Głębokie i przestrzennie kontrolowane ablacje objętościowe przy użyciu mikroskopu dwufotonowego w danio pręgowanym

Summary

Rozwój embrionalny wymaga koordynacji ruchu komórek na dużą skalę. Ablacja laserowa za pośrednictwem wzbudzenia dwufotonowego umożliwia przestrzennie kontrolowaną 3-wymiarową ablację dużych grup głębokich komórek. Ponadto technika ta może badać reakcję kolektywnie migrujących komórek in vivo na zakłócenia w ich środowisku mechanicznym.

Abstract

Morfogeneza obejmuje wiele ruchów komórek w celu zorganizowania komórek w tkanki i organy. Dla prawidłowego rozwoju wszystkie te ruchy muszą być ściśle skoordynowane, a coraz więcej dowodów sugeruje, że osiąga się to, przynajmniej częściowo, poprzez interakcje mechaniczne. Zbadanie tego na zarodku wymaga bezpośrednich zaburzeń fizycznych. Ablacje laserowe są coraz częściej stosowaną opcją, która pozwala na złagodzenie ograniczeń mechanicznych lub fizyczną izolację dwóch populacji komórek od siebie. Jednak wiele ablacji wykonuje się za pomocą lasera ultrafioletowego (UV), który zapewnia ograniczoną rozdzielczość osiową i penetrację tkanki. Opisano tutaj metodę ablacji głębokich, znaczących i przestrzennie dobrze zdefiniowanych objętości za pomocą mikroskopu dwufotonowego. Ablacje wykazano w transgenicznej linii danio pręgowanego, która wykazuje ekspresję białka zielonej fluorescencji w osiowej mezendodermie i jest stosowana do przecięcia osiowej mezendodermy bez wpływu na leżącą nad nią ektodermę lub leżącą poniżej komórkę żółtka. Zachowanie komórek jest monitorowane za pomocą obrazowania na żywo przed i po ablacji. Protokół ablacji może być stosowany na różnych etapach rozwoju, na dowolnym typie komórki lub tkance, w skalach od kilku mikronów do ponad stu mikronów.

Introduction

Interakcje komórka-komórka odgrywają istotną rolę w rozwoju. Komórki dostarczają sygnałów, które mogą dostrzec ich bezpośredni sąsiedzi lub komórki znajdujące się dalej, wpływając w ten sposób na ich los i/lub zachowanie. Wiele z tych sygnałów ma charakter chemiczny. Na przykład, w dobrze scharakteryzowanych zdarzeniach indukcji, jedna grupa komórek wytwarza dyfuzyjne cząsteczki wpływające na los innej populacji komórek¹. Inne sygnały są jednak mechaniczne; Komórki wywierają siły i ograniczenia na swoich sąsiadów, które sąsiedzi dostrzegają i na które reagują².

Jednym ze sposobów badania znaczenia tych interakcji komórka-komórka in vivo jest eliminacja niektórych komórek i obserwacja ich dalszego rozwoju. Niestety, dostępne techniki usuwania lub niszczenia komórek są ograniczone. Komórki można usunąć chirurgicznie^3,4, za pomocą igieł lub małych drutów, ale takie zabiegi są inwazyjne, mało precyzyjne i zwykle wykonywane pod mikroskopem stereoskopowym, co uniemożliwia natychmiastowe obrazowanie pod mikroskopem. Co więcej, celowanie w głębokie komórki oznacza przebijanie w leżących nad nimi tkankach, powodując niepożądane zakłócenia. Genetycznie kodowane fotosensybilizatory, takie jak KillerRed, zostały użyte do wywołania śmierci komórki poprzez oświetlenie światłem⁵. Fotouczulacze to chromofory, które pod wpływem promieniowania świetlnego wytwarzają reaktywne formy tlenu. Ich głównym ograniczeniem jest to, że wymagają długiego oświetlenia światłem (około 15 minut), co może być trudne do osiągnięcia, jeśli komórki się poruszają, oraz że wywołują śmierć komórki poprzez apoptozę, która nie jest natychmiastowa.

Wreszcie, w ciągu ostatnich 15 lat opracowano i szeroko stosowano ablacje laserowe^6,7,8,9^,10,11,12. Wiązka lasera jest skupiana na docelowej komórce/tkance. Indukuje jego ablację poprzez ogrzewanie, fotoablację lub ablację indukowaną plazmą; Związany z tym proces zależy od gęstości mocy i czasu ekspozycji¹³. Większość protokołów ablacji wykorzystuje lasery UV ze względu na ich wysoką energię. Jednak światło UV jest zarówno pochłaniane, jak i rozpraszane przez tkanki biologiczne. Tak więc celowanie w głębokie komórki wymaga dużej mocy lasera, który następnie indukuje uszkodzenia w bardziej powierzchownych, poza płaszczyzną tkankach. Ogranicza to stosowanie laserów UV do struktur powierzchniowych i tłumaczy ich stosunkowo niską rozdzielczość osiową. Optyka nieliniowa (tzw. mikroskopia dwufotonowa) wykorzystuje nieliniowe właściwości światła do wzbudzenia fluoroforu z dwoma fotonami o około połowie energii w domenie podczerwieni. W przypadku ablacji ma to trzy główne zalety. Po pierwsze, światło podczerwone jest mniej rozproszone i mniej absorbowane niż światło UV przez tkanki biologiczne¹⁴, co pozwala dotrzeć do głębszych struktur bez zwiększania wymaganej mocy lasera. Po drugie, zastosowanie femtosekundowego lasera impulsowego zapewnia bardzo duże gęstości mocy, tworząc ablację poprzez indukcję plazmy, która w przeciwieństwie do ogrzewania nie dyfunduje przestrzennie¹⁵. Po trzecie, gęstość mocy indukująca powstawanie plazmy jest osiągana tylko w punkcie ogniskowym. Dzięki tym właściwościom dwufotonowe ablacje laserowe mogą być stosowane do precyzyjnego celowania w głębokie komórki bez wpływu na otaczające środowisko tkankowe.

Migracje zbiorowe są doskonałym przykładem procesów rozwojowych, w których interakcje komórka-komórka są fundamentalne. Migracje zbiorowe są definiowane jako migracje komórek, w których sąsiednie komórki wpływają na zachowanie jednej komórki¹⁶. Charakter tych interakcji (chemicznych lub mechanicznych) i sposób, w jaki wpływają one na migrację komórek, może się znacznie różnić i często nie jest w pełni zrozumiały. Zdolność do usuwania komórek i obserwowania, jak wpływa to na pozostałe, ma kluczowe znaczenie dla dalszego odkrywania tych zbiorowych procesów. Kilka lat temu ustaliliśmy — stosując metody chirurgiczne — że migracja polstera podczas gastrulacji danio pręgowanego jest zbiorową migracją¹⁷. Polster to grupa komórek, która stanowi pierwsze komórki internalizujące po grzbietowej stronie zarodka¹⁸. Komórki te, oznaczone na zielono w linii transgenicznej Tg(gsc:GFP), znajdują się głęboko w zarodku, poniżej kilku warstw komórek epiblastów. Podczas gastrulacji grupa ta prowadzi przedłużenie mezodermy osiowej, migrując od organizatora embrionalnego do bieguna zwierzęcego^{19,20,21,22,23} (Rysunek 1A). Ustaliliśmy, że komórki wymagają kontaktu z sąsiadami, aby ukierunkować swoją migrację w kierunku bieguna zwierzęcego. Jednak lepsze zrozumienie komórkowych i molekularnych podstaw tej zbiorowej migracji wymaga usunięcia niektórych komórek, aby zobaczyć, jak wpływa to na pozostałe. W związku z tym opracowaliśmy ablacje dużych i głębokich objętości przy użyciu zestawu mikroskopii dwufotonowej. Tutaj pokazujemy użycie tego protokołu do przecięcia polstera w jego środku i obserwujemy konsekwencje dla migracji komórek poprzez śledzenie jąder znakowanych Histone2B-mCherry.

Protocol

Wszystkie prace na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny N 59 i Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche pod numerem pliku APAFIS#15859-2018051710341011v3. Niektóre z opisanych poniżej kroków są specyficzne dla naszego sprzętu i oprogramowania, ale można je łatwo dostosować do różnych urządzeń.

1. Przygotowanie do iniekcji

1. Przygotować 75 ml 1% roztworu agarozy w pożywce dla zarodków (EM).
2. Umieść formę wtryskową na szalce Petriego o średnicy 90 mm i wlej około 50 ml agarozy, tyle aby forma unosiła się na wodzie. Pozwól agarozie zestalić się i usuń formę wtryskową.
3. Przygotuj naczynie pokryte agarozą, wlewając 1 ml agarozy do szalki Petriego o średnicy 30 mm.
4. Przygotuj 4 μl 30 ng/μL roztworu mRNA Histone2B-mCherry, rozcieńczając roztwór podstawowy w wodzie wolnej od RNaz i trzymaj na lodzie.
   UWAGA: Uważaj, aby nosić rękawiczki podczas manipulowania mRNA, aby uniknąć degradacji za pośrednictwem RNazy.
5. Wyciągnąć igłę do wstrzykiwań z kapilary za pomocą ściągacza do mikropipet.

2. Przygotowanie zarodków

1. Gdy ryby złożą jaja, zbierz, opłucz i zbierz na szalce Petriego o średnicy 90 mm w EM. Umieścić zarodki w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C.
2. Poczekaj 20 minut, aż pierwsza komórka stanie się widoczna.
3. Przenieść 30 zarodków na płytkę iniekcyjną wypełnioną EM. Ściśnij zarodki w rowkach za pomocą lekko kleszczy i ustaw je tyczką zwierzęcą do góry.
4. Za pomocą końcówki do mikroładowarki napełnij igłę iniekcyjną 2 μl roztworu mRNA. Włóż igłę do uchwytu kapilarnego umieszczonego w mikromanipulatorze połączonym rurką z politetrafluoroetylenu (PTFE) z wtryskiwaczem powietrza.
5. Pod mikroskopem stereoskopowym ostrożnie złamij końcówkę igły.
6. Wstrzyknąć roztwór mRNA do zarodków w stadium 1-komórkowym, wprowadzając igłę do komórki.
   UWAGA: Wstrzyknięta objętość stanowi około jednej trzeciej objętości komórki.
7. Umieścić ponownie wstrzyknięte zarodki w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C.

3. Przygotowanie mikroskopu dwufotonowego

UWAGA: W tym protokole używane są dwa lasery. Jeden służy do obrazowania GFP (przy 920 nm) i wykonywania ablacji (przy 820 nm). Będzie on określany jako laser zielony/ablacyjny. Drugi jest używany przy 1160 nm do obrazowania mCherry. Będzie on określany jako czerwony laser.

1. Ustaw laser zielony/ablacyjny na 820 nm (długość fali ablacji), a laser czerwony na 1160 nm (wzbudzenie mCherry).
2. Korzystając z ruchomych zwierciadeł na ścieżce optycznej, wyrównaj zielone/ablacyjne i czerwone wiązki laserowe zarówno na wejściu, jak i na wyjściu głowicy skanującej.
   UWAGA: Zwiększa to skupienie wiązki laserowej i minimalizuje objętość ogniskowej dla wzbudzenia i ablacji.
3. Zmierz maksymalną moc lasera zielonego/ablacyjnego przy długości fali 820 nm pod obiektywem. W tym celu należy umieścić miernik mocy pod obiektywem, zamknąć czarną komorę, ustawić moc lasera zielonego/ablacyjnego na 100% i otworzyć żaluzje. Oblicz procent mocy lasera potrzebnej do osiągnięcia 300 mW.
4. Ustaw z powrotem laser zielony/ablacyjny na 920 nm (wzbudzenie GFP) i ustaw moc lasera na 7%. Ustaw moc czerwonego lasera na 15%.
5. Aktywuj detektory epi-PhotoMultiplier Tubes (PMT) dla linii zielonej i czerwonej; ustaw czułość PMT zielonej i czerwonej linii na 65.
6. Ustaw pole widzenia na 400 x 400 μm, rozdzielczość obrazu na 512 x 512 pikseli, a częstotliwość skanowania na 800 Hz.
7. Wybierz tryb obrazowania 3D Timelapse. Następnie utwórz folder i aktywuj Autozapis danych po każdym pobraniu.
8. Zmontuj komorę grzewczą i ustaw ją na 28 °C. Odczekaj co najmniej 10 minut, aż komora i obiektyw się nagrzeją.

4. Montaż zarodka

1. Pod stereomikroskopem fluorescencyjnym zidentyfikuj zarodki w 70% epibolii, które wykazują ekspresję GFP.
   UWAGA: Wybierz zarodki z jasnym sygnałem w mezodermie osiowej i bez fluorescencji tła, aby uzyskać lepszą jakość obrazowania.
2. Przenieść trzy do czterech wybranych zarodków do naczynia pokrytego agarozą (krok 1.3) za pomocą plastikowej pipety Pasteura i ostrożnie je zdechorionować za pomocą cienkich kleszczyków.
   UWAGA: Zarodki z odkoryzacją są bardzo delikatne i pękają w kontakcie z powietrzem lub plastikiem.
3. Wlej 1 ml 0,2% agarozy do 1x penicylina-streptomycyna EM w małej szklanej fiolce. Umieścić fiolkę w nagrzanym do 42 °C suchym podgrzewaczu blokowym.
   UWAGA: Następujące kroki należy wykonać szybko, aby umożliwić orientację zarodka przed zawiązaniem agarozy.
4. Przenieść zdekorionowany zarodek w fiolce z 0,2% szkła agarozowego za pomocą pipety ze szkła polerowanego ogniowo. Uważaj, aby nie dodawać zbyt dużo EM do agarozy, aby uniknąć jej rozcieńczenia. Wyrzuć pozostały EM z pipety i odessaj zarodek wraz z wystarczającą ilością agarozy, aby pokryć szkiełko naczynia ze szklanym dnem, zanim zarodek wypadnie z pipety.
5. Wydmuchaj agarozę i zarodek na szklane szkiełko naczynia. Uważaj, aby zarodek nie dotykał powietrza ani plastikowej strony naczynia. Następnie napełnij komorę wokół szkiełka agarozą.
6. Użyj rzęsy, aby ustawić zarodek tak, aby docelowy obszar znajdował się na górze (Rysunek 1B).
   UWAGA: Podczas orientowania zarodków należy uważać, aby dotykać tylko blastodermy, a nie bardzo delikatnego żółtka. Agaroza zastygnie w około 1 minutę, w zależności od temperatury pokojowej.
7. Odczekaj ~5 minut, aż agaroza całkowicie stwardnieje, a następnie dodaj kilka kropli penicyliny-streptomycyny EM.

5. Lokalizacja zarodka i obrazowanie przed ablacją

1. Umieść naczynie ze szklanym dnem pod obiektywem w podgrzewanej komorze. Zanurz obiektyw w penicylinie-streptomycynie EM i zamknij podgrzewaną komorę.
2. Przesuń suwak, aby ustawić ścieżkę światła na okulary. Następnie, za pomocą okularów, lamp fluorescencyjnych i kontroli sceny, znajdź zarodek i ustaw ostrość na powierzchni zarodka.
3. Wyłącz lampę fluorescencyjną, ustaw ścieżkę światła na PMT i zamknij czarną komorę.
   UWAGA: Uważaj, aby wyłączyć wszystkie źródła światła w czarnej komorze, ponieważ może to spowodować uszkodzenie PMT.
4. Rozpocznij obrazowanie na żywo i zlokalizuj mezodermę osiową. Dostosuj moc lasera zielonego/ablacyjnego i czerwonego, aby uzyskać dobry sygnał (tj. od 1 000 do 20 000 fotonów na piksel dla obszarów ekspresji GFP). Użyj czerwonego kanału, aby przesunąć etap na sam szczyt zarodka i ustaw tę pozycję jako Z = 0.
5. Wybierz krok czasowy 1 min i krok Z 2 μm. Przebieg Z o wielkości 110 μm jest wystarczający do pokrycia całego pola i jest uzyskiwany w czasie krótszym niż 1 minuta przy tych ustawieniach. Umieść pierwszy plasterek 15 μm powyżej mezodermy osiowej (w bardziej powierzchownej ektodermie).
   UWAGA: Polster porusza się wzdłuż zakrzywionej linii, tak że dolny wycinek stosu Z powinien być ustawiony o 30 μm głębiej niż najgłębsza pozycja polstera, aby dostosować się do jego ruchu podczas obrazowania poklatkowego (Rysunek 1E).
6. Nagraj 10-15 minut filmu przed ablacją.

Rysunek 1: Pomyślny wynik ablacji laserowych. (A) Schemat zarodka gastrulatującego przy 70% epibolii w widoku grzbietowym; pAM: mezoderma tylna osiowa; strzałka wyznacza kierunek migracji polstera; kwadrat oznacza typowe pole widzenia dla ablacji w polsterze. (B) Schemat montowania zarodków w celu odcięcia polstera. Widok z boku. Zarodek jest montowany w taki sposób, aby płaszczyzna polstera była prostopadła do osi optycznej. (C) przeżywalność i (D) morfologia zarodków kontrolnych i poddanych ablacji w 24 godzinach po zapłodnieniu. Podziałka skali wynosi 300 μm. (E) Sekwencja czasowa z ablacji laserowej w polsterze zarodka Tg(gsc:GFP) wykazującego ekspresję histonu2B-mCherry. Widoki tylko z kanałem zielonym są projekcjami maksymalnymi. Zbliżenie pokazuje obszar po ablacji, w którym znajdują się szczątki komórek. Widoki z kanałami zielonym i czerwonym (wyświetlanym jako magenta) to wycinki XY i XZ przed i po ablacji (zielona błyskawica reprezentuje ablację). Warstwy XZ pokazują, że leżące nad nimi tkanki (jądra magenta bez ekspresji GFP) nie zostały naruszone przez ablację leżących poniżej struktur. Żółte przerywane pole odpowiada zwrotowi z inwestycji wybranemu do zabiegu ablacji laserowej. Podziałka skali wynosi 50 μm w dużych widokach i 25 μm w zbliżeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Lokalizacja celu i ablacja laserowa

1. Zlokalizuj kontur polstera na obrazowaniu na żywo i za pomocą narzędzia Electro-Optic Modulator Region of Interest (EOM ROI) narysuj prostokąt o rozmiarze 20 pikseli (15 μm), który rozciąga się na szerokość polstera. Umieść ten prostokąt w środku polstera (Rysunek 1E).
2. Zwróć uwagę na położenie osiowe najwyższej i najniższej płaszczyzny zawierającej komórki polstera. Ablacje będą wykonywane co 10 μm pomiędzy tymi dwiema płaszczyznami. Uważaj, aby ROI nie zachodziło na komórkę żółtka na żadnej z tych płaszczyzn.
3. Umieść stół montażowy w najniższej pozycji Z interwału. Ablacje muszą być wykonywane od dołu do góry, ponieważ zanieczyszczenia pochłaniają światło.
4. Ustaw długość fali lasera zielonego/ablacyjnego na 820 nm i ustaw procent mocy, aby uzyskać moc wyjściową 300 mW (krok 3.3).
5. Ustaw częstotliwość obrazowania na 200 Hz.
6. Ustaw zielone obrazowanie laserowe / ablacyjne EOM na 0 i wybierz tryb ROI-Treat.
7. Włącz EOM i ustaw leczenie tak, aby rozpoczęło się natychmiast (po 0 klatce).
8. Ustaw tryb obrazowania na Timelapse i wyłącz autozapis.
9. Ustaw krok czasowy na tryb szybki.
10. Ustaw liczbę ramek zabiegowych i liczbę ramek na wartość odpowiadającą docelowej głębokości (Tabela 1).

pkt. do pkt. pkt. pkt. do pkt. pkt. pkt. pkt. Rozdział pkt. Rozdział pkt. pkt. pkt. do pkt.

Głębokość (μm)	Ramki zabiegowe
-30	1
-35	1-2
-40	1-2
-45	cyfra arabska
-50	2-3
-55	3
-60	3-4
-65	4
-70	4
-75	4-5
-80	4-5
-85	5
-90	5
-95	5-6
-100	6
-105	6

Tabela 1: Sugerowana liczba ramek do zabiegu laserowego w funkcji docelowej głębokości komórki w zarodku (0 oznacza powierzchnię zarodka).

11. Rozpocznij obrazowanie. Akwizycja jest, gdy migawka do PMT zamyka się podczas leczenia EOM.
12. Przejście w górę stołu montażowego do następnej pozycji Z na liście (krok 6.2).
13. Powtarzaj kroki od 6.10 do 6.12, aż dojdziesz do górnej części polstera.

7. Weryfikacja i obrazowanie po ablacji

1. Ustaw laser zielony/ablacyjny na 920 nm i 5% mocy. Ustaw EOM obrazowania laserem zielonym/ablacyjnym na 100 i wybierz tryb Fullfield.
2. Ustaw częstotliwość obrazowania na 800 Hz. Wyłącz EOM.
3. Przejrzyj cały stos w trybie na żywo, aby sprawdzić, czy każdy samolot został ablowany. Jeśli tak nie jest, wróć do kroku 6.2.
   UWAGA: Ablacja czasami wywołuje pionowe przesunięcie sąsiednich tkanek, tak że może być konieczne ponowne zdefiniowanie stosu Z.
4. Ustaw tryb obrazowania na 3D Timelapse i ponownie aktywuj autozapis. Nagraj 40-60 minut filmu po ablacji.
5. Sprawdź na filmie po ablacji, czy docelowe komórki zostały skutecznie poddane ablacji. Odzyskiwanie fluorescencji, czyli komórki celowane zajmujące przestrzeń i uniemożliwiające przemieszczanie się komórek podążających, wskazują, że docelowe komórki zostały tylko wybielone, a nie poddane ablacji (Rysunek 1E i Rysunek 2A).

Rysunek 2: Negatywne wyniki ablacji laserowej. (A) Typowe przykłady potencjalnych niepowodzeń w ablacji laserowej. Duże widoki XY to rzuty maksymalne, widok XZ to przekrój zrekonstruowany. Obszar poddany zabiegowi laserowemu znajduje się pomiędzy dwoma białymi grotami strzałek. Trzy płaszczyzny ogniskowej są podświetlone w zrekonstruowanej sekcji i wyświetlane po prawej stronie. Odpowiadają one trzem różnym rodzajom awarii. Płaszczyzna 1 pokazuje, że komórki powyżej polstera zostały poddane ablacji. Można to zidentyfikować po obecności szczątków autofluorescencyjnych na tej płaszczyźnie ogniskowej (patrz zbliżenie) nad polsterem (patrz położenie płaszczyzny 1 na zrekonstruowanym przekroju). Wynika to prawdopodobnie z błędnej definicji regionu, który ma zostać poddany ablacji. Płaszczyzna 2 pokazuje komórki, które zostały wybielone, ale nie zostały poddane ablacji. Można je zidentyfikować, ponieważ sygnał o niskiej fluorescencji nadal ujawnia nienaruszone kontury komórek (patrz zbliżenie). Płaszczyzna 3 pokazuje nienaruszone komórki, które prawie nie zostały wybielone przez leczenie laserowe. Może to wynikać z nieprawidłowej definicji regionu, który ma zostać poddany ablacji, lub ze złego leczenia. W sytuacjach przedstawionych na płaszczyznach 2 i 3 możliwe jest ponowne zastosowanie zabiegu ablacji do komórek docelowych, które nie uległy ablacji. Podziałka wynosi 50 μm w dużych widokach i 20 μm w zbliżeniach. (B) Typowy przykład pęcherzyków (oznaczonych białymi gwiazdkami) formowanych przez kawitację z powodu zbyt intensywnego leczenia laserowego. Takie pęcherzyki nie są ograniczone do płaszczyzny Z, czasami nawet rozciągają się na całą wysokość polstera, deformując sąsiednie tkanki. Podziałka wynosi 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

8. Analiza danych

1. Otwórz serię poklatkową za pomocą oprogramowania do analizy obrazu i ustaw prawidłowy rozmiar pikseli.
2. W funkcji Spot ustaw rozmiar obiektu na 10 μm, ponieważ jest to średni rozmiar jądra podczas gastrulacji. Następnie uruchom funkcję Spot, aby wykryć i śledzić jądra.
   UWAGA: Detekcję można nieznacznie poprawić, biorąc pod uwagę niższą rozdzielczość osiową, dopasowując elipsoidalny kształt o długości 12 μm wzdłuż osi Z.
3. Użyj filtrów, aby usunąć wyniki fałszywie dodatnie. W linii Tg(Gsc:GFP) komórki z osi embrionalnej i niektóre komórki endodermalne są oznaczone kolorem zielonym. W związku z tym filtrowanie według intensywności koloru zielonego pozwala na szybkie wybranie tych komórek (Rysunek 3A).
4. Ustaw maksymalną odległość między kolejnymi punktami na wartość zgodną z szybkością komórek.
   UWAGA: Uważaj, aby wziąć pod uwagę odstęp czasu między dwiema klatkami. Komórki Polster migrują z prędkością 2,8 ± 0,8 μm/min. W związku z tym pozostawienie 4 μm maksymalnego przemieszczenia w kroku czasowym 1 minuty usuwa większość artefaktów.
5. Dopuszczanie przerw w jednym lub dwóch punktach czasowych zapewnia dłuższe ciągłe ścieżki, ale może powodować błędy śledzenia. Jeśli jądro nie zostanie prawidłowo wykryte w jednym punkcie, rozważ ponowne uruchomienie wykrywania punktowego z innymi parametrami/filtrami.
6. Sprawdź wzrokowo ścieżki i w razie potrzeby je skoryguj.
7. Wyeksportuj wyniki jako plik .xlsx. Przetwarzaj plik za pomocą opublikowanych procedur arkusza kalkulacyjnego²⁴ (Rysunek 3B) i niestandardowych procedur w oprogramowaniu do analizy danych (dostępne na żądanie).

Rysunek 3: Izolacja przedniej połowy polsteru wpływa na kierunkowość komórki. (A) 3D rekonstruuje zarodek Tg(gsc:GFP) wykazujący ekspresję Histone2B-mCherry (wyświetlany w kolorze magenta), przed i po ablacji laserowej, przecinając polster w jego środku. Jądra należące do przedniej połowy polstera są oznaczone karmazynową kropką i śledzone w czasie przed i po ablacji (patrz film S1). Podziałka skali wynosi 50 μm. (B) Jako miarę trwałości migracji, kierunek autokorelacji komórek należących do przedniej części polstera przed i po ablacji. Komórki wykazują ciągły ruch przed ablacją, który drastycznie zmniejsza się po ablacji, co wskazuje na utratę migracji zorientowanej na kolektyw. Autokorelację kierunkową mierzono również na komórkach tworzących przednią połowę zarodka bez ablacji, jako kontrolę. Obwiedni wykresu wskazują błąd standardowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

Aby przeciąć polster w jego środku, zarodek Tg(gsc:GFP), któremu wstrzyknięto mRNA Histone2B-mCherry, został zamontowany w fazie 70% epibolii, jak opisano w kroku 4. Polster został zidentyfikowany za pomocą ekspresji GFP, a zarodek został zamontowany tak, aby płaszczyzna polstera była prostopadła do osi optycznej (Rysunek 1B). Odchylenie zarodka od tej pozycji skomplikuje procedurę. Światło będzie musiało przejść przez więcej tkanek, aby dotrzeć do płaszczyzn ablacji, a płaszczyzny...

Discussion

W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje optykę nieliniową do wykonywania głębokich i przestrzennie dobrze zdefiniowanych ablacji objętościowych. Najważniejszym krokiem protokołu jest znalezienie warunków leczenia, które zapewniają wystarczającą ilość energii, aby umożliwić ablację, ale nie za dużo energii, aby uniknąć nadmiernych zanieczyszczeń lub kawitacji. Ilość energii dostarczanej w miejscu docelowym zależy głównie od: (1) mocy wyjściowej lasera, (2) jakości ustawienia lasera, (3) charakteru tkanki, prz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
25-krotny obiektyw do zanurzenia w wodzie	Olympus	XLPLN25XWMP2
Agaroza	PanReac AppliChem	A8963,0500
Oprogramowanie do analizy danych: Matlab	Math Works
Modulator elektrooptyczny (EOM)	ConOptics	350-80LA
		pożywki zarodkowej (EM)	Westerfield, M. Książka o danio pręgowanym. Przewodnik po laboratoryjnym wykorzystaniu danio pręgowanego (Danio rerio), wydanie 5. University of Oregon Press, Eugene (książka). (2000).
Komora środowiskowa	Okolab	H201-T-UNIT-BL
Sterownik EOM	ConOptics	302RM
Źródło fluorescencji	Lumencor	SOLA
Naczynia ze szklanym dnem	MatTek	P35G-0-10-C
Kapilary szklane	Aparat Harvard	300085	Średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,58  mm
Pipety szklane	Volac	D810	Końcówka powinna być polerowana ogniowo
Zielony/laser ablacyjny	Spectra Physics	Mai Tai HP DeepSee
Histone2B-mCherry mRNA			Syntetyzowany z plazmidu pCS2-H2B-mCherry (Dumortier& al. 2012)
Oprogramowanie do analizy obrazu: IMARIS	Bitplane
ImSpector oprogramowanie	Abberior Zespół
Instrumenty Forma wtryskowa	Narzędzia adaptacyjne	I-34
Końcówki do mikroładowarek	Eppendorf	5242956003
Mikromanipulator	Narishige	MN-151
Ściągacz do mikropipet	Sutter	P-1000
mMESSAGE mMACHINE SP6 Zestaw do transkrypcji	Invitrogen	AM1340
Penicylina-Streptomycyna	Thermofisher	15140-122	10 000 jednostek penicyliny i 10 mgstreptomycyny na ml
Probówka fotopowielacza (PMT)	Hammamatsu	H7422-40
PicoPump (wtryskiwacz powietrza)	World Precision Instrument	PV820
Czerwony laser	Spectra Physics	OPO/Insight DeepSee
Woda wolna od RNA do wstrzykiwań	Sigma	W3500
: Excel	Microsoft
Stereomicroscope	Nikon	SMZ18
Tg(gsc:GFP) linia			pręgowanego Doitsidou, M. i wsp. Wskazówki dotyczące pierwotnej migracji komórek rozrodczych przez chemokinę SDF-1. Komórka. 111 (5), 647– 59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002).
Mikroskop TriM Scope II	La Vision Biotech