Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Głębokie i przestrzennie kontrolowane ablacje objętościowe przy użyciu mikroskopu dwufotonowego w danio pręgowanym

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62815

⸱

15 lipca 2021

 ,  , 
1Laboratory for Optics and Biosciences, CNRS UMR7645, INSERM U1182, Institut Polytechnique de Paris

W tym artykule

Podsumowanie

Rozwój embrionalny wymaga koordynacji ruchu komórek na dużą skalę. Ablacja laserowa za pośrednictwem wzbudzenia dwufotonowego umożliwia przestrzennie kontrolowaną 3-wymiarową ablację dużych grup głębokich komórek. Ponadto technika ta może badać reakcję kolektywnie migrujących komórek in vivo na zakłócenia w ich środowisku mechanicznym.

Streszczenie

Morfogeneza obejmuje wiele ruchów komórek w celu zorganizowania komórek w tkanki i organy. Dla prawidłowego rozwoju wszystkie te ruchy muszą być ściśle skoordynowane, a coraz więcej dowodów sugeruje, że osiąga się to, przynajmniej częściowo, poprzez interakcje mechaniczne. Zbadanie tego na zarodku wymaga bezpośrednich zaburzeń fizycznych. Ablacje laserowe są coraz częściej stosowaną opcją, która pozwala na złagodzenie ograniczeń mechanicznych lub fizyczną izolację dwóch populacji komórek od siebie. Jednak wiele ablacji wykonuje się za pomocą lasera ultrafioletowego (UV), który zapewnia ograniczoną rozdzielczość osiową i penetrację tkanki. Opisano tutaj metodę ablacji głębokich, znaczących i przestrzennie dobrze zdefiniowanych objętości za pomocą mikroskopu dwufotonowego. Ablacje wykazano w transgenicznej linii danio pręgowanego, która wykazuje ekspresję białka zielonej fluorescencji w osiowej mezendodermie i jest stosowana do przecięcia osiowej mezendodermy bez wpływu na leżącą nad nią ektodermę lub leżącą poniżej komórkę żółtka. Zachowanie komórek jest monitorowane za pomocą obrazowania na żywo przed i po ablacji. Protokół ablacji może być stosowany na różnych etapach rozwoju, na dowolnym typie komórki lub tkance, w skalach od kilku mikronów do ponad stu mikronów.

Wprowadzenie

Interakcje komórka-komórka odgrywają istotną rolę w rozwoju. Komórki dostarczają sygnałów, które mogą dostrzec ich bezpośredni sąsiedzi lub komórki znajdujące się dalej, wpływając w ten sposób na ich los i/lub zachowanie. Wiele z tych sygnałów ma charakter chemiczny. Na przykład, w dobrze scharakteryzowanych zdarzeniach indukcji, jedna grupa komórek wytwarza dyfuzyjne cząsteczki wpływające na los innej populacji komórek1. Inne sygnały są jednak mechaniczne; Komórki wywierają siły i ograniczenia na swoich sąsiadów, które sąsiedzi dostrzegają i na które reagują2.

Jednym ze sposobów badania znaczenia tych interakcji komórka-komórka in vivo jest eliminacja niektórych komórek i obserwacja ich dalszego rozwoju. Niestety, dostępne techniki usuwania lub niszczenia komórek są ograniczone. Komórki można usunąć chirurgicznie3,4, za pomocą igieł lub małych drutów, ale takie zabiegi są inwazyjne, mało precyzyjne i zwykle wykonywane pod mikroskopem stereoskopowym, co uniemożliwia natychmiastowe obrazowanie pod mikroskopem. Co więcej, celowanie w głębokie komórki oznacza przebijanie w leżących nad nimi tkankach, powodując niepożądane zakłócenia. Genetycznie kodowane fotosensybilizatory, takie jak KillerRed, zostały użyte do wywołania śmierci komórki poprzez oświetlenie światłem5. Fotouczulacze to chromofory, które pod wpływem promieniowania świetlnego wytwarzają reaktywne formy tlenu. Ich głównym ograniczeniem jest to, że wymagają długiego oświetlenia światłem (około 15 minut), co może być trudne do osiągnięcia, jeśli komórki się poruszają, oraz że wywołują śmierć komórki poprzez apoptozę, która nie jest natychmiastowa.

Wreszcie, w ciągu ostatnich 15 lat opracowano i szeroko stosowano ablacje laserowe6,7,8,9,10,11,12. Wiązka lasera jest skupiana na docelowej komórce/tkance. Indukuje jego ablację poprzez ogrzewanie, fotoablację lub ablację indukowaną plazmą; Związany z tym proces zależy od gęstości mocy i czasu ekspozycji13. Większość protokołów ablacji wykorzystuje lasery UV ze względu na ich wysoką energię. Jednak światło UV jest zarówno pochłaniane, jak i rozpraszane przez tkanki biologiczne. Tak więc celowanie w głębokie komórki wymaga dużej mocy lasera, który następnie indukuje uszkodzenia w bardziej powierzchownych, poza płaszczyzną tkankach. Ogranicza to stosowanie laserów UV do struktur powierzchniowych i tłumaczy ich stosunkowo niską rozdzielczość osiową. Optyka nieliniowa (tzw. mikroskopia dwufotonowa) wykorzystuje nieliniowe właściwości światła do wzbudzenia fluoroforu z dwoma fotonami o około połowie energii w domenie podczerwieni. W przypadku ablacji ma to trzy główne zalety. Po pierwsze, światło podczerwone jest mniej rozproszone i mniej absorbowane niż światło UV przez tkanki biologiczne14, co pozwala dotrzeć do głębszych struktur bez zwiększania wymaganej mocy lasera. Po drugie, zastosowanie femtosekundowego lasera impulsowego zapewnia bardzo duże gęstości mocy, tworząc ablację poprzez indukcję plazmy, która w przeciwieństwie do ogrzewania nie dyfunduje przestrzennie15. Po trzecie, gęstość mocy indukująca powstawanie plazmy jest osiągana tylko w punkcie ogniskowym. Dzięki tym właściwościom dwufotonowe ablacje laserowe mogą być stosowane do precyzyjnego celowania w głębokie komórki bez wpływu na otaczające środowisko tkankowe.

Migracje zbiorowe są doskonałym przykładem procesów rozwojowych, w których interakcje komórka-komórka są fundamentalne. Migracje zbiorowe są definiowane jako migracje komórek, w których sąsiednie komórki wpływają na zachowanie jednej komórki16. Charakter tych interakcji (chemicznych lub mechanicznych) i sposób, w jaki wpływają one na migrację komórek, może się znacznie różnić i często nie jest w pełni zrozumiały. Zdolność do usuwania komórek i obserwowania, jak wpływa to na pozostałe, ma kluczowe znaczenie dla dalszego odkrywania tych zbiorowych procesów. Kilka lat temu ustaliliśmy — stosując metody chirurgiczne — że migracja polstera podczas gastrulacji danio pręgowanego jest zbiorową migracją17. Polster to grupa komórek, która stanowi pierwsze komórki internalizujące po grzbietowej stronie zarodka18. Komórki te, oznaczone na zielono w linii transgenicznej Tg(gsc:GFP), znajdują się głęboko w zarodku, poniżej kilku warstw komórek epiblastów. Podczas gastrulacji grupa ta prowadzi przedłużenie mezodermy osiowej, migrując od organizatora embrionalnego do bieguna zwierzęcego19,20,21,22,23 (Rysunek 1A). Ustaliliśmy, że komórki wymagają kontaktu z sąsiadami, aby ukierunkować swoją migrację w kierunku bieguna zwierzęcego. Jednak lepsze zrozumienie komórkowych i molekularnych podstaw tej zbiorowej migracji wymaga usunięcia niektórych komórek, aby zobaczyć, jak wpływa to na pozostałe. W związku z tym opracowaliśmy ablacje dużych i głębokich objętości przy użyciu zestawu mikroskopii dwufotonowej. Tutaj pokazujemy użycie tego protokołu do przecięcia polstera w jego środku i obserwujemy konsekwencje dla migracji komórek poprzez śledzenie jąder znakowanych Histone2B-mCherry.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace z wykorzystaniem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną nr 59 oraz Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche pod numerem akt APAFIS#15859-2018051710341011v3. Niektóre z opisanych poniżej etapów są specyficzne dla naszego sprzętu i oprogramowania, jednak można je łatwo dostosować do innego wyposażenia.

1. Przygotowanie do iniekcji

  1. Przygotować 75 mL 1% roztworu agarozy w Medium dla Zarodków (EM).
  2. Umieścić formę do wstrzykiwania w szalce Petriego o średnicy 90 mm i wlać około 50 mL agarozy, tyle, aby forma unosiła się na powierzchni. Pozostawić agarozę do zastygnięcia, a następnie wyjąć formę do wstrzykiwania.
  3. Przygotować szalkę pokrytą agarozą, wlewając 1 mL agarozy do szalki Petriego o średnicy 30 mm.
  4. Przygotować 4 µL roztworu mRNA Histone2B-mCherry o stężeniu 30 ng/µL poprzez rozcieńczenie roztworu zapasowego w wodzie wolnej od RNaz i przechowywać na lodzie.
    UWAGA: Podczas pracy z mRNA należy używać rękawiczek, aby uniknąć degradacji przez RNazy.
  5. Wyciągnąć igłę do wstrzykiwania z kapilary za pomocą mikro-wyciągarki do pipet.

2. Przygotowanie embrionów

  1. Po złożeniu przez ryby ikry, zebrać ją, wypłukać i przenieść do szalki Petriego o średnicy 90 mm z EM. Umieścić zarodki w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C.
  2. Odczekać 20 min, aż pojawi się pierwsza komórka.
  3. Przenieść 30 zarodków na płytkę do iniekcji wypełnioną EM. Ułożyć zarodki w rowkach za pomocą lekko stępionych pęset i zorientować je biegunem zwierzęcym do góry.
  4. Za pomocą końcówki microloadera napełnić igłę do iniekcji 2 µL roztworu mRNA. Włożyć igłę do uchwytu kapilarnego umieszczonego w mikromanipulatorze połączonym rurkami z politetrafluoretylenu (PTFE) z iniektorem powietrznym.
  5. Pod stereomikroskopem ostrożnie odłamać czubek igły.
  6. Wstrzyknąć roztwór mRNA do zarodków w stadium 1-komórkowym, wprowadzając igłę do wnętrza komórki.
    UWAGA: Wstrzykiwana objętość wynosi około jednej trzeciej objętości komórki.
  7. Umieścić iniektowane zarodki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C.

3. Przygotowanie mikroskopu dwufotonowego

UWAGA: W tym protokole wykorzystywane są dwa lasery. Jeden służy do obrazowania GFP (przy 920 nm) i przeprowadzania ablacji (przy 820 nm) i będzie określany jako laser zielony/do ablacji. Drugi jest używany przy 1160 nm do obrazowania mCherry i będzie określany jako laser czerwony.

  1. Ustaw zielony laser/laser do ablacji na 820 nm (długość fali ablacji), a czerwony laser na 1160 nm (wzbudzenie mCherry).
  2. Za pomocą ruchomych luster na drodze optycznej wyrównaj wiązki zielonego lasera/lasera do ablacji oraz czerwonego lasera zarówno na wejściu, jak i na wyjściu z głowicy skanującej.
    UWAGA: Pozwala to na zwiększenie ogniskowania wiązki lasera i zminimalizowanie objętości ogniskowej dla wzbudzenia i ablacji.
  3. Zmierz maksymalną moc zielonego lasera/lasera do ablacji przy 820 nm pod obiektywem. W tym celu umieść miernik mocy pod obiektywem, zamknij czarną komorę, ustaw moc zielonego lasera/lasera do ablacji na 100% i otwórz migawki. Oblicz procent mocy lasera niezbędny do osiągnięcia 300 mW.
  4. Przywróć ustawienie zielonego lasera/lasera do ablacji na 920 nm (wzbudzenie GFP) i ustaw moc lasera na 7%. Ustaw moc czerwonego lasera na 15%.
  5. Aktywuj detektory epi-fotopowielacze (PMT) dla linii zielonej i czerwonej; ustaw czułość PMT dla linii zielonej i czerwonej na 65.
  6. Ustaw pole widzenia na 400 x 400 µm, rozdzielczość obrazu na 512 x 512 pikseli oraz częstotliwość skanowania na 800 Hz.
  7. Wybierz tryb 3D Timelapse Imaging. Następnie utwórz folder i aktywuj funkcję Autosave dla danych po każdym pomiarze.
  8. Zmontuj komorę grzewczą i ustaw ją na 28 °C. Odczekaj co najmniej 10 min, aby komora i obiektyw się rozgrzały.

4. Montowanie zarodka

  1. Pod fluorescencyjnym stereomikroskopem należy zidentyfikować embriony w fazie 70% epibolii, które wykazują ekspresję GFP.
    UWAGA: Aby uzyskać lepszą jakość obrazowania, należy wybierać embriony z silnym sygnałem w mezodermie osiowej i bez fluorescencji tła.
  2. Przenieść od trzech do czterech wybranych embrionów do naczynia powleczonego agarozą (krok 1.3) za pomocą plastikowej pipety Pasteura i ostrożnie usunąć błonę chorionową przy użyciu precyzyjnej pęsety.
    UWAGA: Embriony po usunięciu błony chorionowej są bardzo delikatne i mogą pęknąć w kontakcie z powietrzem lub plastikiem.
  3. Wlać 1 mL 0,2% agarozy w 1x medium EM z penicyliną i streptomycyną do małej szklanej fiolki. Umieścić fiolkę w podgrzanym do 42 °C suchym bloku grzewczym.
    UWAGA: Następne kroki muszą być wykonane szybko, aby umożliwić orientację embrionu przed zastygnięciem agarozy.
  4. Przenieść embrion pozbawiony błony chorionowej do szklanej fiolki z 0,2% agarozą, używając wypalanej szklanej pipety. Należy uważać, aby nie dodać zbyt dużo EM do agarozy, aby uniknąć jej rozcieńczenia. Odrzucić pozostałe EM z pipety i wciągnąć embrion wraz z ilością agarozy wystarczającą do pokrycia szkła naczynia z dna szklanego, zanim embrion wypadnie z pipety.
  5. Wylać agarozę i embrion na szklaną powierzchnię naczynia. Należy uważać, aby embrion nie dotknął powietrza ani plastikowej ścianki naczynia. Następnie wypełnić komorę wokół szklanej powierzchni agarozą.
  6. Użyć włosia rzęsy, aby zorientować embrion tak, by docelowy region znajdował się na górze (Rysunek 1B).
    UWAGA: Podczas orientowania embrionów należy uważać, aby dotykać tylko blastodermy, a nie bardzo delikatnego żółtka. Agaroza zastygnie w ciągu około 1 min, w zależności od temperatury pokojowej.
  7. Odczekać ok. 5 min do całkowitego zastygnięcia agarozy, a następnie dodać kilka kropli medium EM z penicyliną i streptomycyną.

5. Lokalizacja zarodka i obrazowanie przed ablacją

  1. Umieść szalkę z przeszklonym dnem pod obiektywem w komorze grzewczej. Zanurz obiektyw w medium EM z penicyliną i streptomycyną, a następnie zamknij komorę grzewczą.
  2. Przesuń suwak, aby skierować drogę światła do okularów. Następnie, korzystając z okularów, lamp fluorescencyjnych i sterowania stolikiem, zlokalizuj zarodek i ustaw ostrość na jego powierzchnię.
  3. Wyłącz lampę fluorescencyjną, ustaw drogę światła na PMT i zamknij czarną komorę.
    UWAGA: Należy upewnić się, że wszystkie źródła światła w czarnej komorze są wyłączone, ponieważ może to uszkodzić PMT.
  4. Rozpocznij obrazowanie na żywo i zlokalizuj mezodermę osiową. Dostosuj moc lasera zielonego/ablacyjnego oraz czerwonego, aby uzyskać dobry sygnał (tj. od 1 000 do 20 000 fotonów na piksel dla obszarów wykazujących ekspresję GFP). Użyj kanału czerwonego, aby przesunąć stolik na samą górę zarodka i ustaw tę pozycję jako Z = 0.
  5. Wybierz krok czasowy 1 min oraz krok Z wynoszący 2 µm. Zakres Z o długości 110 µm jest wystarczający, aby objąć cały polster i jest rejestrowany w czasie krótszym niż 1 min przy tych ustawieniach. Ustaw pierwszy przekrój 15 µm powyżej mezodermy osiowej (w bardziej powierzchownej ektodermie).
    ​UWAGA: Polster porusza się wzdłuż krzywej, dlatego dolny przekrój stosu Z powinien zostać ustawiony 30 µm głębiej niż najgłębsza pozycja polstera, aby uwzględnić jego ruch podczas obrazowania time-lapse (Rysunek 1E).
  6. Nagraj 10–15 min filmu przed ablacją.

Układ do ablacji zarodków zebrafish, dane o przeżywalności i obrazy mikroskopowe; badanie zarodków, analiza komórkowa
Rysunek 1Pomyślny wynik ablacji laserowej. (A) Schemat zarodka w fazie gastrulacji przy 70% epibolii w widoku grzbietowym; pAM: tylna mezoderma osiowa; czarna strzałka oznacza kierunek migracji polstera; czarny kwadrat wskazuje typowe pole widzenia dla ablacji w polsterze. (BSchemat montażu zarodka do przecinania poduszeczki (polster). Widok boczny. Zarodek został zamontowany w taki sposób, aby płaszczyzna poduszeczki była prostopadła do osi optycznej.C) przeżywalność i (D) morfologia embrionów kontrolnych i ablacyjnych 24 h po zapłodnieniu. Pasek skali wynosi 300 µm. (E) Sekwencja czasowa ablacji laserowej w polstrze a Tg(gsc:GFP) zarodek wykazujący ekspresję Histone2B-mCherry. Widoki z samym kanałem zielonym stanowią projekcje maksymalne. Powiększenie przedstawia obszar ablacji zawierający szczątki komórkowe. Widoki z kanałami zielonym i czerwonym (wyświetlonym jako magenta) to przekroje XY i XZ przed i po ablacji (zielony symbol błyskawicy oznacza ablację). Przekroje XZ pokazują, że tkanki położone powyżej (jądra w kolorze magenta bez ekspresji GFP) nie zostały dotknięte ablacją struktur pod nimi. Żółta przerywana ramka odpowiada ROI wybranemu do zabiegu ablacji laserowej. Pasek skali wynosi 50 µm w szerokich polach widzenia i 25 µm w zbliżeniu. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

6. Lokalizacja celu i ablacja laserowa

  1. Zlokalizuj kontur polstera w obrazowaniu na żywo i za pomocą narzędzia wyznaczania obszaru zainteresowania modulatora elektrooptycznego (EOM ROI) narysuj prostokąt o wymiarach 20 pikseli (15 µm), który obejmuje szerokość polstera. Umieść ten prostokąt na środku polstera (Rycina 1E).
  2. Zanotuj pozycję osiową najwyższych i najniższych płaszczyzn zawierających komórki polstera. Ablacje będą wykonywane co 10 µm pomiędzy tymi dwiema płaszczyznami. Upewnij się, że obszar ROI nie nakłada się na komórkę żółtka w żadnej z tych płaszczyzn.
  3. Ustaw stolik w najniższej pozycji Z w danym przedziale. Ablacje muszą być wykonywane od dołu do góry, ponieważ szczątki pochłaniają światło.
  4. Ustaw długość fali zielonego lasera do ablacji na 820 nm i ustaw Power Percentage w celu uzyskania mocy wyjściowej 300 mW (krok 3.3).
  5. Ustaw Imaging Frequency na 200 Hz.
  6. Ustaw EOM obrazowania zielonego lasera do ablacji na 0 i wybierz tryb ROI-Treat.
  7. Włącz EOM i ustaw rozpoczęcie zabiegu natychmiast (po 0 klatkach).
  8. Ustaw Imaging Mode na Timelapse i dezaktywuj funkcję Autosave.
  9. Ustaw Time Step w trybie Fast.
  10. Ustaw Number of Treatment Frames oraz Number of Frames na wartość odpowiadającą docelowej głębokości (Tabela 1).
Głębokość (µm)Ramy terapeutyczne
-301
-351-2
-401-2
-452
-502-3
-553
-603-4
-654
-704
-754-5
-804-5
-855
-905
-955-6
-1006
-1056

Tabela 1: Sugerowana liczba klatek naświetlania laserowego w zależności od docelowej głębokości komórek w embrionie (0 oznacza powierzchnię embrionu).

  1. Rozpocznij obrazowanie. Akwizycja jest czarna, ponieważ migawka PMT zamyka się podczas zabiegu EOM.
  2. Przesuń stolik w górę do kolejnej pozycji Z z listy (krok 6.2).
  3. Powtarzaj kroki od 6.10 do 6.12, aż do osiągnięcia górnej krawędzi polstra.

7. Weryfikacja i obrazowanie po ablacji

  1. Ustaw laser zielony/ablacyjny na 920 nm i moc 5%. Ustaw EOM obrazowania lasera zielonego/ablacyjnego na 100 i wybierz tryb Fullfield.
  2. Ustaw Imaging Frequency (częstotliwość obrazowania) na 800 Hz. Wyłącz EOM.
  3. Przejrzyj cały stos obrazów w trybie na żywo, aby sprawdzić, czy każda płaszczyzna została poddana ablacji. Jeśli tak nie jest, wróć do kroku 6.2.
    UWAGA: Ablacja czasami powoduje przesunięcie w pionie sąsiednich tkanek, w związku z czym konieczne może być ponowne zdefiniowanie stosu Z (Z-stack).
  4. Ustaw Imaging Mode (tryb obrazowania) na 3D Timelapse i ponownie aktywuj funkcję Autosave. Nagraj 40-60 min filmu po ablacji.
  5. Sprawdź w filmie po ablacji, czy docelowe komórki zostały skutecznie usunięte. Powrót fluorescencji lub obecność docelowych komórek zajmujących przestrzeń i blokujących przemieszczanie się komórek następczych wskazuje na to, że komórki docelowe zostały jedynie poddane fotobleachingowi, a nie ablacji (Ryc. 1E oraz Ryc. 2A).

Proces ablacji komórek; mikroskopia fluorescencyjna; organizacja komórek przed i po ablacji; układ eksperymentalny.
Rysunek 2: Negatywne wyniki ablacji laserowej. (A) Typowe przykłady potencjalnych niepowodzeń w ablacji laserowej. Duże widoki XY to projekcje maksymalne, widok XZ to przekrój zrekonstruowany. Obszar poddany działaniu lasera znajduje się pomiędzy dwoma białymi grotami strzałek. Na przekroju zrekonstruowanym zaznaczono trzy płaszczyzny ogniskowania, które wyświetlono po prawej stronie. Odpowiadają one trzem różnym rodzajom niepowodzeń. Płaszczyzna 1 pokazuje, że zablałowane zostały komórki powyżej polstera. Można to zidentyfikować po obecności autofluorescencyjnych szczątków na tej płaszczyźnie ogniskowania (patrz powiększenie) powyżej polstera (patrz pozycja płaszczyzny 1 na przekroju zrekonstruowanym). Prawdopodobnie wynika to z błędnego zdefiniowania obszaru do ablacji. Płaszczyzna 2 pokazuje komórki, które uległy wybieleniu, ale nie zostały zablownane. Można je zidentyfikować po tym, że niski sygnał fluorescencji nadal ujawnia nienaruszone kontury komórek (patrz powiększenie). Płaszczyzna 3 przedstawia nienaruszone komórki, które prawie nie uległy wybieleniu w wyniku zabiegu laserowego. Może to być wynikiem błędnego zdefiniowania obszaru do ablacji lub niewłaściwego przeprowadzenia zabiegu. W sytuacjach przedstawionych na płaszczyznach 2 i 3 możliwe jest ponowne zastosowanie ablacji do nieusuniętych komórek docelowych. Pasek skali wynosi 50 µm w widokach dużych i 20 µm w powiększeniach. (B) Typowy przykład pęcherzyków (oznaczonych białymi gwiazdkami) powstałych w wyniku kawitacji z powodu zbyt intensywnego zabiegu laserowego. Takie pęcherzyki nie ograniczają się do jednej płaszczyzny Z, czasem obejmując nawet pełną wysokość polstera, co deformuje sąsiednie tkanki. Pasek skali wynosi 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

8. Analiza danych

  1. Otwórz serię obrazów time-lapse w oprogramowaniu do analizy obrazu i ustaw odpowiednią wielkość piksela.
  2. W funkcji Spot ustaw parametr Object Size na 10 µm, ponieważ jest to średnia wielkość jądra podczas gastrulacji. Następnie uruchom funkcję Spot, aby wykryć i śledzić jądra.
    UWAGA: Detekcję można nieco poprawić, uwzględniając niższą rozdzielczość osiową i dopasowując kształt elipsoidalny o długości 12 µm wzdłuż osi Z.
  3. Użyj filtrów, aby usunąć wyniki fałszywie dodatnie. W linii Tg(Gsc:GFP) komórki osi embrionalnej oraz niektóre komórki endodermy są znakowane na zielono. W związku z tym filtrowanie według intensywności zielonego koloru pozwala na szybką selekcję tych komórek (Rycyna 3A).
  4. Ustaw maksymalną odległość między kolejnymi punktami na wartość zgodną z prędkością komórek.
    UWAGA: Należy wziąć pod uwagę odstęp czasowy między dwiema klatkami. Komórki Polstera migrują z prędkością 2,8 ± 0,8 µm/min. Zatem dopuszczenie maksymalnego przemieszczenia 4 µm dla kroku czasowego 1 min eliminuje większość artefaktów w ścieżkach.
  5. Dopuszczenie luk obejmujących jeden lub dwa punkty czasowe pozwala na uzyskanie dłuższych, ciągłych ścieżek, ale może wprowadzić błędy śledzenia. Jeśli jądro nie zostanie poprawnie wykryte w jednym punkcie czasowym, należy rozważyć ponowne uruchomienie detekcji spot z innymi parametrami/filtrami.
  6. Wizualnie sprawdź ścieżki i w razie potrzeby je skoryguj.
  7. Wyeksportuj wyniki do pliku .xlsx. Przetwórz plik, korzystając z opublikowanych procedur w arkuszu kalkulacyjnym24 (Rycyna 3B) oraz niestandardowych procedur w oprogramowaniu do analizy danych (dostępne na żądanie).

Eksperyment ablacji embrionu, wykres autokorelacji kierunku, obrazy z mikroskopii poklatkowej.
Rysunek 3: Izolacja przedniej połowy polstera wpływa na kierunkowość komórek. (A) Rekonstrukcje 3D embrionu Tg(gsc:GFP) wykazującego ekspresję Histone2B-mCherry (wyświetlone w kolorze purpurowym), przed i po ablacji laserowej przecinającej polster w jego środkowej części. Jądra komórkowe należące do przedniej połowy polstera zostały oznaczone purpurową kropką i śledzone w czasie przed i po ablacji (patrz Film S1). Pasek skali wynosi 50 µm. (B) Jako miara trwałości migracji, autokorelacja kierunku komórek należących do przedniej części polstera przed i po ablacji. Komórki wykazują ciągły ruch przed ablacją, który drastycznie spada po ablacji, co wskazuje na utratę kolektywnej migracji zorientowanej. Autokorelację kierunku zmierzono również w komórkach tworzących przednią połowę polstera embrionu niepoddanego ablacji, jako kontrolę. Obszar wykresu wskazuje błąd standardowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby przeciąć polster w jego środku, zarodek Tg(gsc:GFP), któremu wstrzyknięto mRNA Histone2B-mCherry, został zamontowany w fazie 70% epibolii, jak opisano w kroku 4. Polster został zidentyfikowany za pomocą ekspresji GFP, a zarodek został zamontowany tak, aby płaszczyzna polstera była prostopadła do osi optycznej (Rysunek 1B). Odchylenie zarodka od tej pozycji skomplikuje procedurę. Światło będzie musiało przejść przez więcej tkanek, aby dotrzeć do płaszczyzn ablacji, a płaszczyzny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje optykę nieliniową do wykonywania głębokich i przestrzennie dobrze zdefiniowanych ablacji objętościowych. Najważniejszym krokiem protokołu jest znalezienie warunków leczenia, które zapewniają wystarczającą ilość energii, aby umożliwić ablację, ale nie za dużo energii, aby uniknąć nadmiernych zanieczyszczeń lub kawitacji. Ilość energii dostarczanej w miejscu docelowym zależy głównie od: (1) mocy wyjściowej lasera, (2) jakości ustawienia lasera, (3) charakteru tkanki, prz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Emilie Menant za opiekę nad rybami, Polytechnique Bioimaging Facility, a w szczególności Pierre Mahou, za pomoc w obrazowaniu na żywo na ich sprzęcie, częściowo wspieranym przez Région Ile-de-France (interDIM) i Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029 Morphoscope2, ANR-10-INBS-04 France BioImaging). Prace te były wspierane przez granty ANR 15-CE13-0016-1, 18-CE13-0024, 20-CE13-0016 oraz program Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy o udzielenie dotacji nr 840201 w ramach działania "Maria Skłodowska-Curie", Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche oraz Centre National de la Recherche Scientifique.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
25-krotny obiektyw do zanurzenia w wodzieOlympusXLPLN25XWMP2
AgarozaPanReac AppliChemA8963,0500
Oprogramowanie do analizy danych: MatlabMath Works
Modulator elektrooptyczny (EOM)ConOptics350-80LA
pożywki zarodkowej (EM)Westerfield, M. Książka o danio pręgowanym. Przewodnik po laboratoryjnym wykorzystaniu danio pręgowanego (Danio rerio), wydanie 5. University of Oregon Press, Eugene (książka). (2000).
Komora środowiskowaOkolabH201-T-UNIT-BL
Sterownik EOMConOptics302RM
Źródło fluorescencjiLumencorSOLA
Naczynia ze szklanym dnemMatTekP35G-0-10-C
Kapilary szklaneAparat Harvard300085Średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,58  mm
Pipety szklaneVolacD810Końcówka powinna być polerowana ogniowo
Zielony/laser ablacyjnySpectra PhysicsMai Tai HP DeepSee
Histone2B-mCherry mRNASyntetyzowany z plazmidu pCS2-H2B-mCherry (Dumortier& al. 2012)
Oprogramowanie do analizy obrazu: IMARISBitplane
ImSpector oprogramowanieAbberior Zespół
Instrumenty Forma wtryskowaNarzędzia adaptacyjneI-34
Końcówki do mikroładowarekEppendorf5242956003
MikromanipulatorNarishigeMN-151
Ściągacz do mikropipetSutterP-1000
mMESSAGE mMACHINE SP6 Zestaw do transkrypcjiInvitrogenAM1340
Penicylina-StreptomycynaThermofisher15140-12210 000 jednostek penicyliny i 10 mgstreptomycyny na ml
Probówka fotopowielacza (PMT)HammamatsuH7422-40
PicoPump (wtryskiwacz powietrza)World Precision InstrumentPV820
Czerwony laserSpectra PhysicsOPO/Insight DeepSee
Woda wolna od RNA do wstrzykiwańSigmaW3500
: ExcelMicrosoft
StereomicroscopeNikonSMZ18
Tg(gsc:GFP) liniapręgowanego Doitsidou, M. i wsp. Wskazówki dotyczące pierwotnej migracji komórek rozrodczych przez chemokinę SDF-1. Komórka. 111 (5), 647– 59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002).
Mikroskop TriM Scope IILa Vision Biotech
Roztwór doRozwojowy Oprogramowanie arkusza kalkulacyjnego danio

Bibliografia

  1. Slack, J. M. W. Embryonic induction. Mechanisms of Development. 41 (2-3), 91-107 (1993).
  2. Fernandez-Sanchez, M. -E., Brunet, T., Röper, J. -C., Farge, E. Mechanotransduction's impact on animal development, evolution, and tumorigenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 373-397 (2015).
  3. Shih, J., Fraser, S. E. Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage. Development. 122 (4), 1313-1322 (1996).
  4. Selleck, M. A. J. Culture and microsurgical manipulation of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 51 (51), 1-21 (1996).
  5. Bulina, M. E., et al. A genetically encoded photosensitizer. Nature Biotechnology. 24 (1), 95-99 (2006).
  6. Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 107, 177-206 (2012).
  7. Colombelli, J., Grill, S. W., Stelzer, E. H. K. Ultraviolet diffraction limited nanosurgery of live biological tissues. Review of Scientific Instruments. 75 (2), 472-478 (2004).
  8. Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -P. UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1189, Clifton, N.J. 219-235 (2015).
  9. Behrndt, M., et al. Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation. Science. 338 (6104), 257-260 (2012).
  10. Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), (2020).
  11. Bonnet, I., et al. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface. 9 (75), 2614-2623 (2012).
  12. Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468 (7327), 1110-1115 (2010).
  13. Niemz, M. H. Laser-Tissue Interactions. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering, Second Edition - Four Volume Set. , Springer International Publishing. Cham. (2019).
  14. Smith, A. M., Mancini, M. C., Nie, S. Bioimaging: second window for in vivo imaging. Nature Nanotechnology. 4 (11), 710-711 (2009).
  15. Rauzi, M., Lenne, P. -F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 95, 93-144 (2011).
  16. Theveneau, E., David, N. B. Migrations cellulaires collectives. Medecine/Sciences. 30 (8-9), 751-757 (2014).
  17. Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 16945-16950 (2012).
  18. Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
  19. Montero, J. -A., Kilian, B., Chan, J., Bayliss, P. E., Heisenberg, C. -P. Phosphoinositide 3-kinase is required for process outgrowth and cell polarization of gastrulating mesendodermal cells. Current Biology. 13 (15), 1279-1289 (2003).
  20. Ulrich, F., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
  21. Kai, M., Heisenberg, C. -P., Tada, M. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate individual cell behaviours underlying the directed migration of prechordal plate progenitor cells during zebrafish gastrulation. Development. 135 (18), 3043-3051 (2008).
  22. Smutny, M., et al. Friction forces position the neural anlage. Nature Cell Biology. 19 (4), 306-317 (2017).
  23. Johansson, M., Giger, F. A., Fielding, T., Houart, C. Dkk1 controls cell-cell interaction through regulation of non-nuclear β-Catenin pools. Developmental Cell. 51 (6), 775-786 (2019).
  24. Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
  25. Grill, S. W., Howard, J., Schäffer, E., Stelzer, E. H. K., Hyman, A. A. The distribution of active force generators controls mitotic spindle position. Science. 301 (5632), New York, N.Y. 518-521 (2003).
  26. Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. -A. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental Cell. 15 (3), 470-477 (2008).
  27. Farhadifar, R., Röper, J. -C., Aigouy, B., Eaton, S., Jülicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
  28. Willier, B. H., Oppenheimer, J. M. Foundations of Experimental Embryology. , Prentice-Hall. Englewood Cliffs. (1964).
  29. Ashby, W. J., Zijlstra, A. Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (11), 1338-1350 (2012).
  30. Bosze, B., et al. Pcdh18a regulates endocytosis of E-cadherin during axial mesoderm development in zebrafish. Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 463-480 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ablacja laserowaablacja objętościowaobrazowanie na żywoaksjalny mezendodermmigracja komórek3D time lapseobrazowanie GFPperturbacja mechaniczna
Głębokie i przestrzennie kontrolowane ablacje objętościowe przy użyciu mikroskopu dwufotonowego w danio pręgowanym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.