Jednoczesne obrazowanie w jasnym polu, fluorescencji i optycznej koherentnej tomografii kurczących się beleczków serca ex vivo

Summary

Ten protokół przedstawia zbiór sarkomerów, wapnia i makroskopowych danych geometrycznych z aktywnie kurczącego się trabecula serca ex vivo. Te równoczesne pomiary są możliwe dzięki integracji trzech modalności obrazowania.

Abstract

W mięśniu sercowym, wewnątrzkomórkowe stany przejściowe Ca²⁺ aktywują kurczliwe miofilamenty, powodując skurcze, makroskopowe skrócenie i deformację geometryczną. Nasze zrozumienie wewnętrznych relacji między tymi zdarzeniami jest ograniczone, ponieważ nie możemy ani "zajrzeć" do wnętrza mięśnia, ani precyzyjnie śledzić czasoprzestrzennej natury dynamiki pobudzenia i skurczu. Aby rozwiązać te problemy, skonstruowaliśmy urządzenie, które łączy w sobie zestaw modalności obrazowania. W szczególności integruje mikroskop jasnego pola do pomiaru lokalnych zmian długości sarkomeru i odkształcenia tkanki, mikroskop fluorescencyjny do wizualizacji stanu przejściowego Ca²⁺ oraz optyczny tomograf koherentny do uchwycenia zmian geometrycznych tkanki w całym przebiegu cyklu sercowego. Przedstawiamy tutaj infrastrukturę obrazowania i związane z nią ramy gromadzenia danych. Dane są zbierane z izolowanych struktur tkankowych przypominających pręciki, znanych jako beleczki carneae. W naszym instrumencie para platynowych haczyków z kontrolowanym położeniem przytrzymuje każdy koniec próbki mięśniowej ex vivo, podczas gdy jest ona w sposób ciągły przepełniana bogatym w składniki odżywcze roztworem soli fizjologicznej. Haki są pod niezależną kontrolą, co pozwala na kontrolę długości i siły mięśni w czasie rzeczywistym. Translacja wzdłużna umożliwia fragmentaryczne skanowanie próbki, pokonując ograniczenia związane ze względną wielkością okienka obrazowania mikroskopu (540 μm na 540 μm) i długością typowej beleczki (>2000 μm). Platynowe elektrody na obu końcach komory mięśniowej stymulują beleczkę w tempie zdefiniowanym przez użytkownika. Wykorzystujemy sygnał stymulacji jako wyzwalacz do synchronizacji danych z każdego okna obrazowania, aby zrekonstruować drganie całej próbki w warunkach stanu ustalonego. Zastosowanie technik przetwarzania obrazu do tych danych obrazowania w jasnym polu zapewnia mapy przemieszczeń tkanek i długości sarkomerów. Taki zbiór danych, po włączeniu do procesu modelowania eksperymentu, zapewni głębsze zrozumienie jednorodności i heterogeniczności skurczów mięśni w fizjologii i patofizjologii.

Introduction

Superfuzja preparatów izolowanej tkanki mięśnia sercowego jest standardowym i szeroko stosowanym protokołem do badania aktywacji jonów i mechaniki serca¹. W szczególności odizolowanie beleczków, pręcikowatych struktur od ścian komór, umożliwiło ocenę takich zjawisk, jak zależna od długości aktywacja skurczu², zależna od rozciągania reakcja skurczu^3,4, oraz rozkurczowa lepkosprężystość⁵ tkanki serca. Ter Keurs, inicjator tej techniki superfuzji izolowanych beleczków, początkowo używał kombinacji obrazowania fluorescencyjnego do pomiarów Ca²⁺ i dyfrakcji laserowej do określania długości sarkomeru ^2,5. Od czasu tych wczesnych badań coraz powszechniejsze staje się wyodrębnianie informacji o długości sarkomeru z większą rozdzielczością przestrzenną przy użyciu technik opartych na szybkiej transformacji Fouriera 2D (FFT)⁶ na obrazach mikroskopowych w jasnym polu. Dwa systemy obrazowania pozwalają na częściową ocenę podstawowej zależności między uwalnianiem Ca²⁺ a wytwarzaniem siły zależnej od długości sarkomeru.

Mięsień sercowy jest prążkowany, z widocznym pasmem związanym z leżącą pod spodem serią jednostek kurczliwych składających się z grubych i grubych włókien. Interakcja tych włókien składowych, które tworzą sarkomery, leży u podstaw generowania siły, które rozpoczyna się w następujący sposób: depolaryzujący sygnał elektryczny lub potencjał czynnościowy powoduje otwarcie zależnych od napięcia kanałów Ca²⁺ typu L w błonie komórkowej; wynikający z tego napływ komórkowy Ca^{2 +} indukuje uwalnianie Ca^{2 +} z retikulum sarkoplazmatycznego (SR), wewnątrzkomórkowego magazynu Ca^{2 +}, w procesie znanym jako uwolnienie Ca^{2 +} indukowane przez Ca² + ⁷; ten nagły wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia Ca²⁺ z zakresu nanomolowego do mikromolowego umożliwia wytwarzanie siły; Pompy Ca^{2 +} w sposób ciągły wytłaczają Ca^{2 +} z cytozolu z powrotem do SR i przedziału zewnątrzkomórkowego; gdy wewnątrzkomórkowe stężenie Ca²⁺ powraca do zakresu nanomolowego, produkcja siły ustaje, a mięsień rozluźnia się. Podczas wytwarzania siły grube i cienkie włókna składowe przesuwają się po sobie. Długość sarkomeru dyktuje względny zakres nakładania się, a tym samym potencjał makroskopowego wytwarzania siły przez mięsień.

W tym artykule rozszerzamy te techniki obrazowania fluorescencyjno-jasnego pola o optyczną tomografię koherentną (OCT). OCT wykorzystuje fizyczną zasadę interferencji i jest w stanie uchwycić geometryczną deformację tkanki, aby zrozumieć niejednorodność kurczliwości mięśni⁸. Nasze urządzenie (Rysunek 1) wykorzystuje system OCT (SD-OCT) w domenie spektralnej. W SD-OCT rozdzielacz wiązki rozdziela światło z szerokopasmowej diody superluminescencyjnej o krótkiej koherencji na ramiona referencyjne i pomiarowe. Ramię referencyjne zawiera stałe lustro, a ramię pomiarowe zawiera galwanometr 2D do sterowania światłem. Światło wstecznie rozproszone z próbki jest zbierane i interferuje ze światłem odbitym w ramieniu odniesienia, tworząc wzór interferencyjny. Informacja o głębokości jest zakodowana w częstotliwości prążka widmowego. Aby wydobyć informacje, sygnał jest przepuszczany przez spektrometr, a do wyniku stosuje się odwrotny FFT. Odpowiedni sygnał 1D reprezentuje struktury na różnych głębokościach, co odpowiada zmianom indeksu załamania światła⁹ (A-scan). Sterując laserem w jednej osi, można skonstruować przekrój poprzeczny interesującej nas próbki (B-scan) i podobnie, powtarzając proces w sposób krokowy w pozostałej osi, można wygenerować trójwymiarowy obraz (C-scan). Co za tym idzie, można zebrać serię skanów B w jednym wycinku dla powtarzającego się obiektu zmieniającego się w czasie na podstawie zewnętrznego wyzwalacza i powtórzyć, aby wygenerować skan trójwymiarowy, reprezentujący zmienny w czasie obraz płaski¹⁰.

Integrując trzy systemy obrazowania, wzięliśmy pod uwagę następujące dwie zasady. Po pierwsze, czujniki obrazowania nie powinny wykrywać światła z alternatywnej metody obrazowania, a po drugie, fizyczna konstrukcja powinna zawierać wolną przestrzeń dla co najmniej trzech jednoczesnych płaszczyzn obrazowania. Aby spełnić pierwsze wymaganie, mikroskop jasnego pola wykorzystuje diodę LED o długości fali 660 nm do oświetlania próbki w konfiguracji odwróconej. Mikroskop fluorescencyjny jest w konfiguracji epifluorescencyjnej, w której ta sama soczewka obiektywowa jest używana zarówno do wzbudzenia, jak i zbierania emitowanego światła. Światło wzbudzenia ma długość fali od 340 nm do 380 nm, a lampa fotopowielacza (PMT) mierzy emitowane światło o długości fali 510 nm. Para zwierciadeł dichroicznych umożliwia tym dwóm ścieżkom optycznym dzielenie tego samego śladu fizycznego bez zakłócania przeciwnego pomiaru (Rysunek 2). Wreszcie, OCT wykorzystuje światło szerokopasmowe (szerokość widmowa 100 nm) o centralnej długości fali 840 nm, w odróżnieniu od pozostałych dwóch modalności. Ze względu na niską koherencję światła używanego w OCT, jakiekolwiek rozproszone światło ze źródeł fluorescencji w jasnym polu nie przyczyni się do wzorca interferencji, który koduje informacje o głębokości. W przypadku drugiego wymagania konstrukcja obudowy rurki kapilarnej ma dostępne ścieżki optyczne do przedniej, dolnej i górnej płaszczyzny próbki. Podczas eksperymentów dwa platynowe haczyki utrzymują beleczkę w kapilarnej rurki wypełnionej natlenionym roztworem Krebsa-Henseleita (KH). Głowica galwanometru OCT jest zorientowana prostopadle do ścieżki obrazowania fluorescencji w jasnym polu, aby wykorzystać trzecią ortogonalną płaszczyznę optyczną (Rysunek 3).

Ten artykuł przedstawia założenia projektowe dotyczące budowy urządzenia zdolnego do jednoczesnego obrazowania wapnia, długości sarkomeru i geometrii mięśni. Aby zademonstrować te możliwości pomiarowe, opisujemy proces izolowania beleczki komorowej, przygotowanie niezbędnych roztworów buforowych, wraz z krytycznymi etapami związanymi z obsługą i ładowaniem fluorescencyjnym beleczki ex vivo. Na koniec w tym dokumencie przedstawiono procesy wymagane do przekształcenia zestawu danych w bardziej użyteczne wizualizacje.

Protocol

Komisja Etyki Zwierząt Uniwersytetu w Auckland zatwierdziła postępowanie ze szczurami i przygotowanie próbek tkanek.

1. Kalibracja obrazowania

1. Kalibracja pikseli mikroskopu jasnego pola
   1. Napełnij komorę pomiarową wodą destylowaną.
   2. Umieścić siatkę dyfrakcyjną ze znanymi liniami na μm w komorze pomiarowej.
   3. Naciśnij F1, aby włączyć przechwytywanie i dostosować liczbę klatek na sekundę [Hz], aż siatka dyfrakcyjna będzie wyraźnie widoczna (Rysunek 4A). Upewnij się, że kratka dyfrakcyjna przebiega równolegle do krawędzi ramy. Naciśnij ponownie F1, aby zatrzymać przechwytywanie.
   4. Ustaw łączną liczbę obrazów do przechwycenia? na jeden, naciśnij Ctrl + Shift + S, aby przesłać strumieniowo dane na dysk, a następnie naciśnij F1, aby przechwycić obraz siatki dyfrakcyjnej.
   5. Otwórz ImageJ i zaimportuj obraz siatki dyfrakcyjnej (Plik > Otwórz > Wybierz obraz kalibracji). Trzymając Shift, narysuj linię obejmującą 20 jasnych i ciemnych pasm siatki dyfrakcyjnej.
   6. Skalibruj obraz (Analizuj > ustaw skalę). Długość linii z kroku 1.1.5 ustawia wartość Odległość w pikselach. Ustaw wartość Znana odległość na 20-krotność linii na pomiar μm, a jednostkę długości na μm. Odwrotnością skali jest liczba mikrometrów reprezentowana przez piksel.
2. Kalibracja rozdzielczości głębi OCT
   1. Zmierz grubość szkiełka mikroskopowego za pomocą suwmiarki z noniuszem.
   2. Włącz źródło lasera OCT.
   3. Zakryj głowicę galwanometru i kliknij Pobierz BG, aby zmierzyć wzór zakłóceń tła i odjąć go od pomiaru (Rysunek 4B).
   4. Clamp mierzone szkiełko mikroskopowe (od kroku 1.2.1) w ramieniu pomiarowym OCT.
   5. Kliknij opcję Live Stream (Transmisja na żywo), aby wyświetlić obraz OCT. Wyreguluj szklane szkiełko mikroskopu, aż będzie widoczne w B-scan.
   6. Aby przechwycić obraz B-scan, ustaw Zakres Y (kroki) na jeden, kliknij opcję Przesyłaj strumieniowo dane B-skanowania?, a następnie kliknij przycisk Pobierz.
   7. Zaimportuj obraz B-scan do ImageJ (File > Open > Select B-scan). Trzymając Shift, narysuj linię między granicami szklanego szkiełka mikroskopowego.
   8. Ustaw skalę (Analizuj > Ustaw skalę). Ustaw znaną odległość do pomiaru zebranego w kroku 1.2.1.
   9. Aby obliczyć rozdzielczość głębokości w powietrzu, należy skorygować współczynnik załamania światła szkiełka mikroskopowego (n_szkło = 1,5175)¹¹, mnożąc wartość pomiaru na piksel przez n_glass.
      UWAGA: Podane _szkło n jest przeznaczone dla szkła borokrzemianowego. Szkiełka mikroskopowe mogą być wykonane z różnych materiałów. Użyj odpowiedniego współczynnika załamania światła dla mierzonego szkiełka.
   10. Aby przeskalować rozdzielczość głębokości mięśnia sercowego, podziel wartość z kroku 1.2.9. przez n_{mięśnia sercowego} = 1,38 (wartość zgłoszona wcześniej¹²).

2. Przygotowanie próbki mięśniowej

1. Przygotuj platformę do preparacji.
   1. Wlej trochę roztworu preparacyjnego (opisanego w Tabeli 1) do małej metalowej miski i umieść w zamrażarce na około godzinę przed wycięciem serca.
   2. Ustaw urządzenie do preparacji, upewniając się, że roztwór do preparacji jest dobrze natleniony (100% tlenu) i przepłukany przez każdy z przewodów rurowych. Napełnij komorę rozwarstwiającą natlenionym roztworem preparacyjnym i luźno zawiąż szew 3/0 wokół cewnika perfuzyjnego.
2. Wytnij serce.
   1. Znieczulić 8-10-tygodniowego szczura rasy Wistar za pomocą gazowego izofluranu (< 5% tlenu). Potwierdź znieczulenie, szczypiąc ogon.
   2. Ułożyć znieczulonego szczura w pozycji leżącej na plecach i wstrzyknąć podskórnie w okolicę brzucha roztwór heparyny (1000 j.m./kg). Utrzymuj znieczulenie jeszcze przez pięć minut, aby umożliwić krążenie heparyny.
   3. Wyjmij z zamrażarki metalową miskę zawierającą roztwór preparacyjny i umieść ją w pobliżu stołu do eutanazji.
      UWAGA: Unikaj całkowitego zamrażania roztworu preparacyjnego, aby umożliwić całkowite zanurzenie wypreparowanego serca.
   4. Przenieś znieczulonego szczura na stanowisko do eutanazji i poddaj eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
   5. Otwórz klatkę piersiową szczura nożyczkami, najpierw przecinając ścianę ciała wzdłuż spodu klatki piersiowej, następnie przeponę, a następnie przechodząc wzdłuż bocznych granic klatki piersiowej. Podnieś klatkę piersiową z drogi.
   6. Chwyć serce jedną ręką, podczas gdy drugą ręką użyj zakrzywionych nożyczek, aby przeciąć naczynia łączące (aortę, żyłę główną itp.).
   7. Szybko zanurz serce w zimnym roztworze preparacyjnym.
3. Wyizolować beleczkową.
   1. Zidentyfikuj aortę, gdy serce znajduje się w metalowej misce, a następnie przenieś serce do komory rozwarstwiającej. Za pomocą dwóch zakrzywionych kleszczyków przeciągnij aortę nad kaniulą perfuzyjną.
   2. Przytrzymaj aortę na miejscu za pomocą jednego kleszcza. W międzyczasie otwórz przewód rurkowy, aby umożliwić przepływ roztworu preparacyjnego przez kaniulę perfuzyjną.
      UWAGA: Dążyć do zakończenia perfuzji w ciągu minuty po wycięciu serca.
   3. Gdy naczynia wieńcowe zostaną oczyszczone z krwi, a serce zostanie całkowicie wypełnione roztworem preparacyjnym, zatrzymaj przepływ perfuzji i zabezpiecz aortę na miejscu za pomocą szwu. Ponownie włącz przepływ i perfuj kaniulowane serce.
   4. Obróć kaniulę tak, aby lewa tętnica wieńcowa była widoczna na górnej powierzchni. Przypnij wierzchołek serca do dna komory sekcyjnej (Rysunek 5A). Odetnij oba przedsionki (Rysunek 5B).
   5. Za pomocą zestawu nożyczek sprężynowych przeciąć wzdłuż prawej strony przegrody do wierzchołka serca (jak pokazano na Ryc. 5B). Przypnij otwartą lewą komorę do podstawy komory rozwarstwiającej. Następnie przeciąć wzdłuż lewej strony przegrody, otwórz prawą komorę i przypnij ją również do podstawy komory rozwarstwiania (Rysunek 5C).
      UWAGA: Aby ustawić komory w pozycji otwartej, konieczne będzie przecięcie niektórych mięśni brodawkowatych. Zidentyfikuj swobodnie biegnącą beleczkę w prawej komorze (Rysunek 5D-E).
   6. Za pomocą nożyczek sprężynowych i kleszczy przeciąć tkankę ściany otaczającą beleczkową, a następnie przeciąć tkankę ściany na pół prostopadle do kierunku beleczki. Przytnij tkankę ścienną, aż jej wymiar będzie odpowiedni dla zastosowanej konfiguracji montażowej. W tym przypadku mniej więcej połowa wielkości ziarna sezamu (Rysunek 5F).
      UWAGA: Beleczki można wyciąć z prawej i lewej komory, ale te z lewej są zazwyczaj bardziej mętne i mniej odpowiednie do pomiarów sarkomeru i geometrii.
   7. Pozostaw wyciętą beleczkę w komorze rozwarstwiającej, ciągle przetapiając się z roztworem preparacyjnym.

3. Protokół eksperymentalny

UWAGA: device¹³ użyte w tym eksperymencie zostało zbudowane wewnętrznie i korzysta z niestandardowego kodu sterującego. Niezbędnymi kwestiami do zaprojektowania urządzenia zbudowanego w celu replikacji tych danych są dwa niezależnie uruchamiane haki montażowe, komora pomiarowa z trzema optycznie przezroczystymi osiami (Rysunek 3) oraz zewnętrzna linia wyzwalająca, która synchronizuje kamery jasnego pola i OCT ze stymulatorem. Sygnał napięcia i siły PMT zebrano za pomocą analogowych kart DAQ, obrazy z OCT i mikroskopu jasnego pola zebrano za pomocą kart przechwytywania klatek Camera Link, a sygnał bodźca zebrano za pomocą cyfrowej karty I/O. Dane były przechowywane w trybie offline przy użyciu zestawu pętli konsumenckich producenta w celu utrzymania wyrównania czasowego.

1. Przygotuj kardiomiometr.
   1. Przepłukać gorącą (~60 °C) wodą, wodą destylowaną (temperatura pokojowa), a następnie roztworem superfuzatu przez komorę pomiarową. Roztwór superfuzatu należy w sposób ciągły przecierać karbogenem.
   2. Włącz źródło oświetlenia mikroskopu jasnego pola i naciśnij F1, aby włączyć przechwytywanie (Rysunek 4A). Ręcznie wyreguluj hak za urządzeniem, aż zostanie wyśrodkowany na obrazie w jasnym polu. Kliknij opcję Zero Downstream Axis, a następnie Downstream Disabled (Wyłączono downstream), aby włączyć silnik (Rysunek 4C). Przesuwaj suwak DS Setpoint [um] do momentu, aż koniec haka zrówna się z krawędzią domyślnego obszaru zainteresowania.
      1. Ponownie wyzeruj dolną oś, a następnie przesuń suwak DS Setpoint [um] na 1000. Powtórz proces z hakiem upstream, ale nie przesuwaj suwaka US Setpoint [um].
   3. Kliknij Przenieś do montażu (Rysunek 4C).
   4. Uruchom system oświetlenia fluorescencyjnego, przełączając przełącznik Lampa, a następnie szybko włącz podsystemy sterownika, przełączając wyłącznik główny.
      UWAGA: Niektóre źródła światła UV wytwarzają duże ilości ozonu. W takim przypadku podłącz pochłaniacz ozonu do otworu wylotowego źródła światła i upewnij się, że działa przed włączeniem źródła oświetlenia fluorescencyjnego.
   5. Przełącz tryb operacyjny na Turbo-Blanking, naciskając przycisk Mode na panelu przednim, a następnie 2, a następnie 1. Naciśnij przycisk On-line, aby kod sterujący poinformował o operacji.
2. Zamontuj beleczkę.
   1. Wstrzymać przepływ superfusatu przez komorę pomiarową. Napełnij komorę montażową roztworem preparacyjnym
   .
   2. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml przetransportuj beczkę z komory rozwarstwiania do komory montażowej (Rysunek 5G).
   3. Aby przenieść beleczkę, należy umieścić strzykawkę pionowo i w kontakcie z powierzchnią roztworu komory montażowej. Pozwól, aby trabecula opadła do komory montażowej grawitacyjnie (Rysunek 5H).
   4. Obniż poziom płynu w komorze montażowej tak, aby znajdował się na poziomie środkowej części haków.
   5. Dostosuj odległość między hakami, aby odzwierciedlić długość luzu trabecula, przesuwając suwak DS Setpoint [um].
   6. Używając mikroskopu do wizualizacji, delikatnie chwyć jeden z kawałków tkanki końcowej kleszczami i zamontuj go na haku przed nim. Zamontuj drugi kawałek tkanki końcowej na dolnym haku (Rysunek 5I).
   7. Po bezpiecznym zamontowaniu przenieś belekcję z powrotem do komory pomiarowej (Rysunek 5J), naciskając Przenieś do komory (Rysunek 4C). Wznów przepływ superfuzatu i ekstrakcję płynu.
   8. Ustaw częstotliwość bodźca [Hz] na 1, czas trwania bodźca [ms] na 10, a napięcie bodźca na 10. Rozpocznij stymulację, naciskając przycisk Stimulus On?.
3. Przygotuj beleczkową beleczkę.
   1. Po około 1 godzinie aklimatyzacji stopniowo zmniejszaj napięcie bodźca i czas trwania bodźca odpowiednio w krokach co 1 V i 1 ms. Typowy zestaw wartości to 3 V i 3 ms.
   2. Włącz system oświetlenia w jasnym polu. Naciśnij F1 i wybierz obszar zainteresowania, który obejmuje obszar prążkowany w interfejsie użytkownika. Kliknij opcję Oblicz SL?, aby obliczyć średnią długość sarkomeru w wyróżnionym obszarze. Zwiększ długość mięśnia, aż średnia długość sarkomeru wyniesie 2,32 μm, zwiększając suwak Nastawa separacji [um].
      UWAGA: Umowa SL na obliczenia? używa FFT 2D opisanego w kroku 4.3. Obszar zainteresowania używany do obliczania średniej długości sarkomeru to zazwyczaj kwadrat od 100 μm do 150 μm. Dlatego, gdy mięsień zbliża się do optymalnej długości sarkomeru, do obliczenia średniej długości sarkomeru używa się od 43 do 65 sarkomerów.
   3. Przesuń mięsień, regulując suwak Center Setpoint [um] na karcie "Center and Separation Control" (Rysunek 4C) tak, aby krawędź dolnego haka była widoczna tylko w jasnym polu. Zbierz informacje o fluorescencji dla dziesięciu drgań.
   4. Zwiększ wartość nastawy środkowej [um] o 200 i zbierz informacje o fluorescencji o wartości kolejnych dziesięciu drgań. Powtarzaj ten proces, aż obraz w jasnym polu będzie zawierał punkt zaczepienia. Zbierz informacje o fluorescencji z ostatniego okna.
   5. Przywróć beleczkę do pozycji środkowej, ustawiając wartość zadaną środka [um] na 0.
   6. Zmniejsz częstotliwość bodźca do 0,2 Hz i przełącz się z superfusatu KH na roztwór ładujący Fura-2 (szczegółowo w Tabeli 1).
   7. Mierz sygnał fluorescencji co 10 minut, klikając Włącz źródło fluorescencji na karcie Stim and Data. Wizualizuj sygnał fluorescencji na karcie Sygnał PMT.
   8. Po 10-krotnym wzroście sygnału 360 nm lub przekroczeniu 2 godzin czasu trwania procedury ładowania, należy przywrócić częstotliwość bodźca do 1 Hz i przełączyć się z powrotem na roztwór superbezpiecznika KH.
   9. Sprawdzaj pomiar proporcji co 10 minut, aż pomiar proporcji się ustabilizuje, w którym to momencie można rozpocząć zbieranie danych.
4. Zbieraj dane obrazowania w jasnym polu i fluorescencji.
   1. Przywróć mięsień do pozycji, w której krawędź dolnego haka jest po prostu obecna na obrazie w jasnym polu. Rozpocznij strumieniowe przesyłanie danych sprzętowych, klikając opcję Przesyłaj strumieniowo dane na dysk na karcie Stim and Data (Stymulator i dane) w interfejsie użytkownika sterowania sprzętem. Przechwyć informacje o fluorescencji, klikając opcję Włącz źródło fluorescencji.
   2. W interfejsie użytkownika obrazowania w jasnym polu ustaw tryb przechwytywania na wyzwalacz zewnętrzny, zwiększ częstotliwość odświeżania do 100 Hz i ustaw liczbę przechwytywanych obrazów na 100. Naciśnij Ctrl + Shift + S, a następnie F1, aby nagrać dane obrazowania w jasnym polu dla tego okna.
   3. Zwiększ wartość zadaną środka [um] o 200 i powtórz krok 3.4.2. Kontynuuj korzystanie z protokołu skanowania, aż dane obrazowania zostaną zebrane dla ostatniego okna z kroku 3.3.4.
   4. Przywróć beleczkę do pozycji środkowej, ustawiając wartość zadaną środka [um] na 0.
5. Zbieraj dane obrazowania OCT.
   1. Włącz źródło lasera OCT, przekręcając główny na symbol | , naciskając przycisk zasilania, a następnie przycisk SLDs.
   2. Zakryj głowicę galwanometru i kliknij Pobierz BG, aby zmierzyć wzór zakłóceń tła i odjąć go od pomiaru (Rysunek 4B).
   3. Ustaw tryb przechwytywania obrazu na podgląd na żywo.
   4. Dostosuj pozycję y, aż obraz B-scan będzie zawierał tylko hak poprzedzający. Podziel długość mięśnia wyświetlaną na przednim panelu sterowania (Rysunek 4B) przez dwa i odejmij aktualną pozycję y. Wprowadź tę wartość w polu wejściowym "y-offset". Dostosuj wartość "przesunięcia x", aż przekrój poprzeczny beczek zostanie wyśrodkowany w ramce.
   5. Gdy beczek jest wyśrodkowany, skanuj wzdłuż osi y, dostosowując pozycję y, aby znaleźć pozycje odpowiadające hakom w górę i w dół. Zanotuj te pozycje w dół. Ustaw Zakres Y (kroki) na bezwzględną różnicę między tymi wartościami podzieloną przez dziesięć.
   6. Ustaw tryb przechwytywania obrazu na Wyzwolony bodziec?, Zakres X (kroki) na 100 i kliknij przycisk Ustaw aktywne parametry.
   7. Kliknij opcję Stream B-Scan Data?, a następnie Acquire.
      UWAGA: Protokół obrazowania bramkowanego wymaga 200 drgań, aby uchwycić całą geometrię mięśni dla próbki o długości 2 mm, co odpowiada czasowi przechwytywania wynoszącemu ~3 min 20 s.

4. Przetwarzanie zestawu danych obrazu w jasnym polu

1. Przygotuj obrazy do analizy.
   1. Importuj obrazy do ImageJ (File > Import > Image Sequence > Select image).
   2. Zwiększ kontrast obrazu (suwaki Dostosuj >> Jasność/Kontrast obrazu > Przesuń minimalnie i Maksimum, aby wyśrodkować histogram obrazu).
   3. Wyostrz obrazy (Filtry > procesowych > Maska wyostrzająca > ustaw Promień (sigma) na 1,0 piksela, a Grubość maski (0,1-0,9) na 0,6).
   4. Wyeksportuj sekwencję obrazów (Zapisz jako sekwencję obrazów > > ustaw format na PNG, zacznij od 0, a cyfry (1-8) do 4).
2. Zszyj obrazy, zmierz zlokalizowane przemieszczenie i oblicz lokalne długości sarkomerów.
   1. Otwórz plik "TrabeculaProcessing.m" (dostępny na żądanie) i ustaw zmienną FolderPath na główny folder zawierający wszystkie dane, a ImagePath na folder, w którym została zapisana sekwencja obrazów z kroku 4.1.4. Ustaw sekcje na liczbę okien obrazowania, a klatki na liczbę przechwyconych klatek na okno.
   2. Uruchom plik code.
      UWAGA: Dane wyjściowe będą znajdować się w ścieżce folderu wyjściowego określonej przez użytkownika. (Domyślnie ścieżka jest ustawiona na FolderPath/Output).
3. Technika długości sarkomeru FFT
   1. Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby wykonać FFT w obszarze obrazu, w którym sarkomery są dobrze widoczne.
   2. Pomnóż liczbę pikseli na μm wyniki kalibracji z kroku 1.1.6 przez 1,6 μm i 3,0 μm przed obliczeniem odwrotności, aby uzyskać zakres interesujących nas częstotliwości przestrzennych.
   3. Dopasuj wykładnik do wyniku FFT, ignorując informacje o częstotliwości w zakresie częstotliwości obliczonym w kroku 4.3.2, a następnie odejmij go od wyniku transformacji, aby usunąć składnik DC.
   4. Dopasuj krzywą Gaussa do interesującego Cię pasma częstotliwości.
   5. Oblicz odwrotność szczytu krzywej Gaussa. Jest to średnia długość sarkomeru dla obszaru zainteresowania.
      UWAGA: Obliczenia FFT i dopasowanie równań wykładniczych i gaussowskich zostały wykonane przy użyciu niestandardowego kodu LabVIEW.

5. Przetwarzanie danych fluorescencyjnych

1. Odejmij autofluorescencję zależną od okna od odpowiedniego okna i oblicz iloraz sygnałów związanych z długościami fal wzbudzenia 340 nm i 380 nm.

6. Przetwarzanie danych obrazowania OCT

1. Przygotuj zestaw obrazów OCT do segmentacji.
   1. Otwórz ImageJ i zaimportuj obrazy (File > Import > Image Sequence). W oknie eksploratora plików otworzy się, zlokalizuj obrazy, wybierz jeden i kliknij Otwórz.
      UWAGA: Jeśli kod sterujący dla OCT nie przechowuje obrazów w formacie czytelnym dla ImageJ, przekonwertuj je na PNG.
   2. Aby ułatwić wizualizację, zorganizuj sekwencję obrazów w hiperstos (Obraz > Hyperstacks > Stos do Hyperstack). W oknie dialogowym, które zostanie otwarte, ustaw liczbę plasterków na liczbę skanów B na plasterek, a X na liczbę plasterków wzdłuż długości beleczki.
   3. Narysuj prostokąt otaczający beleczkową. Upewnij się, że obejmuje cały wolumin w czasie, używając suwaków w oknie hyperstack. Przytnij obraz do okna (Obraz > Przytnij).
   4. Usuń plasterki, które zawierają obrazy haków montażowych (Stosy > Narzędzia > Keeper plasterków). Zaznacz zakres plasterków, który zawiera tylko informacje o beleczku.
2. Segmentacja pociągów WEKA.
   1. Otwórz segmentację WEKA (wtyczki > segmentacji > trenowalnej segmentacji WEKA).
   2. Ustaw tryb wyboru na Odręczny.
   3. Kliknij Ustawienia i dostosuj ustawienia klasyfikatora i trenowania. (W tym modelu użyto następujących funkcji treningowych: rozmycie gaussowskie, filtr Sobela, hesjańska, różnica gaussowskich, projekcje membranowe, dwustronne i Lipschitz. Grubość membrany została ustawiona na 1, rozmiar łatki membrany na 8, minimalna sigma na 1, a maksymalna sigma na 32. Klasyfikator został ustawiony na FastRandomForest, a opcje klasyfikatora zostały ustawione na: batchSize 100, maxDepth na 32, numFeatures na 32, numThreads na 0 i numTrees na 200.)
   4. Ręczne segmentowanie obrazów do momentu uzyskania wyników szkolenia w postaci zadowalających segmentacji.
   5. Zapisz klasyfikator.
3. Segmentacja przetworzonych skanów B
   1. Uruchom segmentację WEKA zgodnie z krokiem 6.2.1.
   2. Załaduj klasyfikator z kroku 6.2.5.
   3. Kliknij przycisk Create Result (Utwórz wynik).
   4. Przekonwertuj obrazy na 8-bitowe (Typ > obrazu > 8-bitowe).
   5. Przekonwertuj obrazy na binarne (Process > Binary > Make Binary > Default method i domyślne tło).
   6. Zapisz jako sekwencję obrazów (PNG).
4. Oblicz średnią CSA na podzielonych na segmenty obrazach B-scan.
   1. Policz liczbę białych pikseli w binarnym obrazie B-scan.
   2. Pomnóż obszar piksela przez skalibrowaną rozdzielczość głębi (z kroku 1.2) i 10 μm (odległość między sąsiednimi skanami A).
   3. Powtórz te czynności dla wszystkich skanów B między hakami i uśrednij pomiary.
5. Konwertuj podzielony na segmenty obraz na siatkę.
   1. Otwórz plik "OCTmain.m" (dostępny na żądanie) i ustaw imageDirectory na folder zawierający dane wyjściowe z kroku 6.3.6. Ustaw outputPath zgodnie z potrzebami.
   2. Ustaw plasterki na wartość "Zakres Y (kroki)" (krok 3.5.5), a klatki na wartość "Powtórz X" (krok 3.5.6), z_dim na rozdzielczość głębi (krok 1.2.10), a x_dim i y_dim na wartość przypisaną do 10.
   3. Kliknij przycisk Uruchom.

Results

Aby uchwycić informacje o regionalnym Ca²⁺ i jasnym polu dla całej długości prezentowanego tutaj trabecula, wymagane było siedem pozycji mięśni. Rysunek 6 sugeruje, że siła drgań nie została zakłócona przez ten ruch, ujawniając, że nie było zależności od pozycji produkcji aktywnej siły.

B-skany zebrane za pomocą optycznej koherentnej tomografii z częstotliwością 100 Hz zostały podzielone na segmenty za pomocą wtyczki ImageJ WEKA¹⁴ (Rysunek 7A). Każdy przekrój wydaje się zniekształcony ze względu na różnicę między rozdzielczością boczną (10 μm) a głębokościową (1,73 μm (w mięśniu sercowym)). Zniekształcenia te zostały skorygowane poprzez przeskalowanie osi głębi obrazu za pomocą bocznego stosunku rozdzielczości do głębokości. Rysunek 7B,C pokazuje, że po przeskalowaniu surowego skanu C beleczki jest ona w przybliżeniu cylindryczna w geometrii. Odbicie ścianki komory pomiarowej może czasami pokrywać się z danymi mięśniowymi ( Rysunek 7A, B), ale oprogramowanie do segmentacji można wytrenować, aby to uwzględnić ( Rysunek 7D, E). Po podzieleniu na segmenty, pole przekroju poprzecznego wzdłuż długości mięśnia można obliczyć przez cały skurcz (Rysunek 7F). Zauważ, że ta konkretna bebecula ma mały wyrostek odgałęziający się od niej. Ruch gałęzi jest widoczny ~0,75 mm wzdłuż beleczka. Na koniec podzielone na segmenty obrazy można przekształcić w siatki, aby pomóc w budowie modeli geometrycznych (Rysunek 7G).

Dane obrazowania zebrane w każdej z różnych pozycji beleczki z szybkością 100 fps zostały zszyte razem, aby stworzyć jeden kompletny obraz trabecula (Rysunek 8A). Rozdzielczość tych obrazów wynosi 0,535 μm/piksel. Zastosowanie liniowych funkcji ważenia w nakładających się na siebie obszarach sąsiednich okien ułatwia wizualizację i minimalizuje wpływ winiety obecnej na obrazach w jasnym polu. Aby zmierzyć sygnał fluorescencyjny, okienko trabeculi o wymiarach 540 μm na 540 μm jest cyklicznie oświetlane światłem o długości fali 340 nm, 365 nm i 380 nm z częstotliwością 600 Hz. Stosunek emitowanej fluorescencji związanej ze światłem wzbudzenia 340 nm i 380 nm koreluje z wewnątrzkomórkowym wapniem po obciążeniu beleczki Fura-2. Ponieważ ten pomiar jest stosunkiem, efektywna szybkość pomiaru wynosi 200 Hz. Uśrednione (n = 10) wewnątrzkomórkowe stany przejściowe Ca²⁺ z każdego okna są wyrównane z regionem, w którym zostały zobrazowane (Rysunek 8B). Podczas gdy szczyt stanów nieustalonych wydaje się dość spójny, rozkurczowy [Ca²⁺] jest niższy w obszarze od 900 μm do 1800 μm wzdłuż belecznicy. Podobnie, wyniki obliczeń śledzenia przemieszczeń (Rysunek 8C) i długości sarkomeru (Rysunek 8D) również wskazują na obecność zmienności regionalnej. Zastosowana technika śledzenia bez znaczników jest w stanie przetworzyć przemieszczenie każdego piksela, przy odpowiednim kontraście. Podczas mapowania rozkładu długości sarkomeru w post, do obliczenia regionalnej długości sarkomeru użyto obszaru korelacji krzyżowej o wymiarach 128 pikseli na 128 pikseli (~67 μm na 67 μm). Obszar ten obejmuje około 29 sarkomerów, gdy próbka jest bliska optymalnej długości sarkomeru. Rozmiar kroku (zarówno w kierunku x, jak i y) między środkiem ciężkości każdego okna korelacji krzyżowej został ustawiony na 50 pikseli (~26 μm) w celu przetworzenia tych danych. Przydatność oszacowań długości sarkomeru przetestowano na podstawie szerokości i amplitudy dopasowania Gaussa do sygnału FFT. Warunek ten nie został spełniony w obszarze mięśniowym od 0 μm do 500 μm, więc nie można było tam obliczyć informacji o długości sarkomeru. Biorąc pod uwagę związane z tym przemieszczenia, jest prawdopodobne, że sarkomery w tym regionie wydłużyły się w fazie kurczenia się. Zgodnie z tymi spekulacjami, średnia długość sarkomeru po prawej stronie beleczki skraca się w tym okresie. Łącząc informacje dostarczane przez każdy z paneli, wydaje się, że obszar o największym polu przekroju poprzecznego nie wytwarza najbardziej znaczącej siły. Zakładając, że regionalna zmienność stanów nieustalonych Ca²⁺ ma w przybliżeniu gładki gradient, Rysunek 8B wskazuje, że transjent o największej amplitudzie Ca²⁺ występuje gdzieś między 1300 μm a 1600 μm wzdłuż beleczki. Mapa przemieszczeń wskazuje, że obszar, który podlega najmniejszemu ruchowi, dobrze pokrywa się z stanem przejściowym piku Ca²⁺. Jednak ten obszar ma najmniejsze pola przekroju poprzecznego próbki. Mając na uwadze te dane, można wywnioskować, że to właśnie ten region generował najwięcej stresu.

Rysunek 1: Obraz kardiomiometru z adnotacjami. Każdy z głównych elementów optycznych jest zarysowany. Wstawka zawiera zbliżenie, widok z tyłu, obiektywu mikroskopu in situ, poniżej komory pomiarowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Ścieżka optyczna dla jednoczesnej mikroskopii jasnego pola i fluorescencji. Źródłem oświetlenia mikroskopu fluorescencyjnego jest ksenonowa lampa łukowa, której moc wyjściowa cyklicznie przełącza się między światłem 340 nm, 365 nm i 380 nm. Ścieżka wyjściowa lampy łukowej zawiera zwierciadło dichroiczne o długości fali granicznej 409 nm, które odbija światło UV na lustro, które kieruje światło do obiektywu mikroskopu fluorescencyjnego. Soczewka skupia światło wzbudzenia na próbce i zbiera wyemitowane światło, które ma dłuższą długość fali 510 nm. To emitowane światło przechodzi przez pierwsze zwierciadło dichroiczne, ale nie przez drugie, ponieważ ma ono długość fali granicznej 552 nm. Następnie soczewka pola skupia odbite światło na czujniku PMT. Tymczasem źródło oświetlenia (dioda LED 660 nm) dla mikroskopu jasnego pola znajduje się nad próbką. Przechodzące światło jest skupiane na próbce przez soczewkę kondensatora, a obiektyw fluorescencyjny o × 20 rejestruje wynikowy obraz transmisyjny. Długość fali używanej do oświetlenia w jasnym polu przekracza długość fali granicznej każdego zwierciadła dichroicznego, więc przechodzi przez oba zwierciadła, zanim obraz zostanie ustawiony na matrycy kamery CMOS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Projekt uchwytu komory pomiarowej. (A) Izometryczny widok uchwytu komory pomiarowej z nałożonymi ścieżkami optycznymi. Oświetlenie w jasnym polu odbywa się od górnej powierzchni (oś z); Oświetlenie fluorescencyjne następuje od dolnej powierzchni (oś z), a sygnał OCT ramienia pomiarowego jest prostopadły do drugiej osi oświetlenia (oś y). Podczas eksperymentu dwa platynowe haczyki przytrzymują beleczkę w szklanej rurce kapilarnej, która działa jako komora pomiarowa. Silniki z cewką drgającą sterują każdym zaczepem, a ich położenie jest mierzone za pomocą interferometrii laserowej. Aktualna pozycja jest porównywana z wartością zadaną zdefiniowaną przez użytkownika, a za pomocą regulatora PID zakodowanego w układzie FPGA błąd jest minimalizowany. (B) Komora pomiarowa in situ z włączonym oświetleniem jasnego pola. Widok z tyłu jest pokazany we wstawce Rysunek 1. (C) Schemat przepływu superbezpiecznika przez uchwyt komory pomiarowej. Superfusat dostaje się do tylnej części bloku i płynie w kierunku wskazanym strzałkami. Elektrody przed i za elektrodą wytwarzają stymulację pola w celu wywołania skurczu zamontowanej beleczki w komorze pomiarowej. Niebieskie cieniowanie wskazuje obszary, w których przepływa superfusat podczas eksperymentu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Panel przedni oprogramowania do akwizycji i kontroli obrazu. (A) Interfejs użytkownika obrazowania w jasnym polu. (B) Interfejs użytkownika obrazowania OCT. (C) Interfejs użytkownika sterowania sprzętem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Protokół rozwarstwienia i montażu Trabecula. (A) Serce szczura z perfuzją Langendorffa w komorze prosektoryjnej. (B) To samo serce z usuniętym przedsionkiem. Linie przerywane wskazują trajektorię wycięcia w celu otwarcia komór. (C) Otwarte serce w celu odsłonięcia wnętrza obu komór. Przerywane pole wskazuje obszar, w którym zwykle znajdują się beleczki. (D) Wycięty obszar ściany prawej komory (taki sam, jak wskazuje przerywana ramka w C). Linie przerywane podkreślają trzy beleczki. (E) Trabecula wybrana z trzech w D. (F) Trabecula z panelu E z usuniętą tkanką ścienną. (G) Wyizolowana bełeczka na końcu strzykawki o pojemności 1 ml. (H) Trabecula w komorze montażowej. (I) Bebeczka zamontowana pomiędzy dwoma platynowymi hakami. (J) Beleczka, zamontowana pomiędzy hakami, w obrębie komory pomiarowej (Rysunek 3B). Zielona plama to artefakt z pierwszego filtra dichroicznego. (K) Kąt wtórny zamontowanego belekusa w komorze pomiarowej. Odległość między beleczką a soczewką obiektywu mikroskopu wynosi około 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Zależność od pozycji pomiaru siły. Siła wytwarzana przez mięsień z każdej z pozycji obrazowania (n = 7) nałożona na siebie. Średnia produkcja siły czynnej wynosiła 0,527 mN ± 0,003 mN, czas do 50% skurczu 77,1 ms ± 0,3 ms, a czas do 50% relaksu 328,1 ms ± 0,9 ms (wszystkie dane przedstawiono jako średnią ± SE). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Analiza obrazowania OCT. (A) Przykład segmentacji WEKA. Podzielony na segmenty przekrój mięśnia jest podświetlony na czerwono, a tło jest podświetlone na zielono. (B) Doskonały widok surowych danych C-skan beleczki. Jasna linia pod kątem w kierunku górnej części obrazu to odbicie ścianki komory pomiarowej. (C) Widok boczny surowych danych C-skan beleczki. (D) Lepszy widok na segmentowane dane OCT. (E) Widok boczny danych OCT podzielonych na segmenty. (F) Pole przekroju poprzecznego wzdłuż długości beleczka (oś x) w czasie (oś y). Średnia powierzchnia przekroju poprzecznego wzdłuż długości mięśnia wynosiła 0,0326^mm2 ± 0,0005^mm2 (średnia ± S.E.) (G) Oczko beleczki. Siatka została w przybliżeniu wyrównana z wykresem pola przekroju poprzecznego panelu F. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Analiza obrazowania w jasnym polu i fluorescencji. (A) Zszyty obraz (siedem okien obrazowania) beleczki. (B) Ca²⁺ stany nieustalone wzdłuż beleczki na całej długości. (C) Średnie przemieszczenie x z każdego okna obrazowania. Przemieszczenie dodatnie oznacza ruch w prawo, a ujemny w lewo. (D) Średnie długości sarkomerów z każdego okna obrazowania, które miało wymagany kontrast obrazu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Tabela rozwiązań Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Discussion

W tym badaniu przedstawiamy konfigurację, która umożliwia montaż trzech układów optycznych łączących obrazowanie jasnego pola, fluorescencji i OCT w celu zebrania danych z aktywnie kurczącej się bełeczki serca ex vivo (ryc. 1 i ryc. 2). Tak zaaranżowana integracja jest możliwa dzięki konstrukcji komory pomiarowej (rysunek 3), która umożliwia ortogonalne ułożenie OCT do osi jasne pole-fluorescencja. System mocowania mięśni odgrywa równie ważną rolę w powodzeniu jednoczesnych kwantyfikacji kluczowych wskaźników w charakterystyce dynamiki pobudzenia i skurczu mięśnia sercowego. Jego nowość polega na tym, że umożliwia procedury skanowania mięśni bez widocznych zakłóceń mechanicznej wydajności mięśnia (ryc. 6). Dzięki połączonej konfiguracji obrazowania i zmotoryzowanemu systemowi hakowemu do pomiaru siły, system ten może oceniać regionalną niejednorodność w stanach przejściowych Ca²⁺ , przemieszczeniu i długości sarkomeru, wraz z makroskopowymi informacjami geometrycznymi kurczącej się beleczki w całym przebiegu drgań (ryc. 7 i ryc. 8).

Biorąc pod uwagę wszechobecność systemów obrazowania w jasnym polu i epifluorescencji w laboratoriach badań kardiologicznych, odtworzenie tych wyników można osiągnąć przy niewielkich względach sprzętowych. W tym miejscu przedstawiamy zestaw narzędzi do przetwarzania obrazu do łączenia epifluorescencji jasnego pola i OCT, który jest niezbędny do analizy leżącej u podstaw niejednorodności skurczowej. Integracja OCT wymaga niezakłóconej ścieżki optycznej, podczas gdy obrazowanie bramkowane wymaga zewnętrznej linii wyzwalania między bodźcem a zarówno OCT, jak i kamerą do obrazowania w jasnym polu oraz haków mocujących mięśnie, które są w stanie przesuwać próbkę w całej komorze pomiarowej. Wymagane oprogramowanie i metody przetwarzania końcowego są swobodnie dostępne. W szczególności zastosowane oprogramowanie do segmentacji, WEKA¹⁴, jest open-source. Technika bezznacznikowego śledzenia punktów materialnych⁸, długości sarkomeru, bramkowanego obrazowania wolumetrycznego¹⁰ i kodów generowania siatki jest również dostępna i może być udostępniona na żądanie u autora korespondencyjnego.

Żywotność mięśni, optymalne obciążenie Fura-2 i skupienie obrazu to trzy filary, które tworzą fundamenty udanego eksperymentu. Stosowanie roztworu preparacyjnego zawierającego BDM w celu zapobiegania przykurczom, transport mięśnia w strzykawce, ciągłe natlenianie roztworu i przygotowywanie nowych roztworów eksperymentalnych w dniu eksperymentu przyczynia się do wysokiego wskaźnika żywotności mięśni. Przed załadowaniem beleczka Fura-2AM należy pobrać autofluorescencję dla każdego stanu, który jest zainteresowany badaniem, ponieważ może to mieć znaczący wpływ na zmierzony stan przejściowy Ca^{2 + 15}. Natlenienie roztworu ładującego Fura-2AM jest skomplikowane ze względu na niezbędne włączenie środka powierzchniowo czynnego pluronic-F127 w celu ułatwienia ładowania barwnika. Aby zwalczyć powstające w ten sposób nadmierne tworzenie się pęcherzyków spowodowane przez ten środek powierzchniowo czynny, niewielka kropla środka przeciwpieniącego w roztworze ładującym pozwala użytkownikowi zwiększyć szybkość natleniania, zwiększając w ten sposób szansę na utrzymanie żywotności funkcjonalnej przez cały proces ładowania. Wreszcie, ostrość obrazowania musi być jednolita na całej długości mięśni, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu w jasnym polu i informacji fluorescencyjnej.

Istnieją dwa ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę w przypadku przedstawionych tutaj metod. Pierwszą z nich jest rozdzielczość przestrzenna mikroskopu fluorescencyjnego. Podczas gdy rozdzielczości przestrzenne obrazowania OCT i jasnego pola są wysokie, rozdzielczość mikroskopu fluorescencyjnego jest ograniczona do całki fluorescencji z objętości uchwyconej w oknie obrazowania 540 μm na 540 μm. Istnieje możliwość zwiększenia rozdzielczości przestrzennej mikroskopu fluorescencyjnego poprzez zastosowanie kamery ze sprzężeniem ładunkowym o wysokim wzmocnieniu, zamiast PMT, do przechwytywania sygnału fluorescencji kosztem stosunku sygnału do szumu¹⁶. Druga to średnica beleczka, którą można badać pod kątem mierzalnej długości sarkomeru i głębokości geometrycznej. Podejście FFT w oknie do obliczania długości sarkomeru wykorzystuje korzyści płynące z lepszej rozdzielczości przestrzennej, ale wiąże się ze zmniejszoną odpornością (rysunek 8D). W przypadkach, gdy mają być badane mętne lub duże średnice beleczki, rozdzielczość FFT będzie znacznie zmniejszona ze względu na zmniejszony kontrast związany z pasmami sarkomerycznymi w większych próbkach tkanek. Podobnie, w obrębie KTZ, odbicia wsteczne od głębokości obrazowania większej niż 300 μm będą zbyt słabe, aby można je było rozdzielić na etapie segmentacji. W związku z tym nasza technika ogranicza się do beleczek o średnicy mniejszej niż 300 μm. Nie zaleca się jednak badania próbek o dużej średnicy, ponieważ mogą wystąpić problemy z dyfuzyjnym natlenieniem rdzenia mięśniowego podczas wysokich wskaźników stymulacji¹⁷.

Nasza metoda umożliwia ocenę jonowych funkcji mechanicznych w połączeniu z geometrią mięśni w zdrowych i chorych mięśniach, zapewniając potężne podejście do zrozumienia fizjologii, patofizjologii i farmakologii mięśnia sercowego. Przedstawiony tutaj potok przetwarzania obrazu wyodrębnia dane, które będą miały kluczowe znaczenie dla głębszego zrozumienia niejednorodności skurczowej. Jedną ze sposobów na pełne wykorzystanie potencjału tak bogatego zbioru danych jest budowa modeli matematycznych, które integrują i interpretują te dane, a także dokonują przewidywań, które można przetestować eksperymentalnie za pomocą naszego urządzenia.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Monoksym 2,3-butanodionu	Acros Organics	150375000
20 razy; soczewka mikroskopu	Nikon	CFI Super Fluor 20 razy;	NA 0.75
Galwanometr 2D	Thorlabs	GVSM002/M
50-50 rozdzielacz wiązki	Thorlabs	FC850-40-50-APC
90-10 rozdzielacz wiązki	Thorlabs	TW850R2A2
Moduł wejść analogowych	National Instruments	NI-9205	Rejestruje sygnał PMT przy 200 kHz
Źródło światła do obrazowania w jasnym polu	CoolLED	PE-2	660  nm
LAM Szerokopasmowe źródło światła	Superlum	Broadlighter-840
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Karta Cameralink	National	Instruments NI-1429	Chwytak ramki do obrazowania w jasnym polu
Carbogen 5	BOC	Kod gazu: 181
Soczewka kondensora	Nikon	LWD 0.52
D(+)-Glukoza	Merck	108337
DAQ	National Instruments	NI-6259	Wyzwala ruch galwanometru
Lustro dichroiczne 1	Semrock	FF409-Di03
Lustro dichroiczne 2	Semrock	FF552-Di02
Siatka dyfrakcyjna	Wasatch Photonics	1200 linii/mm @840 nm
Dimetylosulfotlenek	Sigma-Aldrich	276855
Direct-Q 3 UV System	Merck Millipore	ZRQSVR3WW	Maszyna do wody destylowanej
Sucha kąpiel	Corning	6875-SB	LSE cyfrowa sucha kąpiel
FIJI	ImageJ		Oprogramowanie do przetwarzania obrazu o otwartym kodzie
źródłowym Fura-2AM sól pentapotasowa	Thermofisher	F14186
Sprzętowa karta FPGA	National Instruments	NI-7813R	Kontroluje również wyzwalanie wychwytywania jasnego pola
Heparyna Pfizer		61024
HEPES	PanReac AppliChem	A1069
Mikroskop odwrócony	Nikon	TI-DH Słup
Izofluoran	MedSource	VAPDRUGISO250
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Kamera liniowa	Basler	spL2048-70km	Kamera spektrometryczna
Mieszadło magnetyczne	IKA	3810000	RCT basic
Matlab	Mathworks		Kod przetwarzania danych
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	M1880
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
NaH2PO4.2H2O	Sigma-Aldrich	71505
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Karta FPGA OCT	National Instruments	NI-1483R
Zbiornik tlenu	BOC	Kod gazu: pH-metr 100D
fotopowielacza	Mettler Toledo	MP220
	Hamamatsu	H7422-20
Powerload	Thermofisher	P10020
Dioda superluminescencyjna	Broadlighter	D-840
Wzmacniacz transimpedancyjny	Niestandardowy
Tris(hydroksymetylo)aminometan	Sigma-Aldrich	252859
Wistar rat	Vernon Jansen Jednostka		8 – 10 tygodni
Lampa ksenonowa łukowa	Sutter Instrument	DG-4	Lambda DG-4