Indukowana światłem ekspresja GFP w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu optogenetycznego systemu TAEL/C120

Jesselynn LaBelle; Stephanie Woo

doi:10.3791/62818

Method Article

Indukowana światłem ekspresja GFP w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu optogenetycznego systemu TAEL/C120

DOI:

10.3791/62818

⸱

August 19th, 2021

Jesselynn LaBelle¹ , Stephanie Woo¹

¹Department of Molecular Cell Biology, University of California

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetyka to potężne narzędzie o szerokim zastosowaniu. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób osiągnąć indukowaną światłem ekspresję genów w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu reagującego na niebieskie światło systemu TAEL/C120.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Indukowane systemy ekspresji genów są nieocenionym narzędziem do badania procesów biologicznych. Optogenetyczne systemy ekspresji mogą zapewnić precyzyjną kontrolę nad czasem, lokalizacją i amplitudą ekspresji genów przy użyciu światła jako czynnika indukującego. W tym protokole zastosowano optogenetyczny system ekspresji w celu osiągnięcia indukowanej światłem ekspresji genów w zarodkach danio pręgowanego. System ten opiera się na zmodyfikowanym czynniku transkrypcyjnym o nazwie TAEL, opartym na naturalnie występującym, aktywowanym światłem czynniku transkrypcyjnym z bakterii E. litoralis. Po oświetleniu niebieskim światłem TAEL dimeryzuje, wiąże się z pokrewnym elementem regulatorowym zwanym C120 i aktywuje transkrypcję. W protokole tym wykorzystuje się transgeniczne zarodki danio pręgowanego, które wykazują ekspresję czynnika transkrypcyjnego TAEL pod kontrolą wszechobecnego promotora ubb. W tym samym czasie element regulatorowy C120 napędza ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego (GFP). Wykorzystując prosty panel LED do dostarczania aktywującego niebieskie światło, indukcja ekspresji GFP może być po raz pierwszy wykryta po 30 minutach oświetlenia i osiąga szczyt ponad 130-krotnej indukcji po 3 godzinach obróbki światłem. Indukcję ekspresji można ocenić za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) oraz mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta jest wszechstronnym i łatwym w użyciu podejściem do optogenetycznej ekspresji genów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Indukowane systemy ekspresji genów pomagają kontrolować ilość, czas i miejsce ekspresji genów. Jednak osiągnięcie dokładnej kontroli przestrzennej i czasowej w organizmach wielokomórkowych było wyzwaniem. Kontrolę czasową najczęściej osiąga się poprzez dodanie związków małocząsteczkowych¹ lub aktywację promotorów szoku cieplnego². Mimo to oba podejścia są podatne na problemy z czasem, siłą indukcji i niezamierzonymi reakcjami na stres. Kontrolę przestrzenną uzyskuje się głównie za pomocą specyficznych dla tkanek promotorów³, ale takie podejście wymaga odpowiedniego promotora lub elementu regulator....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w Merced.

1. Krzyżowanie się danio pręgowanego i zbieranie zarodków

Utrzymuj oddzielne transgeniczne linie danio pręgowanego zawierające aktywator transkrypcji TAEL lub gen reporterowy kontrolowany przez C120, aby zminimalizować fałszywą aktywację.
Skrzyżuj 6-8 dorosłych ryb danio pręgowanego z każdej linii przy użyciu standardowych metod⁹, aby uzyskać podwójne transgeniczne zarodki, które zawierają zarówno składniki TAEL, jak i C120 (R....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na potrzeby tej demonstracji, linia reporterowa GFP reagująca na C120 (Tg(C120F:GFP)^ucm107)) została skrzyżowana z linią transgeniczną, która ekspresuje TAEL-N z promotora ubikwityny b (ubb) (Tg(ubb:TAEL-N)^ucm113)) w celu wytworzenia podwójnie transgenicznych zarodków zawierających oba elementy. 24 godziny po zapłodnieniu zarodki zostały wystawione na aktywację światła niebieskiego, pulsującego z częstotliwością 1 h włączone/1 h wyłączone. Indukcję ekspresji GFP o.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje zastosowanie optogenetycznego systemu TAEL/C120 w celu uzyskania ekspresji genów indukowanej światłem niebieskim. System ten składa się z aktywatora transkrypcji, TAEL, który dimeryzuje po oświetleniu niebieskim światłem i aktywuje transkrypcję interesującego genu za elementem regulatorowym C120. Indukowaną ekspresję reportera GFP można wykryć już po 30 minutach ekspozycji na światło, co sugeruje, że podejście to ma stosunkowo szybką i responsywną kinetykę.

Na poziom induk.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Stefanowi Maternie i członkom laboratoriów Woo i Materna za pomocne sugestie i komentarze na temat tego protokołu. Dziękujemy Annie Reade, Kevinowi Gardnerowi i Laurze Motta-Mena za cenne dyskusje i spostrzeżenia podczas opracowywania tego protokołu. Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health (NIH; R03 DK106358) oraz Komitetu Koordynacyjnego ds. Badań nad Rakiem Uniwersytetu Kalifornijskiego (CRN-20-636896) do S.W.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Internetowe narzędzie do ilustracji naukowych BioRender			https://biorender.com/
Kolorowa kamera cyfrowa CCD	Lumenara	755-107
Kompaktowa konsola miernika mocy i energii, cyfrowa 4-calowy wyświetlacz LCD	Thorlabs	PM100D
Filtr wzbudzenia, 545 nm	Olympus	ET545/25x
ilustrowany zestaw RNAspin Mini GE	Opieka zdrowotna	95017-491
Natychmiastowa sól morska oceaniczna	Instant Ocean	SS15-10
MARS AQUA Ściemnialne światło LED LED 165 W (niebiesko-białe)	Amazon	B017GWDF7E
Metyloceluloza	Sigma-Aldrich	M7140
NEARPOW Programowalny cyfrowy wyłącznik czasowy	Amazon	B01G6O28NA
PerfeCTa SYBR zielony szybki mix	Quantabio	101414-286
Oprogramowanie do przetwarzania obrazów Photoshop	do
Prism	GraphPad
qScript XLT cDNA SuperMix	Quantabio	10142-786
QuantStudio 3 System PCR w czasie rzeczywistym	Applied Biosystems	A28137
Mikroskop stereoskopowy	Olympus	SZX16
Trikaine (metanosulfonian etylu 3-aminobenzoesanu)	Sigma-Aldrich	E10521
X-Cite 120 Fluorescencyjne źródło światła LED	Excelitas	010-00326R	Wycofane. Został on zastąpiony przez X-Cite mini+

Oprogramowanie tworzenia wykresów i statystyk Adobe

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
Halloran, M. C., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Indukowana światłem ekspresja GFP w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu optogenetycznego systemu TAEL/C120

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles