Artykuł metodologiczny

Kontrole syntetycznego antygenu w immunohistochemii

DOI:

10.3791/62819

⸱

23 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Pathology, Genentech, Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca dokumentuje prostą metodę tworzenia syntetycznych kontroli antygenów dla immunohistochemii. Technikę tę można dostosować do różnych antygenów w szerokim zakresie stężeń. Próbki stanowią odniesienie, za pomocą którego można ocenić wydajność i odtwarzalność testów wewnątrz i między testami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy immunohistochemiczne (IHC) dostarczają cennych informacji na temat wzorców ekspresji białek, których wiarygodna interpretacja wymaga dobrze scharakteryzowanych pozytywnych i negatywnych próbek kontrolnych. Ponieważ odpowiednie kontrole tkanek lub linii komórkowych nie zawsze są dostępne, korzystna może być prosta metoda tworzenia syntetycznych kontroli IHC. Taka metoda jest opisana tutaj. Można go dostosować do różnych typów antygenów, w tym białek, peptydów lub oligonukleotydów, w szerokim zakresie stężeń. Protokół ten wyjaśnia kroki niezbędne do stworzenia syntetycznych kontroli antygenowych, na przykładzie peptydu z ludzkiej domeny wewnątrzkomórkowej (ICD) onkogenu erytroblastycznego B2 (ERBB2 / HER2) rozpoznawanego przez różne diagnostycznie istotne przeciwciała. Seryjne rozcieńczenia peptydu ICD HER2 w roztworze albuminy surowicy bydlęcej (BSA) miesza się z formaldehydem i podgrzewa przez 10 minut w temperaturze 85 °C w celu zestalenia i usieciowania mieszaniny peptyd/BSA. Otrzymany żel można przetworzyć, podzielić i wybarwić jak tkankę, uzyskując serię próbek o znanych stężeniach antygenu w szerokim zakresie intensywności barwienia.

Ten prosty protokół jest zgodny z rutynowymi procedurami laboratorium histologicznego. Metoda wymaga jedynie, aby użytkownik posiadał wystarczającą ilość pożądanego antygenu. Rekombinowane białka, domeny białkowe lub peptydy liniowe, które kodują odpowiednie epitopy, mogą być syntetyzowane lokalnie lub komercyjnie. Laboratoria wytwarzające przeciwciała we własnym zakresie mogą rezerwować porcje antygenu uodparniającego jako syntetyczny cel kontrolny. Możliwość tworzenia dobrze zdefiniowanych kontroli dodatnich w szerokim zakresie stężeń pozwala użytkownikom ocenić wydajność testów wewnątrz- i międzylaboratoryjnych, uzyskać wgląd w zakres dynamiczny i liniowość swoich testów oraz zoptymalizować warunki testu pod kątem konkretnych celów eksperymentalnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunohistochemia (IHC) pozwala na czułe i specyficzne, przestrzennie precyzyjne wykrywanie docelowych antygenów w skrawkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE). Jednak na wyniki barwienia IHC może mieć wpływ wiele zmiennych, w tym czas niedokrwienia ciepłego i zimna, utrwalenie tkanki, wstępne leczenie tkanek, reaktywność i stężenie przeciwciał, chemia wykrywania testu i czasy reakcji1. W związku z tym odtwarzalność i interpretacja reakcji IHC wymagają rygorystycznej kontroli tych zmiennych oraz wykorzystania dobrze scharakteryzowanych pozytywnych i ujemnych próbek kontrolnych. Często używane kontrole obejmują tkanki zatopione w parafinie lub hodowane linie komórkowe znane z niezależnych analiz w celu wyrażenia interesującego antygenu, ale takie próbki nie zawsze są dostępne1. Ponadto poziomy ekspresji docelowych antygenów w tkankach i kontrolach linii komórkowych są na ogół rozumiane tylko jakościowo i mogą być zmienne. Kontrole zawierające powtarzalne, dokładnie znane stężenia docelowego antygenu mogą pomóc w optymalizacji warunków reakcji IHC. Ogólna metoda, którą można dostosować do różnych typów antygenów w fizjologicznie istotnym zakresie stężeń w celu stworzenia syntetycznych próbek kontrolnych IHC, została opisana przez autorów2. W tym miejscu znajduje się szczegółowy protokół tworzenia i stosowania tego typu standardu.

Odpowiednie kontrole są niezbędne do prawidłowej interpretacji testów IHC1,3,4. Tkanki, hodowane komórki i podłoża pokryte peptydami zostały wykorzystane jako kontrole IHC zgodnie ze specyficznymi potrzebami badaczy. Szeroko omówiono zalety i ograniczenia związane z używaniem tkanek jako kontroli IHC1,4. W przypadku wielu przeciwciał można wybrać odpowiednie kontrole spośród wybranych normalnych tkanek zawierających populacje komórek wyrażających docelowy antygen w szerokim zakresie dynamicznym. Kontrole tkankowe są mniej odpowiednie, gdy docelowy antygen nie jest dobrze scharakteryzowany pod względem miejsca ekspresji lub liczebności, lub gdy potencjalnie reagujące krzyżowo antygeny ulegają koekspresji w tych samych komórkach lub miejscach tkankowych. W tych kontekstach pomocne mogą być bloki hodowanych linii komórkowych wyrażających antygen będący przedmiotem zainteresowania. Aby dostarczyć dalszych dowodów na swoistość docelową, linie komórkowe można zmodyfikować tak, aby wykazywały nadmierną lub niedostateczną ekspresję antygenów docelowych. Na przykład, takie podejście zostało niedawno wykorzystane do oceny różnych testów anty-PD-L1 przy użyciu mikromacierzy tkankowej izogenicznych linii komórkowych wyrażających zakres antygenu PD-L15. Praktyczne ograniczenia rutynowego stosowania bloków linii komórkowych obejmują koszt i czas potrzebny do wytworzenia wystarczającej liczby komórek oraz fakt, że ekspresja niektórych antygenów może nie być niezawodnie spójna, nawet w obrębie klonalnych linii komórkowych6. Peptydy syntetyczne są trzecią opcją dla kontroli IHC dla przeciwciał, które rozpoznają krótkie liniowe epitopy. Steven Bogen i jego współpracownicy opublikowali obszerne artykuły na temat stosowania peptydów sprzężonych z powierzchnią szkiełek szkiełkowych7,8 i szklanych koralików9. Jedno z badań przeprowadzonych przez tę grupę wykazało, że analiza ilościowa kontroli IHC na bazie peptydów może wykryć zmienność procesu barwienia pominiętą w jakościowej ocenie kontroli tkanek analizowanych równolegle10. Podczas gdy standardy wykorzystujące antygeny na bazie kulek mogą być szeroko stosowane, wiele szczegółów jest zastrzeżonych przez autorów, co ogranicza ich powszechne przyjęcie.

Inne podejście do standardów IHC polega na włączeniu docelowych antygenów do sztucznie tworzonych żeli białkowych. Koncepcja ta została po raz pierwszy zademonstrowana przez Pera Brandtzaega w 1972 roku w badaniu, w którym normalna surowica królika została spolimeryzowana przy użyciu aldehydu glutarowego11. Małe bloki powstałego żelu moczono następnie przez 1-4 tygodnie w roztworach zawierających interesujące antygeny immunoglobulinowe w różnych stężeniach. Po utrwaleniu alkoholem i zatopieniu parafiny, wykazano, że skrawki otrzymanych kontroli barwią się z intensywnością odpowiadającą logarytmowi roztworów antygenu, w których zostały zanurzone. Później badacze przygotowali koniugaty aldehydu glutarowego określonych aminokwasów w rozcieńczonych roztworach BSA lub homogenatów mózgu jako kontrole pozytywne w badaniach mikroskopii immunologicznej i elektronowej12,13. Nowsze prace dotyczyły zastosowania żeli wykonanych z roztworów białkowych utrwalonych formaldehydem jako substytutów tkanki FFPE w analizie spektrometrii mas14. W innym niedawnym badaniu badano strukturę i właściwości żeli powstałych w wyniku ogrzewania roztworów albuminy surowicy ludzkiej lub bydlęcej w różnych stężeniach i pH15. Autorzy ci odkryli, że albumina surowicy tworzy trzy rodzaje żeli różniących się elastycznością mechaniczną, zachowaniem struktury drugorzędowej i zdolnością wiązania kwasów tłuszczowych w zależności od warunków eksperymentalnych. Łącznie prace te pokazują ogólną wykonalność zastosowanego tu podejścia. Roztwory białkowe o określonym składzie tworzą żele przypominające tkanki, które można dalej przetwarzać, dzielić i barwić przy użyciu rutynowych metod histologicznych.

Ten protokół opisuje tworzenie syntetycznej kontroli IHC wykonanej z albuminy surowicy bydlęcej (BSA) polimeryzowanej ciepłem i formaldehydem. Żele mogą zawierać szeroką gamę antygenów, w tym białka o pełnej długości, domeny białkowe i peptydy liniowe, a także antygeny niebiałkowe, w tym oligonukleotydy2. W tej demonstracji wykorzystano przykładowy antygen, liniowy peptyd kodujący C-końcowe 16 aminokwasów ludzkiego białka ERBB2 (HER2/neu) TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (patrz tabela materiałów). Sekwencja ta obejmuje epitopy rozpoznawane przez trzy komercyjnie dostępne, diagnostycznie istotne przeciwciała, w tym odczynnik poliklonalny Herceptest (ENPEYLGLDVP) oraz przeciwciała monoklonalne CB11 (AENPEYL) i 4B5 (TAENPEYLGL) (patrz tabela materiałów)16.

Metoda tutaj pokazana wykorzystuje łatwo dostępne odczynniki przy użyciu procesów i technik znanych każdemu praktykującemu laboratorium histologicznemu. Największym ograniczeniem jest konieczność identyfikacji i zakupu docelowych antygenów, co w wielu przypadkach można osiągnąć stosunkowo niewielkimi kosztami. Ponieważ te syntetyczne kontrole mają całkowicie określony skład i są wykonane prostymi metodami, mogą być stosowane w wielu laboratoriach z powtarzalnymi wynikami. Ich zastosowanie może ułatwić obiektywną, wymierną ocenę wyników barwienia IHC i umożliwić większą odtwarzalność wewnątrz- i międzylaboratoryjną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworu podstawowego i narzędzi

  1. Przygotować 20 ml 25% w/v roztworu BSA, mieszając 5 g proszku BSA w 14 ml PBS, pH 7,2 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, aż do równomiernego rozproszenia. W razie potrzeby odwirować, aby rozproszyć proszek BSA.
    1. Przechowywać roztwór przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić całkowite rozpuszczenie. Dostosuj końcową objętość do 20 ml za pomocą PBS, aby uzyskać 25% w/v roztwór podstawowy.
  2. Przygotować 20 ml 31,3% w/v roztworu BSA, mieszając 6,26 g proszku BSA w 13 ml PBS, pH 7,2 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, aż do równomiernego rozpylenia. Przechowywać roztwór przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić całkowite rozpuszczenie. Dostosuj końcową objętość do 20 ml za pomocą PBS, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 31,3% w/v.
  3. Rozgrzej blok grzewczy do 85 °C.
    UWAGA: Poniższy protokół tworzy żele peptydowe/BSA o objętości 1,26-1,4 ml uformowane w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Aby użyć mniejszych objętości, na przykład, gdy zapasy antygenu są ograniczone, przygotuj żele w probówkach do PCR i użyj termocyklera ustawionego na 85 °C jako bloku grzewczego.
  4. Sprawdzić, czy mieszanina BSA/formaldehydu tworzy żel zgodnie z oczekiwaniami, mieszając 700 μl 25% roztworu BSA z 700 μl 37% formaldehydu. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół 5 razy w ciągu 5-10 sekund. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Skoncentrowany formaldehyd jest toksyczny; Stosować z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności.
  5. Natychmiast po zmieszaniu roztworów BSA i formaldehydu umieścić zamkniętą probówkę mikrowirówki w bloku grzewczym o temperaturze 85 °C na 10 minut. Wyjąć probówkę z bloku grzewczego i pozostawić do ostygnięcia. Upewnij się, że żel uformował się zgodnie z oczekiwaniami.

2. Przygotowanie i rozcieńczanie peptydów

  1. Uzyskać 5-20 mg liofilizowanego peptydu o pożądanej sekwencji.
    UWAGA: C-końcowe 16 aminokwasów ludzkiej domeny wewnątrzkomórkowej ERBB2 rozpoznawanej przez 4B5 to TPTAENPEYLGLDVPV-COOH.
    1. Dodaj 4 aminokwasy do N-końca, acetylo-YGSG i C-końca, GSGC-amidu, aby ułatwić sieciowanie peptydu do BSA i zapewnić odstępy między cząsteczką BSA a epitopem peptydu.
      UWAGA: Pełna sekwencja to: acetylo-YGSGTPTAENPEYLGLDVPVGSGC-amid.
    2. W razie potrzeby użyj innych N- i C-końcowych sekwencji aminokwasowych, aby rozszerzyć epitop peptydu rdzeniowego.
      UWAGA: Wpływ różnych sekwencji różni się w zależności od różnych kombinacji przeciwciał/epitopów. Dodanie peptydu C-końcowego zmniejsza wiązanie niektórych przeciwciał z epitopami C-końcowymi. W takich przypadkach należy pominąć tę sekwencję.
    3. Potwierdź, że peptydy ze źródeł komercyjnych są dostarczane o czystości >95%, których skład potwierdza analiza HPLC i spektrometrii mas.
  2. Obliczyć niezbędne objętości dla 5 x (1,25 E-2 M) roztworów podstawowych peptydów. Odnosząc się do tabeli 1, kolumny C-E, wprowadzić wartości masy cząsteczkowej antygenu (g/mol), procentowej czystości antygenu (0-100) i masy antygenu (mg).
    UWAGA: Objętość rozpuszczalnika (w μl) do ponownego zawieszenia próbki w celu uzyskania roztworu podstawowego 1,25 E-2 M wynosi 800 x masa cząsteczkowa antygenu x procent czystości antygenu/masy antygenu.
    1. Przygotuj i wyraźnie oznacz osiem probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Probówki będą zawierały 5x peptyd w rozpuszczalniku, 1x peptyd w rozpuszczalniku, pięć 10x seryjnych rozcieńczeń 2,5 E-4 M do 2,5 E-8 M peptydu/BSA/formaldehydu żel oraz żel kontroli ujemnej zawierający BSA/formaldehyd bez dodatku antygenu. Wszystkie próbki żelu wyglądają identycznie. Przygotowując wiele zestawów rozcieńczeń peptydów za jednym razem, należy pamiętać o prawidłowym oznakowaniu i identyfikacji wszystkich probówek i kaset do przetwarzania. Tam, gdzie to możliwe, używaj oznaczonych kolorami probówek do mikrowirówek i kaset do przetwarzania, aby zminimalizować błędną identyfikację.
  3. Przygotować 5-krotny roztwór podstawowy peptydu o stężeniu 1,25 E-2 M, ponownie zawieszając całą masę liofilizowanego peptydu (20 mg dla peptydów ERBB2) w 60 μl odpowiedniego rozpuszczalnika.
    UWAGA: W tym przykładzie dimetyloformamid (DMF) został dodany bezpośrednio do pojemnika dostawcy.
    1. Sprawdź roztwór, aby upewnić się, że peptyd jest całkowicie rozpuszczony. Jeśli to konieczne, dodać dodatkowy rozpuszczalnik i/lub sonikować próbkę aż do całkowitego rozpuszczenia peptydu, uważając, aby nie przekroczyć objętości obliczonej w tabeli 1 dla 5-krotnego zasobu peptydowego.
      UWAGA: DMF jest toksyczny; Stosować z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności.
      UWAGA: W zależności od sekwencji aminokwasów i odpowiadającej jej hydrofobowości i ładunku, peptydy mogą być rozpuszczalne w DMF, dimetylosulfotlenku (DMSO), czystej wodzie lub rozcieńczonych roztworach kwasu octowego, kwasu mrówkowego lub wodorowęglanu amonu. Charakterystykę peptydów można obliczyć za pomocą różnych narzędzi online17. Niektórzy dostawcy peptydów mogą sugerować rozpuszczalniki odpowiednie dla określonych sekwencji.
    2. W razie potrzeby dodać rozpuszczalnik, aby doprowadzić objętość 5-krotnego peptydu do końcowej objętości obliczonej w tabeli 1. Wirować przez 5 s i wirować w temperaturze pokojowej przy 5000 x g przez 5 s. Roztwory podstawowe peptydów można przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Odnosząc się do Tabeli 2, kolumna C, przygotować 150 μl 1x roztworu podstawowego peptydu (2,5 E-3 M), rozcieńczając 30 μl 5x peptydu w 120 μl rozpuszczalnika (DMF w tym przykładzie). Wirować przez 5 s i wirować w temperaturze pokojowej przy 5000 x g przez 5 s.
  5. Odnosząc się do tabeli 2, kolumna D, przygotować 700 μl 5 E-4 M peptydu/roztworu BSA (rozcieńczenie 1) przez rozcieńczenie 140 μl 1x peptydu do 560 μl 31,3% BSA/PBS, pH 7,2. Wirować przez 5 s i odwirowywać w temperaturze pokojowej przy 5000 x g przez 5 s.
    UWAGA: Końcowe stężenie BSA tego roztworu wynosi 25% (w/v).
  6. Odnosząc się do tabeli 2, kolumny E-H, przygotować cztery kolejne 10-krotne seryjne rozcieńczenia 5 E-4 M/BSA podstawy, dodając 70 μl roztworu peptydu/BSA do 630 μl 25% BSA/PBS, pH 7,2. Wirować przez 5 s i odwirowywać w temperaturze pokojowej przy 5000 x g przez 5 s.
    UWAGA: Po tym etapie nastąpi pięć 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń peptydu (5 E-4 M do 5 E-8 M) w 25% BSA/PBS, pH 7,2. Pierwsze cztery próbki będą zawierały 630 μl. Ostatnia próbka będzie zawierała 700 μl.
  7. Odnosząc się do tabeli 2, kolumna I, przygotować próbkę BSA do kontroli ujemnej zawierającą 700 μl 25% BSA/PBS, pH 7,2 (Rysunek 1A).

3. Przygotowanie żeli peptydowych BSA

  1. Upewnij się, że blok grzewczy lub termocykler jest stabilny w temperaturze 85 °C.
  2. Patrz Tabela 3, kolumny B-E. Pracując po jednej próbce na raz, dodać do pierwszej 25% próbki BSA/peptydu (rozcieńczenie 1) 630 μl 37% formaldehydu. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół 5 razy w ciągu 5-10 sekund. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Skoncentrowany formaldehyd jest toksyczny; Stosować z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności.
    1. Po zmieszaniu roztworów peptydu/BSA i formaldehydu umieścić zamkniętą probówkę mikrowirówki w bloku grzewczym w temperaturze 85 °C na 10 minut
      UWAGA: Dokładnie wymieszaj roztwór peptydu BSA i formaldehydu, ale nie należy poświęcać więcej niż 10 sekund na pipetowanie mieszaniny przed umieszczeniem próbki na ogniu. Ponieważ sieciowanie formaldehydu rozpoczyna się natychmiast, żel może tworzyć się inaczej, jeśli procedura jest zróżnicowana dla różnych próbek. Końcowe stężenie BSA w tych żelach wynosi 12,5% (w/v). Końcowe stężenia BSA poniżej 10% mogą prowadzić do powstania żeli, które nie krzepną; końcowe stężenia BSA większe niż 16% mogą powodować powstawanie żeli bardziej kruchych i trudnych do rozdrobnienia po przetworzeniu.
    2. Powtórzyć kroki 3.2 i 3.2.1 dla każdego z rozcieńczeń 2-4.
    3. Powtórzyć kroki 3.2 i 3.2.1 dla rozcieńczenia 5, ale dodać 700 μl 37% formaldehydu, objętość równą 700 μl roztworu antygenu BSA.
    4. Patrz tabela 3, kolumna kolumna G; powtórzyć kroki 3.2 i 3.2.1 dla ujemnej próbki kontrolnej, dodając 700 μl 37% formaldehydu, objętość równą 700 μl roztworu BSA do kontroli ujemnej.
  3. Wyjmij rurki z bloku grzewczego po 10-12 minutach. Czas nagrzewania powinien być jak najbardziej spójny dla każdej próbki. Pozwól żelom ostygnąć na blacie przez 5-10 minut (Rysunek 1B).
  4. Za pomocą czystej, elastycznej jednorazowej szpatułki laboratoryjnej wyjąć próbkę żelu w jednym kawałku z probówki do mikrowirówki i umieścić ją w szczelnie zamkniętym pojemniku zawierającym co najmniej 15 ml neutralnej buforowanej formaliny (NBF), używając oddzielnego pojemnika NBF dla każdej próbki.
    1. Alternatywnie, odciąć spód probówki mikrowirówki nową żyletką z pojedynczą krawędzią i wypchnąć żel z dna za pomocą powietrza lub odpowiedniej sondy (Rysunek 1C-G).
      UWAGA: Zestalone żele formaldehydowe/BSA mogą pozostawać w probówkach mikrowirówek w temperaturze pokojowej do 24 godzin. Pozostawienie żeli w probówce do mikrowirówki na dłużej niż 24 godziny może spowodować, że staną się one kruche i trudniejsze w obróbce i krojeniu.

4. Przycinanie, przetwarzanie i zatapianie żeli BSA

  1. Przytnij stożek żelowy do cylindrycznych krążków o grubości około 5 mm za pomocą czystej maszynki do golenia z pojedynczą krawędzią (Rysunek 1H, I). Owiń krążki folią biopsyjną, umieszczając jeden większy krążek żelowy w jednej kasecie (do wykorzystania w badaniu pilotażowym w kroku 5), a pozostałe krążki żelu razem w drugiej kasecie (Rysunek 2A,E) do użycia w budowie mikromacierzy tkankowej (TMA) w kroku 6. Umieść owinięte krążki żelu w wyraźnie oznaczonych kasetach do przetwarzania tkanek.
    1. Umieść żele w kasecie w co najmniej 15 ml 10% NBF na próbkę żelu przed przetworzeniem, używając oddzielnego pojemnika NBF dla każdej próbki. Żele mogą pozostawać w 10% NBF przez 6-48 godzin.
  2. Przetwarzaj żele w automatycznym procesorze tkanek histologicznych, postępując zgodnie z dużym harmonogramem tkanek z ciśnieniem i podciśnieniem. Każdy etap trwa 1 godzinę: 10% NBF, 70% etanolu, 95% etanolu (powtórz dwa razy), 100% etanolu (powtórz dwa razy), ksyleny (powtórz trzy razy), parafina w temperaturze 60 °C (powtórz trzy razy).
    UWAGA: W przypadku badaczy, którzy zdecydują się na ręczne przetwarzanie próbek, należy postępować zgodnie z tą samą sekwencją odczynników i czasami.
  3. Po zakończeniu przetwarzania próbki wyjmij kasety z procesora tkanek i przenieś je do centrum zatapiania parafiny.
  4. Odwiń żele z folii biopsyjnej i zanurz je w parafinie. Dla każdej próbki umieść jeden krążek żelu w małej formie o wymiarach 15 mm x 15 mm (Rysunek 2B-D), a pozostałe krążki żelu razem w drugiej większej formie (Rysunek 2F-H). Pierwszy blok z jedną próbką zostanie wykorzystany do przetestowania żelu peptydowego w badaniu pilotażowym. Drugi blok może być wykorzystany do budowy TMA.

5. Pilotażowa ocena serii rozcieńczeń peptydów

  1. Dla każdej serii rozcieńczeń peptydów należy zaplanować utworzenie dwóch szkiełek podstawowych zawierających łącznie 6 oddzielnych sekcji: po jednej sekcji z każdej z pięciu próbek z serii rozcieńczeń oraz jednej sekcji z próbki kontrolnej ujemnej zawierającej wyłącznie BSA.
    1. Na pierwszym szkiełku podstawowym wyciąć po jednym fragmencie o grubości 4 μm z każdego z mniejszych bloków zawierających jeden krążek żelu o trzech najwyższych stężeniach peptydów (2,5 E-4 M do 2,5 E-6 M).
    2. Na drugim szkiełku wyciąć jeden odcinek o grubości 4 μm z każdego bloku o dwóch najniższych stężeniach peptydów (2,5 E-7 M i 2,5 E-8 M) oraz jeden odcinek z bloku kontrolnego tylko BSA. Zapisz kolejność próbek na szkiełkach.
      UWAGA: Spodziewaj się, że żele zatopione w parafinie będą ciąć się gładko, tworząc jednolite sekcje bez fragmentacji, rozdarcia lub drgań artefaktu. Jeśli poszczególne próbki żelu zatopionego w parafinie są trudne do pokrojenia, przed cięciem należy na krótko zanurzyć powierzchnię bloku w lodowatej wodzie destylowanej. W razie potrzeby eksperymentuj z różnymi czasami namaczania lub z różnymi roztworami (np. wodą amoniakalną).
    3. Po pokrojeniu na sekcje suszyć szkiełka w temperaturze pokojowej (około 23 °C) przez 24 godziny, a następnie w temperaturze 60 °C przez 30 minut.
  2. Zabarwić dwie szkiełka przygotowane dla każdego peptydu pożądanym przeciwciałem zgodnie ze standardowymi protokołami IHC.
    UWAGA: Pierwszorzędowe stężenie przeciwciał na szkiełku użyte dla króliczego monoklonalu 4B5 w tej demonstracji wynosiło 1,5 ug/ml.
    1. Spodziewaj się zobaczyć stosunkowo jednolity sygnał w każdej sekcji żelu, przy czym różne próbki żelu wykazują zakres intensywności sygnału odpowiadający rozcieńczeniom peptydów.
  3. Jeśli wyniki badania pilotażowego są zadowalające, należy skonstruować TMA z bloków dawcy żelu zawierających różne stężenia antygenu peptydowego, zgodnie z opisem w kolejnych krokach protokołu.

6. Żel BSA Konstrukcja TMA

  1. Skonstruuj mikromacierz tkankową zawierającą zduplikowane rdzenie o średnicy 1 mm z bloków dawcy zawierających sam żel BSA i żele BSA zawierające wszystkie pięć rozcieńczeń peptydu ERBB2.
    UWAGA: W razie potrzeby należy dołączyć żele BSA zawierające te same pięć rozcieńczeń peptydu niedocelowego jako dodatkowe kontrole ujemne. W razie potrzeby należy dołączyć rdzenie reprezentatywnych linii komórkowych wykazujących ekspresję ERBB2 jako kontrole pozytywne.
  2. Wyciąć odcinki TMA o grubości 4 μm i wybarwić 1,5 ug/ml monoklonalnego królika anty-ERBB2/HER2/neu 4B5 (patrz tabela materiałów) zgodnie ze standardowymi protokołami laboratoryjnymi.
  3. Oceń uzyskaną intensywność plamy jakościowo przez inspekcję lub ilościowo za pomocą cyfrowego skanowania i analizy obrazu (Rysunek 3A,B).
    UWAGA: Ponieważ cyfrowa analiza obrazu nie jest głównym celem tego protokołu, te kroki pozostawia się czytelnikowi do wykonania zgodnie z jego preferencjami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptydy powinny całkowicie rozpuścić się w odpowiednim rozpuszczalniku w temperaturze pokojowej, aby utworzyć optycznie przezroczysty roztwór. Jeśli widoczne cząstki stałe są nadal obecne po 30-60 minutach, pomocne może być dodanie dodatkowych objętości oryginalnego rozpuszczalnika lub alternatywnego rozpuszczalnika nieprzekraczających zamierzonej objętości 5-krotnego roztworu podstawowego peptydu obliczonej w tabeli 1. Podobnie, połączony roztwór peptydu/BSA powinien pozostać półprzezroczysty (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda ta pozwala użytkownikowi na tworzenie jednolitych próbek o znanym składzie i stężeniu antygenu jako wzorców w reakcjach IHC, przy użyciu materiałów i technik znanych z większości laboratoriów histologicznych. Najważniejszym krokiem jest zidentyfikowanie epitopu, z którym wiąże się badane przeciwciało. Protokół ten opisuje użycie liniowego antygenu peptydowego z ICD ERBB2 / HER2. Ten sam protokół można wykorzystać do tworzenia żeli BSA zawierających oligonukleotydy, znaczniki fluorescencyjne, domeny białkowe lub bi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charles A. Havnar, Kathy J. Hötzel, Charles A. Jones, Carmina M. Espiritu, Linda K. Rangell i Franklin V. Peale są pracownikami i akcjonariuszami firm Genentech i Roche. Ich filie produkują odczynniki i instrumenty używane w tym badaniu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują swoim kolegom Jeffreyowi Tomowi i Aiminowi Songowi za syntezę peptydów, Nianfeng Ge za konstrukcję TMA, Shari Lau za barwienie IHC, Melissie Edick za cyfrowe skanowanie mikroskopowe i Hai Ngu za cyfrową kwantyfikację obrazu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Klon anty-HER2 / neu 4B5Ventana5278368001
Biopsja OkładyLeica3801090
Albumina surowicy bydlęcej, ultra czystatechnologia sygnalizacji komórkowejBSA #9998
50 ml Rurka stożkowaCorning352070
Jednorazowa forma bazowa (15 mm x 15 mm)Fisher22-363-553
Jednorazowa forma bazowa
(24 mm x 24 mm)		Fisher22-363-554
Jednorazowa szpatułkaVWR80081-188
Eppendorf ThermomixerEppendorf22331
37% formaldehydMikroskopia elektronowa Sciences15686
PeptydUniProt P04626-1; a.a. 1240-55
Leica Autostainer XLLeicaST5010
Magnetyczny pręt mieszający
NanoZoomer 2.0 HT Obraz całych slajdówHamamatsu
10% neutralna buforowana formalinaVWR16004-128
Probówki do mikrofugi bez nukleaz 1,5 ml
Paraplast parafinaLeica39601006
Peptyd Kalkulator parametrówPep-Calc17https://www.pep-calc.com/
Dostawcy peptydówABclonal ScienceUżytkownicy powinni skontaktować się ze sprzedawcami peptydów w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat masy, czystości i kosztów.
Użytkownicy peptydówpowinni skontaktować się ze sprzedawcami peptydów w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat masy, czystości i kosztów.
Użytkownicy CPC Scientificpowinni skontaktować się ze sprzedawcami peptydów w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat masy, czystości i kosztów.
Użytkownicy peptydówpowinni skontaktować się ze sprzedawcami peptydów w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat masy, czystości i kosztów.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,2
Odczynnik AlkoholThermo Scientific9111
Brzytwa jednokrawędziowaVWR55411-050
Superfrost Plus Dodatnio naładowane szkiełka mikroskopoweThermo Scientific6776214
TMA Tissue Grand Master3DHISTECH
XylenesVWR89370-088
ERBB2 / HER2 Anaspec z Nowej Anglii

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Torlakovic, E. E., et al. Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).
  2. Hötzel, K. J., et al. Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).
  3. Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
  4. Torlakovic, E. E., et al. Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).
  5. Martinez-Morilla, S., et al. Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray. Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).
  6. Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
  7. Sompuram, S. R., et al. Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets. Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).
  8. Sompuram, S. R., et al. A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).
  9. Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).
  10. Vani, K., et al. Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).
  11. Brandtzaeg, P. Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity. Immunology. 22, 177-183 (1972).
  12. Matute, C., Streit, P. Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity. Histochemistry. 86, 147-157 (1986).
  13. Ottersen, O. P. Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing. Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).
  14. Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. 'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).
  15. Arabi, S. H., et al. Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties. Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).
  16. Schrohl, A. -S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Brünner, N. Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies. Histopathology. 59, 975-983 (2011).
  17. Lear, S., Cobb, S. L. Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).
  18. Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays. Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).
  19. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  20. Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
  21. Forsström, B., et al. Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).
  22. Forsström, B., et al. Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes. PLoS One. 10 (3), 0121673(2015).
  23. Prasad, B., et al. Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kontrole immunohistochemiczneseria rozcie cze peptyd wele antygenowe BSAsieciowanie formaldehydemmikroarray tkankowyzatapianie w parafiniebarwienie przeciwcia amianaliza intensywno ci sygna uprotok histologiczny

Powiązane artykuły