Ilościowa ocena makropinocytozy w komórkach nadpobudliwych mTORC1 za pomocą cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych narzędzi do oceny makropinocytarnego pobierania składników odżywczych (węglowodanów i białka) przez komórki nadpobudliwe mTORC1. Opisano szczegółowe kroki ilościowego określania wychwytu znakowanego fluorescencyjnie dekstranu i albuminy surowicy bydlęcej (BSA).

Streszczenie

Makropinocytoza to wysoce konserwatywny, zależny od aktyny proces endocytarny, który umożliwia pobieranie materiału zewnątrzkomórkowego, w tym białek i lipidów. W proliferujących komórkach makropinocytoza może dostarczać zewnątrzkomórkowe składniki odżywcze do lizosomu, przetwarzane na krytyczne bloki budulcowe makrocząsteczek. Ostatnie badania wykazały zależność wielu nowotworów od makropinocytozy, w tym raka piersi, jelita grubego i trzustki. Uważa się, że mutacje Ras są zdarzeniami napędzającymi inicjację makropinocytozy, prowadzącą do aktywacji komórkowych procesów anabolicznych poprzez szlak sygnałowy mTORC1. Co ciekawe, mTORC1 może być również aktywowany przez makropinocytozę niezależnie od Ras. Dlatego makropinocytoza stanowi podatność metaboliczną, którą można wykorzystać do zwalczania guzów makropinocytarnych poprzez terapeutyczne ograniczenie ich dostępu do składników odżywczych.

W zespole stwardnienia guzowatego (TSC) i limfangioleiomiomatozie (LAM), hiperaktywacja mTORC1 prowadzi do zwiększenia makropinocytozy i przeprogramowania metabolicznego. W tym miejscu opisujemy protokół oparty na cytometrii przepływowej do ilościowej oceny makropinocytozy w komórkach ssaków. Stosuje się MEF z niedoborem TSC2, które wykazują nieprawidłową aktywację mTORC1 i wykazano, że mają zwiększoną makropinocytozę w porównaniu z komórkami wykazującymi ekspresję TSC2. Komórki leczone farmakologicznymi inhibitorami makropinocytozy inkubuje się z znakowaną fluorescencyjnie, utrwalaną lizyną dektranem o masie 70 kDa lub znakowaną fluorescencyjnie albuminą surowicy bydlęcej (BSA) oznaczaną metodą cytometrii przepływowej. Do tej pory opracowano solidne techniki obrazowe do ilościowej oceny makropinocytozy w komórkach nowotworowych in vitro i in vivo. Analiza ta zapewnia ilościową ocenę makropinocytozy w wielu warunkach eksperymentalnych i uzupełnia istniejące techniki obrazowe.

Wprowadzenie

Makropinocytoza jest procesem endocytycznym służącym do masowego pobierania materiału z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, po którym następuje tworzenie makropinozomów, które są następnie recyklingowane do błony komórkowej lub łączą się z lizosomami w celu degradacji zinternalizowanego ładunku^1,2. Choć pobieranie ładunku jest nieselektywne, makropinocytoza jest procesem wieloetapowym, ściśle regulowanym przez GTPazy Rab i fosfolipidy błonowe^3,4. Warto zauważyć, że komórki nowotworowe wykorzystują makropinocytozę do internalizacji składników odżywczych z zewnątrz, w tym białek, polisacharydów i lipidów. Makropinocytoza w komórkach nowotworowych jest aktywowana przez onkogeny działające poniżej Ras lub v-Src jako mechanizm wspierający ich proliferację, szczególnie w warunkach stresu żywieniowego^5,6. W związku z tym makropinocytoza stanowi nową strategię terapeutyczną ukierunkowaną na komórki nowotworowe poprzez zaburzanie szlaków pobierania składników odżywczych^7,8.

W kompleksie utrudnienia twardzinowego (TSC) oraz limfangioleiomiomatozie (LAM) mutacje utraty funkcji w genach TSC1 lub TSC2 prowadzą do nadaktywacji kompleksu 1 kinazy mTOR (mTORC1) ssaków/mechanistycznej ⁹. Wiadomo, że aberracyjna aktywacja mTORC1 napędza rozległe przeprogramowanie metaboliczne, w tym pobieranie i wykorzystywanie glukozy oraz glutaminy, zwiększoną syntezę kwasów nukleowych, syntezę lipidów oraz autofagię^10,11. Aby zrekompensować te zwiększone zapotrzebowania anaboliczne, komórki z nadaktywnym mTORC1 zwiększają pobieranie egzogennych składników odżywczych poprzez makropinocytozę i nasilają lizosomalną degradację zinternalizowanego ładunku¹². W niedawnej pracy zidentyfikowaliśmy ritanserin, inhibitor kinazy DGK-alfa (DGKA), jako czynnik selektywnie hamujący proliferację komórek z niedoborem TSC2¹³. DGKA jest kinazą lipidową, która metabolizuje diacyloglicerol do kwasu fosfatydowego (PA)¹⁴. PA jest kluczową cząsteczką wtórnego przekaźnika, która odgrywa również istotną rolę w utrzymaniu homeostazy błony komórkowej. Co zaskakujące, ritanserin silnie hamuje makropinocytozę poprzez przeprogramowanie metabolizmu fosfolipidów w komórkach z niedoborem TSC2. Zatem celowanie w szlak pobierania składników odżywczych poprzez makropinocytozę w komórkach z niedoborem TSC2 może dostarczyć nowych podejść terapeutycznych w TSC i LAM.

Ilościowe oznaczenie wychwytu makropinocytycznego in vitro oraz in vivo może dostarczyć kluczowych informacji na temat regulacji tworzenia makropinosomów i przyspieszyć odkrywanie mechanizmów molekularnych, identyfikując jednocześnie nowe podejścia terapeutyczne^2,6. Do tej pory opracowano wiele metodologii pozwalających na odpowiednie ilościowe oznaczenie wychwytu makropinocytycznego fluorescencyjnego dekstranu zarówno in vitro, jak i in vivo^2,15. W niniejszej pracy opisujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do bezpośredniej oceny ilości zinternalizowanego dekstranu i albuminy w komórkach z nadaktywnym kompleksem mTORC1 (Rysunek 1). Metoda ta może być wykorzystana do równoległej analizy wielu warunków doświadczalnych i stanowi uzupełnienie istniejących podejść opartych na obrazowaniu.

Rycina 1. Schemat oceny makropinocytozy w komórkach ssaków. Komórki wysiewa się na płytki sześciodołkowe, a następnie traktuje badanymi związkami. Dodaje się fluorescencyjny dekstran lub BSA na 60 min, a proces poboru hamuje się poprzez przemycie lodowatym PBS. Komórki utrwala się za pomocą paraformaldehydu, a intensywność fluorescencji określa się metodą cytometrii przepływowej. Wykonuje się bramkowanie komórek, a dane analizuje się przy użyciu odpowiedniego oprogramowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Protokół

1. Leczenie komórkowe

Dzień 1

1. Mysie fibroblasty zarodkowe (MEF) z niedoborem TSC2 i ekspresją TSC2 w trzech powtórzeniach, w każdym dołku sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej przy użyciu DMEM, uzupełnione 10% FBS. Komórki powinny być zlewane w 60-70% do 3 dnia.
   1. Wysiewać dodatkowe studzienki kontrolne dla każdego stanu leku, który nie będzie barwiony FITC-Dekstranem lub TMR-BSA.

Dzień 2

2. Ostrożnie zassać pożywkę i dwukrotnie przepłukać komórki PBS w temperaturze pokojowej.
   1. Potraktuj komórki nośnikiem (DMSO), 100 μM kwasu fosfatydowego (PA), 25 μM EIPA, 10 μM rytanseryny lub kombinacją PA i rytanseryny. Stosować DMEM uzupełniony o 1% FBS.
      UWAGA: Objętość DMSO powinna być równa maksymalnej objętości rozpuszczalnika stosowanego w warunkach leczenia. Na przykład, jeśli stosuje się 10 μl EIPA, objętość DMSO w warunkach pojazdu powinna również wynosić 10 μl.

Dzień 3

3. Zastąp pożywkę bezsurowicowym DMEM zawierającym wyżej wymienione leki i 0,5 mg/ml FITC-Dekstranu lub 0,5 mg/ml TMR-BSA 16 godzin po leczeniu. Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C/5% CO₂ przez 60 min.
   UWAGA: Aby zminimalizować fotowybielanie fluoroforów, probówki FITC-Dextran i TMR-BSA należy owinąć folią aluminiową, a eksperyment przeprowadzić w komorze do hodowli komórkowych przy wyłączonym świetle.
4. Odessać podłoże i dwukrotnie przemyć lodowatym PBS.
   1. Odłącz komórki za pomocą 500 μl trypsyny. Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C/5% CO₂ przez 2-3 minuty
      UWAGA: Upewnij się, że wszystkie komórki są odłączone, obserwując je pod mikroskopem jasnego pola.
   2. Za każdym razem, używając czystej końcówki do pipety, zbieraj komórki w probówkach o pojemności 1,5 ml, używając 1% DMEM uzupełnionego FBS na lodzie.
   3. Komórki osadu przez odwirowanie w temperaturze 425 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
   4. Odessać supernatant.
5. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 50 μl 2% paraformaldehydu.
   UWAGA: Paraformaldehyd jest wysoce toksyczny i powinien być przenoszony pod odpowiednim wyciągiem. Odpady zawierające formaldehyd należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
   1. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
   2. Dodaj 1 ml lodowatego PBS do każdej probówki i delikatnie zawieś osad komórkowy. Umieść probówki na lodzie.
6. Odwirować komórki przy 425 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
7. Odessać supernatant.
   1. Zawiesić osad komórkowy w 300 μl lodowatego PBS.
   2. Przenieś komórki do odpowiednich probówek FACS na lodzie.
   3. Kontynuuj cytometrię przepływową.

2. Cytometria przepływowa

1. Krótko zawirować komórki przed włożeniem ich do uchwytu na próbkę FACS.
2. Korzystając z przepływu o niskiej prędkości, bramkują żywe komórki z każdej niebarwionej próbki (kontrola ujemna) za pomocą odpowiedniej mocy lasera, jak widać na Rysunek 2A. Ten krok różni się w zależności od instrumentu i będzie musiał być zoptymalizowany dla każdego eksperymentu. Dostosuj moc zarówno dla rozproszenia do przodu (FSC), jak i rozproszenia bocznego (SSC), tak aby żywe komórki różniły się od zanieczyszczeń lub klastrów komórek.
3. Korzystając z funkcji automatycznej bramki, wybierz żywe populacje komórek dla każdej próbki, unikając resztek komórek i klastrów komórek.
   UWAGA: Wszystkie zdarzenia komórkowe (niezależnie od bramkowania) są ostatecznie rejestrowane przez cytometr. Dlatego wybór bramy na tym etapie nie jest krytyczny.
4. Zarejestrować intensywność fluorescencji z każdej próbki za pomocą odpowiednich zielonych lub czerwonych laserów.

3. Analiza cytometrii przepływowej

1. Bramki komórkowe wykorzystujące parametry rozproszenia do przodu i boku. Zastosuj tę samą bramkę do wszystkich próbek.
2. Utwórz histogramy dla fluorescencji w każdej próbce, jak w Rysunek 2B.
3. W obrębie każdej bramki komórkowej należy obliczyć średnią/medianę intensywności fluorescencji dla wszystkich próbek.
4. Eksport danych do odpowiedniej analizy statystycznej.
   UWAGA: Podczas analizy danych średnia/mediana intensywności fluorescencji każdej próbki powinna zostać znormalizowana poprzez odjęcie wartości próbki niebarwionej.

Wyniki

Ritanseryna hamuje makropinocytozę w TSC2komórki z niedoborem
Wykazaliśmy wcześniej, że pobieranie składników odżywczych drogą makropinocytozy wzrasta trzykrotnie w TSC2komórki z niedoborem [czegoś] w porównaniu do TSC2komórki wykazujące ekspresję¹⁶W przypadku TSC i LAM makropinocytoza jest zapśredniczona przez kinazę diacyloglicerolową alfa (DGKA). Produktem metabolicznym DGKA jest kwas fosfatydowy (PA), który stano...

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy ilościowe podejście do oceny makropinocytozy za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta zapewnia dokładny i szybki pomiar znakowanego fluorescencyjnie makropinocytarnego dekstranu ładunkowego i albuminy. Wcześniejsze badania dokładnie scharakteryzowały indeks makropinocytarny komórek nowotworowych przy użyciu metod mikroskopii konfokalnej^15,20. Chociaż metody te dokładnie określają ilościowo internalizację, rozmiar i rozkład przestrzenny...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Gibco	11965-092	Pożywka wzrostowa
EIPA (amiloryd)	Sigma Aldrich	A3085	Inhibitor makropinocytozy
FBS	R& D Systems	S11150	Płodowa surowica bydlęca
FITC-Dekstran	Invitrogen	D1822	Fluorescencyjny polisacharyd (70kDa)
Parafolmadehyd	Pierce	28906	Środek utrwalający
PBS	Gibco	10010-023	Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna
Penicilina / Streptomycyna	Sigma Aldrich	P4458-100ML	Antybiotyki
do hodowli komórkowychKwas fosfatydowy	Avanti	840101P	Fosfolipid pochodzący z jaj
Ritanserin	Tocris	1955	Inhibitor DGKA
TMR-BSA	Invitrogen	A23016	Albumina fluorescencyjna
Trypsyna	Sigma Aldrich	25300-054	Środek dysocjacyjny