Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowana hodowla mikroorganizmów i ewolucja adaptacyjna z wykorzystaniem systemu hodowli mikrokropelek drobnoustrojów (MMC)

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62800

⸱

18 lutego 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, 5Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, 6School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak używać systemu mikrobiologicznej hodowli mikrokropel (MMC) do prowadzenia zautomatyzowanej hodowli mikrobiologicznej i adaptacyjnej ewolucji. MMC może hodować i podkulminować mikroorganizmy automatycznie i w sposób ciągły oraz monitorować online ich wzrost ze stosunkowo wysoką przepustowością i dobrą równoległością, zmniejszając zużycie pracy i odczynników.

Streszczenie

Konwencjonalne metody hodowli mikrobiologicznej zazwyczaj mają kłopotliwe operacje, niską przepustowość, niską wydajność oraz duże zużycie pracy i odczynników. Co więcej, opracowane w ostatnich latach wysokoprzepustowe metody uprawy oparte na mikropłytkach mają zły stan rozwoju mikroorganizmów i równoległość eksperymentów ze względu na niską zawartość rozpuszczonego tlenu, słabą mieszaninę oraz silne parowanie i efekt termiczny. Ze względu na wiele zalet mikrokropel, takich jak mała objętość, wysoka przepustowość i silna sterowalność, technologia mikroprzepływowa oparta na kropelkach może przezwyciężyć te problemy, co zostało wykorzystane w wielu rodzajach badań nad wysokoprzepustową hodowlą drobnoustrojów, badaniami przesiewowymi i ewolucją. Jednak większość wcześniejszych badań pozostaje na etapie budowy i zastosowania laboratorium. Niektóre kluczowe kwestie, takie jak wysokie wymagania operacyjne, duże trudności konstrukcyjne i brak technologii zautomatyzowanej integracji, ograniczają szerokie zastosowanie technologii mikroprzepływowej kropelkowej w badaniach mikrobiologicznych. W tym przypadku z powodzeniem opracowano zautomatyzowany system hodowli mikrokropel drobnoustrojów (MMC) w oparciu o technologię mikroprzepływową kropelkową, osiągając integrację funkcji takich jak inokulacja, hodowla, monitorowanie online, poduprawa, sortowanie i pobieranie próbek wymaganych w procesie hodowli kropelek drobnoustrojów. W tym protokole jako przykłady potraktowano Escherichia coli (E. coli) MG1655 typu dzikiego oraz szczep E. coli niezbędny dla metanolu (MeSV2.2), aby przedstawić, jak wykorzystać MMC do prowadzenia zautomatyzowanej i stosunkowo wysokoprzepustowej hodowli drobnoustrojów i ewolucji adaptacyjnej. Ta metoda jest łatwa w obsłudze, zużywa mniej pracy i odczynników oraz ma wysoką przepustowość eksperymentalną i dobrą równoległość danych, co ma ogromne zalety w porównaniu z konwencjonalnymi metodami uprawy. Zapewnia tanią, łatwą w obsłudze i niezawodną platformę eksperymentalną dla badaczy naukowych do prowadzenia powiązanych badań mikrobiologicznych.

Wprowadzenie

Hodowla mikroorganizmów jest ważnym fundamentem dla mikrobiologicznych badań naukowych i zastosowań przemysłowych, który jest szeroko stosowany w izolacji, identyfikacji, rekonstrukcji, badaniach przesiewowych i ewolucji mikroorganizmów1,2,3. Konwencjonalne metody hodowli drobnoustrojów wykorzystują głównie probówki, kolby do wytrząsania i płytki stałe jako pojemniki do uprawy, w połączeniu z inkubatorami do wytrząsania, spektrofotometrami, czytnikami mikropłytek i innym sprzętem do hodowli drobnoustrojów, wykrywania i badań przesiewowych. Metody te wiążą się jednak z wieloma problemami, takimi jak uciążliwe operacje, niska przepustowość, niska wydajność oraz duże zużycie pracy i odczynników. Opracowane w ostatnich latach metody uprawy wysokoprzepustowej opierają się głównie na mikropłytce. Ale mikropłytka ma niski poziom rozpuszczonego tlenu, słabe właściwości mieszania oraz silne parowanie i efekt termiczny, co często prowadzi do złego stanu wzrostu i eksperymentalnej równoległości mikroorganizmów4,5,6,7; Z drugiej strony, musi być wyposażony w drogi sprzęt, taki jak stacje robocze do obsługi cieczy i czytniki mikropłytek, aby osiągnąć zautomatyzowane wykrywanie upraw i procesów8,9.

Jako ważna gałąź technologii mikroprzepływowej, mikrofluidyka kropelkowa została opracowana w ostatnich latach w oparciu o tradycyjne systemy mikroprzepływowe o ciągłym przepływie. Jest to technologia mikroprzepływowa o dyskretnym przepływie, która wykorzystuje dwie niemieszające się fazy ciekłe (zwykle olej-woda) do generowania rozproszonych mikrokropelek i działania na nich10. Ponieważ mikrokropelki charakteryzują się małą objętością, dużą powierzchnią właściwą, wysoką wewnętrzną szybkością przenoszenia masy i brakiem zanieczyszczenia krzyżowego spowodowanego podziałem na przedziały, a także zaletami silnej sterowalności i wysokiej przepustowości kropel, przeprowadzono wiele rodzajów badań wykorzystujących technologię mikroprzepływową kropelkową w wysokoprzepustowej hodowli, badaniach przesiewowych i ewolucji mikroorganizmów11. Jednak nadal istnieje szereg kluczowych kwestii, które sprawiają, że technologia mikroprzepływowa kropelkowa jest popularna i szeroko stosowana. Po pierwsze, działanie mikrofluidyki kropelkowej jest kłopotliwe i skomplikowane, co skutkuje wysokimi wymaganiami technicznymi stawianymi operatorom. Po drugie, technologia mikroprzepływowa kropelkowa łączy w sobie komponenty optyczne, mechaniczne i elektryczne i musi być powiązana ze scenariuszami zastosowań biotechnologicznych. Pojedynczemu laboratorium lub zespołowi trudno jest zbudować wydajne systemy kontroli mikroprzepływów kropelkowych, jeśli nie ma współpracy multidyscyplinarnej. Po trzecie, ze względu na małą objętość mikrokropel (od pikolitra (pL) do mikrolitra (μL)), realizacja precyzyjnej automatycznej kontroli i wykrywania kropelek w czasie rzeczywistym w czasie rzeczywistym dla niektórych podstawowych operacji mikrobiologicznych, takich jak podhodowla, sortowanie i pobieranie próbek, wymaga również wielu trudności, a także trudno jest zbudować zintegrowany system wyposażenia12.

W celu rozwiązania powyższych problemów, z powodzeniem opracowano automatyczny system hodowli mikrokropelek mikrobiologicznych (MMC) oparty na technologii mikroprzepływowej kropel13. MMC składa się z czterech modułów funkcjonalnych: modułu rozpoznawania kropel, modułu detekcji widma kropel, modułu chipa mikroprzepływowego oraz modułu próbkowania. Dzięki integracji systemu i sterowaniu wszystkimi modułami, zautomatyzowany system operacyjny, w tym wytwarzanie, hodowla, pomiar (gęstość optyczna (OD) i fluorescencja), rozdzielanie, fuzja, sortowanie kropel, jest dokładnie ustalony, osiągając integrację funkcji, takich jak inokulacja, uprawa, monitorowanie, poduprawa, sortowanie i pobieranie próbek wymagane w procesie hodowli kropel drobnoustrojów. MMC może pomieścić do 200 powtórzonych jednostek do hodowli kropelkowej o objętości 2-3 μl, co odpowiada 200 jednostkom do uprawy w kolbach wstrząsowych. System hodowli mikrokropel może spełnić wymagania dotyczące braku zanieczyszczeń, rozpuszczonego tlenu, mieszania i wymiany masy i energii podczas wzrostu mikroorganizmów, a także zaspokoić różne potrzeby badań mikrobiologicznych dzięki wielu zintegrowanym funkcjom, na przykład pomiarowi krzywej wzrostu, ewolucji adaptacyjnej, jednoczynnikowej analizie wielopoziomowej oraz badaniom i analizie metabolitów (w oparciu o detekcję fluorescencji)13,14.

Tutaj protokół szczegółowo opisuje, jak używać MMC do prowadzenia zautomatyzowanej i mikrobiologicznej hodowli oraz adaptacyjnej ewolucji (Rysunek 1). Jako przykład wzięliśmy Escherichia coli (E. coli) MG1655 typu dzikiego, aby zademonstrować pomiar krzywej wzrostu i szczep E. coli niezbędny dla metanolu MeSV2.215, aby zademonstrować ewolucję adaptacyjną w MMC. Opracowano oprogramowanie operacyjne dla MMC, które sprawia, że obsługa jest bardzo prosta i przejrzysta. W całym procesie użytkownik musi przygotować początkowy roztwór bakteryjny, ustawić warunki MMC, a następnie wstrzyknąć roztwór bakteryjny i powiązane odczynniki do MMC. Następnie MMC automatycznie wykona operacje, takie jak generowanie kropel, rozpoznawanie i numerowanie, uprawa i ewolucja adaptacyjna. Wykona również detekcję online (OD i fluorescencja) kropel z wysoką rozdzielczością czasową i wyświetli powiązane dane (które można wyeksportować) w oprogramowaniu. Operator może w każdej chwili przerwać proces uprawy zgodnie z wynikami i wyodrębnić docelowe kropelki do kolejnych eksperymentów. MMC jest łatwy w obsłudze, zużywa mniej pracy i odczynników oraz ma stosunkowo wysoką przepustowość eksperymentalną i dobrą równoległość danych, co ma znaczące zalety w porównaniu z konwencjonalnymi metodami uprawy. Zapewnia niedrogą, łatwą w obsłudze i solidną platformę eksperymentalną dla naukowców do prowadzenia powiązanych badań mikrobiologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Instalacja instrumentu i oprogramowania

  1. Wybierz czyste i sterylne środowisko (np. komorę z laminarnym przepływem powietrza) jako dedykowaną, stałą przestrzeń dla MMC. Stabilnie zainstaluj MMC w tej przestrzeni.
    UWAGA: Trzymaj MMC z dala od zakłóceń powodowanych przez silne pola elektryczne, pola magnetyczne oraz silne źródła promieniowania cieplnego. Unikaj silnych wibracji, które mogłyby wpłynąć na komponenty detekcji optycznej. Zapewnij zasilanie AC220 V, 50 HZ dla MMC. Szczegółowe informacje na temat MMC znajdują się w Tabeli materiałów oraz na stronie internetowej MMC16.
  2. Zainstaluj oprogramowanie operacyjne z pliku MMC.zip
    UWAGA: Skontaktuj się z autorami w celu otrzymania pliku MMC.zip.
    1. Utwórz dedykowany folder i zapisz w nim plik zip.
    2. Utwórz kolejny dedykowany folder jako „Katalog instalacyjny”. Rozpakuj plik MMC.zip i zapisz pliki w nowym folderze.
      UWAGA: Zalecana konfiguracja komputera: (1) system operacyjny Windows 7 64-bit lub nowszy; (2) procesor: i5 lub nowszy; (3) pamięć: 4 GB lub więcej; (4) dysk twardy: 300 GB lub więcej (prędkość obrotowa powyżej 7200 rpm lub dysk SSD).

2. Przygotowania

  1. Połączyć igłę strzykawki (średnica wewnętrzna 0,41 mm i średnica zewnętrzna 0,71 mm), szybkozłącze A oraz butelkę na odczynnik (Ryc. 2C), a następnie poddać je autoklawowaniu w temperaturze 121 °C przez 15 min.
    UWAGA: Podczas sterylizacji należy lekko odkręcić zakrętkę butelki na odczynnik. Przy każdej okazji można przygotować kilka dodatkowych butelek na odczynniki do późniejszego użycia.
  2. Użyć filtra z polifluorku winylidenu (PVDF) o rozmiarze porów 0,22 µm do przefiltrowania oleju MMC. Chip mikroprzepływowy (Ryc. 2B) oraz olej MMC należy wcześniej umieścić w komorze z laminarnym przepływem powietrza i sterylizować za pomocą promieniowania ultrafioletowego przez 30 min przed użyciem.
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat szybkozłącza A, butelki na odczynnik, oleju MMC oraz chipu mikroprzepływowego znajdują się w Tabeli Materiałów.
  3. Zainstalować chip mikroprzepływowy
    1. Otworzyć drzwiczki komory operacyjnej (Ryc. 2A) i unieść sondę światłowodową.
    2. Zgrać otwory pola elektrycznego z igłami pola elektrycznego i delikatnie położyć chip na podstawce chipa. Następnie włożyć dwa słupki pozycjonujące do otworów pozycjonujących i opuścić sondę światłowodową (Ryc. 2D).
    3. Połączyć szybkozłącze A na chipie z odpowiednim portem MMC zgodnie z numeracją pozycji (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Następnie zamknąć drzwiczki komory operacyjnej.
  4. Przed użyciem uzupełnić olej MMC (do około 80 mL) w butelce z olejem i opróżnić butelkę na odpady z cieczy odpadowej.
    UWAGA: Ciecz odpadowa to zazwyczaj odpady organiczne. Podczas utylizacji należy stosować się do lokalnych przepisów i regulacji, które mogą różnić się w zależności od konfiguracji eksperymentalnej.

3. Pomiar krzywej wzrostu w MMC

  1. Przygotowanie początkowego roztworu bakterii
    1. Zgodnie z odpowiednimi standardowymi procedurami przygotować pożywkę Luria-Bertani (LB) i wysterylizować w autoklawie w temperaturze 121°C przez 15 min.
      UWAGA: Składniki pożywki LB: NaCl (10 g/L), ekstrakt z drożdży (5 g/L) i trypton (10 g/L).
    2. Wyjąć szczep E. coli MG1655 z banku glicerolowego i hodować go w kolbie z mieszadłem o pojemności 50 mL z 10 mL pożywki LB w inkubatorze z wytrząsaniem (200 rpm) w temperaturze 37 °C przez 5-8 h.
      UWAGA: Czas hodowli zależy od konkretnych szczepów. Optymalnie jest hodować szczep do okresu/fazy logarytmicznej.
    3. Rozcieńczyć hodowlę E. coli MG1655 świeżą pożywką do wartości OD600 od 0,05 do 0,1, aby uzyskać początkowy roztwór bakterii (przygotować około 10 mL).
  2. Kliknąć Initialization, aby zainicjować MMC. Po pojawieniu się interfejsu inicjalizacji ustawić temperaturę hodowli na 37 °C, a wartość sygnału fotoelektrycznego na 0,6 (Rysunek 3A). Inicjalizacja potrwa około 20 min.
  3. Włączyć lampę UV (długość fali 254 nm) podczas inicjalizacji.
  4. Wprowadzić początkowy roztwór bakterii i olej MMC do butelki z odczynnikiem.
    1. Wyjąć sterylną butelkę z odczynnikiem w komorze z laminarnym przepływem powietrza i mocno zakręcić nakrętkę.
    2. Za pomocą sterylnej strzykawki 10 mL wstrzyknąć 3-5 mL oleju MMC przez igłę strzykawki do bocznej rurki. Powoli przechylać i obracać butelkę z odczynnikiem, aby olej całkowicie pokrył ściankę wewnętrzną.
    3. Wstrzyknąć około 5 mL początkowego roztworu bakterii, a następnie ponownie wypełnić butelkę, wstrzykując 5-7 mL oleju.
    4. Wyciągnąć niezależny szybkozłączkę A i włożyć szybkozłączkę A butelki z odczynnikiem do jej szybkozłączki B, aby zakończyć operację wstrzykiwania próbki (Rysunek 4A).
  5. Odczekać do zakończenia inicjalizacji, a następnie wyłączyć lampę UV (długość fali 254 nm).
  6. Otworzyć drzwi komory operacyjnej i włożyć butelkę z odczynnikiem do kąpieli metalowej.
  7. Wyciągnąć złącze C2 chipa oraz szybkozłączkę A butelki z odczynnikiem. Połączyć złącze bocznej rurki butelki z odczynnikiem ze złączem C2, a złącze górnej rurki ze złączem O2. Następnie zamknąć drzwi komory operacyjnej.
  8. Kliknąć Growth Curve, aby wybrać funkcję pomiaru krzywej wzrostu (Rysunek 3A). W interfejsie ustawień parametrów wpisać Number jako 15, włączyć przełącznik OD detection i ustawić Wavelength na 600 nm. Kliknąć Start, aby rozpocząć generowanie kropel. Potrwa to około 10 min.
    UWAGA: W tym miejscu Number odnosi się do liczby kropel do wygenerowania. Wavelength odnosi się do długości fali detekcji OD. Ustawić Number (maksymalnie 200) i Wavelength (350-800 nm) zgodnie z wymogami eksperymentu.
  9. Gdy na głównym interfejsie pojawi się okno pop-up z komunikatem „Remove the reagent bottle between C2 and O2, then please click the OK button after completion”, otworzyć drzwi komory operacyjnej, wyjąć butelkę z odczynnikiem i połączyć złącza C2 i O2.
  10. Zamknąć drzwi i kliknąć przycisk OK w oknie pop-up, aby automatycznie hodować krople i wykrywać wartości OD.
    UWAGA: MMC wykrywa wartość OD w momencie, gdy kropla przechodzi przez sondę światłowodową. Zatem okres detekcji zależy od liczby wygenerowanych kropel.
  11. Gdy krzywa wzrostu osiągnie fazę stacjonarną, kliknąć przycisk Data Export, aby wyeksportować dane OD. Wybrać ścieżkę zapisu danych i wyeksportować wartość OD zarejestrowaną podczas okresu hodowli w formacie .csv, który można otworzyć w odpowiednim oprogramowaniu (np. Microsoft Excel). Następnie użyć oprogramowania do mapowania (np. EXCEL i Origin 9.0), aby wykreślić krzywą wzrostu.
    UWAGA: Podczas procesu hodowli można w dowolnym momencie kliknąć Data Export, aby wyeksportować dane OD dla wszystkich aktualnych kropel.

4. Ewolucja adaptacyjna w MMC

  1. Przygotowanie wstępnej zawiesiny bakteryjnej
    1. Należy postępować zgodnie z odpowiednimi standardowymi regulacjami w celu przygotowania specjalnej pożywki płynnej i płytek stałych dla MeSV2.2, a następnie poddać je autoklawowaniu w temperaturze 121 °C przez 15 min.
      UWAGA: W kwestii składników pożywki specjalnej należy odnieść się do Tabela 1 oraz Tabela materiałów.
    2. Hodować MeSV2.2 na szalce z pożywką stałą (średnica = 90 mm) w 37 °C inkubator z konstantną temperaturą przez 72 h. Następnie należy pobrać pojedynczą kolonię i hodować ją w kolbie shake-flask o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml specjalnej pożywki płynnej w inkubatorze wytrząsającym (200 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 72 h.
    3. Rozcieńczyć kulturę MeSV2.2 w medium do wartości OD600 od 0,1 do 0,2 (należy upewnić się, że całkowita objętość nie jest mniejsza niż 10 ml) i kontynuować hodowlę w kolbie z wytrząsarką przez 5 h w celu otrzymania początkowego roztworu bakterii.
      UWAGA: MeSV2.2 jest szczepem zależnym od metanolu E. coli szczep. Specjalne medium płynne zawiera 500 mmol/L metanolu, co stanowi silny stres dla MeSV2.2, skutkując bardzo wolnym wzrostem. Należy zauważyć, że sposób przygotowania początkowego roztworu bakterii w tym przypadku różni się od opisanego w kroku 3.1.
  2. Zainicjuj MMC zgodnie z opisem w krokach 3.2, 3.3 i 3.5.
  3. Wyjąć dwie wysterylizowane butelki na odczynniki, z których jedna służy do początkowego roztworu bakterii, a druga do świeżej pożywki. Wstrzyknąć do butelek początkowy roztwór bakterii (5 ml), świeżą pożywkę (12–15 ml) oraz olej MMC, zgodnie z opisem w kroku 3.4.
    UWAGA: Ponieważ ewolucja adaptacyjna jest procesem długotrwałym, obejmującym wiele kolejnych pasażowań, w MMC należy przechowywać jak największą ilość świeżej pożywki. W trakcie trwania eksperymentu uzupełnienie pożywki nie jest możliwe.
  4. Zainstaluj dwie butelki z odczynnikami w MMC zgodnie z opisem w kroku 3.6. Butelkę z początkowym roztworem bakterii zainstaluj pomiędzy złączem C2 a O2, a butelkę ze świeżą pożywką pomiędzy złączem C4 a O4.
  5. Kliknij w ALE do wyboru funkcji ewolucji adaptacyjnej (Rysunek 3B). W interfejsie ustawień parametrów włącz Pomiar OD przełącznik
  6. Ustawić Numer jako 50, Długość fali przy 600 nm, Stężenie jako 0%, Typ w miarę upływu czasu, Parametr przez 30 h, i Powtórzenia as 99. Kliknij w Start aby rozpocząć generowanie kropel. Proces ten potrwa około 25 min.
    UWAGA: W tym kontekście „stężenie” odnosi się do maksymalnego stężenia czynników chemicznych dla ewolucji adaptacyjnej. W przypadku poszczególnych kropel w MMC możliwe jest wprowadzenie różnych stężeń czynników chemicznych w celu zapewnienia zróżnicowanych warunków wzrostu. Oblicz wprowadzone stężenia, korzystając z poniższego równania:
    Wzór na ciąg arytmetyczny: \(C = a + \frac{b-a}{7} \times i\), gdzie \(i = 1, 2, ..., 7\).
    Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.C" odnosi się do stężenia czynników chemicznych wprowadzonych do kropelek;a„odnosi się do stężenia czynników chemicznych w butelkach z odczynnikami pomiędzy złączem C4 a O4;”b„ odnosi się do stężenia czynników chemicznych w butelkach z odczynnikami pomiędzy złączem C6 a O6; i „i„ odnosi się do dostępnego stężenia. W MMC dostępnych jest osiem stężeń. Ponieważ czynnik chemiczny w tym przypadku występuje w pojedynczym stężeniu (500 mmol/L metanolu) i jest on jednym ze składników medium, zainstalowano tutaj tylko jedną butelkę z odczynnikiem zawierającym czynnik chemiczny, a Stężenie ustawiono na 0%. Typ odnosi się do trybu subkultywacji, który dzieli się na trzy rodzaje: tryb czasowy, tryb wartości OD oraz tryb fluorescencyjny. Pierwszy z nich polega na hodowli kropel przez określony czas, a następnie przeprowadzeniu subkultywacji, natomiast dwa pozostałe polegzą na hodowli kropel do osiągnięcia zdefiniowanej uprzednio wartości OD lub intensywności fluorescencji, a następnie przeprowadzeniu subkultywacji. Parametr odnosi się do powiązanego parametru wymaganego podczas wyboru trybu subkultywacji. Powtórzenia odnosi się do liczby pasaży.
  7. Usuń butelkę z odczynnikiem umieszczoną pomiędzy złączem C2 a O2, zgodnie z opisem w kroku 3.8.
  8. Obserwuj, czy maksymalne wartości OD kropel w każdym okresie subkultywacji uległy znacznemu zwiększeniu. Jeśli wzrost wystąpi i będzie spełniał wymagania eksperymentalne, kliknij w Eksport danych przycisk do eksportu danych OD, zgodnie z wyjaśnieniem w kroku 3.9.
    UWAGA: W tym przypadku okres subkultywacji zależy od ParametrNa przykład podczas ustawiania Typ w miarę jak czas i Parametr jako 30 h, okres pasażowania wynosi 30 h. W każdym okresie pasażowania odnotowuje się maksymalne wartości OD kropelek. Należy ocenić, czy ewolucja adaptacyjna spełnia wymagania eksperymentalne na podstawie wzrostu maksymalnych wartości OD (wzrost zależy od rzeczywistego procesu hodowli szczepu, na przykład wzrost o ponad 20%).
    UWAGA: Należy zwrócić uwagę, czy zapasy świeżej pożywki zostały wyczerpane. Jeśli znaczący wzrost nie nastąpił nawet po wyczerpaniu pożywki, należy wyekstrahować krople o lepszym wzroście i przeprowadzić kolejną rundę ewolucji adaptacyjnej.
  9. Wyodrębnij docelowe kropelki z MMC.
    1. Kliknij w Przesiewanie przycisk do wyboru funkcji ekstrakcji kropelkowej (Rysunek 3C). Wybrać Zbierz opcja, kliknij numery kropel docelowych, a następnie kliknij Proszę przesłać tekst źródłowy do przetłumaczenia..
      UWAGA: Przesiew kropelkowy obejmuje etapy „Zbierz” (Collect), „Odrzuć” (Discard) oraz „Wyodrębnij roztwór zarodkowy” (Extract seed solution). „Wyodrębnij roztwór zarodkowy” oznacza zebranie pozostałych kropel.13 po przeprowadzeniu subkultury.
    2. Należy poczekać na pojawienie się okna wyskakującego z komunikatem: „Please pull out the CF quick connector and put it into the EP tube”. Zgodnie z instrukcją wyświetloną przez oprogramowanie, należy umieścić szybkozłączkę CF w probówce do mikrocentryfugi w celu pobrania próbki, a następnie kliknąć Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia. (Rysunek 4D).
    3. Po 1-2 min interfejs oprogramowania wyświetli nowe okno z komunikatem: „Proszę ponownie włożyć złącze i kliknąć Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. „po zakończeniu”. Następnie ponownie włożyć szybkozłącze CF i kliknąć Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. aby MMC nadal pracowało (Rysunek 4D). Gdy następna kropelka docelowa dotrze do miejsca rozpoznawania kropelek, powtórzyć kroki 4.9.2-4.9.3, aby ją pobrać.
      UWAGA: Po zebraniu wszystkich docelowych kropel MMC będzie kontynuować hodowlę pozostałych kropel. Jeśli hodowla nie jest wymagana, należy kliknąć Stop, aby bezpośrednio zakończyć operację.
    4. Pobierz kropelkę za pomocą 2.5 µL pipetą, nanieść na płytkę z agaroza o średnicy 90 mm i rozprowadzić równomiernie trójkątnym szklanym rozcieraczem o długości boku 3 cm. Następnie inkubować w 37 °C inkubator z konstantną temperaturą przez 72 h.
    5. Wybrać od 3 do 5 niezależnych kolonii i hodować je osobno w kolbach z mieszaniem o pojemności 50 ml, zawierających 10 ml świeżej pożywki, w inkubatorze z wytrząsarką (200 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 48–72 h. Zgodnie z odpowiednimi standardowymi procedurami należy przechowywać hodowlę bakterii w probówkach z glicerolem do dalszych eksperymentów.

5. Czyszczenie MMC

  1. Po zakończeniu eksperymentu kliknij Stop, aby zatrzymać wszystkie operacje. Następnie kliknij Clean, aby wyczyścić chip i probówki. Czynność ta potrwa około 15 min.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym protokole wykorzystano szczepy E. coli MG1655 oraz MeSV2.2 jako przykłady w celu zademonstrowania hodowli drobnoustrojów i adaptacyjnej ewolucji zależnej od metanolu przy użyciu zautomatyzowanej i stosunkowo wysokoprzepustowej strategii w MMC. Pomiar krzywej wzrostu służył głównie do charakterystyki hodowli drobnoustrojów. Ewolucję adaptacyjną przeprowadzono poprzez zautomatyzowane ciągłe pasażowanie z dodatkiem wysokiego stężenia metanolu jako presji selekcyjnej podczas każdego pasażowania. Osiągni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten przedstawia, w jaki sposób wykorzystać system hodowli mikrodrobnoustrojów mikrobiologicznych (MMC) do zautomatyzowanej hodowli drobnoustrojów i długoterminowej ewolucji adaptacyjnej. MMC to zminiaturyzowany, zautomatyzowany i wysokowydajny system hodowli drobnoustrojów. W porównaniu z konwencjonalnymi wysokowydajnymi metodami i instrumentami do hodowli drobnoustrojów, MMC ma wiele zalet, takich jak niskie zużycie pracy i odczynników, prosta obsługa, wykrywanie online (OD i fluorescencja), gromadzenie danych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2018YFA0901500), Narodowy Projekt Kluczowych Instrumentów i Sprzętu Naukowego Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (21627812) oraz Program Badań Naukowych Inicjatywy Uniwersytetu Tsinghua (20161080108). Dziękujemy również prof. Julii A. Vorholt (Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, ETH Zurich, Zurych 8093, Szwajcaria) za dostarczenie niezbędnego dla metanolu szczepu E. coli w wersji 2.2 (MeSV2.2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &m; m Membrana filtracyjna PVDFMerck Millipore Ltd.SLGPR33RBWysterylizuj olej MMC
4 i stopnie; C lodówkaHaierBCD-289BSWDo przechowywania odczynników
AgarBecton, Dickinson and Company214010Do przygotowania płytek stałych
CaCl2· 2H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20011160Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
Czysta ławkaBeijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.DL-CJ-INDIIDo pracy aseptycznej i sterylizacji UV
CoCl2· 6H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10007216Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
KomputerLenovoE450Instalacja oprogramowania i sterowanie MMC
Inkubator o stałej temperaturzeShanghai qixin scientific instrument co., LTDLRH 250Do hodowli mikrobiologicznej przy użyciu stałego podłoża
CuSO4· 5H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10008218Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
Waga elektronicznaOHAUSAR 3130Do ważenia odczynnika
EP probówkaThermo Fisher1,5 mlDo zbierania kropelek
FeCl3· 6H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10011928Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
Rurka zamrażającaThermo Fisher2,0 mldo konserwacji szczepu
GlukonianSigma-AldrichS2054Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
GlicerolGENERAL-REAGENTG66258ADo konserwacji szczepu
Wysokociśnieniowy garnek do sterylizacji parowejSANYO ElectricMLS3020Do sterylizacji w autoklawie
izopropylo-β-d-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Biotopowany420322Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
Siarczan kanamycynySolarbioK8020Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
KH2PO4MACKLINP815661Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
MetanolMACKLINM813895Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
MgSO4· 7H2OBIOBYING1305715Składnik specjalnej pożywki dla MeSV2.2.
System hodowli mikrokropelek drobnoustrojów (MMC)Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.  MMC-IWyznaczanie krzywej wzrostu i ewolucji adaptacyjnej. Proszę zapoznać się z
http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 Chip mikroprzepływowyLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-ALE-ODDo różnych operacji kropelkowych. Proszę zapoznać się z
http://www.tmaxtree.com/en/ MMC oilLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-M/S-ODFaza olejowa dla mikrofluidyki kropelkowej. Proszę zapoznać się z http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20026118Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
NaClODCZYNNIK OGÓLNYG81793JSkładnik podłoża LB
Na2HPO4· 12H2OODCZYNNIK OGÓLNYG10267B Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
NH4ClOdczynnik chemiczny Sinopharm Beijing Co., Ltd.10001518Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
szalka PetriegoCorning Incorporated90 mmDo przygotowania podłoża stałego
Pipetaeppendorf2.5 μ L, 10 i mu; L, 100μ L, 1000μ LDo obsługi cieczy
Szybkozłącze ALuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.—Do połączenia każdego złącza. Proszę zapoznać się z
http://www.tmaxtree.com/en/ Butelka z odczynnikiemLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-PCBPobieranie próbek i przechowywanie roztworu bakteryjnego i odczynników. Proszę zapoznać się z http://www.tmaxtree.com/en/
Shake kolbaUnion-Biotech50 mldo hodowli mikroorganizmów
Inkubator wstrząsającyShanghai Sukun Industrial Co., Ltd.SKY-210 2BDo hodowli mikrobiologicznej w kolbie wstrząsowej
Siarczan streptomycynySolarbioS8290Składnik specjalnej pożywki dla MeSV2.2.
StrzykawkaJIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD10 mlPobrać płyn i wstrzyknąć go do butelki z odczynnikiem
Igła do strzykawkiOUBEL Hardware Store22GŚrednica wewnętrzna wynosi 0,41 mm, a średnica zewnętrzna 0,71 mm.
TryptonOxoid Sp. z o.o.LP0042Element
średniej chłodziarki niskotemperaturowejLB SANYO Ultra-lowMDF-U4086SDo konserwacji szczepów (-80 ° C)
UV– Spektrofotometr VisGeneral Electric CompanyUltrospec 3100 proDo pomiaru wartości OD
Witamina B1SolarbioSV8080Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
Ekstrakt drożdżowyOxoid Ltd.LP0021Składnik medium LB
ZnSO4· 7H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10024018Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.

Bibliografia

  1. Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
  2. Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
  3. Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  4. Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381(2019).
  5. Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
  6. Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
  7. Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
  8. Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
  9. Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
  10. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  11. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
  12. Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
  13. Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  14. Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570(2020).
  15. Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508(2018).
  16. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. The introduction of MMC. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. , Available from: http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 (2021).
  17. Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
  18. Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
  19. Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
  20. Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
  21. Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
  22. Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998(2020).
  23. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  24. Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
  25. Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Adaptacyjna ewolucja laboratoryjnamikroprzepływy kropelkowepomiar krzywej wzrostuhodowla Escherichia coliwysokoprzepustowy screeningmonitorowanie onlinepasażowanieekstrakcja kropelek
Zautomatyzowana hodowla mikroorganizmów i ewolucja adaptacyjna z wykorzystaniem systemu hodowli mikrokropelek drobnoustrojów (MMC)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.