Method Article

Zautomatyzowana hodowla mikroorganizmów i ewolucja adaptacyjna z wykorzystaniem systemu hodowli mikrokropelek drobnoustrojów (MMC)

DOI:

10.3791/62800

⸱

February 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, 5Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, 6School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak używać systemu mikrobiologicznej hodowli mikrokropel (MMC) do prowadzenia zautomatyzowanej hodowli mikrobiologicznej i adaptacyjnej ewolucji. MMC może hodować i podkulminować mikroorganizmy automatycznie i w sposób ciągły oraz monitorować online ich wzrost ze stosunkowo wysoką przepustowością i dobrą równoległością, zmniejszając zużycie pracy i odczynników.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konwencjonalne metody hodowli mikrobiologicznej zazwyczaj mają kłopotliwe operacje, niską przepustowość, niską wydajność oraz duże zużycie pracy i odczynników. Co więcej, opracowane w ostatnich latach wysokoprzepustowe metody uprawy oparte na mikropłytkach mają zły stan rozwoju mikroorganizmów i równoległość eksperymentów ze względu na niską zawartość rozpuszczonego tlenu, słabą mieszaninę oraz silne parowanie i efekt termiczny. Ze względu na wiele zalet mikrokropel, takich jak mała objętość, wysoka przepustowość i silna sterowalność, technologia mikroprzepływowa oparta na kropelkach może przezwyciężyć te problemy, co zostało wykorzystane w wielu rodzajach badań nad wysokoprzepustową hodowlą drobnoustrojów, badaniami przesiewowymi i ewolucją. Jednak większość wcześniejszych badań pozostaje na etapie budowy i zastosowania laboratorium. Niektóre kluczowe kwestie, takie jak wysokie wymagania operacyjne, duże trudności konstrukcyjne i brak technologii zautomatyzowanej integracji, ograniczają szerokie zastosowanie technologii mikroprzepływowej kropelkowej w badaniach mikrobiologicznych. W tym przypadku z powodzeniem opracowano zautomatyzowany system hodowli mikrokropel drobnoustrojów (MMC) w oparciu o technologię mikroprzepływową kropelkową, osiągając integrację funkcji takich jak inokulacja, hodowla, monitorowanie online, poduprawa, sortowanie i pobieranie próbek wymaganych w procesie hodowli kropelek drobnoustrojów. W tym protokole jako przykłady potraktowano Escherichia coli (E. coli) MG1655 typu dzikiego oraz szczep E. coli niezbędny dla metanolu (MeSV2.2), aby przedstawić, jak wykorzystać MMC do prowadzenia zautomatyzowanej i stosunkowo wysokoprzepustowej hodowli drobnoustrojów i ewolucji adaptacyjnej. Ta metoda jest łatwa w obsłudze, zużywa mniej pracy i odczynników oraz ma wysoką przepustowość eksperymentalną i dobrą równoległość danych, co ma ogromne zalety w porównaniu z konwencjonalnymi metodami uprawy. Zapewnia tanią, łatwą w obsłudze i niezawodną platformę eksperymentalną dla badaczy naukowych do prowadzenia powiązanych badań mikrobiologicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla mikroorganizmów jest ważnym fundamentem dla mikrobiologicznych badań naukowych i zastosowań przemysłowych, który jest szeroko stosowany w izolacji, identyfikacji, rekonstrukcji, badaniach przesiewowych i ewolucji mikroorganizmów1,2,3. Konwencjonalne metody hodowli drobnoustrojów wykorzystują głównie probówki, kolby do wytrząsania i płytki stałe jako pojemniki do uprawy, w połączeniu z inkubatorami do wytrząsania, spektrofotometrami, czytnikami mikropłytek i innym sprzętem do hodowli drobnoustrojów, wykrywania i badań przesiewowych. Metody te wiążą się jednak z wieloma problemami, takimi jak uciążliwe operacje, niska przepustowość, niska wydajność oraz duże zużycie pracy i odczynników. Opracowane w ostatnich latach metody uprawy wysokoprzepustowej opierają się głównie na mikropłytce. Ale mikropłytka ma niski poziom rozpuszczonego tlenu, słabe właściwości mieszania oraz silne parowanie i efekt termiczny, co często prowadzi do złego stanu wzrostu i eksperymentalnej równoległości mikroorganizmów4,5,6,7; Z drugiej strony, musi być wyposażony w drogi sprzęt, taki jak stacje robocze do obsługi cieczy i czytniki mikropłytek, aby osiągnąć zautomatyzowane wykrywanie upraw i procesów8,9.

Jako ważna gałąź technologii mikroprzepływowej, mikrofluidyka kropelkowa została opracowana w ostatnich latach w oparciu o tradycyjne systemy mikroprzepływowe o ciągłym przepływie. Jest to technologia mikroprzepływowa o dyskretnym przepływie, która wykorzystuje dwie niemieszające się fazy ciekłe (zwykle olej-woda) do generowania rozproszonych mikrokropelek i działania na nich10. Ponieważ mikrokropelki charakteryzują się małą objętością, dużą powierzchnią właściwą, wysoką wewnętrzną szybkością przenoszenia masy i brakiem zanieczyszczenia krzyżowego spowodowanego podziałem na przedziały, a także zaletami silnej sterowalności i wysokiej przepustowości kropel, przeprowadzono wiele rodzajów badań wykorzystujących technologię mikroprzepływową kropelkową w wysokoprzepustowej hodowli, badaniach przesiewowych i ewolucji mikroorganizmów11. Jednak nadal istnieje szereg kluczowych kwestii, które sprawiają, że technologia mikroprzepływowa kropelkowa jest popularna i szeroko stosowana. Po pierwsze, działanie mikrofluidyki kropelkowej jest kłopotliwe i skomplikowane, co skutkuje wysokimi wymaganiami technicznymi stawianymi operatorom. Po drugie, technologia mikroprzepływowa kropelkowa łączy w sobie komponenty optyczne, mechaniczne i elektryczne i musi być powiązana ze scenariuszami zastosowań biotechnologicznych. Pojedynczemu laboratorium lub zespołowi trudno jest zbudować wydajne systemy kontroli mikroprzepływów kropelkowych, jeśli nie ma współpracy multidyscyplinarnej. Po trzecie, ze względu na małą objętość mikrokropel (od pikolitra (pL) do mikrolitra (μL)), realizacja precyzyjnej automatycznej kontroli i wykrywania kropelek w czasie rzeczywistym w czasie rzeczywistym dla niektórych podstawowych operacji mikrobiologicznych, takich jak podhodowla, sortowanie i pobieranie próbek, wymaga również wielu trudności, a także trudno jest zbudować zintegrowany system wyposażenia12.

W celu rozwiązania powyższych problemów, z powodzeniem opracowano automatyczny system hodowli mikrokropelek mikrobiologicznych (MMC) oparty na technologii mikroprzepływowej kropel13. MMC składa się z czterech modułów funkcjonalnych: modułu rozpoznawania kropel, modułu detekcji widma kropel, modułu chipa mikroprzepływowego oraz modułu próbkowania. Dzięki integracji systemu i sterowaniu wszystkimi modułami, zautomatyzowany system operacyjny, w tym wytwarzanie, hodowla, pomiar (gęstość optyczna (OD) i fluorescencja), rozdzielanie, fuzja, sortowanie kropel, jest dokładnie ustalony, osiągając integrację funkcji, takich jak inokulacja, uprawa, monitorowanie, poduprawa, sortowanie i pobieranie próbek wymagane w procesie hodowli kropel drobnoustrojów. MMC może pomieścić do 200 powtórzonych jednostek do hodowli kropelkowej o objętości 2-3 μl, co odpowiada 200 jednostkom do uprawy w kolbach wstrząsowych. System hodowli mikrokropel może spełnić wymagania dotyczące braku zanieczyszczeń, rozpuszczonego tlenu, mieszania i wymiany masy i energii podczas wzrostu mikroorganizmów, a także zaspokoić różne potrzeby badań mikrobiologicznych dzięki wielu zintegrowanym funkcjom, na przykład pomiarowi krzywej wzrostu, ewolucji adaptacyjnej, jednoczynnikowej analizie wielopoziomowej oraz badaniom i analizie metabolitów (w oparciu o detekcję fluorescencji)13,14.

Tutaj protokół szczegółowo opisuje, jak używać MMC do prowadzenia zautomatyzowanej i mikrobiologicznej hodowli oraz adaptacyjnej ewolucji (Rysunek 1). Jako przykład wzięliśmy Escherichia coli (E. coli) MG1655 typu dzikiego, aby zademonstrować pomiar krzywej wzrostu i szczep E. coli niezbędny dla metanolu MeSV2.215, aby zademonstrować ewolucję adaptacyjną w MMC. Opracowano oprogramowanie operacyjne dla MMC, które sprawia, że obsługa jest bardzo prosta i przejrzysta. W całym procesie użytkownik musi przygotować początkowy roztwór bakteryjny, ustawić warunki MMC, a następnie wstrzyknąć roztwór bakteryjny i powiązane odczynniki do MMC. Następnie MMC automatycznie wykona operacje, takie jak generowanie kropel, rozpoznawanie i numerowanie, uprawa i ewolucja adaptacyjna. Wykona również detekcję online (OD i fluorescencja) kropel z wysoką rozdzielczością czasową i wyświetli powiązane dane (które można wyeksportować) w oprogramowaniu. Operator może w każdej chwili przerwać proces uprawy zgodnie z wynikami i wyodrębnić docelowe kropelki do kolejnych eksperymentów. MMC jest łatwy w obsłudze, zużywa mniej pracy i odczynników oraz ma stosunkowo wysoką przepustowość eksperymentalną i dobrą równoległość danych, co ma znaczące zalety w porównaniu z konwencjonalnymi metodami uprawy. Zapewnia niedrogą, łatwą w obsłudze i solidną platformę eksperymentalną dla naukowców do prowadzenia powiązanych badań mikrobiologicznych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Instalacja instrumentu i oprogramowania

  1. Wybierz czyste i sterylne środowisko (takie jak czysta ławka) jako dedykowaną stałą przestrzeń dla MMC. Zainstaluj MMC stabilnie w przestrzeni.
    UWAGA: Trzymaj MMC z dala od zakłóceń silnych pól elektrycznych, pól magnetycznych i silnych źródeł promieniowania cieplnego. Unikaj silnego wpływu wibracji na optyczne elementy detekcji. Zapewnij zasilanie AC220 V, 50 HZ do MMC. Szczegółowe informacje na temat programu MMC można znaleźć w Tabeli materiałów i na stronie internetowej programu MMC16.
  2. Zainstaluj oprogramowanie operacyjne z pliku MMC.zip
    UWAGA: Skontaktuj się z autorami, aby uzyskać plik MMC.zip.
    1. Utwórz dedykowany folder i zapisz w nim plik zip.
    2. Utwórz kolejny dedykowany folder jako "Katalog instalacyjny". Rozpakuj MMC.zip i zapisz pliki w nowym folderze.
      UWAGA: Konfiguracja komputera najlepiej spełnia: (1) 64-bitowy system operacyjny Windows 7 lub nowszy; (2) Procesor: i5 lub nowszy; (3) pamięć: 4 GB lub więcej; (4) dysk twardy: 300 GB lub więcej (prędkość obrotowa większa niż 7200 obr./min lub dysk półprzewodnikowy).

2. Przygotowania

  1. Podłącz igłę strzykawki (średnica wewnętrzna wynosi 0,41 mm, a średnica zewnętrzna 0,71 mm), szybkozłączkę A i butelkę z odczynnikiem (Rysunek 2C) i sterylizuj je w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut
    UWAGA: Podczas sterylizacji lekko odkręć nakrętkę butelki z odczynnikiem. Za każdym razem można przygotować kilka dodatkowych butelek z odczynnikiem do użycia.
  2. Użyj filtra z polifluorku winylidenu (PVDF) 0,22 μm do filtrowania oleju MMC. Umieść wcześniej chip mikroprzepływowy (Rysunek 2B) i olej MMC na czystej ławce i sterylizuj je promieniowaniem ultrafioletowym przez 30 minut przed użyciem.
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat szybkozłącza A, butelki z odczynnikiem, oleju MMC i chipa mikroprzepływowego znajdują się w Tabeli materiałów.
  3. Zainstaluj chip mikroprzepływowy
    1. Otwórz drzwi komory operacyjnej ( Rysunek 2A) i podnieś sondę światłowodową.
    2. Dopasuj otwory pola elektrycznego do igieł pola elektrycznego i delikatnie umieść chip na cokole chipa. Następnie włóż dwie kolumny pozycjonujące do otworów pozycjonujących i odłóż sondę światłowodową (Rysunek 2D).
    3. Podłącz szybkozłącze A na chipie do odpowiedniego portu MMC zgodnie z numerem pozycji (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Następnie zamknij drzwi komory operacyjnej.
  4. Uzupełnij olej MMC (do około 80 ml) w butelce z olejem i opróżnij zużyty płyn z butelki na odpady przed użyciem.
    UWAGA: Ciecz odpadowa to zwykle odpady organiczne. Po utylizacji należy zapoznać się z regionalnymi przepisami i regulacjami, które mogą ulec zmianie w zależności od konfiguracji eksperymentalnej.

3. Pomiar krzywej wzrostu w MMC

  1. Przygotowanie do początkowego roztworu bakteryjnego
    1. Postępuj zgodnie z odpowiednimi normami, aby przygotować pożywkę Luria-Bertani (LB) i autoklawować w temperaturze 121°C przez 15 minut
      UWAGA: Składniki podłoża LB: NaCl (10 g/L), ekstrakt drożdżowy (5 g/L) i trypton (10 g/L).
    2. Wyjąć szczep E. coli MG1655 z wywaru glicerolowego i hodować go w kolbie do wytrząsania o pojemności 50 ml z 10 ml pożywki LB w inkubatorze do wytrząsania (200 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 5-8 h.
      UWAGA: Czas uprawy zależy od konkretnych szczepów. Optymalnie jest uprawiać szczep do okresu/fazy logarytmicznej.
    3. Rozcieńczyć roztwór hodowli E. coli MG1655 świeżą pożywką do OD600 0,05-0,1 w celu uzyskania początkowego roztworu bakterii (przygotować około 10 ml).
  2. Kliknij Inicjalizacja, aby zainicjować MMC. Po pojawieniu się interfejsu inicjalizacji ustaw temperaturę uprawy na 37 °C, a wartość sygnału fotoelektrycznego na 0,6 (Rysunek 3A). Inicjalizacja zajmie około 20 minut.
  3. Włącz lampę UV (długość fali 254 nm) podczas inicjalizacji.
  4. Wstrzyknąć początkowy roztwór bakterii i olej MMC do butelki z odczynnikiem.
    1. Wyjmij wysterylizowaną butelkę z odczynnikiem na czystej ławie i dokręć nakrętkę.
    2. Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 10 ml wstrzyknij 3-5 ml oleju MMC z igły strzykawki w bocznej tubce. Powoli przechylaj i obracaj butelkę z odczynnikiem, aby olej w pełni przeniknął do wewnętrznej ścianki.
    3. Wstrzyknij około 5 ml początkowego roztworu bakteryjnego, a następnie napełnij butelkę z odczynnikiem, ponownie wstrzykując 5-7 ml oleju.
    4. Wyciągnij niezależne szybkozłącze A i włóż szybkozłącze A butelki z odczynnikiem do szybkozłącza B, aby zakończyć operację wstrzykiwania próbki (Rysunek 4A).
  5. Poczekaj na zakończenie inicjalizacji, a następnie wyłącz lampę UV (długość fali 254 nm).
  6. Otwórz drzwi komory operacyjnej i włóż butelkę z odczynnikiem do metalowej kąpieli.
  7. Wyciągnij złącze C2 chipa i szybkozłącze A butelki z odczynnikiem. Podłącz boczne złącze rurki butelki z odczynnikiem do złącza C2, a złącze górnej rurki do złącza O2. Następnie zamknij drzwi komory operacyjnej.
  8. Kliknij na Krzywa wzrostu, aby wybrać funkcję pomiaru krzywej wzrostu (Rysunek 3A). W interfejsie ustawiania parametrów wprowadź liczbę jako 15, włącz przełącznik wykrywania OD i ustaw długość fali na 600 nm. Kliknij Start, aby rozpocząć generowanie kropel. Zajmie to około 10 min.
    UWAGA: W tym przypadku liczba odnosi się do liczby kropel, które mają zostać wygenerowane. Długość fali odnosi się do długości fali OD, która ma być wykryta. Ustaw liczbę (maksymalnie 200) i długość fali (350-800 nm) zgodnie z wymaganiami eksperymentu.
  9. Gdy w głównym interfejsie pojawi się wyskakujące okienko z monitem "Wyjmij butelkę z odczynnikiem między C2 i O2, a następnie kliknij przycisk OK po zakończeniu", otwórz drzwi komory operacyjnej, aby wyjąć butelkę z odczynnikiem i podłączyć złącza C2 i O2.
  10. Zamknij drzwi i kliknij przycisk OK w wyskakującym okienku, aby automatycznie wyhodować kropelki i wykryć wartości OD.
    UWAGA: MMC wykrywa wartość OD, gdy kropla przechodzi przez sondę światłowodową. Dlatego okres wykrywania zależy od liczby generowanych kropel.
  11. Gdy krzywa wzrostu osiągnie fazę stacjonarną, kliknij przycisk Eksport danych, aby wyeksportować dane OD. Wybierz ścieżkę zapisu danych i wyeksportuj wartość OD zarejestrowaną w okresie uprawy w formacie .csv, który można otworzyć za pomocą odpowiedniego oprogramowania (np. Microsoft Excel). Następnie użyj oprogramowania do mapowania (np. EXCEL i Origin 9.0), aby wykreślić krzywą wzrostu.
    UWAGA: Podczas procesu uprawy możliwe jest kliknięcie Eksport danych w dowolnym momencie, aby wyeksportować dane OD wszystkich bieżących kropel.

4. Ewolucja adaptacyjna w MMC

  1. Przygotowanie do początkowego roztworu bakteryjnego
    1. Postępuj zgodnie z odpowiednimi przepisami normowymi, aby przygotować specjalne płynne podłoże i stałe płytki dla MeSV2.2 i autoklawować w temperaturze 121 °C przez 15 minut
      UWAGA: Aby zapoznać się ze składnikami specjalnego podłoża, patrz Tabela 1 i Tabela materiałów.
    2. Hodować MeSV2.2 na solidnej płytce (średnica = 90 mm) w inkubatorze o stałej temperaturze 37 °C przez 72 godziny. Następnie wybrać niezależną kolonię i hodować ją w kolbie do wytrząsania o pojemności 50 ml z 10 ml specjalnego płynnego podłoża w inkubatorze z wytrząsaniem (200 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 72 godziny.
    3. Rozcieńczyć roztwór MeSV2.2 z pożywką do OD600 0,1-0,2 (upewnić się, że całkowita objętość nie jest mniejsza niż 10 ml) i kontynuować hodowlę w kolbie wstrząsowej przez 5 godzin w celu uzyskania początkowego roztworu bakterii.
      UWAGA: MeSV2.2 to szczep E. coli niezbędny do produkcji metanolu. Specjalna płynna pożywka zawiera 500 mmol/L metanolu, który jest silnym obciążeniem dla MeSV2.2, powodując bardzo powolny wzrost. Należy pamiętać, że uzyskanie początkowego roztworu bakterii w tym miejscu różni się od opisanego w kroku 3.1.
  2. Zainicjuj program MMC zgodnie z opisem w krokach 3.2, 3.3 i 3.5.
  3. Wyjmij dwie wysterylizowane butelki z odczynnikami, z których jedna jest przeznaczona na początkowy roztwór bakterii, a druga na świeżą pożywkę. Wstrzyknąć początkowy roztwór bakterii (5 ml), świeżą pożywkę (12-15 ml) i olej MMC do butelek z odczynnikami, jak wyjaśniono w kroku 3.4.
    UWAGA: Ponieważ ewolucja adaptacyjna jest długotrwałym procesem obejmującym wiele podupraw, przechowuj jak najwięcej świeżego podłoża w MMC. Pożywka nie może być uzupełniana podczas trwania eksperymentu.
  4. Zainstaluj dwie butelki z odczynnikiem w MMC, jak wyjaśniono w kroku 3.6. Zainstaluj jeden dla początkowego roztworu bakterii między złączem C2 i O2, a drugi dla świeżego podłoża między złączem C4 i O4.
  5. Kliknij na ALE, aby wybrać funkcję ewolucji adaptacyjnej (Rysunek 3B). W interfejsie ustawiania parametrów włącz przełącznik wykrywania OD.
  6. Ustaw liczbę na 50, długość fali na 600 nm, stężenie na 0%, wpisz jako czas, parametr na 30 h, a powtórzenia na 99. Kliknij Start, aby rozpocząć generowanie kropel. Zajmie to około 25 min.
    UWAGA: Tutaj "koncentracja" odnosi się do maksymalnego stężenia czynników chemicznych dla ewolucji adaptacyjnej. W przypadku różnych kropel w MMC możliwe jest wprowadzenie różnych stężeń czynników chemicznych w celu zapewnienia różnych warunków wzrostu. Obliczyć wprowadzone stężenia, stosując następujące równanie:
    figure-protocol-1
    Tutaj "C" odnosi się do stężenia czynników chemicznych wprowadzanych do kropel; "a" odnosi się do stężenia czynników chemicznych w butelkach z odczynnikiem między złączem C4 i O4; "b" odnosi się do stężenia czynników chemicznych w butelkach z odczynnikiem między złączem C6 i O6; a "i" odnosi się do dostępnego stężenia. W MMC dostępnych jest osiem stężeń. Ponieważ czynnik chemiczny ma tutaj pojedyncze stężenie (500 mmol/L metanolu) i jest jednym ze składników pożywki, instalowana jest tutaj tylko jedna butelka z odczynnikiem chemicznym zawierająca czynnik chemiczny, a stężenie jest ustawione na 0%. Typ odnosi się do trybu poduprawy, który dzieli się na trzy typy: tryb czasu, tryb wartości OD i tryb fluorescencji. Pierwsza z nich oznacza hodowlę kropel przez określony czas, a następnie podkultywację, podczas gdy druga oznacza hodowlę kropel do wcześniej określonej wartości OD / intensywności fluorescencji, a następnie podkultywację. Parametr odnosi się do powiązanego parametru wymaganego przy wyborze trybu poduprawy. Powtórzenia odnoszą się do liczby podupraw.
  7. Wyjmij butelkę z odczynnikiem umieszczoną między złączem C2 i O2, jak wyjaśniono w kroku 3.8.
  8. Należy obserwować, czy maksymalne wartości OD kropelek podczas każdego okresu uprawy uległy znacznemu wzrostowi. Jeśli wzrost nastąpi i spełnia wymagania eksperymentu, kliknij przycisk Eksport danych, aby wyeksportować dane OD, jak wyjaśniono w kroku 3.9.
    UWAGA: W tym przypadku okres poduprawy zależy od parametru. Na przykład, przy ustawieniu Typu jako Czas i Parametru na 30 godzin, okres poduprawy wynosi 30 godzin. Podczas każdego okresu poduprawy ustalane są maksymalne wartości OD kropel. Oszacować, czy ewolucja adaptacyjna spełnia wymagania eksperymentu poprzez zwiększenie maksymalnych wartości OD (wzrost zależy od rzeczywistego procesu uprawy szczepu, na przykład zwiększonego o więcej niż 20%).
    UWAGA: Zwróć uwagę, czy przechowywane świeże podłoże jest wyczerpane. Jeśli znaczny wzrost nie nastąpił nawet po wyczerpaniu pożywki, wyekstrahuj lepiej rosnące kropelki i przeprowadź nową rundę ewolucji adaptacyjnej.
  9. Wyodrębnij docelowe kropelki z konsoli MMC.
    1. Kliknij przycisk Screening (Ekranowanie), aby wybrać funkcję ekstrakcji kropel (Rysunek 3C). Wybierz opcję Zbierz, kliknij liczbę docelowych kropel, a następnie kliknij OK.
      UWAGA: Przesiewanie kropelek obejmuje "Zbieranie", "Odrzucanie" i "Ekstrakcja roztworu nasion". "Roztwór nasion ekstraktu" oznacza zebranie pozostałych kropelek 13 po operacji poduprawy.
    2. Poczekaj, aż w wyskakującym okienku pojawi się komunikat "Wyciągnij szybkozłącze CF i włóż je do rurki EP". Umieść szybkozłączkę CF w probówce mikrowirówki w celu pobrania zgodnie z monitem oprogramowania, a następnie kliknij OK (Rysunek 4D).
    3. Po 1-2 minutach w interfejsie oprogramowania pojawi się nowe okno z monitem: "Włóż łącznik z powrotem i kliknij OK, jeśli zakończono". Następnie włóż z powrotem szybkozłącze CF i kliknij OK, aby program MMC kontynuował działanie (Rysunek 4D). Gdy następna kropla docelowa dotrze do miejsca rozpoznawania kropli, powtórz 4.9.2-4.9.3, aby ją zebrać.
      UWAGA: Po zebraniu wszystkich docelowych kropel, MMC będzie kontynuować hodowlę pozostałych kropel. Jeśli uprawa nie jest konieczna, kliknij Zatrzymaj, aby bezpośrednio zakończyć operację.
    4. Pobrać kroplę za pomocą pipety o pojemności 2,5 μl, upuścić ją na płytkę agarozową o średnicy 90 mm i równomiernie rozprowadzić za pomocą trójkątnego szklanego pręta do rozprowadzania o boku długości 3 cm. Następnie hoduj go w inkubatorze o stałej temperaturze 37 °C przez 72 godziny.
    5. Wybrać 3-5 niezależnych kolonii i oddzielnie hodować je w kolbach do wytrząsania o pojemności 50 ml z 10 ml świeżej pożywki w inkubatorze z wytrząsaniem (200 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 48-72 godzin. Postępuj zgodnie z odpowiednimi standardowymi przepisami, aby przechowywać roztwór bakterii hodowlanych w probówce z glicerolem do kolejnych eksperymentów.

5. Wyczyść MMC

  1. Po zakończeniu eksperymentu kliknij Zatrzymaj, aby zatrzymać wszystkie operacje. Następnie kliknij Wyczyść, aby wyczyścić wiór i rurki. Zajmie to około 15 minut.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wykorzystuje E. coli MG1655 i szczep MeSV2.2 jako przykłady do zademonstrowania uprawy mikrobiologicznej i niezbędnej dla metanolu ewolucji adaptacyjnej za pomocą zautomatyzowanej i stosunkowo wysokiej przepustowości strategii w MMC. Pomiar krzywej wzrostu wykorzystano głównie do scharakteryzowania hodowli drobnoustrojów. Ewolucja adaptacyjna została przeprowadzona przez zautomatyzowaną ciągłą poduprawę i dodanie wysokiego stężenia metanolu jako ciśnienia selekcyjnego podczas każdej poduprawy. To, c...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia, w jaki sposób wykorzystać system hodowli mikrodrobnoustrojów mikrobiologicznych (MMC) do zautomatyzowanej hodowli drobnoustrojów i długoterminowej ewolucji adaptacyjnej. MMC to zminiaturyzowany, zautomatyzowany i wysokowydajny system hodowli drobnoustrojów. W porównaniu z konwencjonalnymi wysokowydajnymi metodami i instrumentami do hodowli drobnoustrojów, MMC ma wiele zalet, takich jak niskie zużycie pracy i odczynników, prosta obsługa, wykrywanie online (OD i fluorescencja), gromadzenie danych ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2018YFA0901500), Narodowy Projekt Kluczowych Instrumentów i Sprzętu Naukowego Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (21627812) oraz Program Badań Naukowych Inicjatywy Uniwersytetu Tsinghua (20161080108). Dziękujemy również prof. Julii A. Vorholt (Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, ETH Zurich, Zurych 8093, Szwajcaria) za dostarczenie niezbędnego dla metanolu szczepu E. coli w wersji 2.2 (MeSV2.2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22 &m; m Membrana filtracyjna PVDFMerck Millipore Ltd.SLGPR33RBWysterylizuj olej MMC
4 i stopnie; C lodówkaHaierBCD-289BSWDo przechowywania odczynników
AgarBecton, Dickinson and Company214010Do przygotowania płytek stałych
CaCl2· 2H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20011160Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
Czysta ławkaBeijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.DL-CJ-INDIIDo pracy aseptycznej i sterylizacji UV
CoCl2· 6H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10007216Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
KomputerLenovoE450Instalacja oprogramowania i sterowanie MMC
Inkubator o stałej temperaturzeShanghai qixin scientific instrument co., LTDLRH 250Do hodowli mikrobiologicznej przy użyciu stałego podłoża
CuSO4· 5H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10008218Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
Waga elektronicznaOHAUSAR 3130Do ważenia odczynnika
EP probówkaThermo Fisher1,5 mlDo zbierania kropelek
FeCl3· 6H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10011928Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
Rurka zamrażającaThermo Fisher2,0 mldo konserwacji szczepu
GlukonianSigma-AldrichS2054Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
GlicerolGENERAL-REAGENTG66258ADo konserwacji szczepu
Wysokociśnieniowy garnek do sterylizacji parowejSANYO ElectricMLS3020Do sterylizacji w autoklawie
izopropylo-β-d-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Biotopowany420322Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
Siarczan kanamycynySolarbioK8020Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
KH2PO4MACKLINP815661Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
MetanolMACKLINM813895Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
MgSO4· 7H2OBIOBYING1305715Składnik specjalnej pożywki dla MeSV2.2.
System hodowli mikrokropelek drobnoustrojów (MMC)Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.  MMC-IWyznaczanie krzywej wzrostu i ewolucji adaptacyjnej. Proszę zapoznać się z
http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 Chip mikroprzepływowyLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-ALE-ODDo różnych operacji kropelkowych. Proszę zapoznać się z
http://www.tmaxtree.com/en/ MMC oilLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-M/S-ODFaza olejowa dla mikrofluidyki kropelkowej. Proszę zapoznać się z http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20026118Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
NaClODCZYNNIK OGÓLNYG81793JSkładnik podłoża LB
Na2HPO4· 12H2OODCZYNNIK OGÓLNYG10267B Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
NH4ClOdczynnik chemiczny Sinopharm Beijing Co., Ltd.10001518Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
szalka PetriegoCorning Incorporated90 mmDo przygotowania podłoża stałego
Pipetaeppendorf2.5 μ L, 10 i mu; L, 100μ L, 1000μ LDo obsługi cieczy
Szybkozłącze ALuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.—Do połączenia każdego złącza. Proszę zapoznać się z
http://www.tmaxtree.com/en/ Butelka z odczynnikiemLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-PCBPobieranie próbek i przechowywanie roztworu bakteryjnego i odczynników. Proszę zapoznać się z http://www.tmaxtree.com/en/
Shake kolbaUnion-Biotech50 mldo hodowli mikroorganizmów
Inkubator wstrząsającyShanghai Sukun Industrial Co., Ltd.SKY-210 2BDo hodowli mikrobiologicznej w kolbie wstrząsowej
Siarczan streptomycynySolarbioS8290Składnik specjalnej pożywki dla MeSV2.2.
StrzykawkaJIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD10 mlPobrać płyn i wstrzyknąć go do butelki z odczynnikiem
Igła do strzykawkiOUBEL Hardware Store22GŚrednica wewnętrzna wynosi 0,41 mm, a średnica zewnętrzna 0,71 mm.
TryptonOxoid Sp. z o.o.LP0042Element
średniej chłodziarki niskotemperaturowejLB SANYO Ultra-lowMDF-U4086SDo konserwacji szczepów (-80 ° C)
UV– Spektrofotometr VisGeneral Electric CompanyUltrospec 3100 proDo pomiaru wartości OD
Witamina B1SolarbioSV8080Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
Ekstrakt drożdżowyOxoid Ltd.LP0021Składnik medium LB
ZnSO4· 7H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10024018Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
  2. Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
  3. Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  4. Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381(2019).
  5. Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
  6. Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
  7. Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
  8. Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
  9. Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
  10. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  11. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
  12. Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
  13. Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  14. Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570(2020).
  15. Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508(2018).
  16. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. The introduction of MMC. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. , Available from: http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 (2021).
  17. Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
  18. Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
  19. Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
  20. Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
  21. Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
  22. Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998(2020).
  23. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  24. Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
  25. Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbial Microdroplet CultureAutomated Microbial CultivationAdaptive Laboratory EvolutionDroplet MicrofluidicsGrowth Curve MeasurementEscherichia Coli CultivationHigh Throughput ScreeningOnline MonitoringSub CultivationDroplet Extraction

Related Articles