Ta praca dokumentuje prostą metodę tworzenia syntetycznych kontroli antygenów dla immunohistochemii. Technikę tę można dostosować do różnych antygenów w szerokim zakresie stężeń. Próbki stanowią odniesienie, za pomocą którego można ocenić wydajność i odtwarzalność testów wewnątrz i między testami.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kontrole syntetycznego antygenu w immunohistochemii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Testy immunohistochemiczne (IHC) dostarczają cennych informacji na temat wzorców ekspresji białek, których wiarygodna interpretacja wymaga dobrze scharakteryzowanych pozytywnych i negatywnych próbek kontrolnych. Ponieważ odpowiednie kontrole tkanek lub linii komórkowych nie zawsze są dostępne, korzystna może być prosta metoda tworzenia syntetycznych kontroli IHC. Taka metoda jest opisana tutaj. Można go dostosować do różnych typów antygenów, w tym białek, peptydów lub oligonukleotydów, w szerokim zakresie stężeń. Protokół ten wyjaśnia kroki niezbędne do stworzenia syntetycznych kontroli antygenowych, na przykładzie peptydu z ludzkiej domeny wewnątrzkomórkowej (ICD) onkogenu erytroblastycznego B2 (ERBB2 / HER2) rozpoznawanego przez różne diagnostycznie istotne przeciwciała. Seryjne rozcieńczenia peptydu ICD HER2 w roztworze albuminy surowicy bydlęcej (BSA) miesza się z formaldehydem i podgrzewa przez 10 minut w temperaturze 85 °C w celu zestalenia i usieciowania mieszaniny peptyd/BSA. Otrzymany żel można przetworzyć, podzielić i wybarwić jak tkankę, uzyskując serię próbek o znanych stężeniach antygenu w szerokim zakresie intensywności barwienia.
Ten prosty protokół jest zgodny z rutynowymi procedurami laboratorium histologicznego. Metoda wymaga jedynie, aby użytkownik posiadał wystarczającą ilość pożądanego antygenu. Rekombinowane białka, domeny białkowe lub peptydy liniowe, które kodują odpowiednie epitopy, mogą być syntetyzowane lokalnie lub komercyjnie. Laboratoria wytwarzające przeciwciała we własnym zakresie mogą rezerwować porcje antygenu uodparniającego jako syntetyczny cel kontrolny. Możliwość tworzenia dobrze zdefiniowanych kontroli dodatnich w szerokim zakresie stężeń pozwala użytkownikom ocenić wydajność testów wewnątrz- i międzylaboratoryjnych, uzyskać wgląd w zakres dynamiczny i liniowość swoich testów oraz zoptymalizować warunki testu pod kątem konkretnych celów eksperymentalnych.
Wprowadzenie
Immunohistochemia (IHC) pozwala na czułe i specyficzne, przestrzennie precyzyjne wykrywanie docelowych antygenów w skrawkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE). Jednak na wyniki barwienia IHC może mieć wpływ wiele zmiennych, w tym czas niedokrwienia ciepłego i zimna, utrwalenie tkanki, wstępne leczenie tkanek, reaktywność i stężenie przeciwciał, chemia wykrywania testu i czasy reakcji1. W związku z tym odtwarzalność i interpretacja reakcji IHC wymagają rygorystycznej kontroli tych zmiennych oraz wykorzystania dobrze scharakteryzowanych pozytywnych i ujemnych próbek kontrolnych. Często używane kontrole obejmują tkank....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie roztworu podstawowego i narzędzi
- Przygotować 20 ml 25% w/v roztworu BSA, mieszając 5 g proszku BSA w 14 ml PBS, pH 7,2 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, aż do równomiernego rozproszenia. W razie potrzeby odwirować, aby rozproszyć proszek BSA.
- Przechowywać roztwór przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić całkowite rozpuszczenie. Dostosuj końcową objętość do 20 ml za pomocą PBS, aby uzyskać 25% w/v roztwór podstawowy.
- Przygotować 20 ml 31,3% w/v roztworu BSA, mieszając 6,26 g proszku BSA w 13 ml PBS, pH 7,2 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, aż do równomiernego rozpylenia. Przechowywać roz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Peptydy powinny całkowicie rozpuścić się w odpowiednim rozpuszczalniku w temperaturze pokojowej, tworząc optycznie klarowny roztwór. Jeśli po 30–60 minutach nadal widoczne są cząsteczki stałe, pomocne może być dodanie dodatkowych objętości pierwotnego rozpuszczalnika lub rozpuszczalnika alternatywnego, nieprzekraczając przy tym zamierzonej objętości 5-krotnego roztworu zapasu peptydów obliczonej w Tabela 1Podobnie, połączony roztwór peptydowo-BSA powinien pozostać przeźroczysty (Ryci.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metoda ta pozwala użytkownikowi na tworzenie jednolitych próbek o znanym składzie i stężeniu antygenu jako wzorców w reakcjach IHC, przy użyciu materiałów i technik znanych z większości laboratoriów histologicznych. Najważniejszym krokiem jest zidentyfikowanie epitopu, z którym wiąże się badane przeciwciało. Protokół ten opisuje użycie liniowego antygenu peptydowego z ICD ERBB2 / HER2. Ten sam protokół można wykorzystać do tworzenia żeli BSA zawierających oligonukleotydy, znaczniki fluorescencyjne, domeny białkowe lub bi.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Charles A. Havnar, Kathy J. Hötzel, Charles A. Jones, Carmina M. Espiritu, Linda K. Rangell i Franklin V. Peale są pracownikami i akcjonariuszami firm Genentech i Roche. Ich filie produkują odczynniki i instrumenty używane w tym badaniu.
Podziękowania
Autorzy dziękują swoim kolegom Jeffreyowi Tomowi i Aiminowi Songowi za syntezę peptydów, Nianfeng Ge za konstrukcję TMA, Shari Lau za barwienie IHC, Melissie Edick za cyfrowe skanowanie mikroskopowe i Hai Ngu za cyfrową kwantyfikację obrazu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Klon anty-HER2 / neu 4B5 | Ventana | 5278368001 | |
| Biopsja Okłady | Leica | 3801090 | |
| Albumina surowicy bydlęcej, ultra czysta | technologia sygnalizacji komórkowej | BSA #9998 | |
| 50 ml Rurka stożkowa | Corning | 352070 | |
| Jednorazowa forma bazowa (15 mm x 15 mm) | Fisher | 22-363-553 | |
| Jednorazowa forma bazowa (24 mm x 24 mm) | Fisher | 22-363-554 | |
| Jednorazowa szpatułka | VWR | 80081-188 | |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22331 | |
| 37% formaldehyd | Mikroskopia elektronowa Sciences | 15686 | |
| Peptyd | UniProt P04626-1; a.a. 1240-55 | ||
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | |
| Magnetyczny pręt mieszający | |||
| NanoZoomer 2.0 HT Obraz całych slajdów | Hamamatsu | ||
| 10% neutralna buforowana formalina | VWR | 16004-128 | |
| Probówki do mikrofugi bez nukleaz 1,5 ml | |||
| Paraplast parafina | Leica | 39601006 | |
| Peptyd Kalkulator parametrów | Pep-Calc17 | https://www.pep-calc.com/ | |
| Dostawcy peptydów | ABclonal Science | Użytkownicy powinni skontaktować się ze sprzedawcami peptydów w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat masy, czystości i kosztów. | |
| Użytkownicy peptydów | powinni skontaktować się ze sprzedawcami peptydów w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat masy, czystości i kosztów. | ||
| Użytkownicy CPC Scientific | powinni skontaktować się ze sprzedawcami peptydów w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat masy, czystości i kosztów. | ||
| Użytkownicy peptydów | powinni skontaktować się ze sprzedawcami peptydów w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat masy, czystości i kosztów. | ||
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,2 | |||
| Odczynnik Alkohol | Thermo Scientific | 9111 | |
| Brzytwa jednokrawędziowa | VWR | 55411-050 | |
| Superfrost Plus Dodatnio naładowane szkiełka mikroskopowe | Thermo Scientific | 6776214 | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHISTECH | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
Bibliografia
- Torlakovic, E. E., et al. Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).
- Hötzel, K. J., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
