Artykuł metodologiczny

Jednoczesne obrazowanie w jasnym polu, fluorescencji i optycznej koherentnej tomografii kurczących się beleczków serca ex vivo

4.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62799

⸱

2 października 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Auckland Bioengineering Institute, University of Auckland, 2Department of Engineering Science, University of Auckland

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia zbiór sarkomerów, wapnia i makroskopowych danych geometrycznych z aktywnie kurczącego się trabecula serca ex vivo. Te równoczesne pomiary są możliwe dzięki integracji trzech modalności obrazowania.

Streszczenie

W mięśniu sercowym, wewnątrzkomórkowe stany przejściowe Ca2+ aktywują kurczliwe miofilamenty, powodując skurcze, makroskopowe skrócenie i deformację geometryczną. Nasze zrozumienie wewnętrznych relacji między tymi zdarzeniami jest ograniczone, ponieważ nie możemy ani "zajrzeć" do wnętrza mięśnia, ani precyzyjnie śledzić czasoprzestrzennej natury dynamiki pobudzenia i skurczu. Aby rozwiązać te problemy, skonstruowaliśmy urządzenie, które łączy w sobie zestaw modalności obrazowania. W szczególności integruje mikroskop jasnego pola do pomiaru lokalnych zmian długości sarkomeru i odkształcenia tkanki, mikroskop fluorescencyjny do wizualizacji stanu przejściowego Ca2+ oraz optyczny tomograf koherentny do uchwycenia zmian geometrycznych tkanki w całym przebiegu cyklu sercowego. Przedstawiamy tutaj infrastrukturę obrazowania i związane z nią ramy gromadzenia danych. Dane są zbierane z izolowanych struktur tkankowych przypominających pręciki, znanych jako beleczki carneae. W naszym instrumencie para platynowych haczyków z kontrolowanym położeniem przytrzymuje każdy koniec próbki mięśniowej ex vivo, podczas gdy jest ona w sposób ciągły przepełniana bogatym w składniki odżywcze roztworem soli fizjologicznej. Haki są pod niezależną kontrolą, co pozwala na kontrolę długości i siły mięśni w czasie rzeczywistym. Translacja wzdłużna umożliwia fragmentaryczne skanowanie próbki, pokonując ograniczenia związane ze względną wielkością okienka obrazowania mikroskopu (540 μm na 540 μm) i długością typowej beleczki (>2000 μm). Platynowe elektrody na obu końcach komory mięśniowej stymulują beleczkę w tempie zdefiniowanym przez użytkownika. Wykorzystujemy sygnał stymulacji jako wyzwalacz do synchronizacji danych z każdego okna obrazowania, aby zrekonstruować drganie całej próbki w warunkach stanu ustalonego. Zastosowanie technik przetwarzania obrazu do tych danych obrazowania w jasnym polu zapewnia mapy przemieszczeń tkanek i długości sarkomerów. Taki zbiór danych, po włączeniu do procesu modelowania eksperymentu, zapewni głębsze zrozumienie jednorodności i heterogeniczności skurczów mięśni w fizjologii i patofizjologii.

Wprowadzenie

Superfuzja preparatów izolowanej tkanki mięśnia sercowego jest standardowym i szeroko stosowanym protokołem do badania aktywacji jonów i mechaniki serca1. W szczególności odizolowanie beleczków, pręcikowatych struktur od ścian komór, umożliwiło ocenę takich zjawisk, jak zależna od długości aktywacja skurczu2, zależna od rozciągania reakcja skurczu3,4, oraz rozkurczowa lepkosprężystość5 tkanki serca. Ter Keurs, inicjator tej techniki superfuzji izolowanych beleczków, początkowo używał kombinacji obrazowania fluorescencyjnego do pomiarów Ca2+ i dyfrakcji laserowej do określania długości sarkomeru 2,5. Od czasu tych wczesnych badań coraz powszechniejsze staje się wyodrębnianie informacji o długości sarkomeru z większą rozdzielczością przestrzenną przy użyciu technik opartych na szybkiej transformacji Fouriera 2D (FFT)6 na obrazach mikroskopowych w jasnym polu. Dwa systemy obrazowania pozwalają na częściową ocenę podstawowej zależności między uwalnianiem Ca2+ a wytwarzaniem siły zależnej od długości sarkomeru.

Mięsień sercowy jest prążkowany, z widocznym pasmem związanym z leżącą pod spodem serią jednostek kurczliwych składających się z grubych i grubych włókien. Interakcja tych włókien składowych, które tworzą sarkomery, leży u podstaw generowania siły, które rozpoczyna się w następujący sposób: depolaryzujący sygnał elektryczny lub potencjał czynnościowy powoduje otwarcie zależnych od napięcia kanałów Ca2+ typu L w błonie komórkowej; wynikający z tego napływ komórkowy Ca2 + indukuje uwalnianie Ca2 + z retikulum sarkoplazmatycznego (SR), wewnątrzkomórkowego magazynu Ca2 +, w procesie znanym jako uwolnienie Ca2 + indukowane przez Ca2 + 7; ten nagły wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+ z zakresu nanomolowego do mikromolowego umożliwia wytwarzanie siły; Pompy Ca2 + w sposób ciągły wytłaczają Ca2 + z cytozolu z powrotem do SR i przedziału zewnątrzkomórkowego; gdy wewnątrzkomórkowe stężenie Ca2+ powraca do zakresu nanomolowego, produkcja siły ustaje, a mięsień rozluźnia się. Podczas wytwarzania siły grube i cienkie włókna składowe przesuwają się po sobie. Długość sarkomeru dyktuje względny zakres nakładania się, a tym samym potencjał makroskopowego wytwarzania siły przez mięsień.

W tym artykule rozszerzamy te techniki obrazowania fluorescencyjno-jasnego pola o optyczną tomografię koherentną (OCT). OCT wykorzystuje fizyczną zasadę interferencji i jest w stanie uchwycić geometryczną deformację tkanki, aby zrozumieć niejednorodność kurczliwości mięśni8. Nasze urządzenie (Rysunek 1) wykorzystuje system OCT (SD-OCT) w domenie spektralnej. W SD-OCT rozdzielacz wiązki rozdziela światło z szerokopasmowej diody superluminescencyjnej o krótkiej koherencji na ramiona referencyjne i pomiarowe. Ramię referencyjne zawiera stałe lustro, a ramię pomiarowe zawiera galwanometr 2D do sterowania światłem. Światło wstecznie rozproszone z próbki jest zbierane i interferuje ze światłem odbitym w ramieniu odniesienia, tworząc wzór interferencyjny. Informacja o głębokości jest zakodowana w częstotliwości prążka widmowego. Aby wydobyć informacje, sygnał jest przepuszczany przez spektrometr, a do wyniku stosuje się odwrotny FFT. Odpowiedni sygnał 1D reprezentuje struktury na różnych głębokościach, co odpowiada zmianom indeksu załamania światła9 (A-scan). Sterując laserem w jednej osi, można skonstruować przekrój poprzeczny interesującej nas próbki (B-scan) i podobnie, powtarzając proces w sposób krokowy w pozostałej osi, można wygenerować trójwymiarowy obraz (C-scan). Co za tym idzie, można zebrać serię skanów B w jednym wycinku dla powtarzającego się obiektu zmieniającego się w czasie na podstawie zewnętrznego wyzwalacza i powtórzyć, aby wygenerować skan trójwymiarowy, reprezentujący zmienny w czasie obraz płaski10.

Integrując trzy systemy obrazowania, wzięliśmy pod uwagę następujące dwie zasady. Po pierwsze, czujniki obrazowania nie powinny wykrywać światła z alternatywnej metody obrazowania, a po drugie, fizyczna konstrukcja powinna zawierać wolną przestrzeń dla co najmniej trzech jednoczesnych płaszczyzn obrazowania. Aby spełnić pierwsze wymaganie, mikroskop jasnego pola wykorzystuje diodę LED o długości fali 660 nm do oświetlania próbki w konfiguracji odwróconej. Mikroskop fluorescencyjny jest w konfiguracji epifluorescencyjnej, w której ta sama soczewka obiektywowa jest używana zarówno do wzbudzenia, jak i zbierania emitowanego światła. Światło wzbudzenia ma długość fali od 340 nm do 380 nm, a lampa fotopowielacza (PMT) mierzy emitowane światło o długości fali 510 nm. Para zwierciadeł dichroicznych umożliwia tym dwóm ścieżkom optycznym dzielenie tego samego śladu fizycznego bez zakłócania przeciwnego pomiaru (Rysunek 2). Wreszcie, OCT wykorzystuje światło szerokopasmowe (szerokość widmowa 100 nm) o centralnej długości fali 840 nm, w odróżnieniu od pozostałych dwóch modalności. Ze względu na niską koherencję światła używanego w OCT, jakiekolwiek rozproszone światło ze źródeł fluorescencji w jasnym polu nie przyczyni się do wzorca interferencji, który koduje informacje o głębokości. W przypadku drugiego wymagania konstrukcja obudowy rurki kapilarnej ma dostępne ścieżki optyczne do przedniej, dolnej i górnej płaszczyzny próbki. Podczas eksperymentów dwa platynowe haczyki utrzymują beleczkę w kapilarnej rurki wypełnionej natlenionym roztworem Krebsa-Henseleita (KH). Głowica galwanometru OCT jest zorientowana prostopadle do ścieżki obrazowania fluorescencji w jasnym polu, aby wykorzystać trzecią ortogonalną płaszczyznę optyczną (Rysunek 3).

Ten artykuł przedstawia założenia projektowe dotyczące budowy urządzenia zdolnego do jednoczesnego obrazowania wapnia, długości sarkomeru i geometrii mięśni. Aby zademonstrować te możliwości pomiarowe, opisujemy proces izolowania beleczki komorowej, przygotowanie niezbędnych roztworów buforowych, wraz z krytycznymi etapami związanymi z obsługą i ładowaniem fluorescencyjnym beleczki ex vivo. Na koniec w tym dokumencie przedstawiono procesy wymagane do przekształcenia zestawu danych w bardziej użyteczne wizualizacje.

Protokół

Komisja Etyki Zwierząt Uniwersytetu w Auckland zatwierdziła postępowanie ze szczurami i przygotowanie próbek tkanek.

1. Kalibracja obrazowania

  1. Kalibracja pikseli mikroskopu jasnego pola
    1. Napełnij komorę pomiarową wodą destylowaną.
    2. Umieścić siatkę dyfrakcyjną ze znanymi liniami na μm w komorze pomiarowej.
    3. Naciśnij F1, aby włączyć przechwytywanie i dostosować liczbę klatek na sekundę [Hz], aż siatka dyfrakcyjna będzie wyraźnie widoczna (Rysunek 4A). Upewnij się, że kratka dyfrakcyjna przebiega równolegle do krawędzi ramy. Naciśnij ponownie F1, aby zatrzymać przechwytywanie.
    4. Ustaw łączną liczbę obrazów do przechwycenia? na jeden, naciśnij Ctrl + Shift + S, aby przesłać strumieniowo dane na dysk, a następnie naciśnij F1, aby przechwycić obraz siatki dyfrakcyjnej.
    5. Otwórz ImageJ i zaimportuj obraz siatki dyfrakcyjnej (Plik > Otwórz > Wybierz obraz kalibracji). Trzymając Shift, narysuj linię obejmującą 20 jasnych i ciemnych pasm siatki dyfrakcyjnej.
    6. Skalibruj obraz (Analizuj > ustaw skalę). Długość linii z kroku 1.1.5 ustawia wartość Odległość w pikselach. Ustaw wartość Znana odległość na 20-krotność linii na pomiar μm, a jednostkę długości na μm. Odwrotnością skali jest liczba mikrometrów reprezentowana przez piksel.
  2. Kalibracja rozdzielczości głębi OCT
    1. Zmierz grubość szkiełka mikroskopowego za pomocą suwmiarki z noniuszem.
    2. Włącz źródło lasera OCT.
    3. Zakryj głowicę galwanometru i kliknij Pobierz BG, aby zmierzyć wzór zakłóceń tła i odjąć go od pomiaru (Rysunek 4B).
    4. Clamp mierzone szkiełko mikroskopowe (od kroku 1.2.1) w ramieniu pomiarowym OCT.
    5. Kliknij opcję Live Stream (Transmisja na żywo), aby wyświetlić obraz OCT. Wyreguluj szklane szkiełko mikroskopu, aż będzie widoczne w B-scan.
    6. Aby przechwycić obraz B-scan, ustaw Zakres Y (kroki) na jeden, kliknij opcję Przesyłaj strumieniowo dane B-skanowania?, a następnie kliknij przycisk Pobierz.
    7. Zaimportuj obraz B-scan do ImageJ (File > Open > Select B-scan). Trzymając Shift, narysuj linię między granicami szklanego szkiełka mikroskopowego.
    8. Ustaw skalę (Analizuj > Ustaw skalę). Ustaw znaną odległość do pomiaru zebranego w kroku 1.2.1.
    9. Aby obliczyć rozdzielczość głębokości w powietrzu, należy skorygować współczynnik załamania światła szkiełka mikroskopowego (nszkło = 1,5175)11, mnożąc wartość pomiaru na piksel przez nglass.
      UWAGA: Podane szkło n jest przeznaczone dla szkła borokrzemianowego. Szkiełka mikroskopowe mogą być wykonane z różnych materiałów. Użyj odpowiedniego współczynnika załamania światła dla mierzonego szkiełka.
    10. Aby przeskalować rozdzielczość głębokości mięśnia sercowego, podziel wartość z kroku 1.2.9. przez nmięśnia sercowego = 1,38 (wartość zgłoszona wcześniej12).

2. Przygotowanie próbki mięśniowej

  1. Przygotuj platformę do preparacji.
    1. Wlej trochę roztworu preparacyjnego (opisanego w Tabeli 1) do małej metalowej miski i umieść w zamrażarce na około godzinę przed wycięciem serca.
    2. Ustaw urządzenie do preparacji, upewniając się, że roztwór do preparacji jest dobrze natleniony (100% tlenu) i przepłukany przez każdy z przewodów rurowych. Napełnij komorę rozwarstwiającą natlenionym roztworem preparacyjnym i luźno zawiąż szew 3/0 wokół cewnika perfuzyjnego.
  2. Wytnij serce.
    1. Znieczulić 8-10-tygodniowego szczura rasy Wistar za pomocą gazowego izofluranu (< 5% tlenu). Potwierdź znieczulenie, szczypiąc ogon.
    2. Ułożyć znieczulonego szczura w pozycji leżącej na plecach i wstrzyknąć podskórnie w okolicę brzucha roztwór heparyny (1000 j.m./kg). Utrzymuj znieczulenie jeszcze przez pięć minut, aby umożliwić krążenie heparyny.
    3. Wyjmij z zamrażarki metalową miskę zawierającą roztwór preparacyjny i umieść ją w pobliżu stołu do eutanazji.
      UWAGA: Unikaj całkowitego zamrażania roztworu preparacyjnego, aby umożliwić całkowite zanurzenie wypreparowanego serca.
    4. Przenieś znieczulonego szczura na stanowisko do eutanazji i poddaj eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
    5. Otwórz klatkę piersiową szczura nożyczkami, najpierw przecinając ścianę ciała wzdłuż spodu klatki piersiowej, następnie przeponę, a następnie przechodząc wzdłuż bocznych granic klatki piersiowej. Podnieś klatkę piersiową z drogi.
    6. Chwyć serce jedną ręką, podczas gdy drugą ręką użyj zakrzywionych nożyczek, aby przeciąć naczynia łączące (aortę, żyłę główną itp.).
    7. Szybko zanurz serce w zimnym roztworze preparacyjnym.
  3. Wyizolować beleczkową.
    1. Zidentyfikuj aortę, gdy serce znajduje się w metalowej misce, a następnie przenieś serce do komory rozwarstwiającej. Za pomocą dwóch zakrzywionych kleszczyków przeciągnij aortę nad kaniulą perfuzyjną.
    2. Przytrzymaj aortę na miejscu za pomocą jednego kleszcza. W międzyczasie otwórz przewód rurkowy, aby umożliwić przepływ roztworu preparacyjnego przez kaniulę perfuzyjną.
      UWAGA: Dążyć do zakończenia perfuzji w ciągu minuty po wycięciu serca.
    3. Gdy naczynia wieńcowe zostaną oczyszczone z krwi, a serce zostanie całkowicie wypełnione roztworem preparacyjnym, zatrzymaj przepływ perfuzji i zabezpiecz aortę na miejscu za pomocą szwu. Ponownie włącz przepływ i perfuj kaniulowane serce.
    4. Obróć kaniulę tak, aby lewa tętnica wieńcowa była widoczna na górnej powierzchni. Przypnij wierzchołek serca do dna komory sekcyjnej (Rysunek 5A). Odetnij oba przedsionki (Rysunek 5B).
    5. Za pomocą zestawu nożyczek sprężynowych przeciąć wzdłuż prawej strony przegrody do wierzchołka serca (jak pokazano na Ryc. 5B). Przypnij otwartą lewą komorę do podstawy komory rozwarstwiającej. Następnie przeciąć wzdłuż lewej strony przegrody, otwórz prawą komorę i przypnij ją również do podstawy komory rozwarstwiania (Rysunek 5C).
      UWAGA: Aby ustawić komory w pozycji otwartej, konieczne będzie przecięcie niektórych mięśni brodawkowatych. Zidentyfikuj swobodnie biegnącą beleczkę w prawej komorze (Rysunek 5D-E).
    6. Za pomocą nożyczek sprężynowych i kleszczy przeciąć tkankę ściany otaczającą beleczkową, a następnie przeciąć tkankę ściany na pół prostopadle do kierunku beleczki. Przytnij tkankę ścienną, aż jej wymiar będzie odpowiedni dla zastosowanej konfiguracji montażowej. W tym przypadku mniej więcej połowa wielkości ziarna sezamu (Rysunek 5F).
      UWAGA: Beleczki można wyciąć z prawej i lewej komory, ale te z lewej są zazwyczaj bardziej mętne i mniej odpowiednie do pomiarów sarkomeru i geometrii.
    7. Pozostaw wyciętą beleczkę w komorze rozwarstwiającej, ciągle przetapiając się z roztworem preparacyjnym.

3. Protokół eksperymentalny

UWAGA: device13 użyte w tym eksperymencie zostało zbudowane wewnętrznie i korzysta z niestandardowego kodu sterującego. Niezbędnymi kwestiami do zaprojektowania urządzenia zbudowanego w celu replikacji tych danych są dwa niezależnie uruchamiane haki montażowe, komora pomiarowa z trzema optycznie przezroczystymi osiami (Rysunek 3) oraz zewnętrzna linia wyzwalająca, która synchronizuje kamery jasnego pola i OCT ze stymulatorem. Sygnał napięcia i siły PMT zebrano za pomocą analogowych kart DAQ, obrazy z OCT i mikroskopu jasnego pola zebrano za pomocą kart przechwytywania klatek Camera Link, a sygnał bodźca zebrano za pomocą cyfrowej karty I/O. Dane były przechowywane w trybie offline przy użyciu zestawu pętli konsumenckich producenta w celu utrzymania wyrównania czasowego.

  1. Przygotuj kardiomiometr.
    1. Przepłukać gorącą (~60 °C) wodą, wodą destylowaną (temperatura pokojowa), a następnie roztworem superfuzatu przez komorę pomiarową. Roztwór superfuzatu należy w sposób ciągły przecierać karbogenem.
    2. Włącz źródło oświetlenia mikroskopu jasnego pola i naciśnij F1, aby włączyć przechwytywanie (Rysunek 4A). Ręcznie wyreguluj hak za urządzeniem, aż zostanie wyśrodkowany na obrazie w jasnym polu. Kliknij opcję Zero Downstream Axis, a następnie Downstream Disabled (Wyłączono downstream), aby włączyć silnik (Rysunek 4C). Przesuwaj suwak DS Setpoint [um] do momentu, aż koniec haka zrówna się z krawędzią domyślnego obszaru zainteresowania.
      1. Ponownie wyzeruj dolną oś, a następnie przesuń suwak DS Setpoint [um] na 1000. Powtórz proces z hakiem upstream, ale nie przesuwaj suwaka US Setpoint [um].
    3. Kliknij Przenieś do montażu (Rysunek 4C).
    4. Uruchom system oświetlenia fluorescencyjnego, przełączając przełącznik Lampa, a następnie szybko włącz podsystemy sterownika, przełączając wyłącznik główny.
      UWAGA: Niektóre źródła światła UV wytwarzają duże ilości ozonu. W takim przypadku podłącz pochłaniacz ozonu do otworu wylotowego źródła światła i upewnij się, że działa przed włączeniem źródła oświetlenia fluorescencyjnego.
    5. Przełącz tryb operacyjny na Turbo-Blanking, naciskając przycisk Mode na panelu przednim, a następnie 2, a następnie 1. Naciśnij przycisk On-line, aby kod sterujący poinformował o operacji.
  2. Zamontuj beleczkę.
    1. Wstrzymać przepływ superfusatu przez komorę pomiarową. Napełnij komorę montażową roztworem preparacyjnym
      2. .
    2. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml przetransportuj beczkę z komory rozwarstwiania do komory montażowej (Rysunek 5G).
    3. Aby przenieść beleczkę, należy umieścić strzykawkę pionowo i w kontakcie z powierzchnią roztworu komory montażowej. Pozwól, aby trabecula opadła do komory montażowej grawitacyjnie (Rysunek 5H).
    4. Obniż poziom płynu w komorze montażowej tak, aby znajdował się na poziomie środkowej części haków.
    5. Dostosuj odległość między hakami, aby odzwierciedlić długość luzu trabecula, przesuwając suwak DS Setpoint [um].
    6. Używając mikroskopu do wizualizacji, delikatnie chwyć jeden z kawałków tkanki końcowej kleszczami i zamontuj go na haku przed nim. Zamontuj drugi kawałek tkanki końcowej na dolnym haku (Rysunek 5I).
    7. Po bezpiecznym zamontowaniu przenieś belekcję z powrotem do komory pomiarowej (Rysunek 5J), naciskając Przenieś do komory (Rysunek 4C). Wznów przepływ superfuzatu i ekstrakcję płynu.
    8. Ustaw częstotliwość bodźca [Hz] na 1, czas trwania bodźca [ms] na 10, a napięcie bodźca na 10. Rozpocznij stymulację, naciskając przycisk Stimulus On?.
  3. Przygotuj beleczkową beleczkę.
    1. Po około 1 godzinie aklimatyzacji stopniowo zmniejszaj napięcie bodźca i czas trwania bodźca odpowiednio w krokach co 1 V i 1 ms. Typowy zestaw wartości to 3 V i 3 ms.
    2. Włącz system oświetlenia w jasnym polu. Naciśnij F1 i wybierz obszar zainteresowania, który obejmuje obszar prążkowany w interfejsie użytkownika. Kliknij opcję Oblicz SL?, aby obliczyć średnią długość sarkomeru w wyróżnionym obszarze. Zwiększ długość mięśnia, aż średnia długość sarkomeru wyniesie 2,32 μm, zwiększając suwak Nastawa separacji [um].
      UWAGA: Umowa SL na obliczenia? używa FFT 2D opisanego w kroku 4.3. Obszar zainteresowania używany do obliczania średniej długości sarkomeru to zazwyczaj kwadrat od 100 μm do 150 μm. Dlatego, gdy mięsień zbliża się do optymalnej długości sarkomeru, do obliczenia średniej długości sarkomeru używa się od 43 do 65 sarkomerów.
    3. Przesuń mięsień, regulując suwak Center Setpoint [um] na karcie "Center and Separation Control" (Rysunek 4C) tak, aby krawędź dolnego haka była widoczna tylko w jasnym polu. Zbierz informacje o fluorescencji dla dziesięciu drgań.
    4. Zwiększ wartość nastawy środkowej [um] o 200 i zbierz informacje o fluorescencji o wartości kolejnych dziesięciu drgań. Powtarzaj ten proces, aż obraz w jasnym polu będzie zawierał punkt zaczepienia. Zbierz informacje o fluorescencji z ostatniego okna.
    5. Przywróć beleczkę do pozycji środkowej, ustawiając wartość zadaną środka [um] na 0.
    6. Zmniejsz częstotliwość bodźca do 0,2 Hz i przełącz się z superfusatu KH na roztwór ładujący Fura-2 (szczegółowo w Tabeli 1).
    7. Mierz sygnał fluorescencji co 10 minut, klikając Włącz źródło fluorescencji na karcie Stim and Data. Wizualizuj sygnał fluorescencji na karcie Sygnał PMT.
    8. Po 10-krotnym wzroście sygnału 360 nm lub przekroczeniu 2 godzin czasu trwania procedury ładowania, należy przywrócić częstotliwość bodźca do 1 Hz i przełączyć się z powrotem na roztwór superbezpiecznika KH.
    9. Sprawdzaj pomiar proporcji co 10 minut, aż pomiar proporcji się ustabilizuje, w którym to momencie można rozpocząć zbieranie danych.
  4. Zbieraj dane obrazowania w jasnym polu i fluorescencji.
    1. Przywróć mięsień do pozycji, w której krawędź dolnego haka jest po prostu obecna na obrazie w jasnym polu. Rozpocznij strumieniowe przesyłanie danych sprzętowych, klikając opcję Przesyłaj strumieniowo dane na dysk na karcie Stim and Data (Stymulator i dane) w interfejsie użytkownika sterowania sprzętem. Przechwyć informacje o fluorescencji, klikając opcję Włącz źródło fluorescencji.
    2. W interfejsie użytkownika obrazowania w jasnym polu ustaw tryb przechwytywania na wyzwalacz zewnętrzny, zwiększ częstotliwość odświeżania do 100 Hz i ustaw liczbę przechwytywanych obrazów na 100. Naciśnij Ctrl + Shift + S, a następnie F1, aby nagrać dane obrazowania w jasnym polu dla tego okna.
    3. Zwiększ wartość zadaną środka [um] o 200 i powtórz krok 3.4.2. Kontynuuj korzystanie z protokołu skanowania, aż dane obrazowania zostaną zebrane dla ostatniego okna z kroku 3.3.4.
    4. Przywróć beleczkę do pozycji środkowej, ustawiając wartość zadaną środka [um] na 0.
  5. Zbieraj dane obrazowania OCT.
    1. Włącz źródło lasera OCT, przekręcając główny na symbol | , naciskając przycisk zasilania, a następnie przycisk SLDs.
    2. Zakryj głowicę galwanometru i kliknij Pobierz BG, aby zmierzyć wzór zakłóceń tła i odjąć go od pomiaru (Rysunek 4B).
    3. Ustaw tryb przechwytywania obrazu na podgląd na żywo.
    4. Dostosuj pozycję y, aż obraz B-scan będzie zawierał tylko hak poprzedzający. Podziel długość mięśnia wyświetlaną na przednim panelu sterowania (Rysunek 4B) przez dwa i odejmij aktualną pozycję y. Wprowadź tę wartość w polu wejściowym "y-offset". Dostosuj wartość "przesunięcia x", aż przekrój poprzeczny beczek zostanie wyśrodkowany w ramce.
    5. Gdy beczek jest wyśrodkowany, skanuj wzdłuż osi y, dostosowując pozycję y, aby znaleźć pozycje odpowiadające hakom w górę i w dół. Zanotuj te pozycje w dół. Ustaw Zakres Y (kroki) na bezwzględną różnicę między tymi wartościami podzieloną przez dziesięć.
    6. Ustaw tryb przechwytywania obrazu na Wyzwolony bodziec?, Zakres X (kroki) na 100 i kliknij przycisk Ustaw aktywne parametry.
    7. Kliknij opcję Stream B-Scan Data?, a następnie Acquire.
      UWAGA: Protokół obrazowania bramkowanego wymaga 200 drgań, aby uchwycić całą geometrię mięśni dla próbki o długości 2 mm, co odpowiada czasowi przechwytywania wynoszącemu ~3 min 20 s.

4. Przetwarzanie zestawu danych obrazu w jasnym polu

  1. Przygotuj obrazy do analizy.
    1. Importuj obrazy do ImageJ (File > Import > Image Sequence > Select image).
    2. Zwiększ kontrast obrazu (suwaki Dostosuj >> Jasność/Kontrast obrazu > Przesuń minimalnie i Maksimum, aby wyśrodkować histogram obrazu).
    3. Wyostrz obrazy (Filtry > procesowych > Maska wyostrzająca > ustaw Promień (sigma) na 1,0 piksela, a Grubość maski (0,1-0,9) na 0,6).
    4. Wyeksportuj sekwencję obrazów (Zapisz jako sekwencję obrazów > > ustaw format na PNG, zacznij od 0, a cyfry (1-8) do 4).
  2. Zszyj obrazy, zmierz zlokalizowane przemieszczenie i oblicz lokalne długości sarkomerów.
    1. Otwórz plik "TrabeculaProcessing.m" (dostępny na żądanie) i ustaw zmienną FolderPath na główny folder zawierający wszystkie dane, a ImagePath na folder, w którym została zapisana sekwencja obrazów z kroku 4.1.4. Ustaw sekcje na liczbę okien obrazowania, a klatki na liczbę przechwyconych klatek na okno.
    2. Uruchom plik code.
      UWAGA: Dane wyjściowe będą znajdować się w ścieżce folderu wyjściowego określonej przez użytkownika. (Domyślnie ścieżka jest ustawiona na FolderPath/Output).
  3. Technika długości sarkomeru FFT
    1. Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby wykonać FFT w obszarze obrazu, w którym sarkomery są dobrze widoczne.
    2. Pomnóż liczbę pikseli na μm wyniki kalibracji z kroku 1.1.6 przez 1,6 μm i 3,0 μm przed obliczeniem odwrotności, aby uzyskać zakres interesujących nas częstotliwości przestrzennych.
    3. Dopasuj wykładnik do wyniku FFT, ignorując informacje o częstotliwości w zakresie częstotliwości obliczonym w kroku 4.3.2, a następnie odejmij go od wyniku transformacji, aby usunąć składnik DC.
    4. Dopasuj krzywą Gaussa do interesującego Cię pasma częstotliwości.
    5. Oblicz odwrotność szczytu krzywej Gaussa. Jest to średnia długość sarkomeru dla obszaru zainteresowania.
      UWAGA: Obliczenia FFT i dopasowanie równań wykładniczych i gaussowskich zostały wykonane przy użyciu niestandardowego kodu LabVIEW.

5. Przetwarzanie danych fluorescencyjnych

  1. Odejmij autofluorescencję zależną od okna od odpowiedniego okna i oblicz iloraz sygnałów związanych z długościami fal wzbudzenia 340 nm i 380 nm.

6. Przetwarzanie danych obrazowania OCT

  1. Przygotuj zestaw obrazów OCT do segmentacji.
    1. Otwórz ImageJ i zaimportuj obrazy (File > Import > Image Sequence). W oknie eksploratora plików otworzy się, zlokalizuj obrazy, wybierz jeden i kliknij Otwórz.
      UWAGA: Jeśli kod sterujący dla OCT nie przechowuje obrazów w formacie czytelnym dla ImageJ, przekonwertuj je na PNG.
    2. Aby ułatwić wizualizację, zorganizuj sekwencję obrazów w hiperstos (Obraz > Hyperstacks > Stos do Hyperstack). W oknie dialogowym, które zostanie otwarte, ustaw liczbę plasterków na liczbę skanów B na plasterek, a X na liczbę plasterków wzdłuż długości beleczki.
    3. Narysuj prostokąt otaczający beleczkową. Upewnij się, że obejmuje cały wolumin w czasie, używając suwaków w oknie hyperstack. Przytnij obraz do okna (Obraz > Przytnij).
    4. Usuń plasterki, które zawierają obrazy haków montażowych (Stosy > Narzędzia > Keeper plasterków). Zaznacz zakres plasterków, który zawiera tylko informacje o beleczku.
  2. Segmentacja pociągów WEKA.
    1. Otwórz segmentację WEKA (wtyczki > segmentacji > trenowalnej segmentacji WEKA).
    2. Ustaw tryb wyboru na Odręczny.
    3. Kliknij Ustawienia i dostosuj ustawienia klasyfikatora i trenowania. (W tym modelu użyto następujących funkcji treningowych: rozmycie gaussowskie, filtr Sobela, hesjańska, różnica gaussowskich, projekcje membranowe, dwustronne i Lipschitz. Grubość membrany została ustawiona na 1, rozmiar łatki membrany na 8, minimalna sigma na 1, a maksymalna sigma na 32. Klasyfikator został ustawiony na FastRandomForest, a opcje klasyfikatora zostały ustawione na: batchSize 100, maxDepth na 32, numFeatures na 32, numThreads na 0 i numTrees na 200.)
    4. Ręczne segmentowanie obrazów do momentu uzyskania wyników szkolenia w postaci zadowalających segmentacji.
    5. Zapisz klasyfikator.
  3. Segmentacja przetworzonych skanów B
    1. Uruchom segmentację WEKA zgodnie z krokiem 6.2.1.
    2. Załaduj klasyfikator z kroku 6.2.5.
    3. Kliknij przycisk Create Result (Utwórz wynik).
    4. Przekonwertuj obrazy na 8-bitowe (Typ > obrazu > 8-bitowe).
    5. Przekonwertuj obrazy na binarne (Process > Binary > Make Binary > Default method i domyślne tło).
    6. Zapisz jako sekwencję obrazów (PNG).
  4. Oblicz średnią CSA na podzielonych na segmenty obrazach B-scan.
    1. Policz liczbę białych pikseli w binarnym obrazie B-scan.
    2. Pomnóż obszar piksela przez skalibrowaną rozdzielczość głębi (z kroku 1.2) i 10 μm (odległość między sąsiednimi skanami A).
    3. Powtórz te czynności dla wszystkich skanów B między hakami i uśrednij pomiary.
  5. Konwertuj podzielony na segmenty obraz na siatkę.
    1. Otwórz plik "OCTmain.m" (dostępny na żądanie) i ustaw imageDirectory na folder zawierający dane wyjściowe z kroku 6.3.6. Ustaw outputPath zgodnie z potrzebami.
    2. Ustaw plasterki na wartość "Zakres Y (kroki)" (krok 3.5.5), a klatki na wartość "Powtórz X" (krok 3.5.6), z_dim na rozdzielczość głębi (krok 1.2.10), a x_dim i y_dim na wartość przypisaną do 10.
    3. Kliknij przycisk Uruchom.

Wyniki

Aby zarejestrować regionalne informacje o Ca2+ oraz obraz w świetle przechodzącym dla całej długości przedstawionej tutaj beleczki, wymaganych było siedem pozycji mięśnia. Rysunek 6 sugeruje, że siła skurczu pojedynczego nie została zaburzona przez ten ruch, co wykazuje brak zależności produkcji siły aktywnej od pozycji.

Skanowanie B wykonane za pomocą optycznej koherentnej tomografii z częstotliwością 100 Hz zostało poddane segmentacji przy użyciu wtyczki WEKA14 do programu ImageJ (Ryc. 7A). Każdy przekrój poprzeczny wydaje się zniekształcony ze względu na różnicę między rozdzielczością boczną (10 µm) a rozdzielczością w głąb (1,73 µm (w mięśniu sercowym)). Zniekształcenie to zostało skorygowane poprzez przeskalowanie osi głębokości obrazu zgodnie ze stosunkiem rozdzielczości bocznej do rozdzielczości w głąb. Ryc. 7B,C pokazują, że po przeskalowaniu surowy skan C beleczki ma geometrię w przybliżeniu cylindryczną. Odbicie ścianki komory pomiarowej może czasami nakładać się na dane dotyczące mięśnia (Ryc. 7A,B), jednak oprogramowanie do segmentacji można wytrenować tak, aby uwzględniało to zjawisko (Ryc. 7D,E). Po segmentacji można obliczyć pole powierzchni przekroju poprzecznego wzdłuż długości mięśnia w całym cyklu skurczu (Ryc. 7F). Należy zauważyć, że ta konkretna beleczka posiada mały odgałęzienie. Ruch odgałęzienia jest widoczny w odległości ok. 0,75 mm wzdłuż beleczki. Na koniec, segmentowane obrazy można przekształcić w siatki, aby ułatwić konstrukcję modeli geometrycznych (Ryc. 7G).

Dane obrazowe zarejestrowane w każdej z różnych pozycji beleczki z częstotliwością 100 fps zostały połączone w celu utworzenia pojedynczego, kompletnego obrazu beleczki (Rycina 8A). Rozdzielczość tych obrazów wynosi 0,535 µm/pixel. Zastosowanie funkcji liniowego ważenia w obszarach nakładania się sąsiednich okien ułatwia wizualizację i minimalizuje wpływ winietowania występującego w obrazach w polu jasnym. Aby zmierzyć sygnał fluorescencyjny, okno beleczki o wymiarach 540 µm na 540 µm jest cyklicznie oświetlane światłem o długości fali 340 nm, 365 nm i 380 nm z częstotliwością 600 Hz. Stosunek emitowanej fluorescencji związanej z pobudzeniem światłem 340 nm i 380 nm koreluje z wewnątrzkomórkowym poziomem wapnia po załadowaniu beleczki barwnikiem Fura-2. Ponieważ pomiar ten jest stosunkiem, efektywna częstotliwość pomiaru wynosi 200 Hz. Uśrednione (n = 10) przejściowe zmiany wewnątrzkomórkowego Ca2+ z każdego okna są dopasowane do obszaru, z którego zostały obrazowane (Rycina 8B). Choć szczyty tych zmian wydają się dość spójne, rozkurczowe [Ca2+] jest niższe w obszarze między 900 µm a 1800 µm wzdłuż beleczki. Podobnie wyniki śledzenia przemieszczeń (Rycina 8C) i obliczeń długości sarkomerów (Rycina 8D) wskazują na obecność zmienności regionalnej. Zastosowana bezmarkerowa technika śledzenia jest w stanie przetworzyć przemieszczenie każdego piksela, pod warunkiem zapewnienia odpowiedniego kontrastu. Podczas mapowania rozkładu długości sarkomerów, do obliczenia regionalnej długości sarkomerów wykorzystano obszar korelacji wzajemnej o wymiarach 128 pikseli na 128 pikseli (~67 µm na 67 µm). Obszar ten obejmuje około 29 sarkomerów, gdy próbka znajduje się blisko optymalnej długości sarkomeru. Krok (zarówno w kierunku x-, jak i y-) między centroidem każdego okna korelacji wzajemnej został ustawiony na 50 pikseli (~26 µm) w celu przetworzenia tych danych. Odpowiedniość szacunków długości sarkomerów została przetestowana na podstawie szerokości i amplitudy dopasowania Gaussa do sygnału FFT. Warunki te nie zostały spełnione w obszarze mięśnia między 0 µm a 500 µm, w związku z czym nie można było tam obliczyć informacji o długości sarkomerów. Biorąc pod uwagę powiązane przemieszczenia, prawdopodobne jest, że sarkomery w tym obszarze wydłużyły się podczas fazy skurczowej. Zgodnie z tą hipotezą, średnie długości sarkomerów po prawej stronie beleczki ulegają skróceniu w tym okresie. Po połączeniu informacji zawartych na każdym z paneli wydaje się, że obszar o największej powierzchni przekroju poprzecznego nie generuje największej siły. Przy założeniu, że regionalna zmienność przejść Ca2+ ma w przybliżeniu gładki gradient, Rycina 8B wskazuje, że przejście Ca2+ o największej amplitudzie występuje gdzieś między 1300 µm a 1600 µm wzdłuż beleczki. Mapa przemieszczeń wskazuje, że obszar wykazujący najmniejszy ruch dobrze pokrywa się ze szczytem przejścia Ca2+. Jednakże obszar ten posiada najmniejsze powierzchnie przekroju poprzecznego w próbce. Mając na uwadze te dane, można wywnioskować, że region ten generował największe naprężenie.

Schemat układu spektroskopii optycznej; lampa ksenonowa, soczewki, filtry do analizy emisji.
Rycina 1: Adnotowany obraz kardiomiometru. Zaznaczono każdy z głównych komponentów optycznych. Wstawka zawiera zbliżenie z widokiem od tyłu obiektywu mikroskopu in situ, poniżej komory pomiarowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat układu mikroskopii fluorescencyjnej z diodami LED, lustrami dichroicznymi i filtrami do wzbudzenia optycznego.
Rysunek 2: Tor optyczny dla jednoczesnej mikroskopii w polu jasnym i fluorescencyjnej. Źródłem oświetlenia dla mikroskopu fluorescencyjnego jest lampa ksenonowa, której wyjście cyklicznie przełącza się między światłem o długościach fal 340 nm, 365 nm i 380 nm. Ścieżka wyjściowa lampy łukowej zawiera lustro dichroiczne z długością fali odcięcia 409 nm, które odbija światło UV na lustro kierujące światło do obiektywu mikroskopu fluorescencyjnego. Soczewka skupia światło wzbudzenia na próbce i zbiera emitowane światło o dłuższej długości fali 510 nm. Emitowane światło to przechodzi przez pierwsze lustro dichroiczne, ale nie przez drugie, ponieważ ma ono długość fali odcięcia 552 nm. Następnie soczewka polowa skupia odbite światło na detektorze PMT. Tymczasem źródło oświetlenia (dioda LED 660 nm) dla mikroskopu w polu jasnym znajduje się nad próbką. Światło przechodzące jest skupiane na próbce przez soczewkę kondensatora, a obiektyw fluorescencyjny 20× rejestruje powstały obraz transmisyjny. Długość fali stosowana do oświetlenia w polu jasnym przekracza długość fali odcięcia każdego z luster dichroicznych, w związku z czym przechodzi przez oba, zanim obraz zostanie skupiony na matrycy kamery CMOS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Układ pola jasnego i fluorescencji z diagramem OCT, systemem obrazowania mikroskopowego i elektrodami stymulującymi.
Rycina 3: Konstrukcja uchwytu komory pomiarowej. (A) Widok izometryczny uchwytu komory pomiarowej z naniesionymi drogami optycznymi. Oświetlenie w polu jasnym odbywa się z powierzchni górnej (oś z); oświetlenie fluorescencyjne odbywa się z powierzchni dolnej (oś z), a sygnał ramienia pomiarowego OCT jest ortogonalny do pozostałych osi oświetlenia (oś y). Podczas eksperymentu dwa platynowe haczyki utrzymują beleczkę w szklanej rurce kapilarnej, która pełni funkcję komory pomiarowej. Silniki cewkowe sterują każdym haczykiem, a ich pozycje są mierzone za pomocą interferometrii laserowej. Aktualna pozycja jest porównywana z zadaną przez użytkownika wartością referencyjną, a błąd jest minimalizowany za pomocą kontrolera PID zakodowanego w układzie FPGA. (B) Komora pomiarowa in situ przy włączonym oświetleniu w polu jasnym. Widok z tyłu przedstawiono na wstawce w Rycini 1. (C) Schemat przepływu perfuzatu przez uchwyt komory pomiarowej. Perfuzat wpływa do tylnej części bloku i płynie w kierunku wskazanym przez strzałki. Elektrody powyżej i poniżej nurtu generują stymulację polową w celu wywołania skurczu zamocowanej beleczki w komorze pomiarowej. Niebieskie zacienienie wskazuje obszary, przez które przepływa perfuzat podczas eksperymentu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza równowagi statycznej; ΣFx=0; interfejs sterowania mikroskopem z danymi widmowymi; układ eksperymentalny.
Rycina 4: Panel przedni oprogramowania do akwizycji obrazu i sterowania. (A) Interfejs użytkownika obrazowania w polu jasnym. (B) Interfejs użytkownika obrazowania OCT. (C) Interfejs użytkownika sterowania sprzętem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Etapy sekcji organu, zestaw do mikromanipulacji; ekstrakcja tkanki serca, przebieg pracy z mikroczipem.
Rycina 5: Protokół sekcji i montażu trabekuli. (A) Serce szczura poddane perfuzji w układzie Langendorffa w komorze sekcyjnej. (B) To samo serce po usunięciu przedsionków. Linie przerywane wskazują trajektorię wycięcia w celu otwarcia komór. (C) Otwarte serce z odsłoniętym wnętrzem obu komór. Przerywana ramka wskazuje obszar, w którym zazwyczaj znajdują się trabekule. (D) Wycięty fragment ściany prawej komory (ten sam, który wskazano przerywaną ramką w C). Linie przerywane wyróżniają trzy trabekule. (E) Trabekula wybrana spośród trzech wskazanych w D. (F) Trabekula z panelu E po usunięciu tkanki ściany. (G) Izolowana trabekula w końcówce strzykawki 1 mL. (H) Trabekula w komorze montażowej. (I) Trabekula zamontowana pomiędzy dwoma platynowymi haczykami. (J) Trabekula zamontowana między haczykami w komorze pomiarowej (Rycina 3B). Zielona plama jest artefaktem pochodzącym z pierwszego filtra dichroicznego. (K) Dodatkowy kąt widzenia zamontowanej trabekuli w komorze pomiarowej. Odległość między trabekulą a obiektywem mikroskopu wynosi około 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykres siła-czas, analiza odpowiedzi przejściowej z wykorzystaniem danych o elastyczności, reprezentacja graficzna.
Rycina 6: Zależność pomiaru siły od położenia. Nałożone na siebie przebiegi siły generowanej przez mięsień dla każdej z pozycji obrazowania (n = 7). Średnia aktywna siła wyniosła 0.527 mN ± 0.003 mN, czas do 50 % skurczu 77.1 ms ± 0.3 ms, a czas do 50 % rozkurczu 328.1 ms ± 0.9 ms (wszystkie dane przedstawiono jako średnia ± SE). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza równowagi statycznej. Diagramy pokazują wariancję przekroju poprzecznego; mapa kolorystyczna pokazuje czasowe zmiany powierzchni.
Rycina 7: Analiza obrazowania OCT. (A) Przykład segmentacji WEKA. Zsegmentowany przekrój poprzeczny mięśnia zaznaczono na czerwono, a tło na zielono. (B) Widok z góry surowych danych C-scan beleczki. Jasna ukośna linia w górnej części obrazu to odbicie ścianki komory pomiarowej. (C) Widok z boku surowych danych C-scan beleczki. (D) Widok z góry zsegmentowanych danych OCT. (E) Widok z boku zsegmentowanych danych OCT. (F) Powierzchnia przekroju poprzecznego wzdłuż długości beleczki (oś x) w czasie (oś y). Średnia powierzchnia przekroju poprzecznego wzdłuż długości mięśnia wynosiła 0.0326 mm2 ± 0.0005 mm2 (średnia ± S.E.). (G) Siatka beleczki. Siatka została w przybliżeniu dopasowana do wykresu powierzchni przekroju poprzecznego z panelu F. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza włókien mięśniowych z wykresami sarkomerów; wykres położenia w czasie dla stosunków F i przemieszczenia.
Rysunek 8: Analiza obrazowania w świetle przechodzącym i fluorescencyjnym. (A) Złożony obraz (siedem okien obrazowania) beleczki. (B) Przejściowe zmiany stężenia Ca2+ wzdłuż długości beleczki. (C) Średnie przemieszczenie w osi x z każdego okna obrazowania. Dodatnie przemieszczenie oznacza ruch w prawo, a ujemne w lewo. (D) Średnie długości sarkomerów z każdego okna obrazowania, które posiadało odpowiedni kontrast obrazu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Tabela roztworów Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

W tym badaniu przedstawiamy konfigurację, która umożliwia montaż trzech układów optycznych łączących obrazowanie jasnego pola, fluorescencji i OCT w celu zebrania danych z aktywnie kurczącej się bełeczki serca ex vivo (ryc. 1 i ryc. 2). Tak zaaranżowana integracja jest możliwa dzięki konstrukcji komory pomiarowej (rysunek 3), która umożliwia ortogonalne ułożenie OCT do osi jasne pole-fluorescencja. System mocowania mięśni odgrywa równie ważną rolę w powodzeniu jednoczesnych kwantyfikacji kluczowych wskaźników w charakterystyce dynamiki pobudzenia i skurczu mięśnia sercowego. Jego nowość polega na tym, że umożliwia procedury skanowania mięśni bez widocznych zakłóceń mechanicznej wydajności mięśnia (ryc. 6). Dzięki połączonej konfiguracji obrazowania i zmotoryzowanemu systemowi hakowemu do pomiaru siły, system ten może oceniać regionalną niejednorodność w stanach przejściowych Ca2+ , przemieszczeniu i długości sarkomeru, wraz z makroskopowymi informacjami geometrycznymi kurczącej się beleczki w całym przebiegu drgań (ryc. 7 i ryc. 8).

Biorąc pod uwagę wszechobecność systemów obrazowania w jasnym polu i epifluorescencji w laboratoriach badań kardiologicznych, odtworzenie tych wyników można osiągnąć przy niewielkich względach sprzętowych. W tym miejscu przedstawiamy zestaw narzędzi do przetwarzania obrazu do łączenia epifluorescencji jasnego pola i OCT, który jest niezbędny do analizy leżącej u podstaw niejednorodności skurczowej. Integracja OCT wymaga niezakłóconej ścieżki optycznej, podczas gdy obrazowanie bramkowane wymaga zewnętrznej linii wyzwalania między bodźcem a zarówno OCT, jak i kamerą do obrazowania w jasnym polu oraz haków mocujących mięśnie, które są w stanie przesuwać próbkę w całej komorze pomiarowej. Wymagane oprogramowanie i metody przetwarzania końcowego są swobodnie dostępne. W szczególności zastosowane oprogramowanie do segmentacji, WEKA14, jest open-source. Technika bezznacznikowego śledzenia punktów materialnych8, długości sarkomeru, bramkowanego obrazowania wolumetrycznego10 i kodów generowania siatki jest również dostępna i może być udostępniona na żądanie u autora korespondencyjnego.

Żywotność mięśni, optymalne obciążenie Fura-2 i skupienie obrazu to trzy filary, które tworzą fundamenty udanego eksperymentu. Stosowanie roztworu preparacyjnego zawierającego BDM w celu zapobiegania przykurczom, transport mięśnia w strzykawce, ciągłe natlenianie roztworu i przygotowywanie nowych roztworów eksperymentalnych w dniu eksperymentu przyczynia się do wysokiego wskaźnika żywotności mięśni. Przed załadowaniem beleczka Fura-2AM należy pobrać autofluorescencję dla każdego stanu, który jest zainteresowany badaniem, ponieważ może to mieć znaczący wpływ na zmierzony stan przejściowy Ca2 + 15. Natlenienie roztworu ładującego Fura-2AM jest skomplikowane ze względu na niezbędne włączenie środka powierzchniowo czynnego pluronic-F127 w celu ułatwienia ładowania barwnika. Aby zwalczyć powstające w ten sposób nadmierne tworzenie się pęcherzyków spowodowane przez ten środek powierzchniowo czynny, niewielka kropla środka przeciwpieniącego w roztworze ładującym pozwala użytkownikowi zwiększyć szybkość natleniania, zwiększając w ten sposób szansę na utrzymanie żywotności funkcjonalnej przez cały proces ładowania. Wreszcie, ostrość obrazowania musi być jednolita na całej długości mięśni, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu w jasnym polu i informacji fluorescencyjnej.

Istnieją dwa ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę w przypadku przedstawionych tutaj metod. Pierwszą z nich jest rozdzielczość przestrzenna mikroskopu fluorescencyjnego. Podczas gdy rozdzielczości przestrzenne obrazowania OCT i jasnego pola są wysokie, rozdzielczość mikroskopu fluorescencyjnego jest ograniczona do całki fluorescencji z objętości uchwyconej w oknie obrazowania 540 μm na 540 μm. Istnieje możliwość zwiększenia rozdzielczości przestrzennej mikroskopu fluorescencyjnego poprzez zastosowanie kamery ze sprzężeniem ładunkowym o wysokim wzmocnieniu, zamiast PMT, do przechwytywania sygnału fluorescencji kosztem stosunku sygnału do szumu16. Druga to średnica beleczka, którą można badać pod kątem mierzalnej długości sarkomeru i głębokości geometrycznej. Podejście FFT w oknie do obliczania długości sarkomeru wykorzystuje korzyści płynące z lepszej rozdzielczości przestrzennej, ale wiąże się ze zmniejszoną odpornością (rysunek 8D). W przypadkach, gdy mają być badane mętne lub duże średnice beleczki, rozdzielczość FFT będzie znacznie zmniejszona ze względu na zmniejszony kontrast związany z pasmami sarkomerycznymi w większych próbkach tkanek. Podobnie, w obrębie KTZ, odbicia wsteczne od głębokości obrazowania większej niż 300 μm będą zbyt słabe, aby można je było rozdzielić na etapie segmentacji. W związku z tym nasza technika ogranicza się do beleczek o średnicy mniejszej niż 300 μm. Nie zaleca się jednak badania próbek o dużej średnicy, ponieważ mogą wystąpić problemy z dyfuzyjnym natlenieniem rdzenia mięśniowego podczas wysokich wskaźników stymulacji17.

Nasza metoda umożliwia ocenę jonowych funkcji mechanicznych w połączeniu z geometrią mięśni w zdrowych i chorych mięśniach, zapewniając potężne podejście do zrozumienia fizjologii, patofizjologii i farmakologii mięśnia sercowego. Przedstawiony tutaj potok przetwarzania obrazu wyodrębnia dane, które będą miały kluczowe znaczenie dla głębszego zrozumienia niejednorodności skurczowej. Jedną ze sposobów na pełne wykorzystanie potencjału tak bogatego zbioru danych jest budowa modeli matematycznych, które integrują i interpretują te dane, a także dokonują przewidywań, które można przetestować eksperymentalnie za pomocą naszego urządzenia.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane ze stypendiów doktoranckich Uniwersytetu w Auckland (przyznanych JD i MC), stypendiów Sir Charlesa Hercusa na badania nad zdrowiem (20/011 i 21/116) od Rady Badań nad Zdrowiem Nowej Zelandii (przyznanych odpowiednio J-CH do KT), stypendium doktoranckiego przyznanego przez National Heart Foundation (przyznanego AA), grantów Marsden Fast-Start (UOA1504 i UOA1703) od Royal Society of New Zealand (przyznanych J-CH i KT), oraz stypendium Jamesa Cooka z Royal Society of New Zealand (przyznane AT). Pierwotne opracowanie tego instrumentu zostało sfinansowane z grantu Marsdena (11-UOA-199) z Royal Society of New Zealand (przyznanego AT i PN).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Monoksym 2,3-butanodionuAcros Organics150375000
20 razy; soczewka mikroskopuNikonCFI Super Fluor 20 razy;NA 0.75
Galwanometr 2DThorlabsGVSM002/M
50-50 rozdzielacz wiązkiThorlabsFC850-40-50-APC
90-10 rozdzielacz wiązkiThorlabsTW850R2A2
Moduł wejść analogowychNational InstrumentsNI-9205Rejestruje sygnał PMT przy 200 kHz
Źródło światła do obrazowania w jasnym poluCoolLEDPE-2660  nm
LAM Szerokopasmowe źródło światłaSuperlumBroadlighter-840
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Karta CameralinkNationalInstruments NI-1429Chwytak ramki do obrazowania w jasnym polu
Carbogen 5BOCKod gazu: 181
Soczewka kondensoraNikonLWD 0.52
D(+)-GlukozaMerck108337
DAQNational InstrumentsNI-6259Wyzwala ruch galwanometru
Lustro dichroiczne 1SemrockFF409-Di03
Lustro dichroiczne 2SemrockFF552-Di02
Siatka dyfrakcyjnaWasatch Photonics1200 linii/mm @840 nm
DimetylosulfotlenekSigma-Aldrich276855
Direct-Q 3 UV SystemMerck MilliporeZRQSVR3WWMaszyna do wody destylowanej
Sucha kąpielCorning6875-SBLSE cyfrowa sucha kąpiel
FIJIImageJOprogramowanie do przetwarzania obrazu o otwartym kodzie
źródłowym Fura-2AM sól pentapotasowaThermofisherF14186
Sprzętowa karta FPGANational InstrumentsNI-7813RKontroluje również wyzwalanie wychwytywania jasnego pola
Heparyna Pfizer61024
HEPESPanReac AppliChemA1069
Mikroskop odwróconyNikonTI-DH Słup
IzofluoranMedSourceVAPDRUGISO250
KClSigma-AldrichP9541
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
Kamera liniowaBaslerspL2048-70kmKamera spektrometryczna
Mieszadło magnetyczneIKA3810000RCT basic
MatlabMathworksKod przetwarzania danych
MgCl2Sigma-AldrichM8266
MgSO4.7H2OSigma-AldrichM1880
NaClSigma-Aldrich71376
NaH2PO4.2H2OSigma-Aldrich71505
NaHCO3Sigma-AldrichS6014
Karta FPGA OCTNational InstrumentsNI-1483R
Zbiornik tlenuBOCKod gazu: pH-metr 100D
fotopowielaczaMettler ToledoMP220
HamamatsuH7422-20
PowerloadThermofisherP10020
Dioda superluminescencyjnaBroadlighterD-840
Wzmacniacz transimpedancyjnyNiestandardowy
Tris(hydroksymetylo)aminometanSigma-Aldrich252859
Wistar ratVernon Jansen Jednostka8 – 10 tygodni
Lampa ksenonowa łukowaSutter InstrumentDG-4Lambda DG-4
oświetleniowyLampa

Bibliografia

  1. Han, J. -C., et al. Energetics of stress production in isolated cardiac trabeculae from the rat. American Journal of Physiology. Heart and circulatory physiology. 299 (5), 1382-1394 (2010).
  2. Ter Keurs, H. E. D. J., Rijnsburger, W. H., Van Heuningen, R., Nagelsmit, M. J. Tension development and sarcomere length in rat cardiac trabeculae. Evidence of length-dependent activation. Circulation Research. 46 (5), 703-714 (1980).
  3. Shen, X., Cannell, M. B., Ward, M. L. Effect of SR load and pH regulatory mechanisms on stretch-dependent Ca2+ entry during the slow force response. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 63, 37-46 (2013).
  4. Dowrick, J. M., et al. The slow force response to stretch: Controversy and contradictions. Acta Physiologica. 226 (1), 13250(2019).
  5. Stuyvers, B. D. M. Y., Miura, M., Ter Keurs, H. E. D. J. Diastolic viscoelastic properties of rat cardiac muscle; involvement of Ca2+. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 13-28 (1997).
  6. Tang, E. J. L. P., Laven, R. C., Hajirassouliha, A., Nielsen, P. M. F., Taberner, A. J. Measurement of displacement in isolated heart muscle cells using markerless subpixel image registration. Conference Record - IEEE International Instrumentation and Measurement Technology Conference. , (2019).
  7. Bers, D. M. Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).
  8. Cheuk, M. L., et al. A method for markerless tracking of the strain distribution of actively contracting cardiac muscle preparations. Experimental Mechanics. 61 (1), 95-106 (2020).
  9. Lippok, N., Coen, S., Nielsen, P., Vanholsbeeck, F. Dispersion compensation in Fourier domain optical coherence tomography using the fractional Fourier transform. Optics Express. 20 (21), 23398(2012).
  10. Cheuk, M. L., et al. Four-Dimensional imaging of cardiac trabeculae contracting in vitro using gated OCT. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 64 (1), 218-224 (2017).
  11. Ritland, H. N. Relation between refractive index and density of a glass at constant temperature. Journal of the American Ceramic Society. 38 (2), 86-88 (1955).
  12. Tuchina, D. K., Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. Quantification of glucose and glycerol diffusion in myocardium. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 8 (3), (2015).
  13. Taberner, A., et al. A dynamometer for nature's engines. IEEE Instrumentation and Measurement Magazine. 22 (2), 10-16 (2019).
  14. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: A machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  15. Jiang, Y., Julian, F. J. Pacing rate, halothane, and BDM affect fura 2 reporting of [Ca2+](i) in intact rat trabeculae. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273 (6), 2046-2056 (1997).
  16. Miura, M., Boyden, P. A., Ter Keurs, H. E. D. J. Ca2+ waves during triggered propagated contractions in intact trabeculae. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 274 (1), (1998).
  17. Han, J. -C., et al. Radius-dependent decline of performance in isolated cardiac muscle does not reflect inadequacy of diffusive oxygen supply. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (4), 1222-1236 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie beleczek mięśniowych sercamikroskopia w polu jasnymmikroskopia fluorescencyjnaoptyczna koherentna tomografiaprzejściowe stężenia wapniadługość sarkomeruskurcz mięśniamapowanie przemieszczenia tkanekserce ex vivoobrazowanie multimodalne
Jednoczesne obrazowanie w jasnym polu, fluorescencji i optycznej koherentnej tomografii kurczących się beleczków serca ex vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.