Method Article

Indukowana światłem ekspresja GFP w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu optogenetycznego systemu TAEL/C120

DOI:

10.3791/62818

⸱

August 19th, 2021

 , 
1Department of Molecular Cell Biology, University of California

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetyka to potężne narzędzie o szerokim zastosowaniu. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób osiągnąć indukowaną światłem ekspresję genów w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu reagującego na niebieskie światło systemu TAEL/C120.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Indukowane systemy ekspresji genów są nieocenionym narzędziem do badania procesów biologicznych. Optogenetyczne systemy ekspresji mogą zapewnić precyzyjną kontrolę nad czasem, lokalizacją i amplitudą ekspresji genów przy użyciu światła jako czynnika indukującego. W tym protokole zastosowano optogenetyczny system ekspresji w celu osiągnięcia indukowanej światłem ekspresji genów w zarodkach danio pręgowanego. System ten opiera się na zmodyfikowanym czynniku transkrypcyjnym o nazwie TAEL, opartym na naturalnie występującym, aktywowanym światłem czynniku transkrypcyjnym z bakterii E. litoralis. Po oświetleniu niebieskim światłem TAEL dimeryzuje, wiąże się z pokrewnym elementem regulatorowym zwanym C120 i aktywuje transkrypcję. W protokole tym wykorzystuje się transgeniczne zarodki danio pręgowanego, które wykazują ekspresję czynnika transkrypcyjnego TAEL pod kontrolą wszechobecnego promotora ubb. W tym samym czasie element regulatorowy C120 napędza ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego (GFP). Wykorzystując prosty panel LED do dostarczania aktywującego niebieskie światło, indukcja ekspresji GFP może być po raz pierwszy wykryta po 30 minutach oświetlenia i osiąga szczyt ponad 130-krotnej indukcji po 3 godzinach obróbki światłem. Indukcję ekspresji można ocenić za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) oraz mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta jest wszechstronnym i łatwym w użyciu podejściem do optogenetycznej ekspresji genów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Indukowane systemy ekspresji genów pomagają kontrolować ilość, czas i miejsce ekspresji genów. Jednak osiągnięcie dokładnej kontroli przestrzennej i czasowej w organizmach wielokomórkowych było wyzwaniem. Kontrolę czasową najczęściej osiąga się poprzez dodanie związków małocząsteczkowych1 lub aktywację promotorów szoku cieplnego2. Mimo to oba podejścia są podatne na problemy z czasem, siłą indukcji i niezamierzonymi reakcjami na stres. Kontrolę przestrzenną uzyskuje się głównie za pomocą specyficznych dla tkanek promotorów3, ale takie podejście wymaga odpowiedniego promotora lub elementu regulatorowego, które nie zawsze są dostępne i nie sprzyja indukcji na poziomie podtkankowym.

W przeciwieństwie do takich konwencjonalnych metod, aktywowane światłem optogenetyczne aktywatory transkrypcyjne mają potencjał do dokładniejszej przestrzennej i czasowej kontroli ekspresji genów4. System TAEL/C120 reagujący na niebieskie światło został opracowany i zoptymalizowany do stosowania w embrionach danio pręgowanego5,6. System ten opiera się na endogennym czynniku transkrypcyjnym aktywowanym światłem z bakterii E. litoralis7,8. System TAEL/C120 składa się z aktywatora transkrypcji o nazwie TAEL, który zawiera domenę transaktywacyjną Kal-TA4, domenę LOV (wykrywanie światła-tlenu-napięcia) reagującą na niebieskie światło oraz domenę wiążącą DNA helisa-skręt-helisa (HTH)5. Po oświetleniu domeny LOV ulegają zmianie konformacyjnej, która umożliwia dwóm cząsteczkom TAEL dimeryzację, wiązanie się z promotorem C120 reagującym na TAEL i inicjowanie transkrypcji dalszego genu będącego przedmiotem zainteresowania5,8. System TAEL/C120 charakteryzuje się szybką i solidną indukcją przy minimalnej toksyczności i może być aktywowany przez kilka różnych metod dostarczania światła. Ostatnio wprowadzono ulepszenia do systemu TAEL/C120 poprzez dodanie sygnału lokalizacji jądrowej do TAEL (TAEL-N) oraz sprzężenie elementu regulatorowego C120 z podstawowym promotorem cFos (C120F) (Rysunek 1A). Te modyfikacje poprawiły poziom indukcji ponad 15-krotnie6.

W tym protokole, prosty panel LED jest używany do aktywacji systemu TAEL/C120 i wywołania wszechobecnej ekspresji genu reporterowego, GFP. Indukcję ekspresji można monitorować jakościowo, obserwując intensywność fluorescencji lub ilościowo, mierząc poziomy transkryptów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Protokół ten zademonstruje system TAEL/C120 jako wszechstronne, łatwe w użyciu narzędzie, które umożliwia solidną regulację ekspresji genów in vivo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w Merced.

1. Krzyżowanie się danio pręgowanego i zbieranie zarodków

  1. Utrzymuj oddzielne transgeniczne linie danio pręgowanego zawierające aktywator transkrypcji TAEL lub gen reporterowy kontrolowany przez C120, aby zminimalizować fałszywą aktywację.
  2. Skrzyżuj 6-8 dorosłych ryb danio pręgowanego z każdej linii przy użyciu standardowych metod9, aby uzyskać podwójne transgeniczne zarodki, które zawierają zarówno składniki TAEL, jak i C120 (Rysunek 1B).
    UWAGA: Alternatywnie, oba składniki mogą ulegać przejściowej ekspresji poprzez mikroiniekcję mRNA lub plazmidowego DNA przy użyciu standardowych metod10.
  3. Zebrać zarodki na szalkach Petriego zawierających wodę jajeczną (60 μg/ml soli morskiej Instant Ocean rozpuszczonej w wodzie destylowanej), z około 30 zarodkami na stan do przetestowania.
  4. Umieść naczynia w światłoszczelnym pudełku lub przykryj folią aluminiową, aby zminimalizować niezamierzoną aktywację przez światło otoczenia (patrz Tabela 1).

2. Globalna indukcja światła

  1. Użyj panelu LED o niebieskim świetle (465 nm), aby dostarczyć aktywujące niebieskie światło do kilku zarodków jednocześnie.
  2. Ustaw panel LED względem szalek Petriego zawierających zarodki tak, aby rzeczywista moc światła odbieranego przez zarodki wynosiła około 1,5 mW/cm2, mierzona za pomocą miernika mocy i energii światła (Rysunek 2A).
  3. Pulsuj światłem w odstępach 1 h wł./1 h wyłącz za pomocą przekaźnika czasowego, jeśli świeci dłużej niż 3 godziny, aby zmniejszyć ryzyko fotouszkodzenia aktywatora transkrypcji TAEL5,8.
    UWAGA: Dokładny czas świecenia może wymagać optymalizacji pod kątem określonych zastosowań. W niniejszym protokole podano przykłady czasu trwania oświetlenia wynoszącego 30 min, 1 h, 3 h i 6 h.
  4. Zdejmij pokrywki szalki Petriego, aby zminimalizować rozpraszanie światła w wyniku kondensacji.
  5. Umieścić szalki Petriego zawierające zarodki kontrolne w światłoszczelnym pudełku lub przykryć folią aluminiową do ciemnych kontroli.

3. Ilościowa ocena indukcji metodą qRT-PCR

  1. Usuń zarodki z oświetlenia po pożądanym czasie aktywacji.
  2. Wyodrębnij całkowite RNA z 30-50 aktywowanych światłem i 30-50 ciemnych zarodków za pomocą zestawu do izolacji RNA, postępując zgodnie z instrukcjami zestawu.
    1. Przenieś zarodki do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i usuń nadmiar wody z jaj. Dodaj bufor do lizy i homogenizuj zarodki plastikowym tłuczkiem.
    2. Przenieś lizat do kolumny dostarczonej przez zestaw i postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu. Natychmiast przejdź do kroku 3.3 lub przechowuj oczyszczony RNA w temperaturze od -20 °C do -80 °C.
  3. Użyj 1 μg całkowitego RNA do syntezy cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA zgodnie z instrukcjami zestawu.
    1. Weź cienkościenną probówkę PCR o pojemności 0,2 ml, dodaj 1 μg RNA do 4 μl 5 μl głównej mieszanki reakcji cDNA (zawierającej zoptymalizowany bufor, oligo-dT i losowe startery oraz dNTP), 1 μl 20 x roztworu odwrotnej transkryptazy i wodę wolną od nukleaz do całkowitej objętości 20 μl.
    2. Umieść probówkę w termocyklerze zaprogramowanym w następujący sposób: 22 °C przez 10 minut, 42 °C przez 30 minut, 85 °C przez 5 minut, a następnie trzymaj w temperaturze 4 °C. Natychmiast przejdź do kroku 3.4 lub przechowuj cDNA w temperaturze -20 °C.
  4. Przygotować reakcje qPCR zawierające mieszaninę główną zielonego enzymu SYBR, 5-krotnie rozcieńczony cDNA (etap 3.3) i 325 nM każdego startera dla GFP.
    UWAGA: Startery używane w tym protokole w następujący sposób. GFP do przodu: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; Odwrócony GFP: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a naprzód 5'-CACGGTGACACAACATGCTGGAG-3'; ef1a rewers: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3').
  5. Przeprowadzaj reakcje qPCR w maszynie do PCR w czasie rzeczywistym.
    UWAGA: Program PCR: początkowa aktywacja w temperaturze 95 °C przez 10 minut, a następnie 40 cykli po 30 s w temperaturze 95 °C, 30 s w temperaturze 60 °C i 1 minuta w temperaturze 72 °C.
  6. Po zakończeniu PCR należy przeprowadzić analizę krzywej topnienia w celu określenia specyficzności reakcji. Dla każdej próbki należy wykonać trzy kontrpróby techniczne.
  7. Oblicz indukcję aktywowaną światłem jako zmianę krotności w stosunku do zarodków trzymanych w ciemności za pomocą metody 2-ΔΔCt11. Istotność statystyczną można określić za pomocą pakietu oprogramowania statystycznego.

4. Jakościowa ocena indukcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

  1. Usuń zarodki z oświetlenia po pożądanym czasie aktywacji.
  2. Unieruchomić zarodki do obrazowania w 3% metylocelulozie zawierającej 0,01% trikainy w szkiełkach wgłębieniowych.
  3. Uzyskuj obrazy fluorescencyjne i w jasnym polu za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego podłączonego do aparatu cyfrowego przy użyciu standardowych ustawień filtra GFP. Użyj identycznych ustawień akwizycji obrazu dla wszystkich próbek.
  4. Łącz obrazy jasnego pola i fluorescencji po akwizycji za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na potrzeby tej demonstracji, linia reporterowa GFP reagująca na C120 (Tg(C120F:GFP)ucm107)) została skrzyżowana z linią transgeniczną, która ekspresuje TAEL-N z promotora ubikwityny b (ubb) (Tg(ubb:TAEL-N)ucm113)) w celu wytworzenia podwójnie transgenicznych zarodków zawierających oba elementy. 24 godziny po zapłodnieniu zarodki zostały wystawione na aktywację światła niebieskiego, pulsującego z częstotliwością 1 h włączone/1 h wyłączone. Indukcję ekspresji GFP o...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje zastosowanie optogenetycznego systemu TAEL/C120 w celu uzyskania ekspresji genów indukowanej światłem niebieskim. System ten składa się z aktywatora transkrypcji, TAEL, który dimeryzuje po oświetleniu niebieskim światłem i aktywuje transkrypcję interesującego genu za elementem regulatorowym C120. Indukowaną ekspresję reportera GFP można wykryć już po 30 minutach ekspozycji na światło, co sugeruje, że podejście to ma stosunkowo szybką i responsywną kinetykę.

Na poziom induk...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Stefanowi Maternie i członkom laboratoriów Woo i Materna za pomocne sugestie i komentarze na temat tego protokołu. Dziękujemy Annie Reade, Kevinowi Gardnerowi i Laurze Motta-Mena za cenne dyskusje i spostrzeżenia podczas opracowywania tego protokołu. Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health (NIH; R03 DK106358) oraz Komitetu Koordynacyjnego ds. Badań nad Rakiem Uniwersytetu Kalifornijskiego (CRN-20-636896) do S.W.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Internetowe narzędzie do ilustracji naukowych BioRenderhttps://biorender.com/
Kolorowa kamera cyfrowa CCDLumenara755-107
Kompaktowa konsola miernika mocy i energii, cyfrowa 4-calowy wyświetlacz LCDThorlabsPM100D
Filtr wzbudzenia, 545 nmOlympusET545/25x
ilustrowany zestaw RNAspin Mini GE Opieka zdrowotna95017-491
Natychmiastowa sól morska oceanicznaInstant OceanSS15-10
MARS AQUA Ściemnialne światło LED LED 165 W (niebiesko-białe)AmazonB017GWDF7E
MetylocelulozaSigma-AldrichM7140
NEARPOW Programowalny cyfrowy wyłącznik czasowyAmazonB01G6O28NA
PerfeCTa SYBR zielony szybki mixQuantabio101414-286
Oprogramowanie do przetwarzania obrazów Photoshopdo
PrismGraphPad
qScript XLT cDNA SuperMixQuantabio10142-786
QuantStudio 3 System PCR w czasie rzeczywistymApplied BiosystemsA28137
Mikroskop stereoskopowyOlympusSZX16
Trikaine (metanosulfonian etylu 3-aminobenzoesanu)Sigma-AldrichE10521
X-Cite 120 Fluorescencyjne źródło światła LEDExcelitas010-00326RWycofane. Został on zastąpiony przez X-Cite mini+
Oprogramowanie tworzenia wykresów i statystyk Adobe

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
  2. Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).
  3. Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
  4. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
  5. Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).
  6. LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
  7. Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).
  8. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  9. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196(2012).
  10. Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
  11. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
  12. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  13. Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).
  14. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PloS One. 7 (11), 50738(2012).
  15. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  16. Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optogenetic Gene ExpressionLight Induced ExpressionZebrafish EmbryosTAEL C120 SystemGFP ExpressionBlue Light ActivationFluorescence MicroscopyQuantitative PCRInducible Expression SystemTransgenic Zebrafish

Related Articles