Method Article

Oznaczanie trójstronnej interakcji między dwoma monomerami czynnika transkrypcyjnego MADS-box i białka czujnika wapnia za pomocą testu BiFC-FRET-FLIM

DOI:

10.3791/62791

⸱

December 25th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Interdisciplinary Centre for Plant Genomics, Department of Plant Molecular Biology, University of Delhi South Campus, 2University School of Biotechnology, Guru Gobind Singh Indraprastha University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji tworzenia się kompleksu trójskładnikowego między trzema partnerami białkowymi za pomocą białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą testu FRET-FLIM opartego na BiFC. Metoda ta jest cenna w badaniu kompleksów interakcji białko-białko in vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje białko-białko są integralną częścią wszystkich procesów biologicznych w komórkach, ponieważ odgrywają kluczową rolę w regulacji, utrzymaniu i zmianie funkcji komórkowych. Interakcje te biorą udział w szerokim zakresie zjawisk, takich jak transdukcja sygnału, odpowiedź patogenu, interakcje komórka-komórka, procesy metaboliczne i rozwojowe. W przypadku czynników transkrypcyjnych interakcje te mogą prowadzić do oligomeryzacji podjednostek, sekwestracji w określonych kontekstach subkomórkowych, takich jak jądro, cytoplazma itp., co z kolei może mieć głębszy wpływ na ekspresję genów znajdujących się w dalszej części łańcucha. W tym miejscu demonstrujemy metodologię wizualizacji trójstronnej interakcji in vivo za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) opartej na transferze energii rezonansu Förster (FRET) z obrazowaniem czasu życia fluorescencji (FLIM). Dwa z białek wybranych do tej demonstracji oddziałują jako partnerzy BiFC, a ich odtworzona aktywność fluorescencyjna jest wykorzystywana do oznaczania FRET-FLIM z trzecim partnerem. Cztero- do pięciotygodniowe rośliny Nicotiana benthamiana hodowane w komorze wzrostu zostały wykorzystane jako modelowy system roślinny w tej demonstracji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje białko-białko (PPI) stanowią podstawę prawidłowego funkcjonowania komórek eukariotycznych poprzez regulację różnych procesów metabolicznych i rozwojowych. Niektóre IPP są stabilne, podczas gdy inne mają charakter przejściowy. Interakcje można kategoryzować na podstawie liczby i typu elementów w interakcji, takich jak dimeryczne, trymeryczne, tetrameryczne homomeryczne i heteromeryczne1. Identyfikacja i charakterystyka interakcji białkowych może prowadzić do lepszego zrozumienia funkcji białek i sieci regulacyjnych.

Czynniki transkrypcyjne to białka, które biorą udział w funkcjach regulacyjnych. Regulują szybkość transkrypcji swoich genów poprzez wiązanie się z DNA. Czasami oligomeryzacja lub tworzenie kompleksów wyższego rzędu przez białka jest warunkiem wstępnym do realizacji ich funkcji2. Czynniki transkrypcyjne MADS-box roślin to geny homeotyczne, które regulują różne procesy, takie jak przejście kwiatowe, rozwój organów kwiatowych, zapłodnienie, rozwój nasion, starzenie się i rozwój wegetatywny. Wiadomo, że tworzą kompleksy wyższego rzędu, które wiążą się z klasą DNA3,< sup class = "xref">4. Badanie sieci PPI między czynnikami transkrypcyjnymi i ich interaktorami dostarcza informacji na temat złożoności leżącej u podstaw regulacji transkrypcji.

Przejściowa ekspresja białka u Nicotiana benthamiana była popularnym podejściem do badania lokalizacji białek lub interakcji białko-białko in vivo5. BiFC i FRET to metody badania interakcji białko-białko in vivo przy użyciu fluorescencyjnych systemów reporterowych6. Wykazano, że połączenie tych dwóch technik ujawnia interakcję między trzema białkami7. FRET mierzy się za pomocą fotowybielania akceptorowego, emisji uczulożonej i techniki obrazowania fluorescencji (FLIM). Test FRET oparty na FLIM pojawił się jako narzędzie, które zapewnia dokładną kwantyfikację i czasoprzestrzenną specyficzność dla pomiarów transferu energii między dwiema cząsteczkami na podstawie ich czasu życia fluorescencji8. FLIM mierzy czas, w którym fluorofor pozostaje w stanie wzbudzonym przed wyemitowaniem fotonu i jest lepszy niż techniki wykorzystujące same pomiary intensywności9,10. Oprócz systemów heterologicznych, takich jak Nicotiana benthamiana i skórki naskórka cebuli, nowsze doniesienia wykazały wykorzystanie korzeni Arabidopsis i młodych sadzonek ryżu itp., do analizy in vivo interakcji białko-białko w warunkach natywnych11,12.

Oprócz odpowiedniego systemu ekspresji, wybór partnerów do testów BiFC i FRET jest również kluczowy dla powodzenia tego eksperymentu. PPI wśród partnerów używanych w konfiguracji BiFC powinien zostać zweryfikowany przy użyciu odpowiednich kontroli przed ich użyciem jako sprzężonego partnera w eksperymencie FRET13. BiFC wykorzystuje strukturalną komplementację N- i C-końcowych części białka fluorescencyjnego. Wspólnym ograniczeniem w większości, jeśli nie we wszystkich białkach fluorescencyjnych stosowanych w testach BiFC jest samoorganizacja między dwoma pochodnymi fragmentów niefluorescencyjnych, przyczyniająca się do fałszywie dodatniej fluorescencji i zmniejszająca stosunek sygnału do szumu (S/N)14. Ostatnie osiągnięcia, w tym mutacje punktowe lub pozycja rozszczepienia białka fluorescencyjnego, doprowadziły do powstania par BiFC o zwiększonej intensywności, wyższej specyficzności, wysokim stosunku sygnału do szumu15,16. Te białka fluorescencyjne mogą być również wykorzystane do przeprowadzenia BiFC w zależności od przydatności eksperymentu.

Tradycyjnie, CFP i YFP były używane jako para dawców i akceptorów w eksperymentach FRET17. Stwierdzono jednak, że YFP lub m-cytryn są lepszymi dawcami FRET (gdy są używane z RFP jako akceptorem) ze względu na wysoką wydajność kwantową (QY) podczas natywnej ekspresji białek docelowych w systemie korzeniowym Arabidopsis. Dobór promotorów (konstytutywny kontra natywny/endogenny) i fluoroforu również odgrywa kluczową rolę w projektowaniu udanego eksperymentu BiFC-FRET-FLIM. Należy zauważyć, że skuteczność donorów FRET i przydatność par FRET mają tendencję do zmiany wraz ze zmianą promotora i systemu biologicznego używanego do ekspresji. Jakość fluoroforu, która odnosi się do jego jasności, zależy od pH, temperatury i używanego systemu biologicznego. Sugerujemy, aby kryteria te zostały dokładnie rozważone przed wyborem pary fluoroforów do eksperymentu FRET. System biologiczny, promotory i białka użyte w tym protokole dobrze współpracowały z fluoroforami CFP-YFP w eksperymencie BiFC FRET-FLIM.

W obecnym badaniu wykorzystujemy funkcję FLIM do wizualizacji interakcji między trzema cząsteczkami białka za pomocą FRET opartego na BiFC. W tej technice dwa białka są znakowane rozszczepionym białkiem YFP, a trzecie białko CFP. Ponieważ byliśmy zainteresowani badaniem interakcji homodimeru białka MADS-box (M) z białkiem czujnika wapnia (C), białka te zostały oznaczone białkami fluorescencyjnymi w wektorach pSITE-1CA i pSITE-3CA18. Dwóch z oddziałujących partnerów w tym teście zostało oznaczonych N- i C-końcowymi częściami YFP w wektorach pSPYNE-35S i pSPYCE-35S19, a ich interakcja skutkuje odtworzeniem funkcjonalnego YFP, który działa jako akceptor FRET do trzeciego partnera oddziałującego, który jest oznaczony CFP (działającym jako dawca FRET) (Rysunek 1). W tym konkretnym przypadku PPI między dwoma monomerami M oraz między M i C został zwalidowany poprzez wykonanie BiFC w trzech różnych systemach wraz z układem drożdża-dwa hybrydy. Wektory te zostały zmobilizowane do szczepu Agrobacterium tumifaciens GV3101 za pomocą elektroporacji. Szczep GV3101 ma rozbrojony plazmid Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) z odpornością na gentamycynę20. Szczep p19 Agrobacterium został dodany wraz ze wszystkimi naciekami, aby zapobiec wyciszaniu transgenu21. Zalecamy, aby te trzy białka były również używane w przeciwstawnych konformacjach w celu walidacji oddziaływań trójstronnych.

W tej technice zastosowaliśmy FLIM, gdzie najpierw mierzy się czas życia fluorescencji dawcy (niewygaszony czas życia dawcy) w przypadku braku akceptora. Następnie mierzy się jego żywotność w obecności akceptora (wygaszony czas życia dawcy). Ta różnica w czasach życia fluorescencji donorowej jest wykorzystywana do obliczania wydajności FRET, która zależy od liczby fotonów wykazujących skrócenie czasu życia fluorescencji. Poniżej wymieniono szczegółowy protokół określający tworzenie się trójskładnikowego kompleksu między dowolnymi trzema białkami poprzez przejściową ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie w Nicotiana benthamiana i oznaczanie ich interakcji za pomocą BiFC-FRET-FLIM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Klonowanie genów w wektorach wejściowych i docelowych (Rysunek 2)

  1. Amplifikować sekwencję kodującą (CDS) genów będących przedmiotem zainteresowania (w naszym przypadku genów M i C) metodą PCR i sklonować je w odpowiednich wektorach wejściowych (np. wektor pENTR/D-TOPO; zob. tabela 1 dla wektorów użytych w tym doświadczeniu).
  2. Hoduj klony na płytkach zawierających antybiotyki. Walidacja klonów, które są wybrane na antybiotyki, poprzez trawienie restrykcyjne i sekwencjonowanie DNA22,23.
  3. Zmobilizuj odtworzone CDS-y z klonów wejściowych do wektorów docelowych (pSPYNE-35S, pSPYCE-35S, pSITE-1CA i pSITE-3CA) i potwierdź transfer sekwencji z wektorów wejściowych do docelowych przez trawienie enzymem restrykcyjnym.
    UWAGA: Wszystkie wektory użyte w tym eksperymencie są wymienione w Tabeli 1.
  4. Na koniec przekształć komórki Agrobacterium GV3101 (pMP90 (GentR)) z wektorami docelowymi za pomocą elektroporacji (Rysunek 3)24.

2. Warunki wzrostu roślin Nicotiana benthamiana

UWAGA: Uprawiaj rośliny Nicotiana do fazy 4-6 liści w warunkach kontrolnych.

  1. Aby wyhodować rośliny Nicotiana, przygotuj mieszankę gleby, mieszając dostępne w handlu mieszanki glebowe z kokosem i kompostem w stosunku 2:1:1.
  2. Rozłóż warstwę tej mieszanki gleby o grubości 1 cala w plastikowej tacy, aby przygotować podłoże glebowe i nasycić je wodą dejonizowaną. Rozsyp około 200 nasion w tym łóżku glebowym.
  3. Przełóż go na większą tacę zawierającą 1 cm stojącej wody. Przykryj tę tacę folią, aby utworzyć komorę wilgotnościową.
  4. Przenieś ten zestaw do komory wzrostowej ustawionej w temperaturze 23 °C przy 16 godzinach światła i 8-godzinnym cyklu ciemnym o natężeniu światła 150-170 μmol/m2s.
  5. Po dwóch tygodniach przenieś młode sadzonki do małych, 3-4-calowych doniczek zawierających nasyconą wodą mieszankę gleby.
  6. Umieść te doniczki w plastikowych tacach i przenieś je do komory wzrostowej na kolejne cztery tygodnie.

3. Przygotuj szczepy bakteryjne do agroinfiltracji

UWAGA: Do agroinfiltracji, szczepy bakteryjne muszą być świeżo wyhodowane i zmieszane ze szczepem p19 Agrobacterium w odpowiednich proporcjach.

  1. Przygotuj 2xYT płytki agarowe zawierające ryfampicynę (100 μg/ml), gentamycynę (25 μg/ml) i kanamycynę (50 μg/ml) dla Agrobacterium zawierających wektor pSPYNE-35S i pSPYCE-35S. W przypadku wektora zawierającego szczep pSITE należy użyć ryfampicyny (100 μg/ml), gentamycyny (25 μg/ml) i spektynomycyny (50 μg/ml).
  2. Szczepy Agrobacterium zawierające plazmidy należy rozprowadzić na tych płytkach za pomocą sterylnych pętli inokulacyjnych w okapie z przepływem laminarnym.
  3. Inkubować je w temperaturze 28 °C przez 48 godzin w ciemności.
  4. Procedurę tę należy rozpocząć od inokulacji szczepu Agrobacterium GV3101 zawierającego konstrukty BiFC i FRET (przygotowane w wektorach pSPYNE-35S, pSPYCE-35S i pSITE) z prążkowanych płytek w 10 ml bulionu 2xYT zawierającego odpowiednie antybiotyki (ryfampicyna (100 μg/ml), gentamycyna (25 μg/ml), kanamycyna (50 μg/ml) lub spektynomycyna (50 μg/ml)).
  5. Dodatkowo zainicjuj hodowlę szczepu p19 Agrobacteria poprzez zaszczepienie 10 ml bulionu 2xYT zawierającego ryfampicynę (100 μg/ml) i kanamycynę (50 μg/ml).
    UWAGA: szczep p19 jest dodawany, aby zapobiec wyciszeniu transgenu.
  6. Przykryć kolbę folią aluminiową i przechowywać je w wytrząsarce inkubatora ustawionej na 28 °C i 170 obr./min przez 16 godzin w ciemności.
  7. Po całonocnym wzroście przenieś 1 ml tej kultury do jednorazowej kuwety, aby zmierzyć gęstość optyczną (OD) kultur przy 600 nm za pomocą spektrofotometru.
  8. Wymieszać kultury odpowiednich szczepów zawierających BiFC i FRET tak, aby końcowa średnica zewnętrzna każdej kultury wynosiła 0,5, a p19 0,3 w całkowitej objętości 2 ml.
  9. Aby osiągnąć te proporcje, użyj wzoru podanego poniżej:
    figure-protocol-1
    Otrzymany OD = średnica zewnętrzna kultury mierzona przy 600 nm
    Vkultura = wymagana objętość kultury
    ODfinal = 0,5 dla konstrukcji i 0,3 dla p19
    Vkońcowy = Końcowa objętość do infiltracji, która wynosi 2 ml < br / > UWAGA: Kombinacje konstruktów użyte w tym badaniu są określone w Tabeli 2.
  10. Odwirować zmieszane kultury Agrobacterium przy 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ostrożnie wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w 2 ml świeżo przygotowanego buforu infiltracyjnego (10 mM MES, 100 μM acetosyringonu i 10 mM MgCl2). Użyj mieszalnika wirowego, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek.
  11. Probówki zawierające zawieszone komórki inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
  12. W międzyczasie oznacz każdą doniczkę mieszanką konstruktu, którą będzie infiltrowana. Użyj dwóch roślin na każdą mieszaninę infiltracyjną.
  13. Napełnij strzykawkę bezigłową o pojemności 1 ml mieszanką agrobakteryjną. Delikatnie, ale stanowczo docisnąć strzykawkę do aosialnej strony w pełni rozwiniętego liścia, jednocześnie podtrzymując liść z drugiej strony. Delikatnie naciskać tłok, aż roztwory wypełnią się w obszarze liścia w ilości odpowiadającej 2-3 krotności końcówki strzykawki.
  14. Naciekaj do czterech plamek na liściu i 3-4 liści na roślinę, jak pokazano na Rysunek 4.
    UWAGA: Zmień rękawice lub przetrzyj rękawice 70% alkoholem między próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
  15. Przenieś wszystkie doniczki na tacę i inkubuj w komorze wzrostowej w tych samych warunkach, jak wspomniano w kroku 2.
  16. Sprawdź niewielką część liścia agroinfiltrowanego w różnych punktach czasowych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Gdy fluorescencja zarówno z YFP, jak i CFP jest wykrywalna w komórkach, przejdź do mikroskopu konfokalnego w celu przeprowadzenia testu BiFC-FRET FLIM. W tym eksperymencie analizę przeprowadzono 3 dni po agroinfiltracji.
    UWAGA: Ustaw okres inkubacji po agroinfiltracji indywidualnie dla każdej kombinacji promotora i genu, aby uniknąć nadekspresji białek chimerycznych stosowanych w teście BiFC-FRET FLIM. Nadekspresja białek partnerskich może prowadzić do interakcji fałszywie dodatnich.

4. Przygotowanie preparatów do wizualizacji fluorescencji

  1. Gdy rośliny są gotowe do wizualizacji, należy wyciąć próbki o kwadratowych liściach, w odległości 5-8 mm od rany infiltracyjnej, i umieścić je w wodzie destylowanej na czystych szkiełkach.
    UWAGA: Aby zminimalizować fluorescencję tła, wyczyść szkiełka 80% etanolem, a następnie wodą destylowaną 3-4 razy, wysusz je na powietrzu i trzymaj na chłonnym arkuszu.
  2. Przykryj próbkę liści czystym szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij za pomocą emalii do paznokci.
  3. Wizualizuj te próbki pod konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym.

5. Analiza FRET-FLIM przy użyciu konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego

UWAGA: W tej procedurze, podstawą do określenia i ilościowego określenia interakcji między dwoma białkami jest skrócenie czasu życia fluorescencji partnera dawcy FRET po jego interakcji z akceptorem, co jest używane do obliczenia wydajności FRET. Złożoność w przypadku oddziaływania trójstronnego wzrasta jeszcze bardziej, ponieważ akceptor FRET, w tym przypadku, nie jest pojedynczą cząsteczką, ale rozdzieloną parą YFP-BiFC, która powinna najpierw zostać odtworzona in vivo, aby stać się funkcjonalnym fluoroforem akceptora FRET. Aby przeprowadzić FRET-FLIM, należy określić czas życia fluorescencji cząsteczki dawcy - najpierw samodzielnie, a następnie w obecności partnera FRET.

  1. Otwórz aplikację FLIM w konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym, uruchom konsolę i użyj funkcji zliczania fotonów z rozpoznawaniem wzorców, aby zmierzyć czas życia fluorescencji. Wybierz standardowy tryb pomiaru "Zliczanie wszystkich fotonów".
  2. Analizuj próbki z dwóch rodzajów roślin przesączonych rolniczo: jedna z samym dawcą (C-CFP), a druga z dawcą i akceptorem (C-CFP, wraz z M-YFP) oba.
    UWAGA: Ponieważ oddziaływanie białka M zostało już zwalidowane z białkiem C przy użyciu BiFC i Y2H, oczekuje się dobrej wydajności FRET w przypadku tej oddziałującej pary.
  3. Następnie zeskanuj liść naciekany przez C-CFP i skup się na komórce wykazującej dobrą fluorescencję CFP. Uruchom tryb skanowania laserowego i ustaw system na wizualizację CFP i pomiary FLIM (λex 440 nm laser impulsowy, λem 480-520 nm przez detektory hybrydowe, prędkość skanowania 512 x 512 pikseli przy 400 Hz).
  4. Dostosuj ostrość, zoom i inteligentne wzmocnienie, aby ustawić ostrość na obszarze, który ma zostać uchwycony.
  5. Oświetlić próbkę z wystarczającą mocą lasera, aby uzyskać wychwycenie około 0,1 fotonu na impuls. W przypadku próbek o zmiennej intensywności fluorescencji należy uchwycić 50 klatek, aby zebrać odpowiednie fotony wymagane do pomiaru czasu życia. CFP wykazuje dwa czasy życia fluorescencji ze względu na swoją adaptację konformacyjną; W związku z tym dopasuj dane przy użyciu modelu rekonwolucji wykładniczej N, zachowując wartość N równą 2.
  6. Przy tych ustawieniach CFP pokazuje dwa okresy istnienia 1,0 i 3,2 ns. W tym przypadku wyższy okres istnienia wynoszący 3,2 ns jest używany do wszystkich kolejnych obliczeń25,26.
  7. Aby obliczyć wydajność FRET za pomocą FLIM, który jest miarą stopnia interakcji między dwoma białkami, należy pobrać próbkę liści, która była współinfiltrowana C-CFP i M-YFP. Poszukaj komórki, która wyraża zarówno C-CFP, jak i M-YFP i potwierdź ich odpowiednie wzorce emisji, wzbudzając je za pomocą lasera impulsowego λex 440 nm, λem 480-520 nm i lasera światła białegoλ ex 514 nm z λem 526-550 nm. Sekwencyjnie skanuj i zidentyfikuj komórkę, która wykazuje zarówno fluorescencję CFP, jak i YFP.
  8. Po potwierdzeniu fluorescencji obu białek przełącz się na konsolę FLIM, aby zmierzyć czas życia CFP przy użyciu tych samych ustawień, których użyliśmy wcześniej do pomiaru czasu życia C-CFP (krok 5.5).
    UWAGA: Ta komórka również wykazuje ekspresję M-YFP, która może potencjalnie wchodzić w interakcje z C-CFP i powodować skrócenie czasu życia C-CFP.
  9. Dopasuj wykres uzyskany przy użyciu modelu rekonwolucji n-wykładniczej, gdzie n = 2. Zaobserwowano skrócenie czasu życia CFP z 3,2 do 2,6 ns, co wskazuje na transfer energii rezonansowej Förstera między CFP a YFP (Rysunek 5A).
  10. Teraz uruchom konsolę FRET w oprogramowaniu i oblicz wydajność FRET, ręcznie wprowadzając niewygaszony czas życia dawcy w równaniu dostarczonym w oprogramowaniu. A obserwowana sprawność FRET wynosi: 56%.
  11. Interakcja trójstronna
    1. Na koniec, aby zobrazować interakcje między trzema partnerami, pobierz próbkę liści z rośliny, która była współinfiltrowana z C-CFP, M-YFPn i M-YFPc.
    2. Zeskanuj eksplant liści w poszukiwaniu komórki, która wykazuje zarówno CFP, jak i odtworzoną fluorescencję YFP emanującą z interakcji BiFC między dwoma białkami M. Użyj tych samych długości fal laserowych i emisyjnych, które były używane wcześniej.
    3. Następnie wyłącz laser 514 nm i przejdź do konsoli FLIM.
      UWAGA: Jeśli dimer M-YFP wchodzi w interakcję z C-CFP, powinno nastąpić skrócenie czasu życia C-CFP, jak zaobserwowano podczas jego interakcji z M-YFP. Jeśli jednak C-CFP nie wchodzi w interakcję ze dimerem M-YFP, jego czas trwania fluorescencji powinien pozostać na poziomie 3,2 ns.
    4. Korzystając z podobnych ustawień, jak wspomniano powyżej, zmierz czas życia CFP w obecności odtworzonego YFP. Dopasuj wykres uzyskany przy użyciu modelu rekonwolucji n-wykładniczej, gdzie n = 2, i przejdź do konsoli FRET.
      UWAGA: Nastąpił spadek czasu życia CFP z 3,2 do 2,3 ns. Oblicz wydajność FRET zgodnie z powyższym opisem. Obliczona sprawność FRET wynosi 55%. Skrócenie czasu życia dawcy i dobra wydajność FRET wynosząca 55% potwierdza trójstronne oddziaływanie między dwoma białkami M a białkiem C in vivo (patrz Rysunek 5B).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół reprezentuje zoptymalizowaną metodę badania in vivo trójstronnych interakcji białko-białko u roślin. Podstawową zasadą protokołu jest połączenie dwóch technik interakcji białek znakowanych fluorescencją, tj. BiFC i FRET, w celu stworzenia testu do pomiaru tworzenia się kompleksu trójskładnikowego między trzema partnerami białkowymi. W tym przypadku użyliśmy FLIM do pomiaru czasu życia fluorescencji partnera dawcy FRET w obecności i bez akceptora FRET. Spodziewano się skrócenia czasu życia fluorescen...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy protokół demonstruje zastosowanie testu FRET-FLIM opartego na BiFC w celu ustalenia tworzenia trójskładnikowego kompleksu między dwoma monomerami białka MADS-box i białkiem czujnika wapnia. Protokół jest adaptacją raportu Y. John Shyu i wsp., w którym opracowali oni metodę FRET opartą na BiFC do wizualizacji trójskładnikowego kompleksu utworzonego między heterodimerami Fos-Jun a NFAT lub p65 przy użyciu metody emisji uczulonej7. Wcześniej, w roku 2004-29, Galperin i jego współpracownicy ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NB, GG, SB, KC serdecznie dziękujemy Komisji ds. Grantów Uniwersyteckich (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE oraz Radzie Badań Naukowych i Przemysłowych (CSIR) za ich stypendia badawcze. Dziękujemy Departamentowi Biotechnologii (DBT), Rządowi Indii, Departamentowi Nauki i Technologii (DST-FIST), Rządowi Indii za wsparcie finansowe.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Strzykawki 1 ml bez igiełDispovan -
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406
Gateway  LR Clonase II Mieszanka enzymówThermo Fischer Scientific11791020Wektory użyte w badaniu to
siarczan gentamycynyHimediaCMS461
siarczan kanamycyny,HimediaMB105
hydrat MESSigma-AldrichM2933
MgCl2Sigma-AldrichM2670
pENTR/D-TOPO Zestaw do klonowaniaThermo Fischer ScientificK240020Wektory użyte w badaniu to Oparta na bramce
Phusion polimeraza DNA Taq o wysokiej wiernościThermo Fischer ScientificF530-SDowolna polimeraza o wysokiej wierności może działać
RyfampicynaHimediaCMS1889
SP8 FALCON Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyLeicaSP8 FALCONMożna do tego użyć dowolnego CLSM z możliwościami FLIM analiza
Spektynomycyna dichlorowodorek pentahydratHimediaTC034
na bazie bramy, , , , ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grove, C. A., Walhout, A. J. M. Transcription factor functionality and transcription regulatory networks. Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).
  2. Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors. Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).
  3. Arora, R., et al. MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress. BMC Genomics. 8 (242), (2007).
  4. Theißen, G., Gramzow, L. Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors. Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).
  5. Schweiger, R., Schwenkert, S. Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).
  6. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  7. Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).
  8. Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. Combined bimolecular fluorescence complementation and förster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells. Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).
  9. Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
  10. Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1(2020).
  11. Long, Y., et al. Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots. Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).
  12. Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants. Frontiers in Plant Science. , 11(2020).
  13. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  14. Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).
  15. Kodama, Y., Hu, C. D. An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio. BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).
  16. Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives. BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
  17. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
  18. Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).
  19. Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).
  20. Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).
  21. Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins. Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).
  22. Xie, X., et al. Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system. Nature Protocols. 16, (2021).
  23. Xu, J., et al. Optimized plasmid construction strategy for Cas9. Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).
  24. Mattanovich, D., et al. Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747(1989).
  25. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).
  26. Tramier, M., et al. Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells. Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).
  27. Alvarez, L. A. J., et al. SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM. Nature Methods. 20, 2-4 (2019).
  28. Postma, M., Goedhart, J. Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries. PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).
  29. Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells. Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).
  30. Waadt, R., Kudla, J. In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MADS box Transcription FactorProtein protein InteractionsTripartite InteractionCalcium Sensor ProteinBiFC FRET FLIM AssayFluorescence Lifetime MeasurementsHomodimerizeSplit YFP ProteinsFRET AcceptorFRET DonorPCR AmplificationNicotiana BenthamianaAgrobacterium GV3101AgroinfiltrationSoil Mix Preparation