitą liczbą komórek.
   UWAGA: Objętość rekompozycji = 0,15 x [całkowita liczba komórek (etap 8 dysocjacji plwociny) / 10⁶]. Użyj 50 x 10⁶ jako liczby komórek dla bardzo dużej próbki.
7. Przechowywać wszystkie probówki do pobierania próbek i kompensacji, chronione przed światłem, na lodzie w temperaturze 4 °C do czasu przeprowadzenia analizy metodą cytometrii przepływowej.
   UWAGA: Ten protokół nie został przetestowany pod kątem przechowywania przez więcej niż 24 godziny.

5. Akwizycja danych na cytometrze przepływowym

1. Zastosować odpowiednie procedury uruchamiania dla używanego cytometru przepływowego.
   UWAGA: W tej części protokołu założono, że osoba obsługująca cytometr przepływowy jest przeszkolona w zakresie korzystania z dostępnego dla niej przyrządu, w szczególności w zakresie codziennych procedur, w tym sprawdzania stabilności układów optycznych i fluidycznych, technik standaryzacji rozpraszania światła i intensywności fluorescencji, a także obliczania i stosowania prawidłowej matrycy kompensacji.
2. Użyj mieszaniny ściegów National Institute of Standards and Technology (NIST), aby upewnić się, że napięcia rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego są ustawione tak, aby koraliki NIST obejmowały całą działkę bez umieszczania ściegów zbyt blisko osi.
   UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że zanieczyszczenia mniejsze niż 5 μm mogą zostać wyeliminowane przez analizę bramkowania po akwizycji. W zależności od zastosowanego cytometru przepływowego należy pamiętać, że najmniejsze kulki nie są wykluczane za pomocą progu (w przypadku korzystania z LSR II lub Lyric) lub z wysokim dyskryminatorem (przy użyciu cytometru przepływowego Navios EX). W przypadku Navios EX zastosowano wzmocnienie 2 dla rozproszenia przedniego i bocznego, napięcie 236 dla rozproszenia do przodu i 250 dla rozproszenia bocznego. W przypadku LSR II zastosowano napięcie rozproszenia przewodzenia 165 i napięcie rozproszenia bocznego 190
.
3. Ustaw natężenie przepływu na średnie (LSR II) lub wysokie (Navios EX).
   UWAGA: Średnie lub wysokie natężenie przepływu dla większości instrumentów może być wykorzystane do uzyskania probówek plwociny. Ważne jest, aby pamiętać, że użycie zbyt małego natężenia przepływu lub zbyt rozcieńczenia próbki może spowodować osiadanie komórek, co skutkuje zwiększonym wirowaniem, co nie jest pożądane. W związku z tym przestrzeganie obliczonej objętości zawiesiny w kroku 4.6 powinno skutkować uzyskaniem gęstości komórkowej, którą można szybko uzyskać, ale nie zatkać maszyny.
4. Dostosuj napięcia dla każdego parametru używanego dla parametrów rozproszenia i fluorescencji, aby umieścić populacje komórek na skali. Użyj liczb ze strategią bramkowania jako wskazówek, jak odpowiednio dostosować napięcia.
   UWAGA: Upewnij się, że wszystkie potrzebne parametry są wybrane w oknie wyboru parametrów przed akwizycją, w przeciwnym razie dane nie zostaną pobrane.
5. Najpierw uzyskaj dane dla niebarwionej próbki plwociny, następnie próbki barwionej izotypem, a następnie probówki z krwią i rurki nabłonkowej.
   UWAGA: Jeśli zawiesina komórek jest zbyt stężona, aby cytometr przepływowy mógł uruchomić próbki bez zatykania, próbki można dodatkowo rozcieńczyć HBSS.

Ten protokół został opracowany z myślą o warunkach klinicznych. Podczas opracowywania protokołu skupiono się na prostocie, wydajności i odtwarzalności. Stwierdzono, że najbardziej czasochłonnym etapem przetwarzania plwociny było liczenie komórek. Dlatego protokół jest skonfigurowany w taki sposób, że przetwarzanie plwociny i znakowanie komórek może odbywać się niezależnie od zliczania komórek bez straty czasu. Dokładna liczba komórek, która jest nadal niezbędna do odpowiedniego rozcieńczenia próbki w celu uzyskania niezakłóconego przebiegu, można następnie uzyskać w okresie inkubacji znakowania przeciwciałami.

Ten protokół używa miary wagi plwociny zamiast liczby komórek jako wskaźnika, ile przeciwciała/barwnika należy użyć do optymalnego znakowania komórek. Istnieje jednak duże zróżnicowanie masy próbek plwociny; Spośród 126 analizowanych próbek waga wahała się od 0,57 g do 38,30 g. Rysunek 1A pokazuje, że korelacja między masą plwociny a wydajnością komórek nie jest silna. W związku z tym próby podzielono na cztery kategorie; mediana masy próbek wynosiła 2,1 g dla małych próbek, 5,0 g dla średnich próbek, 11,2 g dla dużych próbek i 22,0 g dla bardzo dużych próbek (Rysunek 1B). Jednak nadal istniały próbki, które dały znacznie więcej komórek niż oczekiwano na podstawie ich masy (Rysunek 1C), większość próbek ładnie się grupowała. Dla małych próbek mediana wydajności komórek wynosiła 8,0 x 106 komórek, dla średnich próbek 13,0 x 106, dla dużych próbek 35,4 x 106, a bardzo dużych próbek 93,0 x 106.

Każde przeciwciało użyte w tym protokole zostało dodane miareczkowaniu. Jako stężenie robocze wybrano stężenie w fazie plateau (Rysunek 2A) o najwyższym wskaźniku barwienia (Rysunek 2B) krzywej miareczkowania. Różnice w liczbie komórek nie zmienią dramatycznie intensywności barwienia. To miareczkowanie i testowanie przeciwciał jest niezbędne i powinno być skonfigurowane z ostrożnością dla każdego nowego przeciwciała lub barwnika używanego w tym protokole34,35. Gdy przeciwciało jest miareczkowane z ostrożnością, powinno wybarwić od 10 do 50 razy więcej komórek niż liczba komórek, na których przeciwciało zostało miareczkowane34,35. Przykład tej zasady znajduje się w tabeli 4. Przeciwciało anty-ludzkie CD45-PE miareczkowano na 1 x 106 komórkach w całkowitej objętości 400 μl. Jeżeli to przeciwciało do objętości barwienia zostanie ekstrapolowane do protokołu (patrz tabela 2, która pokazuje ilość CD45-PE i objętości barwienia dla każdej wielkości próbki), dla małej próbki 0,625 x 106 komórek zostanie wybarwionych, 1,25 x 106 komórek zostanie wybarwionych dla średniej próbki i 2,5 x 106 komórek dla dużej próbki (kolumna A w tabeli 4). Oblicza się, że 50-krotny nadmiar liczby komórek dla każdej kategorii wynosi odpowiednio 31,25 x 106, 62,5 x 106 i 125 x 106 komórek (kolumna B). Jak pokazano w kolumnach C i D, mediana liczby komórek w każdej kategorii wielkości i największa próbka w każdej kategorii mieszczą się w zakresie 50-krotnym.

Pomimo widocznych różnic w wielkości i wydajności komórek między różnymi rozmiarami próbek plwociny, mediana procentowego zanieczyszczenia SEC w każdej kategorii jest bardzo podobna. Rysunek 3A pokazuje procent SEC znalezionych w poszczególnych próbkach, podzielonych według kategorii wagowej plwociny. Główny problem dotyczył SEC, ponieważ komórki te nie są reprezentatywne dla tkanki płucnej, ale dla jamy ustnej. Jednak średnie zanieczyszczenie SEC wynosi mniej niż 20% dla wszystkich kategorii. Rysunek 3B pokazuje procent żywotnych komórek znalezionych w tych próbkach. Wyłączając SEC, średnia rentowność wynosiła około 72% dla małych, średnich i dużych kategorii wielkości próby. Był on nieco wyższy (79%) w przypadku kategorii bardzo dużej.

Rysunek 4 pokazuje typową strategię bramkowania polegającą na oddzieleniu interesujących komórek plwociny od zanieczyszczeń, martwych komórek (które obejmują również zanieczyszczające SEC36) i grudek komórek. Rysunek 4A pokazuje użycie koralików NIST do ustawiania bramek w celu wyeliminowania zanieczyszczeń mniejszych niż 5 μm lub większych niż 30 μm, podczas gdy Rysunek 4B stosuje tę bramkę na komórkach plwociny. Rysunek 4C pokazuje typowy profil plwociny, gdy patrzy się na niego jako szerokość rozproszenia bocznego (SSC-W) w stosunku do szerokości rozproszenia do przodu (FSC-W), bramki szerokości. Profil ten służy do eliminowania drobnych zanieczyszczeń, które pojawiają się wzdłuż osi SSC-W i FSC-W. Eliminacja martwych komórek jest pokazana na Rysunki 4D i Rysunek 4E. Niebarwiona kontrola (Rysunek 4D) służy do określenia wartości odcięcia dla dodatniej FVS510; komórki, które zabarwiły się dodatnio na FVS510 powyżej kontroli ujemnej, są uważane za martwe i nie będą używane w analizie komórek plwociny (Rysunek 4E). Na koniec stosuje się bramkę singletową w celu usunięcia dubletów komórek z analizy, co pokazano w Rysunek 4F. Tak więc komórki, które przeszły przez bramki selekcyjne pokazane na Rysunki 4B, Figura 4C, Figura 4E i Figura 4F reprezentują żywe, pojedyncze komórki plwociny gotowe do późniejszej analizy z przeciwciałami stosowanymi w tym protokole.

Użycie przeciwciała anty-CD45 w tym protokole znakowania pozwala na rozdzielenie żywych, pojedynczych komórek plwociny na przedział komórek krwi (CD45+) i przedział komórek niekrwistych (CD45-). Ta ostatnia kategoria obejmuje komórki nabłonkowe i inne komórki niebędące komórkami krwi. Górny profil w Rysunek 5A pokazuje użycie niebarwionej próbki plwociny do ustawienia granicy dla dodatniej wartości CD45, renderując bramki do przechwytywania komórek CD45+ i komórek CD45-. Dolny profil Rysunek 5A pokazuje obie te bramki zastosowane do próbki plwociny wybarwionej przeciwciałem anty-CD45. Barwienie dodatkowymi przeciwciałami jest następnie wykorzystywane do identyfikacji populacji specyficznych dla komórek krwi w bramce CD45 + (Figura 5B) i innych populacjach niezwiązanych z komórkami krwi, w tym populacji nabłonka w bramce CD45 (Figura 5C). Na obu rysunkach górne profile pokazują, w jaki sposób plwocina barwiona izotypem jest używana do ustawiania podwójnie ujemnych populacji, podczas gdy dolne profile pokazują komórki plwociny barwione przeciwciałami. Rysunek 5B (na dole) pokazuje sześć różnych populacji komórek CD45+ utworzonych za pomocą koktajlu przeciwciał wykrywalnych w kanale fluorescencji (FL) 1 (przeciwciała anty-CD66b, CD3, CD19) i anty-CD206 wykrywalnych w kanale FL3. Eksperymenty z sortowaniem ujawniły, że makrofagi specyficzne dla płuc znajdują się w bramach zidentyfikowanych jako M. Obecność komórek w tych bramach wskazuje zatem, że próbka plwociny pochodziła z płuc i nie była śliną (Bederka i wsp., rękopis w przygotowaniu). Rysunek 5C (na dole) pokazuje kwadranty bramkowania utworzone za pomocą przeciwciał anty-pan-cytokeratyny (panCK) wykrywalnej w kanale FL1 i przeciwciał anty-nabłonkowej cząsteczki adhezyjnej komórek (EpCAM) wykrywalnej w kanale FL3 wśród komórek plwociny CD45.

Ten protokół etykietowania został gruntownie przetestowany na Navios EX i LSR II. Na Lyricu przeprowadzono kilka wstępnych eksperymentów, ale bez obszernej optymalizacji instrumentów, która została przeprowadzona dla pozostałych dwóch maszyn. W związku z tym szczegółowe ustawienia instrumentów są podane dla Navios EX i LSR II w karcie Materiały, ale nie dla Lyrica. Aby zrozumieć podobieństwa i różnice między tymi trzema platformami cytometrii przepływowej, które można wykorzystać do analizy komórek plwociny, profile uzyskane z różnych maszyn można porównać w Rysunek 6 i Rysunek 7. Dwie duże próbki plwociny zostały przetworzone, połączone, oznakowane, rozdzielone na trzy równe porcje, a następnie pobrane na każdym cytometrze przepływowym wspomnianym powyżej. Rysunek 6, który jest podobny do Rysunek 4, porównuje strategię bramkowania w celu eliminacji zanieczyszczeń, martwych komórek i skupisk komórek. Rysunek 7, który jest identyczny z Rysunek 5, porównuje profile krwi i nie krwi na podstawie danych uzyskanych na różnych cytometrach przepływowych.

Porównanie różnych profili uzyskanych z trzech różnych cytometrów przepływowych pokazuje, że te same podstawowe profile można zaobserwować w każdym instrumencie. Różnice, na które należy zwrócić uwagę, to wykresy SSC-W/FSC-W (width gate) (Rysunek 6, drugi wiersz) oraz skale liniowe wykresów punktowych (Rysunki 6 i 7). Wykres szerokości punktowej wygenerowany na Navios EX pokazuje bramkę inkluzji (czerwona ramka), co oznacza, że wszystkie komórki zawarte w bramce są dalej analizowane; Zdarzenia wzdłuż osi w lewym dolnym rogu są wykluczone. Wykresy szerokości rozproszenia na LSR II i Lyric nie pokazują podobnego osadu zdarzeń wzdłuż tych samych osi. Ta rozbieżność jest prawdopodobnie spowodowana bardzo czułym progiem zastosowanym w Navios EX, co prowadzi do powstania kilku małych zanieczyszczeń w poprzedniej bramce wykluczającej rozmiar (górny rząd Rysunek 6). Czasami odłamki są widoczne wzdłuż osi w profilu szerokości rozrzutu generowanym na LSRII, ale znajdują się one w prawym dolnym rogu. W takich przypadkach bramka wykluczenia (oznaczona czerwoną ramką przerywaną w środkowym profilu w wierszu 2 Rysunek 6) jest używana w celu wyeliminowania tych zdarzeń z dalszej analizy.

Podczas gdy skale logarytmiczne wyglądają nieco inaczej na wykresach między cytometrami Navios EX a cytometrami Lyric i LSR II, Navios EX ma możliwość pozyskiwania danych przy użyciu większej liczby dekad. Realizacja kolejnych dekad zależy od kontekstu eksperymentu i pożądanej czułości do wizualizacji interesujących populacji.

Dodatkową zauważalną różnicą między cytometrami Navios EX i LSR II oraz Lyric jest wygląd profilu bramki singletowej. Cytometr Navios EX wyposażony jest w prostokątną celę przepływową o innym kącie zbierania niż LSR II. Navios EX zawiera trzy sterowane programowo kąty zbierania, które optymalizują kąt rozpraszania światła pod kątem do przodu, aby uzyskać czułość odpowiednią do wielkości cząstek do analizy. Bramka wielokątna dla cytometru Navios EX będzie musiała zostać dostosowana do nieco niższego kąta niż bramka singletowa dla LSRII. Bramka singletowa dla Lyrica może być zoptymalizowana, aby uzyskać profil podobny do tego, który można zobaczyć w LSR II. Korzystając z próbki plwociny, współczynnik skalowania obszaru musiałby zostać zoptymalizowany dla każdego lasera na Lyric, aby uzyskać bramkę singletową podobną do LSR II.

Wszystkie profile pokazane w Rysunek 4 do Rysunek 7 został przeanalizowany za pomocą oprogramowania FlowJo, wersja 10.6. Pliki .fcs można znaleźć w FlowRepository (https://flowrepository.org) pod identyfikatorami FR-FCM-Z3LX, FR-FCM-Z3MJ i FR-FCM-Z3MM i można ich używać do ćwiczenia analizy plwociny, jak pokazano na tych rysunkach.

Rysunek 1: Waga plwociny i wydajność komórek. (A) Przedstawiona jest zależność między masą plwociny, oznaczoną przed przetwarzaniem, a całkowitą wydajnością komórek, oznaczoną po przetworzeniu za pomocą hemocytometru. Każdy pocisk reprezentuje pojedynczą próbkę, w sumie 126 sztuk. (B) Próbki plwociny podzielono na cztery kategorie w zależności od ich masy: małe dla próbek o masie do 3 g, średnie dla próbek o masie powyżej 3 g do 8 g, duże dla próbek o masie powyżej 8 g do 16 g i bardzo duże próbki dla próbek o masie powyżej 16 g. (C) Pokazano rozkład wydajności komórek dla próbek każdej kategorii. Czerwone słupki w punktach (B) i (C) reprezentują medianę wartości w każdej kategorii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Miareczkowanie przeciwciał przeciwko ludzkiemu CD45-PE. (A) Krzywa miareczkowania CD45-PE (IgG1) ze średnią intensywnością fluorescencji (MFI) populacji dodatniej wykreśloną w funkcji stężenia przeciwciała CD45-PE na poziomie 1 μg/ml. (B) Krzywa miareczkowania przedstawiająca wskaźnik barwienia w funkcji stężenia przeciwciał pokazuje, że najwyższy wskaźnik barwienia wynosi 1 μg/ml. Wskaźnik barwienia obliczono jako: [populacja dodatnia CD45 MFI - populacja ujemna CD45 MFI] / [2 * odchylenie standardowe]. Na podstawie Rysunek 2A i Rysunek 2B, jako optymalne stężenie przeciwciała CD45-PE wybrano 1 μg/ml. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Proporcja SEC i martwych komórek w próbkach plwociny jest spójna między czterema kategoriami wagowymi. (A) Proporcja SEC w próbkach plwociny jest klasyfikowana według ich kategorii wagowej. Procentowe zanieczyszczenie SEC określono za pomocą hemocytometru jako część całkowitej liczby komórek. (B) Żywotność komórek próbek plwociny z wyłączeniem SECS, oznaczona za pomocą hemocytometru i metody wykluczania błękitu trypanowego. Dla każdego wykresu czerwone linie reprezentują medianę wartości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Strategia bramkowania do wykluczania zanieczyszczeń, martwych komórek i dubletów w próbce plwociny. (A) Koraliki NIST o rozmiarach 5 μm, 20 μm i 30 μm zostały użyte do ustawienia bramki wskazanej przez czerwoną ramkę, aby wykluczyć zanieczyszczenia mniejsze niż 5 μm i większe powyżej 30 μm i blisko osi. (B) Próbka plwociny została pobrana przy użyciu tych samych napięć dla rozproszenia do przodu i bocznego, co w przypadku kulek NIST. Brama utworzona w (A) została zastosowana w celu wykluczenia gruzu. (C) Małe szczątki w pobliżu osi zostały wykluczone z tego wykresu szerokości rozproszenia. (D) Niebarwioną próbkę plwociny użyto do wyznaczenia punktu odcięcia (czerwonej linii) dla ujemnej, niebarwionej populacji dla barwnika żywotności. (E) Odcięcie utworzone w D zastosowano do barwionej próbki plwociny w celu utworzenia bramki (czerwonej skrzynki) zawierającej żywe, żywotne komórki. (F) Bramka singletowa oznaczona czerwonym wielokątem wyklucza komórki, które nie spadają na przekątną, eliminując dublety i/lub grudki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Strategia bramkowania komórek plwociny do przedziałów krwi i niekrwinek. (A) Niebarwione komórki plwociny pochodzące z bramki singletowej są używane do wyznaczenia punktu odcięcia (czerwonej linii) w populacji ujemnej dla CD45 (u góry). Odcięcie od górnego profilu stosuje się do barwionej próbki plwociny (na dole) w celu rozróżnienia populacji CD45 dodatnich (CD45+) i ujemnych (CD45-). (B) Komórki plwociny CD45 + barwione przeciwciałami izotypowymi dla FITC / AF488 są używane do ustawiania bramek w populacji ujemnej (u góry). Te same bramki są stosowane do komórek plwociny CD45 + barwionych markerami komórek krwi CD3, CD19, CD66b i CD206 (na dole). (C) Bramki kwadrantowe umieszcza się na komórkach plwociny CD45 wybarwionych kontrolami izotypu (u góry) i nakłada na komórki CD45 z próbki plwociny wybarwionej markerami nabłonkowymi pan-cytokeratyną (panCK) i EpCAM (na dole). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Strategia bramkowania w celu wykluczenia zanieczyszczeń, grudek i martwych komórek barwionych komórek plwociny na trzech platformach cytometrii przepływowej. Dwie duże próbki plwociny zostały przetworzone, połączone, znakowane i podzielone na trzy równe porcje w celu pobrania za pomocą cytometrów przepływowych Navios EX (A), LSR II (B) i Lyric (C). Górny rząd: Próbki plwociny zostały bramkowane (czerwona ramka), aby wykluczyć bardzo małe i duże zanieczyszczenia. Drugi rząd: Duże czerwone pole na wykresie Navios EX reprezentuje bramkę włączenia, która obejmuje komórki, ale nie obejmuje zanieczyszczeń. Mała czerwona ramka przerywana widoczna na wykresie LSR II reprezentuje bramkę wykluczającą do eliminacji szczątków z dalszej analizy. Konieczna jest dalsza optymalizacja za pomocą Lyrica, aby określić, gdzie potrzebne jest bramkowanie wykluczające zanieczyszczenia. W związku z tym na tej działce nie ma żadnej bramy. Trzeci rząd: czerwone prostokątne bramki zawierają żywe komórki do dalszej analizy. Dolny rząd: bramka wielokątna ma pojedyncze komórki, wykluczając dublety, które wypadają poza przekątną bramki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Strategia bramkowania dla plwociny wybarwionej na obecność krwi i markerów nabłonkowych na trzech platformach cytometrii przepływowej. Analiza pokazana w Rysunek 6 jest kontynuowany w Rysunek 7; wszystkie żywotne, pojedyncze komórki (dolny rząd, Rysunek 6) podzielono na populacje CD45 + i CD45 (pierwszy rząd, Rycina 7), tak aby markery specyficzne dla komórek krwi i markery specyficzne dla komórek nabłonkowych mogły dalej wyznaczać te populacje. Drugi rząd: profil markerów krwinek CD3/CD19/CD66b i CD206 z komórek CD45+. Trzeci rząd: markery komórek nabłonkowych panCK i EpCAM z komórek CD45. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Zastosowano przeciwciała i barwniki żywotności. Wykaz przeciwciał i barwnika żywotności użytego w tym protokole. Wskazane są podzbiory komórkowe, które każdy z nich identyfikuje.

Tabela 2: Zawartość probówek z komórkami plwociny. Użyj tej tabeli, do której odwołuje się protokół, aby dodać określone objętości przeciwciał i barwienie żywotności dla odpowiedniej wielkości próbki.

Tabela 3: Zawartość rurek kompensacyjnych. Użyj tej tabeli, jak odwołuje się do protokołu, aby dodać określone objętości przeciwciał do kulek kompensacyjnych.

Tabela 4: Stężenie anty-ludzkiego CD45-PE dla wszystkich próbek w każdej kategorii wielkości próbki.

Wszyscy autorzy są byłymi lub obecnymi pracownikami bioAffinity Technologies.