Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oznaczanie trójstronnej interakcji między dwoma monomerami czynnika transkrypcyjnego MADS-box i białka czujnika wapnia za pomocą testu BiFC-FRET-FLIM

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62791

⸱

25 grudnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Interdisciplinary Centre for Plant Genomics, Department of Plant Molecular Biology, University of Delhi South Campus, 2University School of Biotechnology, Guru Gobind Singh Indraprastha University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji tworzenia się kompleksu trójskładnikowego między trzema partnerami białkowymi za pomocą białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą testu FRET-FLIM opartego na BiFC. Metoda ta jest cenna w badaniu kompleksów interakcji białko-białko in vivo.

Streszczenie

Interakcje białko-białko są integralną częścią wszystkich procesów biologicznych w komórkach, ponieważ odgrywają kluczową rolę w regulacji, utrzymaniu i zmianie funkcji komórkowych. Interakcje te biorą udział w szerokim zakresie zjawisk, takich jak transdukcja sygnału, odpowiedź patogenu, interakcje komórka-komórka, procesy metaboliczne i rozwojowe. W przypadku czynników transkrypcyjnych interakcje te mogą prowadzić do oligomeryzacji podjednostek, sekwestracji w określonych kontekstach subkomórkowych, takich jak jądro, cytoplazma itp., co z kolei może mieć głębszy wpływ na ekspresję genów znajdujących się w dalszej części łańcucha. W tym miejscu demonstrujemy metodologię wizualizacji trójstronnej interakcji in vivo za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) opartej na transferze energii rezonansu Förster (FRET) z obrazowaniem czasu życia fluorescencji (FLIM). Dwa z białek wybranych do tej demonstracji oddziałują jako partnerzy BiFC, a ich odtworzona aktywność fluorescencyjna jest wykorzystywana do oznaczania FRET-FLIM z trzecim partnerem. Cztero- do pięciotygodniowe rośliny Nicotiana benthamiana hodowane w komorze wzrostu zostały wykorzystane jako modelowy system roślinny w tej demonstracji.

Wprowadzenie

Interakcje białko-białko (PPI) stanowią podstawę prawidłowego funkcjonowania komórek eukariotycznych poprzez regulację różnych procesów metabolicznych i rozwojowych. Niektóre IPP są stabilne, podczas gdy inne mają charakter przejściowy. Interakcje można kategoryzować na podstawie liczby i typu elementów w interakcji, takich jak dimeryczne, trymeryczne, tetrameryczne homomeryczne i heteromeryczne1. Identyfikacja i charakterystyka interakcji białkowych może prowadzić do lepszego zrozumienia funkcji białek i sieci regulacyjnych.

Czynniki transkrypcyjne to białka, które biorą udział w funkcjach regulacyjnych. Regulują szybkość transkrypcji swoich genów poprzez wiązanie się z DNA. Czasami oligomeryzacja lub tworzenie kompleksów wyższego rzędu przez białka jest warunkiem wstępnym do realizacji ich funkcji2. Czynniki transkrypcyjne MADS-box roślin to geny homeotyczne, które regulują różne procesy, takie jak przejście kwiatowe, rozwój organów kwiatowych, zapłodnienie, rozwój nasion, starzenie się i rozwój wegetatywny. Wiadomo, że tworzą kompleksy wyższego rzędu, które wiążą się z klasą DNA3,< sup class = "xref">4. Badanie sieci PPI między czynnikami transkrypcyjnymi i ich interaktorami dostarcza informacji na temat złożoności leżącej u podstaw regulacji transkrypcji.

Przejściowa ekspresja białka u Nicotiana benthamiana była popularnym podejściem do badania lokalizacji białek lub interakcji białko-białko in vivo5. BiFC i FRET to metody badania interakcji białko-białko in vivo przy użyciu fluorescencyjnych systemów reporterowych6. Wykazano, że połączenie tych dwóch technik ujawnia interakcję między trzema białkami7. FRET mierzy się za pomocą fotowybielania akceptorowego, emisji uczulożonej i techniki obrazowania fluorescencji (FLIM). Test FRET oparty na FLIM pojawił się jako narzędzie, które zapewnia dokładną kwantyfikację i czasoprzestrzenną specyficzność dla pomiarów transferu energii między dwiema cząsteczkami na podstawie ich czasu życia fluorescencji8. FLIM mierzy czas, w którym fluorofor pozostaje w stanie wzbudzonym przed wyemitowaniem fotonu i jest lepszy niż techniki wykorzystujące same pomiary intensywności9,10. Oprócz systemów heterologicznych, takich jak Nicotiana benthamiana i skórki naskórka cebuli, nowsze doniesienia wykazały wykorzystanie korzeni Arabidopsis i młodych sadzonek ryżu itp., do analizy in vivo interakcji białko-białko w warunkach natywnych11,12.

Oprócz odpowiedniego systemu ekspresji, wybór partnerów do testów BiFC i FRET jest również kluczowy dla powodzenia tego eksperymentu. PPI wśród partnerów używanych w konfiguracji BiFC powinien zostać zweryfikowany przy użyciu odpowiednich kontroli przed ich użyciem jako sprzężonego partnera w eksperymencie FRET13. BiFC wykorzystuje strukturalną komplementację N- i C-końcowych części białka fluorescencyjnego. Wspólnym ograniczeniem w większości, jeśli nie we wszystkich białkach fluorescencyjnych stosowanych w testach BiFC jest samoorganizacja między dwoma pochodnymi fragmentów niefluorescencyjnych, przyczyniająca się do fałszywie dodatniej fluorescencji i zmniejszająca stosunek sygnału do szumu (S/N)14. Ostatnie osiągnięcia, w tym mutacje punktowe lub pozycja rozszczepienia białka fluorescencyjnego, doprowadziły do powstania par BiFC o zwiększonej intensywności, wyższej specyficzności, wysokim stosunku sygnału do szumu15,16. Te białka fluorescencyjne mogą być również wykorzystane do przeprowadzenia BiFC w zależności od przydatności eksperymentu.

Tradycyjnie, CFP i YFP były używane jako para dawców i akceptorów w eksperymentach FRET17. Stwierdzono jednak, że YFP lub m-cytryn są lepszymi dawcami FRET (gdy są używane z RFP jako akceptorem) ze względu na wysoką wydajność kwantową (QY) podczas natywnej ekspresji białek docelowych w systemie korzeniowym Arabidopsis. Dobór promotorów (konstytutywny kontra natywny/endogenny) i fluoroforu również odgrywa kluczową rolę w projektowaniu udanego eksperymentu BiFC-FRET-FLIM. Należy zauważyć, że skuteczność donorów FRET i przydatność par FRET mają tendencję do zmiany wraz ze zmianą promotora i systemu biologicznego używanego do ekspresji. Jakość fluoroforu, która odnosi się do jego jasności, zależy od pH, temperatury i używanego systemu biologicznego. Sugerujemy, aby kryteria te zostały dokładnie rozważone przed wyborem pary fluoroforów do eksperymentu FRET. System biologiczny, promotory i białka użyte w tym protokole dobrze współpracowały z fluoroforami CFP-YFP w eksperymencie BiFC FRET-FLIM.

W obecnym badaniu wykorzystujemy funkcję FLIM do wizualizacji interakcji między trzema cząsteczkami białka za pomocą FRET opartego na BiFC. W tej technice dwa białka są znakowane rozszczepionym białkiem YFP, a trzecie białko CFP. Ponieważ byliśmy zainteresowani badaniem interakcji homodimeru białka MADS-box (M) z białkiem czujnika wapnia (C), białka te zostały oznaczone białkami fluorescencyjnymi w wektorach pSITE-1CA i pSITE-3CA18. Dwóch z oddziałujących partnerów w tym teście zostało oznaczonych N- i C-końcowymi częściami YFP w wektorach pSPYNE-35S i pSPYCE-35S19, a ich interakcja skutkuje odtworzeniem funkcjonalnego YFP, który działa jako akceptor FRET do trzeciego partnera oddziałującego, który jest oznaczony CFP (działającym jako dawca FRET) (Rysunek 1). W tym konkretnym przypadku PPI między dwoma monomerami M oraz między M i C został zwalidowany poprzez wykonanie BiFC w trzech różnych systemach wraz z układem drożdża-dwa hybrydy. Wektory te zostały zmobilizowane do szczepu Agrobacterium tumifaciens GV3101 za pomocą elektroporacji. Szczep GV3101 ma rozbrojony plazmid Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) z odpornością na gentamycynę20. Szczep p19 Agrobacterium został dodany wraz ze wszystkimi naciekami, aby zapobiec wyciszaniu transgenu21. Zalecamy, aby te trzy białka były również używane w przeciwstawnych konformacjach w celu walidacji oddziaływań trójstronnych.

W tej technice zastosowaliśmy FLIM, gdzie najpierw mierzy się czas życia fluorescencji dawcy (niewygaszony czas życia dawcy) w przypadku braku akceptora. Następnie mierzy się jego żywotność w obecności akceptora (wygaszony czas życia dawcy). Ta różnica w czasach życia fluorescencji donorowej jest wykorzystywana do obliczania wydajności FRET, która zależy od liczby fotonów wykazujących skrócenie czasu życia fluorescencji. Poniżej wymieniono szczegółowy protokół określający tworzenie się trójskładnikowego kompleksu między dowolnymi trzema białkami poprzez przejściową ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie w Nicotiana benthamiana i oznaczanie ich interakcji za pomocą BiFC-FRET-FLIM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Klonowanie genów w wektorach wejściowych i docelowych (Rysunek 2)

  1. Namnożyć sekwencję kodującą (CDS) genów docelowych (w naszym przypadku geny M i C) metodą PCR, a następnie sklonować je do odpowiednich wektorów wejściowych (np. wektora pENTR/D-TOPO; patrz Tabela 1 w celu zapoznania się z wektorami użytymi w tym eksperymencie).
  2. Hodować klony na płytkach z antybiotykami. Zweryfikować wyselekcjonowane na antybiotykach klony za pomocą trawienia restrykcyjnego i sekwencjonowania DNA22,23.
  3. Przenieść zrekonstytuowane CDS z klonów wejściowych do wektorów docelowych (pSPYNE-35S, pSPYCE-35S, pSITE-1CA i pSITE-3CA) i potwierdzić transfer sekwencji z wektorów wejściowych do docelowych poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi.
    UWAGA: Wszystkie wektory użyte w tym eksperymencie są wymienione w Tabeli 1.
  4. Na koniec przeprowadzić transformację komórek Agrobacterium GV3101 (pMP90 (GentR)) wektorami docelowymi metodą elektroporacji (Rysunek 3)24.

2. Warunki wzrostu roślin Nicotiana benthamiana

UWAGA: Rośliny Nicotiana należy hodować do stadium 4-6 liści w warunkach kontrolnych.

  1. Aby wyhodować rośliny Nicotiana, przygotować mieszankę glebową, łącząc dostępne w handlu podłoża z torfem kokosowym i kompostem w stosunku 2:1:1.
  2. W plastikowej tacy wysypać warstwę mieszanki glebowej o grubości 1 cala, tworząc podłoże, a następnie nasycić ją wodą dejonizowaną. W podłożu wysiać około 200 nasion.
  3. Przenieść całość do większej tacy zawierającej 1 cm wody. Przykryć tacę folią plastikową, aby stworzyć komorę wilgotnościową.
  4. Umieścić taki zestaw w komorze wzrostowej ustawionej na 23 °C, z cyklem 16 h światła i 8 h ciemności oraz natężeniem światła 150-170 µmol/m2s.
  5. Po dwóch tygodniach przenieść młode siewki do małych doniczek o średnicy 3-4 cali, zawierających nasyconą wodą mieszankę glebową.
  6. Umieścić doniczki w plastikowych tacach i przenieść je do komory wzrostowej na kolejne cztery tygodnie.

3. Przygotowanie szczepów bakteryjnych do agroinfiltracji

UWAGA: W przypadku agroinfiltracji szczepy bakteryjne muszą być świeżo przepaszczarkowane i zmieszane ze szczepem p19 Agrobacterium w odpowiednich proporcjach.

  1. Przygotować szalki z agarem 2xYT zawierającym rifampicynę (100 µg/mL), gentamicinę (25 µg/mL) i kanamycynę (50 µg/mL) dla Agrobacterium przenoszącego wektory pSPYNE-35S i pSPYCE-35S. Dla szczepu zawierającego wektor pSITE należy użyć rifampicyny (100 µg/mL), gentamiciny (25 µg/mL) i spektynomycyny (50 µg/mL).
  2. Przeciągnąć szczepy Agrobacterium zawierające plazmidy na te szalki, używając sterylnych pętli szczepiących w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
  3. Inkubować je w temperaturze 28 °C przez 48 h w ciemności.
  4. Rozpocząć tę procedurę poprzez szczepienie szczepu Agrobacterium GV3101 przenoszącego konstrukty BiFC i FRET (przygotowane w wektorach pSPYNE-35S, pSPYCE-35S i pSITE) z posianych szalek do 10 mL bulionu 2xYT zawierającego odpowiednie antybiotyki (rifampicynę (100 µg/mL), gentamicinę (25 µg/mL), kanamycynę (50 µg/mL) lub spektynomycynę (50 µg/mL)).
  5. Dodatkowo zaszczepić kulturę szczepu p19 Agrobacteria w 10 mL bulionu 2xYT zawierającego rifampicynę (100 µg/mL) i kanamycynę (50 µg/mL).
    UWAGA: Szczep p19 jest dodawany w celu zapobiegania wyciszaniu transgenów.
  6. Przykryć kolbę folią aluminiową i inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 28 °C i przy 170 rpm przez 16 h w ciemności.
  7. Po nocnym wzroście przenieść 1 mL tej kultury do jednorazowej kuwety, aby zmierzyć gęstość optyczną (O.D.) kultur przy 600 nm za pomocą spektrofotometru.
  8. Zmieszać kultury odpowiednich szczepów zawierających partnerów BiFC i FRET w taki sposób, aby końcowa gęstość optyczna każdej z kultur wynosiła 0,5, a kultury p19 – 0,3 w całkowitej objętości 2 mL.
  9. Aby uzyskać te proporcje, należy użyć poniższego wzoru:
    Wzór bilansowania gęstości optycznej dla obliczenia objętości kultury w eksperymencie mikrobiologicznym.
    ODobtained = gęstość optyczna kultury zmierzona przy 600 nm
    Vculture = wymagana objętość kultury
    ODfinal = 0,5 dla konstruktów i 0,3 dla p19
    Vfinal = końcowa objętość do infiltracji, wynosząca 2 mL
    UWAGA: Kombinacje konstruktów użyte w niniejszym badaniu wyszczególniono w Tabeli 2.
  10. Odwirować zmieszane kultury Agrobacterium przy 3 000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej i ostrożnie usunąć nadsącz. Resuspender osad w 2 mL świeżo przygotowanego buforu do infiltracji (10 mM MES, 100 µM acetosyringonu i 10 mM MgCl2). Użyć mieszadła typu vortex, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek.
  11. Inkubować probówki zawierające resuspendowane komórki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 3 h.
  12. W międzyczasie opisać każdą doniczkę z rośliną, podając mieszankę konstruktów, którą będzie ona infiltrowana. Użyć dwóch roślin dla każdej mieszanki infiltracyjnej.
  13. Napełnić strzykawkę 1 mL bez igły mieszaniną agrobakteryjną. Delikatnie, ale pewnie docisnąć strzykawkę do strony abaksjalnej całkowicie rozwiniętego liścia, podtrzymując liść z drugiej strony. Powoli nacisnąć tłok, aż roztwory wypełnią obszar liścia równy 2-3 krociom długości końcówki strzykawki.
  14. Infiltrować do czterech miejsc na liściu i 3-4 liście na roślinę, jak pokazano na Rysunku 4.
    UWAGA: Zmieniać rękawiczki lub przecierać je 70% alkoholem pomiędzy próbkami, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej.
  15. Przenieść wszystkie doniczki na tacę i inkubować w komorze wzrostowej w tych samych warunkach, o których wspomniano w kroku 2.
  16. Sprawdzać niewielką część agroinfiltrowanego liścia w różnych punktach czasowych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Gdy w komórkach będzie można wykryć fluorescencję zarówno YFP, jak i CFP, przystąpić do analizy BiFC-FRET FLIM za pomocą mikroskopu konfokalnego. W tym eksperymencie analizę przeprowadzono 3 dni po agroinfiltracji.
    ​UWAGA: Okres inkubacji po agroinfiltracji należy dobrać indywidualnie dla każdej kombinacji promotora i genu, aby uniknąć nadmiernej ekspresji białek chimerycznych użytych w analizie BiFC-FRET FLIM. Nadmierna ekspresja białek partnerów może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich w badaniu oddziaływań.

4. Przygotowanie preparatów do wizualizacji fluorescencyjnej

  1. Gdy rośliny będą gotowe do wizualizacji, wyciąć kwadratowe próbki liści w odległości 5-8 mm od miejsca infiltracji i zamocować je w wodzie destylowanej na czystych szkiełkach.
    UWAGA: Aby zminimalizować autofluorescencję tła, należy przemyć szkiełka 80% etanolem, a następnie wodą destylowaną 3-4 razy, wysuszyć je na powietrzu i przechowywać na arkuszu chłonnym.
  2. Próbkę liścia przykryć czystym szkiełkiem nakrywkowym i zabezpieczyć za pomocą laku do paznokci.
  3. Próbki wizualizować przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.

5. Analiza FRET-FLIM z użyciem konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego

UWAGA: W tej procedurze podstawą określania i ilościowego pomiaru oddziaływania między dwoma białkami jest skrócenie czasu życia fluorescencji partnera-donora FRET podczas jego oddziaływania z akceptorem, co służy do obliczenia wydajności FRET. Złożoność w przypadku oddziaływania trójdzielnego wzrasta jeszcze bardziej, ponieważ akceptor FRET w tym przypadku nie jest pojedynczą cząsteczką, lecz rozszczepioną parą YFP-BiFC, która musi najpierw ulec rekonstytucji in vivo, aby stać się funkcjonalnym fluorophorem-akceptorem FRET. Aby przeprowadzić FRET-FLIM, należy najpierw określić czas życia fluorescencji cząsteczki donora samodzielnie, a następnie w obecności partnera FRET.

  1. Otwórz aplikację FLIM w konfokalnym skaningowym mikroskopie laserowym, uruchom konsolę i wykorzystaj zliczanie fotonów z rozpoznawaniem wzorców do pomiaru czasu życia fluorescencji. Wybierz standardowy tryb pomiaru „All photon counting”.
  2. Przeanalizuj próbki z dwóch typów roślin poddanych agroinfiltracji: jednej tylko z donorem (C-CFP) i drugiej z donorem oraz akceptorem jednocześnie (C-CFP wraz z M-YFP).
    UWAGA: Ponieważ interakcja białka M z białkiem C została już potwierdzona za pomocą BiFC i Y2H, oczekuje się dobrej wydajności FRET dla tej pary oddziałującej.
  3. Następnie zeskanuj liść po agroinfiltracji C-CFP i ustaw ostrość na komórce wykazującej silną fluorescencję CFP. Uruchom tryb skanowania laserowego i skonfiguruj system do wizualizacji CFP oraz pomiarów FLIM (laser impulsowy λex 440 nm, detektory hybrydowe λem 480-520 nm, prędkość skanowania 512 x 512 pikseli przy 400 Hz).
  4. Dostosuj ostrość, powiększenie i inteligentne wzmocnienie (smart gain), aby skupić się na obszarze, który ma zostać zarejestrowany.
  5. Oświetl próbkę laserem o mocy wystarczającej do zarejestrowania około 0,1 fotonu na impuls. W przypadku próbek o zmiennej intensywności fluorescencji zarejestruj 50 klatek, aby zebrać odpowiednią liczbę fotonów wymaganą do pomiaru czasu życia. CFP wykazuje dwa czasy życia fluorescencji ze względu na adaptację konformacyjną; dlatego dopasuj dane, używając modelu rekonwolucji n-wykładniczej, utrzymując wartość n równą 2.
  6. Przy tych ustawieniach CFP wykazuje dwa czasy życia: 1,0 i 3,2 ns. W dalszych obliczeniach wykorzystywany jest wyższy czas życia wynoszący 3,2 ns25,26.
  7. Aby obliczyć wydajność FRET za pomocą FLIM, która jest miarą stopnia interakcji między dwoma białkami, pobierz próbkę liścia współinfiltrowanego C-CFP i M-YFP. Znajdź komórkę ekspresującą zarówno C-CFP, jak i M-YFP i potwierdź ich odpowiednie wzorce emisji, wzbudzając je za pomocą lasera impulsowego λex 440 nm (λem 480-520 nm) oraz białego lasera λex 514 nm (λem 526-550 nm). Skanuj sekwencyjnie i zidentyfikuj komórkę wykazującą fluorescencję zarówno CFP, jak i YFP.
  8. Po potwierdzeniu fluorescencji obu białek przełącz się na konsolę FLIM, aby zmierzyć czas życia CFP, korzystając z tych samych ustawień, których użyto wcześniej do pomiaru czasu życia C-CFP (krok 5.5).
    UWAGA: Ta komórka ekspresuje również M-YFP, który może potencjalnie oddziaływać z C-CFP i powodować skrócenie czasu życia C-CFP.
  9. Dopasuj uzyskany wykres za pomocą modelu rekonwolucji n-wykładniczej z n = 2. Zaobserwowano skrócenie czasu życia CFP z 3,2 do 2,6 ns, co wskazuje na rezonansowy transfer energii Förstera między CFP a YFP (Rycina 5A).
  10. Uruchom teraz konsolę FRET w oprogramowaniu i oblicz wydajność FRET, wprowadzając ręcznie czas życia niegaszonego donora do równania dostarczonego w programie. Obserwowana wydajność FRET wynosi 56%.
  11. Interakcja trójczłonowa
    1. Na koniec, aby zwizualizować interakcje między trzema partnerami, pobierz próbkę liścia z rośliny współinfiltrowanej C-CFP, M-YFPn oraz M-YFPc.
    2. Zeskanuj wycinek liścia w poszukiwaniu komórki wykazującej fluorescencję zarówno CFP, jak i zrekonstytuowanego YFP wynikającą z interakcji BiFC między dwoma białkami M. Użyj tych samych długości fal lasera i emisji, co wcześniej.
    3. Następnie wyłącz laser 514 nm i przejdź do konsoli FLIM.
      UWAGA: Jeśli dimer M-YFP oddziałuje z C-CFP, powinno dojść do skrócenia czasu życia C-CFP, analogicznie do interakcji z M-YFP. Jednak jeśli C-CFP nie wejdzie w interakcję z dimerem M-YFP, czas życia jego fluorescencji powinien pozostać na poziomie 3,2 ns.
    4. Używając ustawień podobnych do opisanych powyżej, zmierz czas życia CFP w obecności zrekonstytuowanego YFP. Dopasuj uzyskany wykres za pomocą modelu rekonwolucji n-wykładniczej z n = 2 i przejdź do konsoli FRET.
      UWAGA: Odnotowano spadek czasu życia CFP z 3,2 do 2,3 ns. Oblicz wydajność FRET zgodnie z opisem powyżej. Obliczona wydajność FRET wynosi 55%. Skrócenie czasu życia donora i dobra wydajność FRET na poziomie 55% potwierdzają interakcję trójczłonową między dwoma białkami M a białkiem C in vivo (patrz Rycina 5B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół przedstawia zoptymalizowaną metodę badania in vivo trójdzielnych oddziaływań białko-białko w roślinach. Podstawową zasadą protokołu jest połączenie dwóch technik badania oddziaływań białek z użyciem znaczników fluorescencyjnych, tj. BiFC i FRET, w celu stworzenia testu pozwalającego mierzyć tworzenie kompleksów trójskładnikowych pomiędzy trzema białkami. W tej pracy zastosowano FLIM do pomiaru czasu życia fluorescencji donora FRET w obecności i pod nieobecność akceptora FRET. Oczekiwano skróce...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół demonstruje zastosowanie testu FRET-FLIM opartego na BiFC w celu ustalenia tworzenia trójskładnikowego kompleksu między dwoma monomerami białka MADS-box i białkiem czujnika wapnia. Protokół jest adaptacją raportu Y. John Shyu i wsp., w którym opracowali oni metodę FRET opartą na BiFC do wizualizacji trójskładnikowego kompleksu utworzonego między heterodimerami Fos-Jun a NFAT lub p65 przy użyciu metody emisji uczulonej7. Wcześniej, w roku 2004-29, Galperin i jego współpracownicy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

NB, GG, SB, KC serdecznie dziękujemy Komisji ds. Grantów Uniwersyteckich (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE oraz Radzie Badań Naukowych i Przemysłowych (CSIR) za ich stypendia badawcze. Dziękujemy Departamentowi Biotechnologii (DBT), Rządowi Indii, Departamentowi Nauki i Technologii (DST-FIST), Rządowi Indii za wsparcie finansowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawki 1 ml bez igiełDispovan -
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406
Gateway  LR Clonase II Mieszanka enzymówThermo Fischer Scientific11791020Wektory użyte w badaniu to
siarczan gentamycynyHimediaCMS461
siarczan kanamycyny,HimediaMB105
hydrat MESSigma-AldrichM2933
MgCl2Sigma-AldrichM2670
pENTR/D-TOPO Zestaw do klonowaniaThermo Fischer ScientificK240020Wektory użyte w badaniu to Oparta na bramce
Phusion polimeraza DNA Taq o wysokiej wiernościThermo Fischer ScientificF530-SDowolna polimeraza o wysokiej wierności może działać
RyfampicynaHimediaCMS1889
SP8 FALCON Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyLeicaSP8 FALCONMożna do tego użyć dowolnego CLSM z możliwościami FLIM analiza
Spektynomycyna dichlorowodorek pentahydratHimediaTC034
na bazie bramy, , , , ,

Bibliografia

  1. Grove, C. A., Walhout, A. J. M. Transcription factor functionality and transcription regulatory networks. Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).
  2. Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors. Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).
  3. Arora, R., et al. MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress. BMC Genomics. 8 (242), (2007).
  4. Theißen, G., Gramzow, L. Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors. Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).
  5. Schweiger, R., Schwenkert, S. Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).
  6. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  7. Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).
  8. Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. Combined bimolecular fluorescence complementation and förster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells. Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).
  9. Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
  10. Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1(2020).
  11. Long, Y., et al. Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots. Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).
  12. Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants. Frontiers in Plant Science. , 11(2020).
  13. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  14. Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).
  15. Kodama, Y., Hu, C. D. An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio. BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).
  16. Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives. BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
  17. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
  18. Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).
  19. Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).
  20. Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).
  21. Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins. Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).
  22. Xie, X., et al. Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system. Nature Protocols. 16, (2021).
  23. Xu, J., et al. Optimized plasmid construction strategy for Cas9. Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).
  24. Mattanovich, D., et al. Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747(1989).
  25. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).
  26. Tramier, M., et al. Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells. Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).
  27. Alvarez, L. A. J., et al. SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM. Nature Methods. 20, 2-4 (2019).
  28. Postma, M., Goedhart, J. Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries. PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).
  29. Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells. Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).
  30. Waadt, R., Kudla, J. In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Interakcje bia ko bia koobrazowanie czasu ycia fluorescencjimikroskopia konfokalnaNicotiana benthamianainfiltracja Agrobacteriumwydajno FRET
Oznaczanie trójstronnej interakcji między dwoma monomerami czynnika transkrypcyjnego MADS-box i białka czujnika wapnia za pomocą testu BiFC-FRET-FLIM
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.