Artykuł metodologiczny

In vitro Różnicowanie ludzkich komórek dendrytycznych i ich markerów w zakażeniu Leishmania

DOI:

10.3791/62794

⸱

6 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Host-Parasite Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki dendrytyczne (DC) są niezbędnymi składnikami wrodzonej odporności na zakażenie Leishmania. Mechanizmy leżące u podstaw złożonej interakcji między DC a Leishmania pozostają słabo poznane. W tym miejscu opisujemy metody oceny, w jaki sposób zakażenie Leishmania wpływa na funkcje immunobiologiczne ludzkich DC, takie jak ekspresja cząsteczek związana z migracją i kostymulująca.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leishmaniasis to zbiór objawów klinicznych związanych z zakażeniem obligatoryjnych wewnątrzkomórkowych pierwotniaków, Leishmania. Cykl życiowy pasożytów Leishmania składa się z dwóch naprzemiennych etapów życia (amastigotes i promastigotes), podczas których pasożyty przebywają odpowiednio w obrębie wektorów stawonogów lub kręgowców. Warto zauważyć, że złożone interakcje między pasożytami Leishmania a kilkoma komórkami układu odpornościowego w dużej mierze wpływają na wynik infekcji. Co ważne, chociaż wiadomo, że makrofagi są główną niszą żywicielską dla replikacji Leishmania, pasożyty są również fagocytozowane przez inne wrodzone komórki odpornościowe, takie jak neutrofile i komórki dendrytyczne (DC).

DC odgrywają główną rolę w łączeniu wrodzonych i adaptacyjnych gałęzi odporności, a tym samym organizują odpowiedzi immunologiczne przeciwko szerokiej gamie patogenów. Mechanizmy, za pomocą których Leishmania i DC oddziałują na siebie, pozostają niejasne i obejmują aspekty wychwytywania patogenów, dynamiki dojrzewania i aktywacji DC, migracji DC do drenujących węzłów chłonnych (dLNs) oraz prezentacji antygenu limfocytom T. Chociaż duża liczba badań potwierdza pogląd, że DC odgrywają podwójną rolę w modulowaniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko Leishmania, udział tych komórek w podatności lub oporności na Leishmania pozostaje słabo poznany. Po zakażeniu DC przechodzą proces dojrzewania związany z regulacją w górę powierzchniowego głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) II, oprócz cząsteczek kostymulujących (a mianowicie CD40, CD80 i CD86).

Zrozumienie roli DC w wyniku infekcji jest kluczowe dla opracowania strategii terapeutycznych i profilaktycznych modulujących odpowiedź immunologiczną przeciwko Leishmania. W artykule opisano metodę charakterystyki oddziaływania Leishmania-DC. Ten szczegółowy protokół zawiera wskazówki dotyczące etapów różnicowania DC, charakterystyki cząsteczek na powierzchni komórki i protokołów infekcji, umożliwiając naukowcom zbadanie odpowiedzi DC na zakażenie Leishmania i uzyskanie wglądu w role odgrywane przez te komórki w przebiegu infekcji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leishmaniasis stanowi kompleks zaniedbanych chorób wywoływanych przez różne gatunki z rodzaju Leishmania1. Leishmania to wewnątrzkomórkowy pierwotniak z rodziny Trypanosomatidae, który zakaża ludzi i inne ssaki, powodując szereg chorób, od zmian skórnych po formy trzewne2. Głównymi objawami klinicznymi tej choroby są leiszmanioza nakrywkowa (TL) i leiszmanioza trzewna (VL). Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) szacuje, że rocznie dochodzi do 700 000 do 1 miliona nowych przypadków, powodując 70 000 zgonów każdego roku2. Na całym świecie leiszmanioza dotyka około 12 do 15 milionów ludzi, a 350 milionów jest zagrożonych zarażeniem się tą chorobą3.

Rodzaj Leishmania prezentuje dwie formy ewolucyjne: promastigote i amastigote4. Promastigoty Leishmania charakteryzują się obecnością wici i wysoką ruchliwością. Formy te znajdują się w przewodzie pokarmowym muchy piaskowej, gdzie ulegają różnicowaniu do formy zakaźnej (promastigoty metacykliczne)5. Natomiast amastigoty znajdują się w środowisku wewnątrzkomórkowym zakażonych komórek ssaków. Ta forma ewolucyjna z kolei replikuje się w fagolizosomach komórek fagocytarnych6.

Cykl transmisji Leishmania spp. rozpoczyna się podczas karmienia krwią, kiedy muszki piaskowe zaszczepiają metacykliczne promastigoty w skórze gospodarza1. Wkrótce po zaszczepieniu Leishmania wrodzone komórki odpornościowe, w tym neutrofile i makrofagi rezydujące w tkankach, fagocytują pasożyty. Wewnątrz parazytoforycznych wakuoli Leishmania różnicują się w amastigoty i replikują się, czego kulminacją jest pęknięcie błony komórkowej gospodarza, co umożliwia infekcję sąsiednich komórek i rozprzestrzenianie się pasożyta4. Cykl kończy się, gdy flebotominy połkną fagocyty zawierające amastigotę, które różnicują się w procykliczne promastigoty, a następnie w metacykliczne promastigoty w przewodzie pokarmowym owada7.

Komórki dendrytyczne, profesjonalne komórki prezentujące antygen znajdujące się w tkankach i węzłach chłonnych, pełnią rolę strażnika układu odpornościowego8. Komórki te znajdują się w tkankach obwodowych w niedojrzałych stadiach, głównie zaangażowanych w wychwytywanie i przetwarzanie antygenu. Po kontakcie z patogenami DC przechodzą proces dojrzewania, który kończy się ich migracją do węzłów chłonnych, a następnie prezentowaniem antygenów naiwnym limfocytom T CD4+. Komórki te są również niezbędne w koordynowaniu wrodzonych i adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych, które generują tolerancję lub stan zapalny9. Proces dojrzewania DC obejmuje kilka aspektów, w tym zwiększoną ekspresję MHC i cząsteczek kostymulujących, takich jak CD40 i CD86, a także zwiększone wydzielanie cytokin. DC wyrażają różne markery, w tym CD11b i CD11c, a u ludzi DC pochodzące z monocytów CD14 + (moDC) wyrażają CD1a10. CCR7 ulega silnej ekspresji na DC i wskazuje na złożony proces migracji tych komórek12. CD209 i CD80 odgrywają również ważną rolę w początkowym kontakcie z DC i limfocytami13.

W leiszmaniozie, badania sugerują, że moDC fagocytozują pasożyty i dostarczają je do węzłów chłonnych drenujących (dLN), gdzie prezentują antygeny limfocytom T13. Mechanizm wychwytywania pasożyta jest związany z reorganizacją cytoszkieletu przez włókna aktyny podczas fagocytozy, co sprzyja internalizacji pasożyta14. Większość badań dotyczących ról odgrywanych przez DC w leiszmaniozie koncentrowała się na L. major, L. amazonensis i L. braziliensis15. Co ciekawe, badania in vivo nad zakażeniem Leishmania wykazały, że upośledzenie funkcji DC występuje w sposób specyficzny dla szczepu pasożyta.

Wykazano, że we wczesnych stadiach infekcji L. amazonensis, DC wykazują zmniejszoną zdolność do ograniczania infekcji pasożytami. I odwrotnie, w eksperymentalnym modelu zakażenia L. braziliensis wykazano, że DC wywołują odpowiednie odpowiedzi immunologiczne, które ograniczały przeżycie Leishmania16. Głównymi aspektami, o których wiadomo, że są związane z różnymi reakcjami na zakażenie Leishmania spp., są stopień dojrzewania i aktywacji DC. W artykule opisano metodę badania roli ludzkich DC w zakażeniu Leishmania, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób komórki te wpływają na wyniki choroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Komórki uzyskano od zdrowych ochotników-dawców. Procedura opisana w niniejszym dokumencie została zatwierdzona przez Krajową Komisję Etyki (numer 2.751.345) – Fiocruz, Bahia, Brazylia).

1. Różnicowanie ludzkich komórek dendrytycznych

  1. Odpipetować 10 ml mieszaniny triazoinianu polisarozy i sodu w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml.
  2. Oznacz stożkowe probówki o pojemności 50 ml odpowiednio dla każdego dawcy.
  3. Zbierz 30 ml krwi od zdrowych dawców i wykonaj wszystkie kolejne kroki w okapie z przepływem laminarnym.
  4. Ostrożnie przenieś krew do stożkowych probówek i rozcieńcz krew w roztworze soli fizjologicznej (0,9% chlorku sodu) w stosunku 1:1 w temperaturze pokojowej.
  5. Nałożyć powoli rozcieńczoną krew na mieszaninę polisacharozy i triazoinianu sodu w probówkach (krok 1.1). Odwirować probówki raz w temperaturze 400 × g przez 30 minut w temperaturze 25 °C.
    UWAGA: Wyłącz hamulec przed wirowaniem, aby zapobiec mieszaniu się warstw gradientu. Po pierwszym odwirowaniu obniżyć temperaturę w wirówce do 4 °C.
  6. Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki.
  7. Poszukać pierścienia utworzonego przez komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) w próbce (kożuch); ostrożnie odessać resztki osocza za pomocą pipety.
    UWAGA: Wirowanie prowadzi do powstania następujących warstw gradientowych: erytrocytów, podłoża gradientu gęstości, pierścienia PBMC i osocza. Pierścień PBMC znajduje się pomiędzy ośrodkiem gradientu gęstości a warstwami plazmy.
  8. Przenieś mętną warstwę PBMC do innej probówki i dodaj sól fizjologiczną do końcowej objętości 30 ml.
  9. Odwirować probówki zawierające zawiesiny komórek o stężeniu 250 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i dodać 1 ml soli fizjologicznej w celu ponownego zawieszenia osadu.
  10. Zbierz porcję do zliczania komórek i rozcieńcz ją w stosunku 1:1 000. Użyć 10 μl rozcieńczonych komórek do policzenia komórek metodą wykluczania błękitu trypanowego przy użyciu komory Neubauera w celu określenia żywotności komórek.
  11. Ponownie obracać zawiesinę w temperaturze 200 × g przez 10 minut w temperaturze poniżej 4 °C.
  12. Ponownie zawiesić osad w buforze do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS). Użyć 80 μl buforu na 1 × 107 komórek.
    UWAGA: Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze składem bufora MACS. Przechowywać bufor w chłodnym miejscu i przechowywać w temperaturze 2-8 °C.
  13. Dodaj mikrogranulki CD14 do zawiesiny komórek przygotowanej w kroku 1.9. Użyj 20 μl mikrogranulek CD14 na 1 × 107 komórek.
    UWAGA: Mikrogranulki CD14 są używane do pozytywnej selekcji ludzkich monocytów z PBMC, ponieważ kulki zawierające ludzki anty-CD14 wiążą się z komórkami CD14 + ulegającymi ekspresji na powierzchni większości monocytów.
  14. Pipetować w górę i w dół, aby równomiernie zawiesić granulki i mikrogranulki. Trzymaj na lodzie przez 15 minut.
  15. Odwirować zawiesinę o stężeniu 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  16. Ponownie zawieś komórki w buforze MACS. Użyj 1-2 ml na 1 × 107 komórek w mieszaninie komórkowo-mikrokulkowej.
  17. Odwirować zawiesinę o stężeniu 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  18. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu MACS.
    UWAGA: Jest to maksymalna objętość zawiesiny komórek, która może być przetworzona w jednej kolumnie.
  19. Zamontuj kolumnę magnetyczną.
  20. Przemyć kolumnę raz 500 μl buforu MACS i pozwolić buforowi przepływać pod wpływem grawitacji przez kolumnę.
    UWAGA: Uważaj, aby nie dopuścić do wyschnięcia kolumny, ponieważ powietrze może ją zatkać.
  21. Dodać 500 μl zawiesiny kulek komórkowych (krok 1.19) na kolumnę. Pozwól, aby zawiesina komórek przepływała pod wpływem grawitacji przez kolumnę.
  22. Przemyć kolumnę 500 μl buforu MACS (2x). Dodaj nowy bufor tylko wtedy, gdy zbiornik kolumny jest pusty. Nie pozwól, aby kolumna wyschła.
  23. Umieścić nową probówkę pod kolumną, odpipetować 1 ml buforu MACS na kolumnę i natychmiast wypłukać magnetycznie znakowane komórki z kolumny, mocno naciskając tłok.
  24. Odwirować komórki wzbogacone w CD14 w temperaturze 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  25. Policz komórki za pomocą komory Neubauera.
  26. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pełnego RPMI ze 100 μl / ml interleukiny-4 (IL-4) ( (50 ng / ml) + czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) (50 ng / ml).
  27. Komórki nasienne na 24-dołkowej płytce o stężeniu 2 × 105 komórek na basenik w 500 μl kompletnej pożywki RPMI zawierającej powyższe cytokiny i inkubować przez 7 dni w temperaturze 37 °C.

2. Kultura Leishmanii

UWAGA: w tym teście użyto pasożytów L. amazonensis (MHOM/BR88/Ba-125).

  1. Utrzymuj promastigoty na pożywce z agarem z krwi Novy-Nicolle-MacNeal (NNN) z 5 ml kompletnej pożywki Schneidera lub minimalnej niezbędnej pożywki (MEM) w butelce hodowlanej o średnicy 25 cm 2 w inkubatorze do pomiaru zapotrzebowania na tlen (BZT) w temperaturze 24 °C.
    UWAGA: Do wyhodowania formy promastygoty gatunku L. amazonensis użyto 5 ml kompletnego podłoża Schneidera (pożywka Schneidera zawierająca 10% inaktywowanej płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i gentamycyny w stężeniu 50 μg/ml).
  2. Inkubować przez 7 dni w temperaturze 24 °C w inkubatorze BZT.
  3. Odpipetować 100 μl kultury promastigoty do nowej kolby do hodowli komórkowycho średnicy 25 cm.
  4. Dodać 5 ml suplementowanego MEM.
  5. Inkubować w temperaturze 24 °C w inkubatorze BZT i okresowo liczyć promastigoty, przenosząc podwielokrotność zawiesiny komórek pasożyta rozcieńczonej solą fizjologiczną do komory Neubauera (tj. hemocytometru) aż do osiągnięcia fazy stacjonarnej><. UWAGA: Nie używaj pierwszego fragmentu po NNN Medium do eksperymentów.
  6. Przenieść 1 × 105 promastigotów w stacjonarnej fazie wzrostu Leishmania do nowej kolby do hodowli komórkowych o długości 25 cmi dodać 5 ml uzupełnionego MEM.
  7. Okresowo monitoruj wzrost kultur za pomocą komory Neubauera, aż do osiągnięcia fazy stacjonarnej.
    UWAGA: Używaj kultur promastyn do 7 pasaży in vitro, aby uniknąć utraty zjadliwości.

3. Zakażenie Leishmania

  1. Po sprawdzeniu wzrostu hodowlanych pasożytów w fazie stacjonarnej, należy usunąć całą zawartość z butelek hodowlanych i umieścić ją w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Dodaj zimny roztwór soli fizjologicznej, aby uzyskać końcową objętość 30 ml.
  2. Wirować przez 10 minut w temperaturze 4 °C i trzykrotnie × g 1.600 g. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w zimnym roztworze soli.
  3. Umyj komórki, aby usunąć wszelkie niezdolne do życia pasożyty i ponownie zawieś granulkę w 1 ml zimnej soli fizjologicznej. Przepuścić zawiesinę 5 razy powoli przez strzykawkę o pojemności 1 ml wyposażoną w igłę 16 G, aby oddzielić skupiska pasożytów.
  4. Usunąć podwielokrotność z próbki, aby policzyć stężenie pasożyta w hemocytometrze za pomocą Eq (1).
    Stężenie pasożyta = średnia pasożytów w 4 kwadrantach × współczynnik rozcieńczenia × 104 (1)
  5. Oblicz ilość Leishmania sp. Wymagane dla liczby komórek gospodarza, które mają zostać posiane, w celu utrzymania stosunku pasożyta do komórek gospodarza 10:1 (krok 1.27).
  6. Umyć DC, dodając 1 ml roztworu soli fizjologicznej i trzykrotnie odwirowując komórki w temperaturze 300 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Umieścić wymaganą objętość Leishmania w każdym dołku 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej (patrz krok 3.5).
  8. Inkubować DC z pasożytami przez 4 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .

4. Barwienie immunologiczne do analizy cytometrii przepływowej

  1. Po zakażeniu przemyj komórki dwukrotnie 1 ml roztworu soli fizjologicznej, aby usunąć wszelkie niezinternalizowane pasożyty.
    UWAGA: Panel z klonami przeciwciał i fluorochromami jest wymieniony w Tabeli Materiałów.
  2. Rozcieńczyć przeciwciała (1:50) w buforze do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) (1x PBS z 1% BSA) w końcowej objętości 50 μL na warunki doświadczalne.
    UWAGA: Ważne jest, aby miareczkować przeciwciała przed eksperymentami, aby zapewnić optymalne stężenia barwienia. W tym protokole zastosowano 1:50 po eksperymentach miareczkowych.
  3. Przygotować mieszankę wzorcową (1x PBS z 1% BSA + mieszanina przeciwciał). Odwirować i odpipetować 50 μl mieszaniny w studzienkach zawierających komórki.
  4. Krótko inkubować DC z mieszanką przeciwciał (anty-ludzki CD1a, anty-ludzki CCR7, anty-ludzki CD83, anty-CD11c, anty-ludzki CD209, anty-ludzki HLA-DR) na lodzie przez 30 minut, chroniony przed światłem.
  5. Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml zimnego buforu barwiącego (1% FBS w 1x PBS) i odwirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl zimnego buforu barwiącego.
  7. Kontynuuj zbieranie danych na cytometrze przepływowym.
    UWAGA: Aby zapewnić optymalne warunki do analizy FACS, akwizycja danych powinna być przeprowadzona w ciągu 48 godzin po barwieniu próbki. Dane zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania FlowJo.
    1. Otwórz oprogramowanie FlowJo i utwórz nową przestrzeń roboczą. Dodaj pliki cytometrii przepływowej do analizy, przeciągając je do okna obszaru roboczego.
    2. Kliknij nazwę tuby, aby wybrać parametry rozproszenia bocznego (SSC) i rozproszenia do przodu (FSC).
      UWAGA: Analiza cytometryczna przepływu dojrzewania DC opierała się na ekspresji CD1a, CD11c, CD80, CCR7, CD209 i HLA-DR.
    3. Korzystając z narzędzia do bramkowania wielokątów, narysuj bramę wokół kontrolerów domeny. Kliknij dwukrotnie wybrane komórki bramkowane, aby wyświetlić nowe okno. Wykonaj czyszczenie dubletu, wybierając parametry FSC-A i FSC-H. Za pomocą narzędzia wielokąta narysuj nowy wykres wokół poszczególnych komórek.
    4. Kliknij dwukrotnie bramkowane komórki i wybierz parametry SSC i CD11c, aby wygenerować bramkę zawierającą komórki CD11c+.
    5. Wyeksportuj oczyszczoną bramkę komórkową CD11c+, wybierając ją. Kliknij bramę prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Wybierz równoważne węzły. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wyeksportuj bramę wraz ze wszystkimi skompensowanymi parametrami, zapisując ją w ostatnio utworzonym folderze.
    6. Utwórz nowy obszar roboczy, otwierając ostatnio zapisane pliki. Kliknij Przestrzeń robocza i wybierz wtyczki | Próbkowanie w dół | od 30 000 do 50 000 zdarzeń; Naciśnij OK.
      UWAGA: Ponieważ TSNE jest procesem zarówno czasochłonnym, jak i wymagającym obliczeniowo, ten krok jest zalecany w celu zmniejszenia całkowitej liczby analizowanych zdarzeń.
    7. Kliknij prawym przyciskiem myszy plik, z którego pobrano próbkowanie, i wybierz równoważne węzły.
    8. Kliknij prawym przyciskiem myszy plik, z którego pobrano próbkę, i wybierz polecenie Eksportuj/łącz.
    9. Kliknij okno łączenia i wybierz wszystkie skompensowane parametry. Wybierz połączone pliki i kliknij workspace | plugin | tSNE.
    10. Wybierz żądane parametry (CD1a, HLA-DR, CCR7, CD80, CD209 i CD11c), aby utworzyć klastry. Naciśnij przycisk OK.
    11. Kliknij połączony plik, aby wyświetlić parametry tSNE1 i tSNE2.

5. Barwienie immunologiczne aktyny

  1. Zakażone płytkami DC na szkiełkach nakrywkowych umieszczonych w płytkach 24-dołkowych. Odwirować płytki w temperaturze 300 × g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Umyj komórki 3x sterylnym roztworem soli fizjologicznej po zakażeniu w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie pasożyty zewnątrzkomórkowe.
  2. Inkubować DC z 500 μl 4% paraformaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć paraformaldehyd i dodać 1 ml soli fizjologicznej (patrz Tabela 1).

6. Znakowanie immunologiczne

UWAGA: Wykonaj następujące kroki pod wpływem mieszania.

  1. Umyć szkiełka nakrywkowe 1x PBS przez 5 minut; powtórzyć 3x. Dodać 500 μl roztworu chlorku amonu do dołka; inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Myć szkiełka nakrywkowe 1x PBS przez 5 minut; powtórzyć 3x.
  3. Przepuszczaj membranę za pomocą 0,15% saponiny przez 15 min.
  4. Blokuj przez 1 godzinę z 1x PBS 1x/3% BSA/0,15% saponiny. Płukać szkiełka nakrywkowe 1x PBS/0,15% saponiną przez 5 min; Powtórz 3 razy.
  5. Inkubować komórki przez 1 godzinę z falloidyną (1:1,200] rozcieńczoną w 1x PBS / 1% BSA / 0,15% saponinie. Płukać szkiełka nakrywkowe 1x PBS/0,15% saponiną przez 5 min; Powtórz 3 razy.
  6. Umieść szkiełka nakrywkowe komórkami skierowanymi w dół na podłożu montażowym z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI). Przykryj szkiełka folią aluminiową, aby chronić je przed światłem.
  7. Rejestruj obrazy za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 63x/1,4.

7. Akwizycja mikroskopii konfokalnej i kwantyfikacja Fidżi

  1. Uchwyć obrazy immunofluorescencyjne za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Aby uzyskać najlepszą rozdzielczość, użyj obiektywowej soczewki zanurzeniowej z olejkiem 63x.
  2. Chroń szkiełka nakrywkowe przed światłem i pozostaw je w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut przed pobraniem.
  3. Użyj chłonnej chusteczki do czyszczenia szkiełek nakrywkowych. Dodaj kroplę olejku immersyjnego do obiektywu i umieść szkiełko na stoliku mikroskopu. Wybierz obiektyw 63x z olejem, podnieś platformę, aż olej dotknie szkiełka, a następnie wyreguluj ostrość na mikroskopie.
  4. Otwórz program i aktywuj fale lasera o długości 488, 552 i 405 nm.
  5. Ustaw rozdzielczość obrazu na 1024 x 1024 piksele.
  6. Kliknij na live bottom, ustaw stos Z i naciśnij Begin. Powtórz ten proces, a następnie naciśnij przycisk Zakończ.
  7. Poczekaj na zakończenie akwizycji obrazu, a następnie wybierz opcję Maksymalna projekcja w narzędziach.
  8. Zapisz eksperyment i wyeksportuj obrazy w formacie lif do komputera.
  9. Otwórz program FIJI, otwórz eksperyment na FIDŻI i ustaw stos widoków na Hyperstack.
  10. Wybierz otwarte pliki obrazów pojedynczo | Zszyj płytki.
  11. Wybierz narzędzie wolnej ręki na pasku narzędzi Fidżi i uważnie prześledź ręcznie każdą komórkę. Naciśnij przycisk analizuj | mierz, aby zobrazować intensywność fluorescencji. Powtórz ten proces dla każdego typu komórki w grupie.
  12. Zapisz pomiary i wyeksportuj je do arkusza kalkulacyjnego. Otwórz plik zawierający dane za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej (patrz tabela materiałów), aby przeprowadzić analizę statystyczną.

8. Analiza statystyczna

  1. Otwórz nowy projekt w oprogramowaniu.
  2. W przypadku danych o rozkładzie normalnym należy użyć testu t-Studenta, a w przypadku danych nieparametrycznych należy użyć testu U Manna-Whitneya.
  3. Wklej wartości uzyskane z wyników eksperymentu w tabeli.
  4. Wybierz statystyki opisowe i wybierz opcję kolumna statystyki [wszystkie testy], aby przeanalizować rozkład danych.
    UWAGA: Jeśli dane są zgodne z rozkładem Gaussa, wybierz test t, aby zbadać próbki, porównując dwie pary. Jeśli rozkład jest niegaussowski, przeanalizuj dane za pomocą testu U Manna-Whitneya z miarami tendencji centralnej (średnimi lub medianami) i miarami zmienności.
  5. Wybierz najlepszą opcję wykresu, aby uzyskać optymalną reprezentację danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten raport bada rolę DC w zakażeniu Leishmania za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej. Początkowo ustalono profil fenotypowy DC pochodzącego z ludzkich monocytów. Warto zauważyć, że uzyskane populacje komórek dendrytycznych CD11c+ były dodatnie dla CCR7, CD209, CD80, CD1a i HLA-DR. Wyniki wskazują, że ekspresja tych markerów w populacjach DC jest głęboko dotknięta zakażeniem Leishmania. Zainfekowane DC wykazywały zwiększoną ekspresję CD80, CD209, CCR7 i HLA-DR. Jednak obn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leiszmanioza jest poważnym problemem zdrowia publicznego na całym świecie. Patogeneza tej choroby jest dość złożona, a mechanizmy sprzyjające przetrwaniu pasożytów u kręgowców pozostają nieuchwytne17. DC to profesjonalne komórki prezentujące antygen znajdujące się w całym ciele, w tym w narządach filtrujących i limfatycznych. Po wychwyceniu i przetworzeniu antygenu niedojrzałe DC przechodzą złożony proces dojrzewania, którego kulminacją jest ich migracja do węzłów chłonnych, gdzie komórki te są od...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Instytutowi Gonçalo Moniz (IGM-Fiocruz) (Bahia, Brazylia) oraz działowi mikroskopii za pomoc. Autorzy są wdzięczni Andrisowi K. Walterowi za krytyczną analizę, korektę języka angielskiego i pomoc w redakcji manuskryptów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
anty CCR7Thermo
anty CD209Isofarma
anty CD83Leica SP8
anty HLA-DRGibco
Albumina surowicy bydlęcejThermoA2153-100GSigma
CiprofloksacynaGibco
Thermo Fisher Scientific
Płodowa surowica bydlęcaGibco
Flow JoThermo Fisher Scientific
GentamycynaThermo Fisher Scientific
GlutaminaGibco
HEPESThermo Fisher Scientific
falloidynaThermo Fisher Scientific
Roztwór buforu fosforanowegoPeprotech
prolong złoty zestaw przeciw blaknięciuBD pharmigen
RPMIBD pharmigen
SaponinBD pharmigen47036 – 50G – F
Oprogramowanie do pożywki dla owadówBD biosciences
Mikroskop konfokalny Sigma Schneider

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Torres-Guerrero, E., Qunitanilla-Cedillo, M. R., Ruiz-Esmenhjaud, J., Arenas, R. Leishmaniasis: a review. F1000 Research. 6, 750(2017).
  2. Pace, D. Leishmaniasis. Journal of Infection. 69, Suppl 1 10-18 (2014).
  3. Reithinger, R., et al. Cutaneous leishmaniasis. Lancet. Infectious Diseases. 7 (9), 581-596 (2007).
  4. Kaye, P., Scott, P. Leishmaniasis: complexity at the host-pathogen interface. Nature Reviews. Microbiology. 9 (8), 604-615 (2011).
  5. Handman, E., Bullen, D. V. Interaction of Leishmania with the host macrophage. Trends in Parasitology. 18 (8), 332-334 (2002).
  6. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  7. Kamhawi, S. Phlebotomine sand flies and Leishmania parasites: friends or foes. Trends in Parasitology. 22 (9), 439-445 (2006).
  8. Guilliams, M., et al. Unsupervised high-dimensional analysis aligns dendritic cells across tissues and species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
  9. Moll, H. Dendritic cells and host resistance to infection. Cellular Microbiology. 5 (8), 493-500 (2003).
  10. Sundquist, M., Rydstrom, A., Wick, M. J. Immunity to Salmonella from a dendritic point of view. Cellular Microbiology. 6 (1), 1-11 (2004).
  11. Saban, D. The chemokine receptor CCR7 expressed by dendritic cells: A key player in corneal and ocular surface inflammation. Ocular Surface Journal. 12, 87-99 (2014).
  12. Relloso, M., et al. DC-SIGN (CD209) Expression is IL-4 dependent and it is negatively regulated by IFN, TGF and inflammatory agents. Journal of Immunology. 168 (6), 2634-2643 (2002).
  13. Leon, B., Lopez-Bravo, M., Ardavin, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  14. Gordon, S. Phagocytosis: An immunobiologic process. Immunity. 44 (3), 463-475 (2016).
  15. Ashok, D., Acha-Orbea, H. Timing is everything: dendritic cell subsets in murine Leishmania infection. Trends in Parasitology. 30 (10), 499-507 (2014).
  16. Carvalho, A. K., et al. Leishmania (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis promote differential expression of dendritic cells and cellular immune response in murine model. Parasite Immunology. 34 (8-9), 395-403 (2012).
  17. Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. International Journal of Parasitology. 37 (10), 1097-1106 (2007).
  18. Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (8), 3012-3017 (2012).
  19. Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1263-1272 (1994).
  20. Suzuki, H., et al. Activities of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-3 on monocytes. American Journal of Hematology. 75 (4), 179-189 (2004).
  21. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nature Reviews. Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).
  22. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  23. Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 1795(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

R nicowanie kom rek dendrytycznychmarkery kom rek dendrytycznychprezentacja antygenumodulacja odpowiedzi immunologicznejekspresja MHC IIcz steczki kostymuluj cedojrzewanie kom rek dendrytycznychwychwytywanie patogen w
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły