Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rekombinowana produkcja endoglikozydaz bifidobakteryjnych do uwalniania N-glikanów

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62804

⸱

20 lipca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Çanakkale Onsekiz Mart University, 2Uluova Dairy Farm, 3Department of Nutrition, University of Nevada, 4Department of Food Science and Technology, University of Nebraska, 5Evolve BioSystems Inc., 6Department of Biomedical Engineering, Karabuk University, 7Department of Chemistry, Hacettepe University

W tym artykule

Podsumowanie

Bifidobacteria posiadają unikalną zdolność genomiczną do rozszczepienia N-glikanów. Rekombinowana produkcja tych enzymów byłaby obiecującym nowym narzędziem do uwalniania bioaktywnych N-glikanów z substratów bogatych w glikoproteiny, takich jak siara.

Streszczenie

Glikozylacja białek to różnorodna i powszechna modyfikacja potranslacyjna, która jest związana z wieloma ważnymi rolami, takimi jak funkcja białka, w tym fałdowanie białek, stabilność, ochrona enzymatyczna i rozpoznawanie biologiczne. N-glikany przyłączone do glikoprotein (takich jak laktoferyna, laktadheryna i immunoglobuliny) nie mogą być trawione przez gospodarza i docierają do jelita grubego, gdzie są spożywane przez niektóre pożyteczne drobnoustroje. Dlatego są uważane za związki prebiotyczne nowej generacji, które mogą selektywnie stymulować pożyteczne mikroorganizmy mikrobiomu jelitowego. Jednak wyizolowanie tych nowych klas prebiotyków wymaga nowych enzymów. W tym miejscu opisujemy rekombinowaną produkcję nowych glikozydaz z różnych szczepów Bifidobacteria (wyizolowanych od niemowląt, królików, kurczaków i trzmieli) w celu poprawy izolacji N-glikanów z glikoprotein. Metoda przedstawiona w tym badaniu obejmuje następujące etapy: klonowanie molekularne genów Bifidobacterial za pomocą strategii klonowania rekombinacyjnego in vivo, kontrola sukcesu transformacji, indukcja białek i oczyszczanie białek.

Wprowadzenie

Glikozylacja jest bardzo istotną modyfikacją potranslacyjną obserwowaną w białkach. Około 50% białek znajduje się w ich glikozylowanych formach u eukariontów. N- i O-glikozylacja to dwa główne typy glikozylacji1,2. Glikany sprzężone z O (O-glikany) są kowalencyjnie przyłączone do białek za pośrednictwem N-acetylogalalaktozaminy do grupy hydroksylowej reszt aminokwasowych seryny (Ser) lub treoniny (Thr). Glikany sprzężone z N (N-glikany) są złożonymi oligosacharydami, które są kowalencyjnie przyłączone do reszty aminokwasowej asparaginy (Asn) białek poprzez N-acetyloglukozaminę (GlcNAc) w określonej sekwencji aminokwasów JakoN-X-Ser / Thr i rzadziej występującej, JakoN-X-Cys (cysteina) (gdzie X może być dowolnym aminokwasem z wyjątkiem proliny)3,4. Podstawowy rdzeń N-glikanu składa się z dwóch reszt HexNAc i trzech reszt mannozy. Dalsze wydłużanie tego wspólnego rdzenia z innymi monosacharydami za pomocą glikozylotransferazy i enzymów glikozydazy określa rodzaj N-glikanów w oparciu o stopień rozgałęzienia i rodzaj wiązania5. N-glikany są ogólnie pogrupowane w trzy główne klasy: wysoka mannoza (HM), typ złożony (CT) i hybryda (HY)6.

N-glikany są niestrawnymi związkami dla organizmów gospodarza z powodu braku enzymów hydrolazy glikozydowej. Związki te docierają do jelita cienkiego/grubego w postaci niestrawionej, gdzie wykorzystują je tysiące różnych gatunków bakterii i mogą działać jako prebiotyki, promując wyspecjalizowane drobnoustroje jelitowe, zwłaszcza gatunki Bifidobacterium7. Ostatnie odkrycia wykazały, że N-glikany selektywnie stymulują wzrost niektórych gatunków bakterii8,9. N-glikany uwalniane z glikoprotein mleka bydlęcego selektywnie stymulowały wzrost Bifidobacterium longum subspecies infantis (B. infantis), który jest kluczowym gatunkiem Bifidobacterial w jelitach niemowlęcia, ale inne gatunki bifidobakterii, takie jak Bifidobacterium animalis (B. animalis) nie wykorzystywały tych związków9. Ponadto niedawne badanie in vivo wykazało, że 19 unikalnych N-glikanów z laktoferyny mlecznej i immunoglobulin selektywnie stymuluje wzrost B. infantis8. W szczególności B. infantis posiada genomiczną zdolność do rozszczepiania glikanów i metabolizmu. Endo-β-N-acetyloglukozaminidaza (EndoBI-1), która należy do rodziny hydrolaz glikozylu 18, rekombinowana wytwarzana z B. infantis ATCC 15697 wykazała wysoką aktywność na glikoproteinach mleka w warunkach in vitro9,10. Ten nowy enzym hydrolazy glikozydowej może rozszczepiać części N-N′-diacetylochitomitobiozy znajdujące się w N-glikanach 10,11. Na aktywność EndoBI-1 nie ma wpływu fukozylacja rdzenia i różne warunki reakcji, takie jak wysoka temperatura, pH, czas reakcji itp3,11,12. Ta unikalna cecha hydrolaz glikozydów Bifidobacterial stanowi obiecujące narzędzie do produkcji N-glikanów z substratów bogatych w glikoproteiny, takich jak siara bydlęca13,14.

Kilka chemicznie i enzymatycznie opracowanych metod deglikozylacji zostało szeroko stosowanych do uzyskania N-glikanów i O-glikanów z glikoprotein2,15. Metody chemiczne są szeroko stosowane w glikobiologii do deglikozylacji glikoprotein ze względu na ich łatwość użycia, niski koszt i wysoką specyficzność substratową16. Najczęstszymi metodami deglikozylacji chemicznej są eliminacja β i hydrazynacja17. Wśród tych metod eliminacja β opiera się na zasadzie rozszczepienia glikanów z glikoprotein poprzez wystawienie glikoprotein na warunki alkaliczne. Uwolnione glikany mogą ulec degradacji podczas procesu w wyniku reakcji eliminacji β, ale temu problemowi można zapobiec, stosując środki redukujące, takie jak borowodorek sodu (NaBH4)18,19,20. Istnieją różne ograniczenia w metodzie eliminacji β. Środki redukujące przekształcają glikany w aldytole, zapobiegają wiązaniu przez nie fluoroforu lub chromoforu. W związku z tym monitorowanie uwalniania glikanów staje się trudne19,20. Ze względu na wysoką zawartość soli w etapie czyszczenia metody, elucja może spowodować straty próbki20. Inną metodą uwalniania glikanu z glikoprotein jest metoda hydrazynowa oparta na zasadzie reakcji hydrolizy po dodaniu bezwodnej hydrazyny do glikoproteiny. Ponieważ pozwala na kontrolowanie izolacji glikanów poprzez zmianę warunków reakcji, takich jak temperatura, metoda hydrazynacji jest szeroko stosowana w glikobiologii21. Deglikozylację chemiczną można również przeprowadzić przy użyciu bezwodnego preparatu fluorowodoru i kwasu trifluorooctowego, oprócz innych metod deglikozylacji chemicznej16,22,23. Enzymatyczne uwalnianie N-glikanów z glikoprotein jest powszechnie wykonywane przez peptydylo-N-glikozydazy (PNGazy), które na ogół uwalniają N-glikany, niezależnie od ich wielkości i ładunku24,25,26,27. Podobnie jak w przypadku chemicznych metod deglikozylacji, proces deglikozylacji enzymatycznej wiąże się z różnymi wyzwaniami. PNGazy wykazują aktywność w obecności kilku użytych detergentów, które zwiększają dostępność enzymu do glikanów. Jednak te surowe zabiegi mogą zakłócić działanie natywnych glikanów i pozostałych struktur polipeptydowych28. PNGazy nie mogą rozszczepiać glikanów, gdy występuje fukoza połączona z N-acetyloglukozaminą29. Różne endoglikozydazy, takie jak F1, F2 i F3, wykazują większą aktywność na białkach natywnych niż PNGazy. Te endoglikozydazy mają niską aktywność na glikanach wieloantenowych, podczas gdy odporny na ciepło nowy EndoBI-1 jest skuteczny we wszystkich typach N-glikanów10,11,28. Jeśli chodzi o ograniczenia obecnych metod, oczywiste jest, że nowe enzymy są nadal potrzebne do skutecznego uwalniania glikanów bez żadnych ograniczeń. W tym celu gatunki Bifidobacteria, które mają dużą wyspę genomową kodującą różne enzymy hydrolazy glikozydowej, umożliwiają rozszczepianie N-glikanów z glikoprotein30,31. W tym kontekście, ogólnym celem tego badania jest odkrycie nowych glikozydaz z różnych gatunków Bifidobacteria. Aby rekombinacyjnie wytworzyć te enzymy, różne znaczniki fuzyjne mają na celu zwiększenie ich produkcji, a także aktywności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Klonowanie molekularne genów Bifidobacterial

  1. Amplifikacja PCR docelowych genów za pomocą trzech zestawów starterów wektorowych (N-His, C-His i N-His SUMO)
    1. Przygotować 100 μM roztwory podstawowych (oligomerów) poprzez dodanie sterylnej wody w ilościach określonych przez firmę. Przygotuj 10 μM nowych stad z tych stad do wykorzystania w amplifikacji PCR docelowych genów.
    2. Przygotować mieszaninę PCR (całkowita objętość 50 μl) z 25 μl mieszanki wzorcowej, 1 μl startera do przodu i do tyłu w 0,2 μM, 21 μl wody destylowanej wolnej od DNazy/RNaz i 2 μl matrycy DNA (komórki bakteryjne) w probówkach do PCR. Delikatnie wymieszać mieszaninę, pipetując w górę i w dół.
      UWAGA: Mieszanka główna (Lucigen) używana do PCR zawiera polimerazę DNA Taq o wysokiej czystości i wysokiej aktywności i może pracować w wyższych temperaturach w celu niezawodnej amplifikacji matryc do 5 kb.
    3. Ustawić program PCR w następujący sposób: początkowy etap denaturacji w temperaturze 95 °C przez 5 minut w celu uwolnienia genomowego DNA, następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 30 s, wyżarzanie w temperaturze 60 °C przez 30 s i wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 minutę, a końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 minut.
    4. Sprawdź produkty PCR metodą elektroforezy w żelu agarozowym za pomocą systemu dokumentacji żelu po uruchomieniu pod napięciem 100 V przez 60 minut na 1% żelu agarozowym. Wymieszaj produkty PCR i drabinkę DNA z barwnikiem ładującym, mieszając w stosunku 1:5 (5 μl produktu PCR + 1 μl barwnika ładującego i 5 μl 1 kb drabinki DNA + 1 μl barwnika ładującego), aby nałożyć na żel (Rysunek 1).
    5. Zmierzyć stężenia DNA w produktach PCR za pomocą fluorometru przed etapem klonowania molekularnego.
      UWAGA: Stężenia produktów PCR powinny mieścić się w zakresie wymaganym do klonowania molekularnego (25-100 ng/μL).
  2. Przygotowanie pożywki agarowej Lysogeny Bulth (LB) do klonowania molekularnego
    1. Rozpuścić 12,5 g LB i 6 g agarozy w 500 mldH2O i autoklawować podłoże agarowe LB (sterylizacja w temperaturze 121 °C przez 20 min).
    2. Rozpuścić 15 mg kanamycyny w 1 mldH2O i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    3. Po sterylizacji w autoklawie dodać 1 ml kanamycyny do butelki zawierającej sterylne 500 ml pożywki agarowej LB. Końcowe stężenie kanamycyny wynosi 30 μg/ml. Wlej 25 ml pożywki z kanamycyną agarową LB do każdej płytki w szafie laboratoryjnej.
  3. Transformacja szokowa w chemicznie kompetentnych komórkach E. coli
    1. Dodać do probówki 1-3 μl (25 do 100 ng) produktów PCR dla każdego szczepu, w tym 40 μl chemicznie kompetentnych komórek E. coli. Następnie dodaj 2 μl wektora DNA do tej samej probówki. Delikatnie wymieszać końcówką pipety i przenieść mieszaniny do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Wykonaj ten krok na lodzie. Nie pipetować w górę i w dół w celu wymieszania, aby uniknąć pęcherzyków powietrza i przypadkowego rozgrzania komórek.
    2. Probówki zawierające właściwe komórki i DNA inkubować na lodzie przez 30 minut. Zastosować szok termiczny do mieszaniny w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 45 s. Natychmiast umieścić te probówki na lodzie i inkubować przez 2 minuty.
    3. Dodać 960 μl pożywki regeneracyjnej, używanej do szybkiego odzyskiwania komórek po klonowaniu molekularnym, do komórek w probówkach i inkubować probówki z prędkością 250 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem.
    4. Płytka 100 μl przekształconych komórek na płytkach agarowych LB zawierających 30 μg/ml kanamycyny. Używaj tylko chemicznie kompetentnych komórek E. coli jako kontroli negatywnej.
      UWAGA: Przed użyciem umieścić płytki agarowe LB zawierające 30 μg/ml kanamycyny przygotowanej w kroku 1.2.2 do inkubatora w temperaturze 37 °C.
    5. Inkubować wszystkie płytki przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze otoczenia (Rysunek 2).
  4. Przygotowanie pożywki LB do PCR kolonii
    1. Rozpuścić 7,5 g LB w 300 mldH2Ow butelce i autoklawować pożywkę LB (sterylizacja w temperaturze 121 °C przez 20 min).
    2. Rozpuścić 9 mg kanamycyny (30 μg/ml) w 1 mldH2Oi umieścić w temperaturze -20 °C. Po sterylizacji w autoklawie dodać 1 ml kanamycyny do butelki zawierającej sterylne 300 ml pożywki LB. Przechowywać płynną pożywkę hodowlaną w temperaturze +4 °C do momentu jej użycia.
  5. Badania przesiewowe transformantów metodą colony PCR
    1. Aby potwierdzić, że wszystkie transformanty przenoszą rekombinowane geny, wybierz losowo kolonie i amplifikuj geny docelowe metodą PCR przy użyciu starterów sekwencjonowania dostarczonych z zestawem do klonowania.
    2. Wykonaj wszystkie czynności na lodzie i wstępnie schłodź wszystkie probówki PCR i probówki 15 ml przed użyciem.
    3. Za pomocą końcówki pipety przenieś połowę wybranej kolonii do probówki PCR dla każdej próbki. Weź drugą połowę kolonii za pomocą końcówki pipety i umieść ją w 15 ml probówce zawierającej 5 ml płynnego podłoża LB+kanamycyna (przygotowanego w kroku 1.4). Wirować probówki o pojemności 15 ml i inkubować płynne kultury z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem.
    4. Umieścić 50 μl mieszaniny reakcyjnej PCR (25 μl mieszanki wzorcowej, 1 μl startera doprowadzającego, 1 μl startera odwrotnego, 23 μl wody destylowanej wolnej od DNazy/RNaz) do wszystkich probówek PCR i rozproszyć komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół.
    5. Ustaw program PCR na 95 °C na 5 minut w celu uwolnienia genomowego DNA w wyniku lizy komórek bakteryjnych, łącznie 40 cykli po 95 °C przez 30 s w przypadku początkowej denaturacji, 60 °C w przypadku 30 s w przypadku wyżarzania, 72 °C w celu 1 minuty w przypadku wydłużenia i 72 °C w celu 10 minut w celu ostatecznego przedłużenia.
    6. Sprawdź produkty PCR metodą elektroforezy żelowej po uruchomieniu pod napięciem 100 V przez 60 minut na 1% żelu agarozowym (Rysunek 3). Szczegóły elektroforezy żelowej DNA opisano w kroku 1.1.3.
    7. Przygotuj 15% zapasy glicerolu udanych transformantów. Umieść 500 μl 60% glicerolu w kriotubach i dodaj 1,500 μl płynnej kultury udanych transformatorów. Przygotowane zapasy przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Indukcja ekspresji białek przez L-ramnozę

  1. Przygotować hodowlę wstępną z 1 litrem płynnego podłoża LB zawierającego 30 μg/ml kanamycyny.
  2. Umieścić 8 ml pożywki LB w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml. Użyj jednej z probówek jako kontroli ujemnej zawierającej tylko ciekłe medium. W przypadku 20% L-ramnozy w bulionie rozpuścić 0,5 g L-ramnozy w 2,5 ml dH2O i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  3. Umieścić 10 μl wywaru bakteryjnego w probówkach wirówkowych zawierających 8 ml płynnej pożywki. Delikatnie je wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem.
  4. Wlać 250 ml płynnego podłoża LB do wysterylizowanej kolby Erlenmeyera o pojemności 2 l.
  5. Zaszczepić 2,5 ml płynnej kultury przez noc w 2-litrowej kolbie zawierającej płynne podłoże LB w stosunku 1:100 między kolbą a pożywką i inkubować w temperaturze 37 °C i 150 obr./min przez 4 godziny w inkubatorze z wytrząsaniem.
  6. Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) dla komórek bakteryjnych za pomocą spektrofotometru. Gdy komórki osiągną gęstość optyczną 0,5-0,6, dodać 2,5 ml 20% ramnozy (końcowe stężenie wynosi 0,2%) do 250 ml kultury LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc przy 250 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem.
  7. Przenieść płynną kulturę do probówek o pojemności 5 x 50 ml, odwirować próbki o masie 3724 x g przez 15 minut w temperaturze +4 °C i odrzucić supernatant. Przechowywać granulki w temperaturze -20 °C do etapu oczyszczania.
    UWAGA: Aby ocenić ekspresję białka za pomocą SDS-PAGE, należy pobrać 1 ml nieindukowanej (w przypadku hodowli o gęstości optycznej 600 nm 0,5-0,6, bez L-ramnozy) kultury jako kontroli i 1 ml indukowanej hodowli (po całonocnej inkubacji) jako próbki indukowanej. Mikrowirować wszystkie próbki o masie 12 000 x g przez 1 minutę i ponownie zawiesić próbki nieindukowane i indukowane odpowiednio 50 μl i 100 μl buforu ładującego SDS-PAGE.

3. Liza komórek chemicznie kompetentnych komórek E. coli zawierających enzymy znakowane Hisem

  1. Przygotować bufor do lizy o pH 8,0 (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM imidazol, 1% SDS), bufor równowagowy o pH 7,4 (20 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol), bufor płuczący o pH 7,4 (20 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 25 mM imidazol) i bufor elucyjny o pH 7,4 (20 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol).
  2. Umieścić probówki o pojemności 50 ml zawierające granulki komórek w temperaturze -80 °C na 15 minut do zamrożenia. Następnie usuń granulki z -80 °C i rozmroź w temperaturze pokojowej.
  3. Dodać 5 ml dH2O do granulek i rozpuścić przez pipetowanie w górę iw dół. Wirować przy 3724 x g przez 15 minut w temperaturze +4 °C i odrzucić supernatant.
  4. W przypadku granulek hodowlanych o pojemności 50 ml dodaj 6 300 μl buforu do lizy i 63 μl koktajlu inhibitorów proteazy halt bez EDTA (w stosunku 1:100) do granulek i rozpuść przez pipetowanie w górę iw dół. Inkubuj je na lodzie przez 30 min, wiruj co 10 min.
  5. Ustaw tryb impulsowy sonikatora na 10 s ON i 59 s OFF, a amplitudę na 37%. Umieścić probówkę w zlewce zawierającej lód i zanurzyć sondę sonikatora w probówce.
    UWAGA: Sonda powinna być całkowicie zanurzona, nie dotykając żadnej strony rurki.
  6. Po procesie sonikacji (6 impulsów przez 10 s z 1 minutowym chłodzeniem), należy odwirować próbki przy 3,724 x g przez 45 minut w temperaturze +4 °C. Następnie zebrać wszystkie części sklarowane nad osadem do probówki i odwirować przy ciśnieniu 3,724 x g przez 5 minut w temperaturze +4 °C.
  7. Zebrać supernatant do probówki i pobrać 100 μl próbki do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) w kroku 4.7. Zmierzyć stężenie białka w próbkach za pomocą fluorometru.

4. Oczyszczanie enzymów oznaczonych przez Hisa metodą wsadową

  1. Dodaj 1 ml żywicy Ni-NTA do probówki wirówkowej i wiruj przez 2 minuty przy 700 x g. Ostrożnie wyjąć probówkę i wyrzucić powstały supernatant.
  2. Dodać 2 ml (dwukrotność objętości żywicy) buforu równoważącego do probówki i dobrze wymieszać, aż żywica zostanie całkowicie zawieszona. Odwirować probówkę przez 2 minuty przy 700 x g, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić bufor.
  3. Wymieszać ekstrakt białkowy i bufor równoważący w stosunku 1:1 w probówce wirówkowej. Dodaj mieszaninę do probówki z żywicą i umieść ją na wytrząsarce z prędkością 150 obr./min na 30 min. Odwirować probówkę przez 2 minuty przy sile 700 x g i odrzucić supernatant.
  4. Przemyć żywicę 5 ml buforu do przemywania i odwirować probówkę przez 2 minuty przy 700 x g. Powtarzać etap płukania, aż stężenie supernatantu spadnie do wartości podstawowej.
  5. Dodaj 1 ml buforu elucyjnego do probówki, aby wymyć związane białka znakowane His. Odwirowywać probówkę przez 2 minuty przy 700 x g. Zachowaj supernatant i weź 100 μl do analizy SDS-PAGE w kroku 4.7. Powtórz etap elucji trzy razy. Zmierzyć stężenia każdego supernatantu za pomocą fluorometru.
  6. Zebrać wszystkie supernatanty w probówce odcinającej o sile 10 kDa i odwirować ją przez 2 minuty przy 700 x g. Powtarzać wirowanie, aż objętość supernatantu zmniejszy się do 200 μl, od czasu do czasu pipetując w górę i w dół. Oczyszczone białka należy przechowywać w temperaturze -20 °C i pobrać 100 μl do analizy SDS-PAGE w kroku 4.7.
    UWAGA: Należy zmierzyć stężenie białka i, jeśli stężenie jest niskie, odwirować, aż wzrośnie.
  7. Analiza oczyszczonych białek metodą SDS-PAGE
    1. Przygotuj 4% żel do układania w stos (40% akrylamid/bisakrylamid, 1 M Tris pH 6,8, 10% SDS, 10% nadsiarczan amonu, TEMED, dH2O) i 12% żel rozdzielczy (40% akrylamid/bisakrylamid, 1 M Tris pH 8,8, 10% SDS, 10% nadsiarczan amonu, TEMED, dH2O).
    2. Wymieszać próbkę z 2 do próbek Laemmli w stosunku 1:1 i inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut w celu denaturacji białek.
      UWAGA: Stężenie białka w próbkach należy zmierzyć przed załadowaniem, a załadowana objętość będzie oparta na ich stężeniu przy równym obciążeniu.
    3. Dodaj 1x bufor do pracy do zbiornika i załaduj próbki i drabinkę białkową do studzienek. Uruchom białka najpierw przy napięciu 80 V i zwiększ prąd do 120 V, gdy białka przemieszczą się z żelu układającego się w stos do żelu rozdzielczego.
    4. Umieść żel w barwniku barwiącym coomassie blue i umieść go w shakerze na 30 minut. Umyj żel roztworem odbarwiającym (250 ml dH2O + 50 ml kwasu octowego (HOAc) + 200 ml metanolu) i wykonaj zdjęcie (Rysunek 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym badaniu poddano analizie enzymy należące do glikozylohydrolaz pochodzące z różnych źródeł. Przyjęto założenie, że jednoczesne zastosowanie różnych enzymów o odmiennych strukturach może zapewnić lepsze uwalnianie glikanów, ponieważ ewoluowały one w celu wykazania aktywności wobec różnych glikoprotein. Lista genów docelowych oraz ich pochodzenie zostały przedstawione w Tabeli 1. Szczepy bakteryjne pozyskano z Belgium Co-ordinated Collections of Micro-organisms. Zestawy starterów zaprojektowano...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Strategia klonowania rekombinacyjnego in vivo stosowana do klonowania molekularnego genów docelowych zapewnia szybkie i wiarygodne wyniki w porównaniu z innymi tradycyjnymi protokołami klonowania. Mimo że istnieje wiele wygodnych metod klonowania molekularnego, metoda opisana w tym artykule ma więcej zalet. System klonowania in vivo , w przeciwieństwie do innych systemów klonowania, nie wymaga żadnej obróbki enzymatycznej ani oczyszczania produktów PCR. Nie ma również ograniczeń związanych ze złączami s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie jest wspierane przez TUBITAK #118z146 i Uluova Süt Ticaret A.Ş (Uluova Milk Trading Co.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
EconoTaq PLUS 2X Master MixLucigen30035-1Amplifikacja genów docelowych (PCR)
Woda destylowana bez DNaz/RNazInvitrogen10977035Amplifikacja genów docelowych (PCR)
Safe-Red Loading DyeabmG108-RElektroforeza żelowa DNA
1 kb Plus DNA LadderGoldBioD011-500elektroforeza żelowa DNA
Zestaw do oznaczania białek kubitowychInvitrogenQ33211Pomiar stężenia DNA
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)amrescoJ106-2KGPożywka do hodowli bakteryjnych
AgarozaInvitrogen16500-500Pożywka do hodowli bakteryjnych i wsp.
Monosiarczan kanamycynyGoldBioK-120-5Antybiotyk w pożywkach do hodowli bakteryjnych
Zestaw systemu klonowania i ekspresji Expresso Rhamnose, zestaw do klonowania N-HisLucigen49011-1Zestaw
do klonowania i wyrażania ramnozy Expresso, SUMOLucigen49013-1Zestaw do klonowania
wyrażania Expresso Rhamnose Zestaw systemu klonowania i ekspresji, C-HisLucigen49012-1Zestaw do klonowania
Roztwór gliceroluSigma-Aldrich15524-1L-RPrzygotowanie glicerolu
monohydrat L-RamnozySigma-Aldrich83650Indukcja ekspresji białka
2X Laemmli Sample BufferClearBandTGS10SDS-Page analysis
SureCast 40% (w/v) AcrylamidInvitrogenHC2040SDS-Page analysis
SureCast APSInvitrogenHC2005SDS-Page analysis
SureCast TEMEDInvitrogenHC2006SDS-Page analysis
10X Running BufferClearBandTGS10SDS-Page analysis
Triset al.BioShopTRS001.1Analiza stron SDS i liza komórek
10% SDSClearBandS100Analiza strony SDS
PageRuler Plus Prestained Protein LadderThermoFisher26619Analiza stron SDS
ImidazolSigma-Aldrich56750Liza komórek
NaClSigma-Aldrich31434-5Kg-RLiza komórek
Sód Fosforan Jednozasadowy bezwodnyamresco0571-1KgBufor fosforanowy sodu do lizy komórek
Fosforan sodu dwuwodny i wsp.Sigma-Aldrich04272-1KgBufor fosforanu sodu do lizy komórek
Filtr odśrodkowy 10 kDa-odcinającyAmicon® - MERCKUFC9010Oczyszczanie enzymów
i

Bibliografia

  1. Adlerova, L., Bartoskova, A., Faldyna, M. Lactoferrin: a review. Veterinarni Medicina. 53 (9), 457-468 (2008).
  2. Karav, S., German, J. B., Rouquié, C., Le Parc, A., Barile, D. Studying lactoferrin N-glycosylation. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 870(2017).
  3. Le Parc, A., et al. A novel endo-β-N-acetylglucosaminidase releases specific N-glycans depending on different reaction conditions. Biotechnology Progress. 31 (5), 1323-1330 (2015).
  4. Lafite, P., Daniellou, R. Rare and unusual glycosylation of peptides and proteins. Natural Product Reports. 29 (7), 729(2012).
  5. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  6. Varki, A., et al. Structures common to different glycans. Essentials of Glyobiology. , (2009).
  7. Koropatkin, N. M., Cameron, E. A., Martens, E. C. How glycan metabolism shapes the human gut microbiota. Nature Reviews Microbiology. 10 (5), 323(2012).
  8. Karav, S., et al. N-glycans from human milk glycoproteins are selectively released by an infant gut symbiont in vivo. Journal of Functional Foods. 61, 103485(2019).
  9. Karav, S., et al. Oligosaccharides released from milk glycoproteins are selective growth substrates for infant-associated bifidobacteria. Applied and Environmental Microbiology. 82 (12), 3622-3630 (2016).
  10. Garrido, D., et al. Endo-β-N-acetylglucosaminidases from infant gut-associated bifidobacteria release complex N-glycans from human milk glycoproteins. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 775-785 (2012).
  11. Karav, S., et al. Kinetic characterization of a novel endo-beta-N-acetylglucosaminidase on concentrated bovine colostrum whey to release bioactive glycans. Enzyme and Microbial Technology. 77, 46-53 (2015).
  12. Karav, S., et al. Characterizing the release of bioactive N- glycans from dairy products by a novel endo-β-N-acetylglucosaminidase. Biotechnology Progress. 31 (5), 1331-1339 (2015).
  13. Sahutoglu, A. S., Duman, H., Frese, S. A., Karav, S. Structural insights of two novel N-acetyl-glucosaminidase enzymes through in silico methods. Turkish Journal Of Chemistry. 44 (6), 1703-1712 (2020).
  14. Duman, H., et al. Potential applications of Endo-β-N-Acetylglucosaminidases from Bifidobacterium longum subspecies infantis in designing value-added, next generation infant formulas. Frontiers in Nutrition. 8, 646275(2021).
  15. Karav, S. Application of a novel Endo-β-N-Acetylglucosaminidase to isolate an entirely new class of bioactive compounds: N-Glycans. Enzymes in Food Biotechnology. , 389-404 (2019).
  16. Sojar, H. T., Bahl, O. P. A chemical method for the deglycosylation of proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics. 259 (1), 52-57 (1987).
  17. Dwek, R. A., Edge, C. J., Harvey, D. J., Wormald, M. R., Parekh, R. B. Analysis of glycoprotein-associated oligosaccharides. Annual Review of Biochemistry. 62 (1), 65-100 (1993).
  18. Carlson, D. M. Structures and immunochemical properties of oligosaccharides isolated from pig submaxillary mucins. Journal of Biological Chemistry. 243 (3), 616-626 (1968).
  19. Roth, Z., Yehezkel, G., Khalaila, I. Identification and quantification of protein glycosylation. International Journal of Carbohydrate Chemistry. 2012, 1-10 (2012).
  20. Turyan, I., Hronowski, X., Sosic, Z., Lyubarskaya, Y. Comparison of two approaches for quantitative O-linked glycan analysis used in characterization of recombinant proteins. Analytical Biochemistry. 446, 28-36 (2014).
  21. Patel, T., et al. Use of hydrazine to release in intact and unreduced form both N-and O-linked oligosaccharides from glycoproteins. Biochemistry. 32 (2), 679-693 (1993).
  22. Edge, A. S. B., Faltynek, C. R., Hof, L., Reichert, L. E., Weber, P. Deglycosylation of glycoproteins by trifluoromethanesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 118 (1), 131-137 (1981).
  23. Fryksdale, B. G., Jedrzejewski, P. T., Wong, D. L., Gaertner, A. L., Miller, B. S. Impact of deglycosylation methods on two-dimensional gel electrophoresis and matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry for proteomic analysis. Electrophoresis. 23 (14), 2184-2193 (2002).
  24. Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity. Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).
  25. Morelle, W., Faid, V., Chirat, F., Michalski, J. C. Analysis of N- and O-linked glycans from glycoproteins using MALDI-TOF mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 534, 5-21 (2009).
  26. O'Neill, R. A. Enzymatic release of oligosaccharides from glycoproteins for chromatographic and electrophoretic analysis. Journal of Chromatography. A. 720 (1-2), 201-215 (1996).
  27. Szabo, Z., Guttman, A., Karger, B. L. Rapid release of N-linked glycans from glycoproteins by pressure-cycling technology. Analytical Chemistry. 82 (6), 2588-2593 (2010).
  28. Trimble, R. B., Tarentino, A. L. Identification of distinct endoglycosidase (endo) activities in Flavobacterium meningosepticum: endo F1, endo F2, and endo F3. Endo F1 and endo H hydrolyze only high mannose and hybrid glycans. The Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1646(1991).
  29. Tretter, V., Altmann, F., März, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).
  30. Sela, D. A., et al. The genome sequence of Bifidobacterium longum subsp. infantis reveals adaptations for milk utilization within the infant microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18964-18969 (2008).
  31. Garrido, D., Kim, J. H., German, J. B., Raybould, H. E., Mills, D. A. Oligosaccharide binding proteins from Bifidobacterium longum subsp. infantis reveal a preference for host glycans. PLoS One. 6 (3), 17315(2011).
  32. Butt, T. R., Edavettal, S. C., Hall, J. P., Mattern, M. R. SUMO fusion technology for difficult-to-express proteins. Protein Expression and Purification. 43 (1), 1-9 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

glikozylacja białekizolacja glikoproteinklonowanie molekularneoczyszczanie białekmikrobiom jelitowyzwiązki prebiotyczneenzymy glikozydazy

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.