Artykuł metodologiczny

Ilościowa ocena makropinocytozy w komórkach nadpobudliwych mTORC1 za pomocą cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/62793

⸱

2 sierpnia 2021

 , 
1Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, 2Metcalf Science Center, Chemistry Department, Boston University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych narzędzi do oceny makropinocytarnego pobierania składników odżywczych (węglowodanów i białka) przez komórki nadpobudliwe mTORC1. Opisano szczegółowe kroki ilościowego określania wychwytu znakowanego fluorescencyjnie dekstranu i albuminy surowicy bydlęcej (BSA).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makropinocytoza to wysoce konserwatywny, zależny od aktyny proces endocytarny, który umożliwia pobieranie materiału zewnątrzkomórkowego, w tym białek i lipidów. W proliferujących komórkach makropinocytoza może dostarczać zewnątrzkomórkowe składniki odżywcze do lizosomu, przetwarzane na krytyczne bloki budulcowe makrocząsteczek. Ostatnie badania wykazały zależność wielu nowotworów od makropinocytozy, w tym raka piersi, jelita grubego i trzustki. Uważa się, że mutacje Ras są zdarzeniami napędzającymi inicjację makropinocytozy, prowadzącą do aktywacji komórkowych procesów anabolicznych poprzez szlak sygnałowy mTORC1. Co ciekawe, mTORC1 może być również aktywowany przez makropinocytozę niezależnie od Ras. Dlatego makropinocytoza stanowi podatność metaboliczną, którą można wykorzystać do zwalczania guzów makropinocytarnych poprzez terapeutyczne ograniczenie ich dostępu do składników odżywczych.

W zespole stwardnienia guzowatego (TSC) i limfangioleiomiomatozie (LAM), hiperaktywacja mTORC1 prowadzi do zwiększenia makropinocytozy i przeprogramowania metabolicznego. W tym miejscu opisujemy protokół oparty na cytometrii przepływowej do ilościowej oceny makropinocytozy w komórkach ssaków. Stosuje się MEF z niedoborem TSC2, które wykazują nieprawidłową aktywację mTORC1 i wykazano, że mają zwiększoną makropinocytozę w porównaniu z komórkami wykazującymi ekspresję TSC2. Komórki leczone farmakologicznymi inhibitorami makropinocytozy inkubuje się z znakowaną fluorescencyjnie, utrwalaną lizyną dektranem o masie 70 kDa lub znakowaną fluorescencyjnie albuminą surowicy bydlęcej (BSA) oznaczaną metodą cytometrii przepływowej. Do tej pory opracowano solidne techniki obrazowe do ilościowej oceny makropinocytozy w komórkach nowotworowych in vitro i in vivo. Analiza ta zapewnia ilościową ocenę makropinocytozy w wielu warunkach eksperymentalnych i uzupełnia istniejące techniki obrazowe.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makropinocytoza to proces endocytarny poświęcony masowemu pobieraniu materiału zewnątrzkomórkowego, po którym następuje tworzenie makropinosomów, które są albo zawracane do błony plazmatycznej, albo łączone z lizosomami w celu degradacji zinternalizowanego ładunku1,2. Chociaż pobieranie ładunku jest nieselektywne, makropinocytoza jest procesem wieloetapowym, ściśle regulowanym przez GTPazy Rab i fosfolipidy błonowe3,4. Warto zauważyć, że komórki rakowe wykorzystują makropinocytozę do internalizacji zewnątrzkomórkowych składników odżywczych, w tym białek, polisacharydów i lipidów. Makropinocytoza w komórkach nowotworowych jest aktywowana przez onkogeny znajdujące się za Ras lub v-Src jako mechanizm wspierający ich proliferację, szczególnie w warunkach stresu związanego ze składnikami odżywczymi5,6. Dlatego makropinocytoza stanowi nowe podejście terapeutyczne do celowania w komórki nowotworowe poprzez zakłócanie szlaków pobierania składników odżywczych7,8.

W kompleksie stwardnienia guzowatego (TSC) i limfangioleomiomatozie (LAM), mutacje powodujące utratę funkcji w TSC1 lub TSC2 prowadzą do hiperaktywacji ssaczo-mechanistycznego celu kompleksu rapamycyny 1 (mTORC1)9. Wiadomo, że nieprawidłowa aktywacja mTORC1 napędza rozległe przeprogramowanie metaboliczne, w tym wychwyt i wykorzystanie glukozy i glutaminy, zwiększoną syntezę kwasów nukleinowych, syntezę lipidów i autofagię10,11. Aby zrekompensować te zwiększone zapotrzebowanie anaboliczne, komórki nadpobudliwe mTORC1 zwiększają wychwyt egzogennych składników odżywczych poprzez makropinocytozę i zwiększają lizosomalną degradację zinternalizowanego ładunku12. W ostatnich pracach zidentyfikowaliśmy rytanserynę, inhibitor kinazy diacyloglicerolu alfa (DGKA) jako środek, który selektywnie hamuje proliferację komórek z niedoborem TSC213. DGKA to kinaza lipidowa, która metabolizuje diacyloglicerol do kwasu fosfatydowego (PA)14. PA jest kluczową drugą cząsteczką przekaźnikową, która odgrywa również istotną rolę w utrzymaniu homeostazy błony komórkowej. Co zaskakujące, rytanseryna silnie hamuje makropinocytozę poprzez przeprogramowanie metabolizmu fosfolipidów w komórkach z niedoborem TSC2. W związku z tym ukierunkowanie na szlak wchłaniania składników odżywczych makropinocytozy w komórkach z niedoborem TSC2 może zapewnić nowe podejścia terapeutyczne w TSC i LAM.

Kwantyfikacja wychwytu makropinocytów in vitro i in vivo może dostarczyć kluczowych informacji na temat regulacji powstawania makropinosomów i przyspieszyć odkrycie mechanizmów molekularnych, jednocześnie identyfikując nowe podejścia terapeutyczne2,6. Do tej pory opracowano wiele metodologii, które odpowiednio określają ilościowo makropinocytarny wychwyt fluorescencyjnego dekstranu zarówno in vitro, jak i in vivo2,15. Tutaj opisujemy podejście oparte na cytometrii przepływowej do bezpośredniej oceny ilości zinternalizowanego dekstranu i albuminy w komórkach nadpobudliwych mTORC1 (Rysunek 1). Metoda ta może być wykorzystana do równoległej analizy wielu warunków eksperymentalnych i uzupełnia istniejące podejścia oparte na obrazie.

figure-introduction-1
Rysunek 1. Przebieg pracy do oceny makropinocytozy w komórkach ssaków. Komórki wysiewa się na płytkach sześciodołkowych, a następnie traktuje związkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Dekstran fluorescencyjny lub BSA dodaje się na 60 minut, a wchłanianie jest hamowane przez przemywanie lodowatym PBS. Komórki są utrwalane za pomocą paraformaldehydu, a intensywność fluorescencji określa się ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki są bramkowane, a dane analizowane są za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Leczenie komórkowe

Dzień 1

  1. Mysie fibroblasty zarodkowe (MEF) z niedoborem TSC2 i ekspresją TSC2 w trzech powtórzeniach, w każdym dołku sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej przy użyciu DMEM, uzupełnione 10% FBS. Komórki powinny być zlewane w 60-70% do 3 dnia.
    1. Wysiewać dodatkowe studzienki kontrolne dla każdego stanu leku, który nie będzie barwiony FITC-Dekstranem lub TMR-BSA.

Dzień 2

  1. Ostrożnie zassać pożywkę i dwukrotnie przepłukać komórki PBS w temperaturze pokojowej.
    1. Potraktuj komórki nośnikiem (DMSO), 100 μM kwasu fosfatydowego (PA), 25 μM EIPA, 10 μM rytanseryny lub kombinacją PA i rytanseryny. Stosować DMEM uzupełniony o 1% FBS.
      UWAGA: Objętość DMSO powinna być równa maksymalnej objętości rozpuszczalnika stosowanego w warunkach leczenia. Na przykład, jeśli stosuje się 10 μl EIPA, objętość DMSO w warunkach pojazdu powinna również wynosić 10 μl.

Dzień 3

  1. Zastąp pożywkę bezsurowicowym DMEM zawierającym wyżej wymienione leki i 0,5 mg/ml FITC-Dekstranu lub 0,5 mg/ml TMR-BSA 16 godzin po leczeniu. Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 60 min.
    UWAGA: Aby zminimalizować fotowybielanie fluoroforów, probówki FITC-Dextran i TMR-BSA należy owinąć folią aluminiową, a eksperyment przeprowadzić w komorze do hodowli komórkowych przy wyłączonym świetle.
  2. Odessać podłoże i dwukrotnie przemyć lodowatym PBS.
    1. Odłącz komórki za pomocą 500 μl trypsyny. Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 2-3 minuty
      UWAGA: Upewnij się, że wszystkie komórki są odłączone, obserwując je pod mikroskopem jasnego pola.
    2. Za każdym razem, używając czystej końcówki do pipety, zbieraj komórki w probówkach o pojemności 1,5 ml, używając 1% DMEM uzupełnionego FBS na lodzie.
    3. Komórki osadu przez odwirowanie w temperaturze 425 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
    4. Odessać supernatant.
  3. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 50 μl 2% paraformaldehydu.
    UWAGA: Paraformaldehyd jest wysoce toksyczny i powinien być przenoszony pod odpowiednim wyciągiem. Odpady zawierające formaldehyd należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
    1. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    2. Dodaj 1 ml lodowatego PBS do każdej probówki i delikatnie zawieś osad komórkowy. Umieść probówki na lodzie.
  4. Odwirować komórki przy 425 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
  5. Odessać supernatant.
    1. Zawiesić osad komórkowy w 300 μl lodowatego PBS.
    2. Przenieś komórki do odpowiednich probówek FACS na lodzie.
    3. Kontynuuj cytometrię przepływową.

2. Cytometria przepływowa

  1. Krótko zawirować komórki przed włożeniem ich do uchwytu na próbkę FACS.
  2. Korzystając z przepływu o niskiej prędkości, bramkują żywe komórki z każdej niebarwionej próbki (kontrola ujemna) za pomocą odpowiedniej mocy lasera, jak widać na Rysunek 2A. Ten krok różni się w zależności od instrumentu i będzie musiał być zoptymalizowany dla każdego eksperymentu. Dostosuj moc zarówno dla rozproszenia do przodu (FSC), jak i rozproszenia bocznego (SSC), tak aby żywe komórki różniły się od zanieczyszczeń lub klastrów komórek.
  3. Korzystając z funkcji automatycznej bramki, wybierz żywe populacje komórek dla każdej próbki, unikając resztek komórek i klastrów komórek.
    UWAGA: Wszystkie zdarzenia komórkowe (niezależnie od bramkowania) są ostatecznie rejestrowane przez cytometr. Dlatego wybór bramy na tym etapie nie jest krytyczny.
  4. Zarejestrować intensywność fluorescencji z każdej próbki za pomocą odpowiednich zielonych lub czerwonych laserów.

3. Analiza cytometrii przepływowej

  1. Bramki komórkowe wykorzystujące parametry rozproszenia do przodu i boku. Zastosuj tę samą bramkę do wszystkich próbek.
  2. Utwórz histogramy dla fluorescencji w każdej próbce, jak w Rysunek 2B.
  3. W obrębie każdej bramki komórkowej należy obliczyć średnią/medianę intensywności fluorescencji dla wszystkich próbek.
  4. Eksport danych do odpowiedniej analizy statystycznej.
    UWAGA: Podczas analizy danych średnia/mediana intensywności fluorescencji każdej próbki powinna zostać znormalizowana poprzez odjęcie wartości próbki niebarwionej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ritanserin hamuje makropinocytozę w komórkach z niedoborem TSC2
Wcześniej wykazaliśmy, że wychwyt makropinocytarów składników odżywczych jest trzykrotnie zwiększony w komórkach z niedoborem TSC2 w porównaniu z komórkami wykazującymi ekspresję TSC216. W TSC i LAM w makropinocytozie pośredniczy kinaza diacyloglicerolowa alfa (DGKA). Produktem przemiany materii DGKA jest kwas fosfatydowy (PA), kluczowy składnik błon kom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy ilościowe podejście do oceny makropinocytozy za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta zapewnia dokładny i szybki pomiar znakowanego fluorescencyjnie makropinocytarnego dekstranu ładunkowego i albuminy. Wcześniejsze badania dokładnie scharakteryzowały indeks makropinocytarny komórek nowotworowych przy użyciu metod mikroskopii konfokalnej15,20. Chociaż metody te dokładnie określają ilościowo internalizację, rozmiar i rozkład przestrzenny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nagroda za rozwój kariery Fundacji LAM. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com. Krytycznej lektury dokonał Hilaire C. Lam.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMGibco11965-092Pożywka wzrostowa
EIPA (amiloryd)Sigma AldrichA3085Inhibitor makropinocytozy
FBSR& D SystemsS11150Płodowa surowica bydlęca
FITC-DekstranInvitrogenD1822Fluorescencyjny polisacharyd (70kDa)
ParafolmadehydPierce28906Środek utrwalający
PBSGibco10010-023Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna
Penicilina / StreptomycynaSigma AldrichP4458-100MLAntybiotyki
do hodowli komórkowychKwas fosfatydowyAvanti840101PFosfolipid pochodzący z jaj
RitanserinTocris1955Inhibitor DGKA
TMR-BSAInvitrogenA23016Albumina fluorescencyjna
TrypsynaSigma Aldrich25300-054Środek dysocjacyjny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yoshida, S., Pacitto, R., Inoki, K., Swanson, J. Macropinocytosis, mTORC1 and cellular growth control. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (7), 1227-1239 (2018).
  2. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
  3. Maxson, M. E., Sarantis, H., Volchuk, A., Brumell, J. H., Grinstein, S. Rab5 regulates macropinocytosis by recruiting the inositol 5-phosphatases OCRL/Inpp5b that hydrolyze PtdIns(4,5)P2. Journal of Cell Science. , (2021).
  4. Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1712(2013).
  5. Ramirez, C., Hauser, A. D., Vucic, E. A., Bar-Sagi, D. Plasma membrane V-ATPase controls oncogenic RAS-induced macropinocytosis. Nature. 576 (7787), 477-481 (2019).
  6. Kamphorst, J. J., et al. Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein. Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).
  7. Kim, S. M., et al. Targeting cancer metabolism by simultaneously disrupting parallel nutrient access pathways. Journal of Clinical Investigation. 126 (11), 4088-4102 (2016).
  8. Selwan, E. M., Finicle, B. T., Kim, S. M., Edinger, A. L. Attacking the supply wagons to starve cancer cells to death. FEBS Letters. 590 (7), 885-907 (2016).
  9. Henske, E. P., Jozwiak, S., Kingswood, J. C., Sampson, J. R., Thiele, E. A. Tuberous sclerosis complex. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16035(2016).
  10. Duvel, K., et al. Activation of a metabolic gene regulatory network downstream of mTOR complex 1. Molecular Cell. 39 (2), 171-183 (2010).
  11. Sancak, Y., et al. The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1. Science. 320 (5882), 1496-1501 (2008).
  12. Choo, A. Y., et al. Glucose addiction of TSC null cells is caused by failed mTORC1-dependent balancing of metabolic demand with supply. Molecular Cell. 38 (4), 487-499 (2010).
  13. Kovalenko, A., et al. Therapeutic targeting of DGKA-mediated macropinocytosis leads to phospholipid reprogramming in Tuberous Sclerosis Complex. Cancer Research. , (2021).
  14. Swanson, J. A. Phorbol esters stimulate macropinocytosis and solute flow through macrophages. Journal of Cell Science. 94, Pt 1 135-142 (1989).
  15. Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).
  16. Filippakis, H., et al. Vps34-mediated macropinocytosis in Tuberous Sclerosis Complex 2-deficient cells supports tumorigenesis. Scientific Reports. 8 (1), 14161(2018).
  17. Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biol Int. 39 (5), 531-539 (2015).
  18. Jachimska, B., Wasilewska, M., Adamczyk, Z. Characterization of globular protein solutions by dynamic light scattering, electrophoretic mobility, and viscosity measurements. Langmuir. 24 (13), 6866-6872 (2008).
  19. Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87 (6), 4259-4270 (2004).
  20. Lee, S. W., Alas, B., Commisso, C. Detection and Quantification of Macropinosomes in Pancreatic Tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).
  21. Williams, T. D., Kay, R. R. The physiological regulation of macropinocytosis during Dictyostelium growth and development. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
  22. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  23. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  24. Murphy, R. F. Analysis and isolation of endocytic vesicles by flow cytometry and sorting: demonstration of three kinetically distinct compartments involved in fluid-phase endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (24), 8523-8526 (1985).
  25. Williams, T., Kay, R. R. High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (139), e58434(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ocena makropinocytozyMEF z niedoborem TSC2reprogramowanie metabolicznemutacje Raspobieranie przez kom rki nowotworowepobieranie dekstranualbumina surowicy bydl cejproces endocytozy
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły