Artykuł metodologiczny

Skuteczność bakteriofagów w biokontroli patogenów przenoszonych przez żywność oceniana za pomocą ustawień o wysokiej przepustowości

3.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62812

⸱

19 sierpnia 2021

 ,  , 
1Department of Ecosystem and Public Health, Faculty of Veterinary Medicine, University of Calgary

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje solidną metodę korzystania z ustawień o wysokiej przepustowości do badania skuteczności przeciwbakteryjnej koktajli bakteriofagowych.

Streszczenie

Patogeny bakteryjne nieustannie stanowią wyzwanie dla systemów bezpieczeństwa żywności na całym świecie. Wraz z rosnącymi obawami o pojawienie się bakterii odpornych na ciepło i środki odkażające, pilnie potrzebne są nowe środki przeciwbakteryjne. Strategia kontroli biologicznej oparta na bakteriofagach polega na terapeutycznym zastosowaniu fagów do zwalczania patogenów bakteryjnych w środowisku rolniczym. Biokontrola fagów jest coraz częściej akceptowana jako zrównoważona technologia, skuteczna w odkażaniu patogenów przenoszonych przez żywność. Aby zapewnić skuteczne wyniki kontroli biologicznej, kluczowe znaczenie ma systematyczne badania przesiewowe kombinacji fagów pod kątem docelowych bakterii w wymaganych warunkach środowiskowych. Na skuteczność przeciwbakteryjną koktajli fagowych mogą mieć wpływ rodzaje i kombinacje fagów, docelowe szczepy bakterii, mnogość infekcji, temperatura i czas. Aby opracować koktajl fagowy o najwyższej skuteczności, zaproponowana metoda polegała na systematycznej ocenie skuteczności poszczególnych fagów i koktajli fagowych w zabijaniu patogenów bakteryjnych przenoszonych przez żywność w określonych warunkach. Skuteczność zabijania bakterii monitorowano, mierząc gęstość optyczną w pożądanych temperaturach i czasie trwania. O wyższej skuteczności fagów decydowało całkowite zahamowanie wzrostu bakterii. Proponowana metoda jest solidnym, opartym na dowodach podejściem, które ma ułatwić formułowanie koktajli fagowych o doskonałej skuteczności przeciwbakteryjnej.

Wprowadzenie

Bakteriofagi (fagi) to wirusy, które naturalnie atakują komórki bakteryjne, zakłócając metabolizm bakterii i powodując lizę bakterii. W przeciwieństwie do konwencjonalnych środków przeciwdrobnoustrojowych (np. antybiotyków), widma fagów gospodarzy są stosunkowo wąskie, zdolne do infekowania tylko wybranego zestawu gatunków lub szczepów bakterii, a zatem powinny zminimalizować skutki uboczne dla mikrobioty, które są korzystne dla zdrowia zwierząt i ludzi. Wraz ze wzrostem oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR), fagi i ich pochodne prowadzą do alternatywnych środków przeciwdrobnoustrojowych do kontrolowania bakteryjnych chorób zakaźnych, w tym zakażeń bakteryjnych AMR u ludzi i zwierząt1,2. Fagi mają potwierdzony potencjał terapeutyczny przeciwko patogenom bakteryjnym >20, które powodują powierzchowne infekcje oraz infekcje górnych dróg oddechowych i przewodu pokarmowego u ludzi3.

W warunkach rolniczych, strategia kontroli biologicznej oparta na fagach polega na terapeutycznym wykorzystaniu fagów do kontroli patogenów bakteryjnych. Biokontrola fagów jest dobrze akceptowana jako zielona technologia, skuteczna w odkażaniu patogenów przenoszonych przez żywność (np. Escherichia coli wytwarzających toksynę Shiga (STEC), Salmonella i Listeria) w różnych produktach spożywczych4,5. Ponadto fagi mogą być stosowane jako środki odkażające do dezynfekcji powierzchni przetwarzania żywności i skór zwierzęcych, które można zintegrować z konwencjonalnymi systemami przeciwdrobnoustrojowymi (np. chemikaliami, pasteryzacją parą i gorącą wodą) w celu zwiększenia pożądanych rezultatów i zmniejszenia wpływu na środowisko. Wykorzystanie fagów do redukcji bakterii odzwierzęcych u zwierząt jest również obiecujące1. Istnieje jednak potrzeba sprostania wyzwaniom technicznym w celu poprawy wyników podejścia opartego na kontroli biologicznej fagów, które ma być powszechnie stosowane w różnych systemach produkcji żywności. Głównym wyzwaniem jest upośledzona skuteczność fagów spowodowana rozwojem mutantów opornych na bakterie5 oraz zmiany w fizjologii bakterii spowodowane ekspozycją na stresory środowiskowe6.

W celu zminimalizowania ryzyka oporności na fagi, proponuje się koktajle fagowe (tj. kombinację wielu fagów), które mają zwiększoną siłę kontroli biologicznej w rolnictwie i akwakulturze7. Jednak z kilku badań udowodniono, że koktajle fagowe nie zawsze oferują lepszą skuteczność niż podawanie pojedynczego faga. Na przykład koktajl 3 fagów podobnych do T4 miał węższy zakres gospodarzy w stosunku do szczepów E. coli8. Co więcej, AKFV33, członek tekwintawirusa, miał większą skuteczność niż koktajl czterech fagów w usuwaniu E. coli O157 z wołowiny, pomimo zastosowanych temperatur inkubacji4. Ostatnio doniesiono, że skuteczność poszczególnych fagów nie przewiduje skuteczności koktajli fagowych w kontroli O1579, ponieważ interakcje między wieloma fagami mogą zmieniać skuteczność. Co najważniejsze, wiele czynników, takich jak rodzaje i kombinacje fagów, docelowe szczepy i MOI oraz temperatury i czasy inkubacji, mogą wpływać na interakcje między fagami. Dlatego staranne badanie kombinacji fagów pod kątem określonych bakterii w celu oceny synergii lub ułatwienia fagów, a przynajmniej w celu zapewnienia minimalnego antagonizmu fagów w określonych warunkach środowiskowych, jest niezwykle ważne dla uzyskania optymalnych wyników. W tym miejscu opisano metodę systematycznej oceny skuteczności różnych kombinacji fagów przeciwko patogenom przenoszonym przez żywność w różnych warunkach środowiskowych. Korzyścią płynącą z tego podejścia jest umożliwienie badań przesiewowych wszystkich możliwych czynników biotycznych i abiotycznych, które zgodnie z przewidywaniami wpływają na skuteczność przeciwbakteryjną fagów w warunkach naturalnych. W protokole jako przykład zastosowano STEC O157 i ich infekujące fagi.

Protokół

1. Przygotowanie buforu i odczynników

  1. Przygotuj 500 ml bulionu sojowego tryptycznego (TSB) (15 g proszku TSB i 500 ml ultraczystej wody) i autoklaw.
    UWAGA: Można go przechowywać w temperaturze pokojowej do 3 miesięcy lub w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.
  2. Przygotować 500 ml tryptycznego agaru sojowego (TSA) (20 g proszku TSA i 500 ml ultraczystej wody) i autoklaw.
    UWAGA: Można go przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.
  3. Przygotować 500 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 4 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,77 g Na2HPO4 i 0,12 g KH2PO4, 500 ml ultraczystej wody), zmierzyć i dostosować pH do 7,2 ± 0,2 w temperaturze 25 °C i autoklawować
    UWAGA: Można go przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
  4. Przygotować 200 ml 1 M MgSO4 (49,294 g i 200 ml ultraczystej wody) i wysterylizować przez filtr polieterosulfonowy 0,22 μm.
  5. Przygotować 500 ml TSB z 10 mMMgSO4 (mTSB; 15 g proszku TSB, 500 ml wody ultraczystej i 5 ml 1 MMgSO4) i przelać w autoklawie; pozostawić autoklawowane podłoże do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Zastosuj technikę aseptyczną. Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie przenieść 5,0 ml 1 MMgSO4; Delikatnie zamieszaj, aby wymieszać.

2. Przygotowanie kultury bakteryjnej

  1. Aby przygotować laboratoryjną hodowlę bakterii (BRLC), wyjmij fiolkę (fiolki) z zamrażarki i przenieś do laboratorium.
  2. Użyj jednorazowej pętli do zaszczepiania lub jej odpowiednika, zanurz w fiolce, usuń resztki inokulum (zamrożone błoto pośniegowe) i rozprowadź na płytce TSA lub jej odpowiedniku w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu II. Inkubować płytkę w temperaturze 37 ± 2 °C przez 15−18 godzin.
  3. Przygotowane płytki BRLC należy zapakować w worki i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Ogólny termin ważności dla BRLC: 14 dni w temperaturze 4 °C po wygenerowaniu.
  4. Zaszczepić pojedynczą kolonię każdego szczepu E. coli O157 z płytek BRLC, które mają być badane, w 10 ml TSB i inkubować statycznie w temperaturze 37 °C przez 18 godzin, aby osiągnąć 9 log10 CFU/ml.
  5. Przygotować seryjne rozcieńczenie nocnych kultur (następnego ranka), każdy szczep E. coli O157 przy użyciu mTSB zawierającego 10 mM MgSO4 w celu osiągnięcia 4-5 log10 CFU/ml (lub innego pożądanego poziomu inokulum).
  6. Wymieszaj równą objętość nocnej kultury każdego szczepu, aby uzyskać łącznie 4-5 log10 CFU/ml (lub według uznania) w celu przygotowania mieszaniny bakteryjnej.
  7. Rozcieńczoną kulturę bakteryjną należy natychmiast umieścić w temperaturze 4 °C do dalszego użycia.
  8. Rozcieńczyć kulturę inokulum 10 lub 100 razy i rozlać 0,1 ml podwielokrotności tych rozcieńczeń na płytki TSA, aby otrzymać izolowane kolonie.

3. Przygotowanie roztworów roboczych dla fagów

  1. Rozmnażaj zapasy robocze o wysokim mianie dla każdego faga, który ma być poddany badaniom przesiewowym (≥108 PFU/ml), postępując zgodnie ze standardowymi metodami4.
    UWAGA: Ogólny okres ważności zapasów fagowych wynosi 3 miesiące w plastikowej butelce w temperaturze 4 °C po wygeneracjeniu.
  2. Aby osiągnąć pożądane miano, np. ~108 PFU/ml dla kinetyki lizy, należy rozcieńczyć poszczególne preparaty fagowe mTSB zawierającym 10 mMMgSO4. Przygotować koktajle fagowe, mieszając równe objętości każdego materiału roboczego o tym samym mianie we wszystkich możliwych kombinacjach.

4. Przygotowanie kinetyki lizy in vitro dla poszczególnych fagów i koktajli fagowych

  1. Przygotować seryjne 10-krotne rozcieńczenia każdego faga w kolumnach 1-8 w sterylnych 96-dołkowych mikropłytkach w celu przeprowadzenia testu mikropłytkowego.
    UWAGA: Cztery fagi przeciwko jednemu szczepowi bakteryjnemu można testować dwukrotnie, w sąsiednich kolumnach, na każdej płytce. Pozostałe cztery kolumny są przeznaczone dla kontroli, które są bez faga, a także dla mTSB puste (Rysunek 1).
  2. Umieścić 180 μl mTSB w studzienkach z kolumn od 1 do 12 96-dołkowej mikropłytki.
  3. Dodać 20 μl rozcieńczonych pojedynczych fagów lub koktajli fagowych (~108 PFU/ml) do studzienek 1-8 górnego rzędu mikropłytki (rząd A).
  4. W przypadku kontroli bez fagów i ślepej próby dodać 20 μl mTSB do górnej studzienki kolumn 9, 10 i 11.
  5. Za pomocą pipety 12-kanałowej rozcieńczyć płytkę. Przenieś 20 μl z rzędu do rzędu. Wymieszaj zawartość studzienki przez delikatne, wielokrotne zasysanie, wyrzucanie (co najmniej pięć razy) i zmienianie końcówek między rozcieńczeniami. Usunąć 20 μl z ostatniego rzędu (rząd H).
    UWAGA: Zaleca się używanie końcówek z filtrami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
  6. Ustaw zbiornik dla każdego szczepu, użyj pipety o pojemności 1 ml, aby przenieść 2-3 ml rozcieńczonej kultury do zbiornika. W przypadku kolumn 1-10 użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 20 μl rozcieńczonej kultury bakteryjnej do każdego dołka. Zmieniaj wskazówki między każdym dodawaniem.
  7. Przykryć i inkubować mikropłytkę w żądanych warunkach (np. 37 °C przez 10 godzin lub 22 °C przez 22 godziny).
  8. W odstępach 2 godzin lub w innych zalecanych odstępach czasu wyjąć mikropłytki z inkubatora.

5. Wyznaczanie gęstości optycznej

  1. Zbadaj gęstość optyczną przy 600 nm (OD600nm) za pomocą czytnika mikropłytek.
    UWAGA: Zaleca się skonfigurowanie i zapisanie protokołu testu w programie przed przygotowaniem płytki testowej.
  2. Włącz czytnik mikropłytek i otwórz program.
  3. Wybierz tryb prosty w oknie Opcje uruchamiania i wybierz Utwórz nowy protokół w Menedżerze zadań (rysunek uzupełniający 1a,b).
  4. W oknie Select Plate Type (Wybierz typ płytki) wybierz z listy rozwijanej opcję 96 Well Plate (Rysunek uzupełniający 2).
  5. Wybierz Absorbancję dla metody wykrywania, opcję Punkt końcowy/Kinetyczny dla typu odczytu i Monochromatory dla typu optyki. Kliknij przycisk OK (Rysunek uzupełniający 3).
  6. W polu Read Step (Krok odczytu) wprowadź wartość 600 nm dla długości fal i wybierz opcję Normal (Normalna) dla prędkości odczytu. Kliknij OK (Rysunek uzupełniający 4).
  7. Aby ustawić temperaturę dla testu, kliknij pole wyboru Inkubacja i wybierz Inkubator włączony. Wprowadź żądaną temperaturę w polu Temperatura. Kliknij OK. Aby zapobiec kondensacji pary wodnej na pokrywie płytki podczas inkubacji, ustaw gradient temperatury, wprowadzając wartość (1-3) w polu Gradient. Kliknij OK (rysunek uzupełniający 5a).
    UWAGA: Kliknij pole wyboru Podgrzej przed przejściem do następnego kroku dla temperatury inkubacji 37 °C. Ten etap nie jest wymagany w warunkach badania w temperaturze 22 °C (RT).
  8. Następnie kliknij pole wyboru Kinetic, aby otworzyć Kinetic Setup. Ustaw czas pracy na 10 godzin dla inkubacji w 37 °C lub 22 godziny dla RT. Wprowadź 2 godziny jako interwał odczytu. Kliknij OK (Rysunek uzupełniający 5b).
  9. Kliknij pole wyboru Potrząśnij w oknie Procedura, aby w razie potrzeby ustawić warunek potrząśnięcia dla każdego odczytu kinetycznego (Rysunek uzupełniający 6a).
  10. Wybierz Liniowy dla trybów potrząsania i zmień czas trwania na 30 s. Ustaw wartość częstotliwości liniowej na 731 cpm (2 mm), a następnie kliknij OK (Rysunek uzupełniający 6b).
  11. W oknie dialogowym Podsumowanie protokołu kliknij Układ płytki i wybierz Ślepe próby, Kontrole testu i Próbki. Kliknij Dalej (Rysunek Uzupełniający 7).
    UWAGA: Wprowadź 1 w liczbie różnych typów kontroli dla kontroli ujemnej.
  12. Po zdefiniowaniu ustawień dla każdego typu studni kliknij przycisk Zakończ.
  13. Wybierz identyfikator studni w interfejsie po lewej stronie, a następnie przypisz go do macierzy pokazanej w układzie płyty. Kliknij przycisk OK (Rysunek uzupełniający 8).
  14. Kliknij przycisk Read Plate i zapisz protokół jako plik .prt, a następnie kliknij Zapisz (Rysunek uzupełniający 9).
  15. Włóż tabliczkę i kliknij OK.
  16. Po zakończeniu eksperymentu zapisz eksperyment jako plik .xpt i kliknij przycisk Zapisz (Rysunek uzupełniający 10).
  17. Wyeksportuj dane do programu Excel, klikając przycisk Tak w oknie komunikatu w celu dalszej analizy (Rysunek uzupełniający 11).
  18. Kliknij opcję Zapisz Tak/Nie i pole wyboru Nie pytaj ponownie, aby zapisać preferencje.

6. Analizy danych

  1. Powtórz co najmniej dwa niezależne eksperymenty, jak opisano powyżej. Zbierz wyniki ze wszystkich niezależnych badań. Obliczyć średnią i odchylenie standardowe OD600 z każdej kultury poddanej działaniu fagów i wolnej od niej.
  2. Wykonaj pierwiastek kwadratowy z wartości OD przy 600 nm i przeanalizuj je przy użyciu odpowiedniego modelu statystycznego dla każdego szczepu bakterii i temperatury.
    UWAGA: W przypadku oprogramowania SAS wybierany jest model MIESZANY i metoda najmniejszych kwadratów do różnicowania średnich (P < 0,05). Dla każdego szczepu przypisz panele A−G do każdego leczenia fagowego, którego ogólna skuteczność anty-O157 w czasie i MOI różniła się (P < 0,05).
  3. Określ doskonałą skuteczność fagów na podstawie wartości OD600 nm ≤ 0,01 odpowiadającej niewykrywalnemu wzrostowi bakterii (granica wykrywalności: 300 CFU / ml).
    1. Przeanalizuj wpływ czasu, temperatury inkubacji, szczepów E. coli O157, MOI i typów fagów na skuteczność fagów przy użyciu odpowiedniego modelu statystycznego.
      UWAGA: W przypadku oprogramowania SAS należy użyć GLIMMIX z miarami losowymi.
    2. Oblicz iloraz szans, aby porównać doskonałą skuteczność dla różnych czynników środowiskowych i biologicznych.

Wyniki

Zgodnie z protokołem przeprowadzono porównanie skuteczności fagów przeciwko O157 w zależności od różnych kombinacji fagowych, temperatur, czasu oraz wartości MOI. Wpływ temperatury i czasu inkubacji, MOI, rodzajów użytych fagów oraz szczepów bakteryjnych na zwiększenie skuteczności przeciwko E. coli O157 przedstawiono w Tabeli 1 (tabela ilorazu szans)9. Przeanalizowano procent (%) pomiarów mętności optycznej ≤ 0,01 dla każdego preparatu fagowego w każdych warunkach doświadczalnych. Na podstawie tej analizy stwierdzono, że skuteczność fagów przeciwko O157 była maksymalna po 14, 16 lub 18 h inkubacji w temperaturze 22 °C (P < 0,001) oraz przy MOI = 1000 (P < 0,001), przy czym wzrost hodowli traktowanej fagami został całkowicie zahamowany odpowiednio w 75% i 89% przypadków. Ogólnie, spośród 11 preparatów fagowych, koktajl T1, T4 i rV5 był najskuteczniejszy (P < 0,05) przeciwko O157. Ponadto, w zależności od testowanych temperatur inkubacji, czasu, MOI i fagów, wrażliwość na fagi była zróżnicowana, przy czym spośród badanych szczepów O157 szczep CO281-31N był najbardziej wrażliwy (P < 0,001), a szczep 3081 (P < 0,001) najmniej wrażliwy na fagi.

Aby zrozumieć kinetykę zabijania przez fagi każdego z badanych szczepów bakteryjnych, wartości OD600 naniesiono na wykres w zależności od czasu pobierania próbek, wartości MOI oraz rodzaju zastosowanego faga w każdej temperaturze inkubacji. Reprezentatywne wyniki skuteczności fagów przeciwko E. coli O157 3081 w 37 °C przedstawiono na Rysunku 2. Przed oceną zahamowania krzywej wzrostu w kulturze traktowanej fagami upewniono się, że krzywa wzrostu kultury kontrolnej (bez fagów) ma charakter prawidłowy. Zgodnie z Rysunkiem 2, zastosowanie faga T4 całkowicie zahamowało wzrost bakterii w 37 °C w każdym czasie pobierania próbek przy MOI wynoszącym zaledwie 1. Aby przedstawić ogólny obraz hamowania wzrostu bakterii przez fagi w czasie w różnych temperaturach, niezależnie od wartości MOI, średnią wartość OD600nm wyliczoną dla wszystkich MOI (MOI > 0) naniesiono na wykres w zależności od czasu pobierania próbek i rodzaju zastosowanego faga (Rysunek 3). W porównaniu do 37 °C, skuteczność zabijania przez konkretne fagi, np. fagi T4 oraz T1 + T4, była wyższa w 22 °C. Inne podejście do podsumowania i porównania ogólnej skuteczności przeciwko O157 różnych fagów przedstawiono w Tabeli 2 i Tabeli 39. Wartość OD600 wyliczono jako średnią z każdego czasu pobierania próbek i MOI, a następnie uszeregowano skuteczność fagów od najwyższej (A) do najniższej (F w 37 °C i D w 22 °C). Tabela ta ułatwia identyfikację najlepszej metody leczenia fagami. Na przykład w przypadku szczepu 3081, fagi T4 i T5 + T4 (Panel A) były najskuteczniejszą terapią w 37 °C, podczas gdy w 22 °C, oprócz faga T4, najskuteczniejszą terapią były fagi T1 + T4, T1 + T4 + rV5 oraz koktajle z 4 fagami (Panel A).

Niniejszy protokół umożliwił nam również porównanie skuteczności fagów przeciwko różnym szczepom bakteryjnym oraz dostosowanie przygotowania fagów. Na przykład podczas wyboru fagów, w temperaturze 37 °C, z wyłączeniem szczepu 3081, koktajl fagów T1 + T4 + rV5 wykazał największą skuteczność przeciwko wszystkim pozostałym szczepom, niezależnie od ich typów fagowych. W temperaturze 22 °C koktajl składający się z 4 fagów był najskuteczniejszy przeciwko wszystkim badanym szczepom. Optymalne wartości MOI doprowadziły do całkowitej lizy (OD600 ≤ 0,01), co wskazało na potencjalnie wyższą skuteczność w warunkach eksperymentalnych (Tabela 2 i Tabela 3).

figure-results-1
Rysunek 1: Sugerowany układ testu na mikropłytce 96-dołkowej. Seryjne rozcieńczenia 10-krotne każdego faga przygotowuje się w kolumnach 1-8 sterylnych mikropłytek 96-dołkowych. Cztery fagi przeciwko jednemu szczepowi bakteryjnemu można testować w dubletach, w sąsiednich kolumnach, na każdej płytce. Pozostałe kolumny służą jako kontrole. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Krzywe wzrostu szczepu 3081 E. coli O157 w temperaturze 37 °C poddanego i niepoddanego działaniu fagów przy poszczególnych wartościach MOI. Dane zostały zestawione z dwóch niezależnych prób. Słupki przedstawiają odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rycina 3: Krzywe wzrostu szczepów E. coli O157 3081. (A) Krzywe wzrostu w 37 °C. (B) Krzywe wzrostu w 22 °C. Każda krzywa reprezentuje kultury pojedyncze i mieszane, poddane i niepoddane działaniu fagów przy różnych MOI. Dane zebrano z dwóch niezależnych prób. Słupki przedstawiają błąd standardowy średniej (zaadaptowano z Referencji9 za zgodą). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Ilorazy szans porównujące prawdopodobieństwo wyższej skuteczności fagów przeciwko E. coli O157 w zależności od temperatur inkubacji, czasu inkubacji, MOI, rodzajów fagów i szczepów E. coli O157 (zaadaptowano z referencji9 za zgodą autora). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Ogólna skuteczność fagów przeciwko E. coli O157 w temperaturze 37 °C (zaadaptowano z Publikacji9 za zgodą autora). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Ogólna skuteczność fagów przeciwko E. coli O157 w temperaturze 22 °C (zaadaptowano z publikacji9 za zgodą autorów). Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Ryciny uzupełniające 1-11: Zrzuty ekranu z działania i procedur czytnika mikropłytek. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Dyskusja

W protokole tym opisano solidne podejście do systemowej oceny skuteczności fagów przeciwko patogenom przenoszonym przez żywność, w tym STEC9 i Salmonelli10. Jednym z krytycznych kroków jest rozcieńczanie nocnej hodowli bakterii, użycie wstępnie schłodzonej pożywki i manipulowanie rozcieńczeniem za pomocą wiadra z lodem, aby zminimalizować potencjalny rozwój bakterii. Ponadto przygotowano rozcieńczenie fagów przed rozcieńczeniem kultury bakteryjnej. Etap liczenia 2.8 dostarczył rzeczywistej liczby inokulum bakteryjnego do obliczenia końcowego zastosowanego MOI. Do przygotowania fagów zwykle stosuje się surowe lizaty fagowe przygotowane przez filtracyjny zakażony w 4-6 godzinach hodowli bakteryjnej. Krytycznym etapem związanym z zakaźnością fagów jest zawsze użycie zapasów roboczych fagów przygotowanych w ciągu 3 miesięcy. Niezwykle dokładne pipetowanie (szczególnie w przypadku korzystania z pipet wielokanałowych) i jednolitość podejścia są również niezbędne do uzyskania porównywalnych i możliwych do interpretacji wyników. Zmodyfikowany TSB uzupełniony 10 mM Mg2+ zastosowano do rozcieńczenia fagów, kultury bakteryjnej i pożywki zasadowej w celu optymalizacji adsorpcji i infekcji fagów.

Ponieważ bakterie namnażają się w fazie logarytmicznej, nawet poniżej temperatury inkubatora, zaleca się stosowanie rozcieńczonej hodowli nocnej zamiast hodowli w fazie logarytmicznej, aby zminimalizować potencjalny wzrost bakterii.

Proponowany protokół ma pewne ograniczenia. Po pierwsze, ponieważ mikropłytka może pomieścić tylko 200 μl, długotrwała inkubacja może spowodować znaczne parowanie i nie jest zalecana. W takim przypadku test może nie być odpowiedni dla wolno rosnących bakterii. Po drugie, proponowany protokół nie był w stanie monitorować amplifikacji fagów. Po trzecie, protokół ten nie mógł monitorować rozwoju oporności na fagi w czasie, krytycznego czynnika decydującego o wyniku leczenia fagami 11,12. Konieczne są dalsze eksperymenty w celu oceny dalszej skuteczności najbardziej wpływowego koktajlu w badaniach przesiewowych w zapobieganiu pojawianiu się mutantów anty-fagowych w ekstensywnym systemie hodowli bulionu i innych matrycach biologicznych.

W przeciwieństwie do konwencjonalnych środków przeciwdrobnoustrojowych, biologiczny charakter fagów wpływa na złożoność kontroli biologicznej i zastosowania terapeutycznego w warunkach praktycznych. Konwencjonalnie, racjonalna selekcja koktajli fagowych opiera się przede wszystkim na aktywności litycznej i zakresie gospodarzy fagów. Często zaleca się kandydatów na fagi o najsilniejszej aktywności litycznej i najszerszym zakresie gospodarzy13,14. Jednak w oparciu o obecne badanie, fagi takie jak rV5 i T1, choć same w sobie nie są tak zjadliwe jak T4 i T5, znacznie ułatwiły ogólny wynik kontroli biologicznej w połączeniu z T4 i / lub T5. W związku z tym, aby osiągnąć wyższą skuteczność koktajli fagowych, zaleca się ogólnoustrojowe badania przesiewowe aktywności przeciwbakteryjnej potencjalnych kombinacji fagów przeciwko docelowym szczepom gospodarza w pożądanych warunkach środowiskowych. Ponadto określenie receptorów dla kandydatów na fagi i włączenie fagów do różnych receptorów może zapobiec konkurencji o przyłączenie gospodarza, udaremnić szybki rozwój mutantów antyfagowych i poprawić wyniki kontroli biologicznej13.

Metoda ta umożliwiła dokładne ilościowe określenie kinetyki lizy fagów w formacie wysokoprzepustowym. Co więcej, umożliwiło to systematyczną ocenę różnych czynników biologicznych i środowiskowych pod kątem skuteczności przeciwbakteryjnej asortymentu fagów, ułatwiając w ten sposób formułowanie koktajli fagowych o zoptymalizowanych wynikach. Zakłada się, że przyszłe zastosowania i rozwój metody będą obejmowały monitorowanie in situ skuteczności każdego faga w koktajlach fagowych poprzez znakowanie fluorescencyjne fagów. Oprócz proponowanego protokołu, zrozumienie uwarunkowań genetycznych, które promują synergiczne i ułatwione efekty między fagami podczas jednoczesnego zakażenia jednego gospodarza, ułatwiłoby opracowanie odpowiednich koktajli fagowych o wyższej skuteczności.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Te badania były wspierane przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC Discovery Grant, RGPIN-2019-04384), Kanadyjską Fundację Innowacji (Projekt # 38710) oraz Major Innovation Fund, Alberta. Dziękujemy dr. Johnowi Kastelicowi za redakcję manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Niezbędne materiały, odczynniki i sprzęt
Pętle inokulacyjneVWR12000-806
Siarczan magnezu siedmiowodnySigma1374361MgSO4.7H2O
Szalki Petriego z przezroczystą pokrywkąFisherFB0875713Średnica: 100 mm, sterylne
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Fisher10010023
Pipeta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+METTLER TOLEDO17014382
Pipeta Pipet-Lite LTS L-300XLS+METTLER TOLEDO17014405
Pipeta wielofunkcyjna Pipet-Lite L12-20XLS+METTLER TOLEDO17013808
Pipeta Pipet-Lite, Unv. SL-20XLS+METTLER TOLEDO17014412
Końcówki do pipet RT LTS 1000µ L FL 768A/8-o niskiej retencjiMETTLER TOLEDO30389213
SR LTS 20µ L F 960A/5METTLER TOLEDO17005860
Końcówki do pipet SR LTS 300µ L 768A/4METTLER TOLEDO17005867bez filtra
ZbiornikMETTLER TOLEDO89094-662
Sterylne, przezroczyste, 96-dołkowe płaskie mikropłytki polistyrenowe z pokrywkamiFisher168055
Tryptyczny agar sojowy (TSA)Sigma105458-0500
Tryptyczny bulion sojowy (TSB)Sigma105459-0500
Komórka w kształcie litery T RozsiewaczeVWR76299-566
Instruments
Analogowy mieszalnik wirowyFisher02-215-414
Kompaktowe inkubatory mikrobiologiczneFisher50125590H
Mieszadło magnetyczne z płytami grzejnymiFIsher13-889-335
Wielokątne mieszadłaFIsher14-512-125długość: 20 mm
Synergy Neo2 Hybrydowy czytnik wielomodowyFisherBTNEO2M
Software
SAS SAS Institute9.4
Końcówki do pipet

Bibliografia

  1. Carvalho, C., Costa, A. R., Silva, F., Oliveira, A. Bacteriophages and their derivatives for the treatment and control of food-producing animal infections. Critical Reviews in Microbiology. 43 (5), 583-601 (2017).
  2. Czaplewski, L., et al. Alternatives to antibiotics-a pipeline portfolio review. The Lancet. Infectious Diseases. 16 (2), 239-251 (2016).
  3. Cisek, A. A., Dabrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyzewski, Z. Phage therapy in bacterial infections treatment: one hundred years after the discovery of bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
  4. Liu, H., et al. Control of Escherichia coli O157 on beef at 37, 22 and 4°C by T5-, T1-, T4-and O1-like bacteriophages. Food Microbiology. 51, 69-73 (2015).
  5. Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. Bacteriophage applications for food production and processing. Viruses. 10 (4), (2018).
  6. Ly-Chatain, M. H. The factors affecting effectiveness of treatment in phages therapy. Frontiers in Microbiololgy. 5, 51(2014).
  7. Dy, R. L., Rigano, L. A., Fineran, P. C. Phage-based biocontrol strategies and their application in agriculture and aquaculture. Biochemical Society Transactions. 46 (6), 1605-1613 (2018).
  8. Bourdin, G., et al. Coverage of diarrhoea-associated Escherichia coli isolates from different origins with two types of phage cocktails. Microbial Biotechnology. 7 (2), 165-176 (2014).
  9. Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. Efficacy of individual bacteriophages does not predict efficacy of bacteriophage cocktails for control of Escherichia coli O157. Frontiers in Microbiololgy. 12, 616712(2021).
  10. Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. Effect of a bacteriophage T5virus on growth of Shiga toxigenic Escherichia coli and Salmonella strains in individual and mixed cultures. Virology Journal. 17, 3(2020).
  11. Brüssow, H. What is needed for phage therapy to become a reality in Western medicine. Virology. 434 (2), 138-142 (2012).
  12. Chan, B. K., Abedon, S. T., Loc-Carrillo, C. Phage cocktails and the future of phage therapy. Future Microbiology. 8 (6), 769-783 (2013).
  13. Nikolich, M. P., Filippov, A. A. Bacteriophage therapy: developments and directions. Antibiotics. 9 (3), Basel, Switzerland. 135(2020).
  14. Niu, Y. D., et al. Host range and lytic capability of four bacteriophages against bovine and clinical human isolates of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7. Journal of Applied Microbiology. 107 (2), 646-656 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biokontrola bakteriofagowakoktajl fagowyprzesiewy wysokoprzepustoweskuteczno antybakteryjnatesty w mikrop ytkachg sto optycznawielokrotno infekcjihamowanie wzrostu bakteriikinetyka zabijania przez fagi

Powiązane artykuły