Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62795

⸱

14 października 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1European Laboratory for Non-Linear Spectroscopy, 2Department of Biology, University of Florence, 3National Institute of Optics, National Research Council, 4Department of Physics and Astronomy, University of Florence, 5Department of Neurosciences, Psychology, Drugs and Child Health, University of Florence, 6Institute for Experimental Cardiovascular Medicine, Faculty of Medicine, University of Freiburg

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy metodę mezoskopowej rekonstrukcji całego serca myszy poprzez połączenie nowych osiągnięć w transformacji tkanek i barwieniu z rozwojem osiowo skanowanego mikroskopu świetlnego.

Streszczenie

Zarówno genetyczne, jak i niegenetyczne choroby serca mogą powodować poważne procesy przebudowy serca. Przebudowa strukturalna, taka jak odkładanie się kolagenu (zwłóknienie) i niewspółosiowość komórek, może wpływać na przewodnictwo elektryczne, wprowadzać dysfunkcje elektromechaniczne i ostatecznie prowadzić do arytmii. Obecne modele predykcyjne tych zmian funkcjonalnych opierają się na niezintegrowanych informacjach strukturalnych o niskiej rozdzielczości. Umieszczenie tych ram w innym rzędzie wielkości jest trudne ze względu na nieskuteczność standardowych metod obrazowania w wykonywaniu obrazowania w wysokiej rozdzielczości w masywnych tkankach. W niniejszej pracy opisano ramy metodologiczne, które umożliwiają obrazowanie całych serc myszy z rozdzielczością mikrometryczną. Osiągnięcie tego celu wymagało wysiłku technologicznego, w ramach którego połączono postępy w metodach transformacji tkanek i obrazowania. Po pierwsze, opisujemy zoptymalizowany protokół CLARITY zdolny do przekształcenia nienaruszonego serca w nanoporowatą, hydrożelowo-hybrydyczną, wolną od lipidów formę, która umożliwia wysoką przezroczystość i głębokie barwienie. Następnie opisano fluorescencyjny mikroskop arkuszowy zdolny do szybkiego pozyskiwania obrazów mezoskopowego pola widzenia (w skali mm) z rozdzielczością w skali mikronowej. W ślad za projektem mesoSPIM, opracowany mikroskop pozwala na rekonstrukcję całego serca myszy z rozdzielczością mikrometryczną w jednym skanie tomograficznym. Wierzymy, że te ramy metodologiczne pozwolą wyjaśnić udział chaosu cytoarchitektury w dysfunkcjach elektrycznych i utorują drogę do kompleksowego modelu, który uwzględnia zarówno dane funkcjonalne, jak i strukturalne, umożliwiając w ten sposób ujednolicone badanie przyczyn strukturalnych, które prowadzą do zmian elektrycznych i mechanicznych po przebudowie tkanki.

Wprowadzenie

Przebudowa strukturalna związana z chorobami serca może wpływać na przewodnictwo elektryczne i wprowadzać elektromechaniczne dysfunkcje narządu1,2. Obecne podejścia stosowane do przewidywania zmian funkcjonalnych często wykorzystują MRI i DT-MRI w celu uzyskania ogólnej rekonstrukcji odkładania się zwłóknienia, drzewa naczyniowego i rozmieszczenia włókien serca, a także są wykorzystywane do modelowania ścieżek propagacji preferencyjnego potencjału czynnościowego (APP) w całym narządzie3,4. Strategie te mogą zapewnić piękny przegląd organizacji serca. Jednak ich rozdzielczość przestrzenna jest niewystarczająca do zbadania wpływu przebudowy strukturalnej na funkcję serca na poziomie komórkowym.

Umieszczenie tego frameworka w innym rzędzie wielkości, gdzie pojedyncze komórki mogą odgrywać indywidualne role w propagacji potencjału czynnościowego, jest wyzwaniem. Głównym ograniczeniem jest nieskuteczność standardowych metod obrazowania w wykonywaniu obrazowania o wysokiej rozdzielczości (rozdzielczość mikrometryczna) w masywnych (centymetrowych) tkankach. W rzeczywistości obrazowanie tkanek biologicznych w 3D w wysokiej rozdzielczości jest bardzo skomplikowane ze względu na nieprzezroczystość tkanek. Najczęstszym podejściem do wykonywania rekonstrukcji 3D całych organów jest przygotowanie cienkich odcinków. Jednak precyzyjne cięcie, montaż i obrazowanie wymagają znacznego wysiłku i czasu. Alternatywnym podejściem, które nie wymaga cięcia próbki, jest wygenerowanie przezroczystej tkanki. W ciągu ostatnich lat zaproponowano kilka metodologii wyjaśniania tkanek5,6,7,8. Wyzwanie polegające na wyprodukowaniu masywnych, przezroczystych i znakowanych fluorescencyjnie tkanek zostało niedawno osiągnięte dzięki opracowaniu prawdziwych metod transformacji tkanek (CLARITY9, SHIELD10). W szczególności metoda CLARITY opiera się na przekształceniu nienaruszonej tkanki w nanoporowatą, hydrożelowo-hybrydyczną, wolną od lipidów formę, która umożliwia nadanie wysokiej przezroczystości poprzez selektywne usuwanie dwuwarstw lipidowych błony. Warto zauważyć, że metoda ta okazała się skuteczna również w preparatyce kardiologicznej11,12,13,14. Ponieważ jednak serce jest zbyt delikatne, aby nadawało się do aktywnego oczyszczenia, musi zostać oczyszczone przy użyciu podejścia pasywnego, co wymaga dużo czasu, aby zapewnić pełną przejrzystość.

W połączeniu z zaawansowanymi technikami obrazowania, takimi jak mikroskopia arkuszowa, CLARITY ma potencjał do obrazowania 3D masywnych tkanek serca w rozdzielczości mikrometrycznej. W mikroskopii arkuszowej oświetlenie próbki odbywa się za pomocą cienkiego arkusza światła zamkniętego w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu detekcji. Emisja fluorescencji jest zbierana wzdłuż osi prostopadłej do płaszczyzny oświetlenia15. Architektura detekcji jest podobna do mikroskopii szerokokątnej, dzięki czemu akwizycja jest znacznie szybsza niż w przypadku laserowych mikroskopów skaningowych. Przesuwanie próbki przez arkusz świetlny pozwala na uzyskanie pełnej tomografii dużych próbek, do centymetrów. Jednak ze względu na wewnętrzne właściwości wiązki Gaussa możliwe jest uzyskanie bardzo cienkiej (rzędu kilku mikronów) warstwy światła tylko przy ograniczonej rozciągłości przestrzennej, co drastycznie ogranicza pole widzenia (FoV). Niedawno wprowadzono nowatorski schemat wzbudzenia, aby przezwyciężyć to ograniczenie i zastosowano go do obrazowania mózgu, umożliwiając rekonstrukcje 3D z rozdzielczością izotropową16.

W tym artykule przedstawiono pasywne podejście do czyszczenia, umożliwiające znaczne skrócenie czasu czyszczenia wymaganego przez protokół CLARITY. Opisane tu ramy metodologiczne pozwalają na rekonstrukcję całego serca myszy z rozdzielczością mikrometryczną w pojedynczym skanie tomograficznym z czasem akwizycji rzędu minut.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące postępowania ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Dyrektywy Parlamentu Europejskiego 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych oraz zgodne z zasadami i przepisami włoskiego Ministerstwa Zdrowia. Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (numer protokołu 647/2015-PR). Wszystkie zwierzęta zostały dostarczone przez firmę ENVIGO z Włoch. Do tych eksperymentów wykorzystano 5 samców myszy C57BL/6J w wieku 6 miesięcy.

1. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotuj 4% paraformaldehydu (PFA) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (pH 7,6) w kapturze chemicznym. Przechowywać 4% porcje PFA w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
  2. Przygotuj roztwór hydrożelu: Wymieszaj 4% akrylamidu, 0,05% bis-akrylamidu, 0,25% inicjatora AV-044 w 0,01 M PBS w kapturze chemicznym. Odczynniki i roztwór należy przechowywać na lodzie przez cały czas przygotowania. Porcje hydrożelu należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
  3. Przygotuj roztwór czyszczący: Wymieszaj 200 mM kwasu borowego, 4% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w wodzie dejonizowanej; pH 8,6 w kapturze chemicznym. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 21-37 °C, aby uniknąć wytrącania się SDS.
  4. Przygotuj świeży roztwór Tyrode w dniu eksperymentu: Dodaj 10 mM glukozy, 10 mM HEPES, 113 mM NaCl, 1,2 mM MgCl2 i 4,7 mM KCl; miareczkować do pH 7,4 za pomocą 1 M NaOH.

2. Izolacja serca

  1. Wstrzyknąć podskórnie 0,1 ml heparyny 500 j.m. 30 minut przed zabiegiem izolacji serca.
  2. Napełnij strzykawkę o pojemności 30 ml i trzy 6-centymetrowe szalki Petriego świeżym roztworem Tyrode. Wykonaj małą szczelinę (o głębokości 3-4 mm) na granicy jednej z szalek Petriego i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym.
  3. Przymocuj kaniulę o średnicy 1 mm do strzykawki i włóż ją w szczelinę szalki Petriego. Upewnij się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza.
  4. Napełnij strzykawkę o pojemności 20 ml 4% PFA i trzymaj ją w kapturze chemicznym. Przygotuj pustą szalkę Petriego pod maską.
  5. Znieczulić mysz 3% izofluranem/tlenem przy natężeniu przepływu 1,0 l/min i poświęcić ją przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z obowiązującymi zasadami dobrostanu zwierząt.
  6. Po złożeniu ofiary zdejmij futro z klatki piersiowej i otwórz skrzynię, aby mieć pełny dostęp do serca.
  7. Wyizoluj serce, zanurz je na szalce Petriego uprzednio wypełnionej 50 ml roztworu tyrodu. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć aortę bezpośrednio w pobliżu łuku aorty, aby odsłonić serce.
  8. Przenieś serce pod mikroskop stereoskopowy i ostrożnie wykonaj kaniulację. Nie wkładaj kaniuli zbyt głęboko do aorty (nie więcej niż 2 mm), aby uniknąć uszkodzenia tkanek.
  9. Użyj małego zacisku i szwu (rozmiar 5/0), aby przymocować serce do kaniuli.
  10. Wykonać perfuzję serca za pomocą 30 ml roztworu Tyrode pod stałym ciśnieniem 10 ml/min, aby usunąć krew z naczyń.
  11. Odłącz kaniulę od strzykawki i umieść serce na szalce Petriego wypełnionej roztworem Tyrode'a. Uważaj, aby w kaniuli nie dostały się pęcherzyki powietrza; W przeciwnym razie należy prawidłowo usunąć pęcherzyki powietrza.
  12. Podłącz strzykawkę o pojemności 20 ml wypełnioną zimnym 4% PFA do kaniuli i wykonaj perfuzję serca pod tym samym stałym ciśnieniem.
  13. Inkubować serce w 10 ml 4% PFA w temperaturze 4 °C przez noc (O/N). Aby uniknąć degradacji tkanek, wykonaj kroki 2.6-2.13 w jak najkrótszym czasie.

3. Oczyszczanie serca

  1. Następnego dnia umyć serce w 0,01 M PBS 3 razy w temperaturze 4 °C przez 15 min.
    UWAGA: Po tym etapie serce może być przechowywane w PBS + 0,01% azydku sodu (NaN3) w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
  2. Inkubować serce w 30 ml roztworu hydrożelu, wstrząsając (15 obr./min) w temperaturze 4 °C przez 3 dni.
  3. Odgazowanie próbki w temperaturze pokojowej za pomocą osuszacza, pompy próżniowej i systemu rur, który łączy suszarkę zarówno z pompą, jak i rurociągiem azotu.
    1. Umieścić próbkę w suszarce i otworzyć fiolkę, trzymając na niej nakrętkę.
    2. Zamknij osuszacz i usuń tlen z rurki, otwierając rurociąg azotu.
    3. Włącz pompę próżniową, aby usunąć tlen z suszarki na 10 minut.
    4. Wyłącz pompę i za pomocą pokrętła osuszacza otwórz rurociąg azotu. Gdy ciśnienie zrówna się ciśnieniu atmosferycznemu, ostrożnie otwórz suszarkę i szybko zamknij fiolkę.
  4. Utrzymuj serce w odgazowanym roztworze hydrożelu w temperaturze 37 °C przez 3 godziny w spoczynku.
  5. Gdy hydrożel jest prawidłowo spolimeryzowany i wydaje się całkowicie galaretowaty, ostrożnie wyjmij z niego serce i umieść je w uchwycie na próbkę.
  6. Włożyć uchwyt na próbkę z sercem do jednej z komór czyszczących i odpowiednio go zamknąć, aby uniknąć wycieków roztworu czyszczącego.
  7. Włączyć łaźnię wodną, w której umieszczony jest pojemnik z roztworem czyszczącym, oraz pompę perystaltyczną, aby rozpocząć recyrkulację roztworu czyszczącego.
  8. Raz w tygodniu należy zmienić roztwór czyszczący w pojemniku, aby przyspieszyć procedurę klarowania.

4. Barwienie błony komórkowej

  1. Gdy serce wydaje się całkowicie oczyszczone, wyjmij je z uchwytu na próbkę i myj w 50 ml rozgrzanego PBS przez 24 godziny. Płucz ponownie w 50 ml PBS + 1% Triton-X (PBS-T 1x) przez 24 godziny.
  2. Inkubować próbkę w 0,01 mg/ml aglutyniny z kiełków pszenicy (WGA) - Alexa Fluor 633 w 3 ml PBS-T 1x w wstrząsaniu (50 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 7 dni.
  3. Po 7-dniowej inkubacji przemyć próbkę w 50 ml PBS-T 1x w temperaturze pokojowej w wytrząsaniu przez 24 godziny.
  4. Próbkę inkubować w 4% PFA przez 15 minut, a następnie myć ją 3 razy w PBS przez 5 minut każdy.
    UWAGA: Po tym etapie serce może być przechowywane w PBS + 0,01% NaN3 w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
  5. Inkubować serce w rosnących stężeniach 2,2′-tiodieetanolu (TDE) w 0,01 M PBS (20% i 47% TDE/PBS) przez 8 godzin każdy, aż do końcowego stężenia 68% TDE w 0,01 M PBS, aby uzyskać wymagany współczynnik załamania światła (RI = 1,46). Jest to nośnik dopasowujący RI (RI-medium) do pobierania obrazów16.

5. Montaż i akwizycja serca

UWAGA: Wszystkie elementy systemu optycznego są szczegółowo wymienione w Tabeli Materiałów.

  1. Delikatnie napełnij około 80% zewnętrznej kuwety (kwarcowej, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) RI-medium.
    UWAGA: W tym przypadku możliwe jest zastosowanie różnych rozwiązań nieulotnych, które gwarantują RI na poziomie 1,46.
  2. Delikatnie napełnij wewnętrzną kuwetę (kwarc, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) tym samym medium RI.
  3. Zanurz próbkę w wewnętrznej kuwecie. Opisana powyżej inkubacja próbki pozwala na utrzymanie stabilności próbki w pożywce RI bez konieczności jej przetrzymywania.
  4. Delikatnie przesuń próbkę na dno kuwety za pomocą cienkiej pęsety i ułóż serce tak, aby jego oś podłużna była równoległa do głównej osi kuwety, aby zminimalizować drogę światła wzbudzającego przez tkankę podczas skanowania.
  5. Delikatnie przymocuj dopasowaną zatyczkę nad wewnętrzną kuwetą za pomocą dwóch.
  6. Zamontuj próbkę na stoliku mikroskopu za pomocą magnesów.
  7. Przełóż pionowy stolik na próbkę ręcznie, aby zanurzyć wewnętrzną kuwetę w zewnętrznej.
  8. Włącz źródło światła wzbudzenia (długość fali 638 nm), ustawiając niską moc (rzędu 3 mW).
  9. Przesuń próbkę za pomocą zmotoryzowanego translatora, aby oświetlić wewnętrzną płaszczyznę tkanki.
  10. Włącz oprogramowanie do przetwarzania obrazu (HCImageLive) i ustaw wyzwalacz kamery w trybie zewnętrznym (arkusz świetlny), aby sterować wyzwalaczem akwizycji kamery przez niestandardowe oprogramowanie sterujące całą konfiguracją.
  11. Włącz opcję Autozapis w panelu Ustawienia skanowania i ustaw folder wyjściowy, w którym mają zostać zapisane obrazy.
  12. Ręcznie dostosuj pozycję próbki w płaszczyźnie XY za pomocą translatorów liniowych, aby przesunąć próbkę do środka pola widzenia czujnika kamery.
  13. Przesuń próbkę wzdłuż osi Z za pomocą liniowego translatora z napędem, aby zidentyfikować granice serca do rekonstrukcji tomograficznej.
  14. Zwiększ moc lasera do ~20 mW, gotowy do sesji obrazowania.
  15. Rozpocznij akwizycję tomograficzną, kliknij przycisk Start w panelu sekwencji oprogramowania do obrazowania, a jednocześnie przesuwaj próbkę wzdłuż osi Z ze stałą prędkością 6 μm/s za pomocą zmotoryzowanego translatora.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opracowany układ pasywnego klarowania umożliwia uzyskanie sklarowanego serca dorosłej myszy (o wymiarach rzędu 10 mm x 6 mm x 6 mm) w ciągu około 3 miesięcy. Wszystkie komponenty układu są zamontowane zgodnie z Rysunkiem 1. Pomijalny gradient temperatury między poszczególnymi komorami klarującymi (rzędu 3°C) pozwala na utrzymanie temperatury w odpowiednim zakresie we wszystkich komorach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tej pracy wprowadzono skuteczne podejście do czyszczenia, barwienia i obrazowania całego serca myszy w wysokiej rozdzielczości. W pierwszej kolejności zoptymalizowano i przeprowadzono protokół transformacji tkankowej (CLARITY), nieznacznie zmodyfikowany pod kątem jego zastosowania w tkance serca. Rzeczywiście, aby uzyskać skuteczną rekonstrukcję w 3D całego serca, konieczne jest zapobieganie zjawisku rozpraszania światła. Metodologia CLARITY pozwala nam uzyskać wysoce przezroczyste nienaruszone serce, ale wymaga długie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten projekt otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji w ramach umowy o grant nr 952166 (REPAIR), MUR w ramach programu FISR, projektu FISR2019_00320 i Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, projektu PERCARE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-2' TiodiethanolSigma-Aldrich166782
AkrylamidBio-Rad61-0140
InicjatorWako ChemicalsAVP5874
Bis-AcrylamidBio-Rad161-042
Kwas borowySigma-AldrichB7901
AparatHamamatsuOrca Flash 4.0 v3
Oprogramowanie kameryHamamatsuHC Image
Soczewka kolimacyjnaThorlabsAC254-050-A-ML
Ramię detekcyjneZintegrowana optyka0638L-15A-NI-PT-NF
Soczewka wzbudzającaNikon91863
Exteraì kuweta kwarcowa portmannInstrumentsUQ-753
Lustra składaneThorlabsBBE1-E02
Lustro galwanometryczneThorlabsGVS211/M
GlukozaSigma-AldrichG8270
HCImage LiveHamamatsu4.6.1.19
HEPESSigma-AldrichH3375
Wewnętrzna kuweta kwarcowaPortmann InstrumentsUQ-204
KClSigma-AldrichP4504
Źródło laseroweZintegrowane optyki0638L-15A-NI-PT-NF
Filtr długoprzepustowyThorlabsFELH0650
Podstawa magnetycznaThorlabsKB25/M
MgCl2Chem-LabCI-1316-0250
Zmotoryzowany przekładnikInstrument PhysiskM-122.2DD
NaClSigma-Aldrich59888
ObiektywThorlabsTL2X-SAP
ParaformaldehydAgar ScientificR1018
Roztwór buforu fosforanowegoSigma-AldrichP4417
Polycap ASWhatman2606T
Soczewka przekaźnikowaQioptiqG063200000
Dodecyl siarczan soduSigma-AldrichL3771
Soczewka tubusuThorlabsACT508-200-A-ML
Przestrajalna soczewkaOptotuneEL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
Pompa próżniowaKNF Neuberger IncN86KT.18
Woda wannaMemmertWTB
AV-044

Bibliografia

  1. Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
  2. Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
  3. Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
  4. Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
  5. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  6. Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
  7. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  8. Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205(2016).
  9. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  10. Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73(2019).
  11. Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769(2018).
  12. Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
  13. Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
  14. Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
  15. Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
  16. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808(2015).
  17. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012(2016).
  18. Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64(2018).
  19. Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia arkuszowaprotok CLARITYutrwalanie tkankirekonstrukcja tomograficznaobrazowanie tkanki sercazatapianie w hydro eludopasowanie wsp czynnika za amania wiat arozdzielczo b on kom rkowych
Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.