Zautomatyzowane testy wykorzystujące wielodołkowe mikropłytki są korzystnym podejściem do identyfikacji regulatorów szlaku, umożliwiając ocenę wielu warunków w jednym eksperymencie. W tym przypadku dostosowaliśmy dobrze znany protokół obrazowania i kwantyfikacji makropinosomów do 96-dołkowego formatu mikropłytek i zapewniamy kompleksowy zarys automatyzacji przy użyciu wielomodowego czytnika płytek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zautomatyzowane obrazowanie i analiza w celu ilościowego oznaczania makropinosomów znakowanych fluorescencyjnie
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Makropinocytoza to niespecyficzny szlak absorpcji w fazie płynnej, który pozwala komórkom na internalizację dużych ładunków zewnątrzkomórkowych, takich jak białka, patogeny i resztki komórek, poprzez endocytozę masową. Szlak ten odgrywa istotną rolę w różnych procesach komórkowych, w tym w regulacji odpowiedzi immunologicznej i metabolizmie komórek rakowych. Biorąc pod uwagę to znaczenie dla funkcji biologicznych, badanie warunków hodowli komórkowej może dostarczyć cennych informacji poprzez identyfikację regulatorów tego szlaku i optymalizację warunków, które zostaną wykorzystane do odkrywania nowych podejść terapeutycznych. W badaniu opisano zautomatyzowaną technikę obrazowania i analizy przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego i wielotrybowego czytnika płytek do obrazowania komórek w celu szybkiej kwantyfikacji indeksu makropinocytarnego w przylegających komórkach. Zautomatyzowana metoda opiera się na wychwytywaniu dekstranu fluorescencyjnego o wysokiej masie cząsteczkowej i może być stosowana do 96-dołkowych mikropłytek w celu ułatwienia oceny wielu warunków w jednym eksperymencie lub utrwalonych próbkach zamontowanych na szklanych szkiełkach nakrywkowych. Takie podejście ma na celu maksymalizację odtwarzalności i zmniejszenie zmienności eksperymentalnej, a jednocześnie jest zarówno czasooszczędne, jak i opłacalne.
Wprowadzenie
Niespecyficzna ścieżka endocytozy, jaką jest makropinocytoza, umożliwia komórkom internalizację różnych komponentów zewnątrzkomórkowych, w tym składników odżywczych, białek, antygenów i patogenów, poprzez masowe pobieranie płynu zewnątrzkomórkowego i jego składników1. Choć jest ona istotna dla biologii wielu typów komórek, coraz częściej opisuje się, że ścieżka makropinocytozy odgrywa kluczową rolę w biologii nowotworów, gdzie dzięki pobieraniu makropinocytycznemu komórki nowotworowe są w stanie przetrwać i proliferować w środowisku mikrotoksycznym pozbawionym składników odżywczych2,3. ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie materiałów
- Rozpuścić dekstran 70 kDa znakowany FITC lub tetrametylorodaminą (TMR) w PBS, aby uzyskać roztwór o stężeniu 20 mg/mL. Alikwoty przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Rozpuścić DAPI w ddH2O, aby uzyskać roztwór o stężeniu 1 mg/mL. Alikwoty przechowywać w temperaturze -20 °C.
OSTROŻNIE: DAPI jest potencjalnym kancerogenem i należy z nim obchodzić się ostrożnie. - W dniu fiksacji przygotować świeży 3,7% formaldehyd klasy ACS w PBS.
OSTROŻNIE: Formaldehyd jest utrwalaczem, znanym kancerogenem i jest toksyczny w przypadku inhalacji. Roztwór należy przygotować w dygestorium chemicznym, aby uniknąć ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Jeśli kroki i dostosowania opisanego powyżej protokołu zostaną odpowiednio zastosowane, końcowe wyniki eksperymentalne powinny dostarczyć informacji o tym, czy badane warunki hodowli komórkowej lub inhibitory indukują bądź redukują makropinocytozę w badanej linii komórkowej. Aby wzmocnić wiarygodność tych ustaleń, uwzględnienie warunków kontrolnych pozwoli na weryfikację wyników w celu ustalenia, czy eksperyment został pomyślnie przeprowadzony. Kontrole indukcji makropinocytozy dostarczą informacji o względnym poziomie m.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jakość eksperymentów i pozyskiwania danych w dużym stopniu zależy od jakości odczynników, optymalizacji ustawień oraz czystości szkiełek nakrywkowych i mikropłytki. Końcowe wyniki powinny dawać minimalne różnice między kontrpróbami; Jednak zmiany biologiczne występują naturalnie lub mogą być spowodowane wieloma czynnikami. Zagęszczenie komórek może powodować, że komórki reagują mniej więcej na induktory lub inhibitory makropinocytozy. W związku z tym kluczowe znaczenie ma przestrzeganie 80-procentowej zbieżności, zgodnie.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
C.C. jest wynalazcą patentu zatytułowanego "Diagnostyka, terapia i odkrywanie leków związanych z makropinocytozą", nr patentu: 9,983,194.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty NIH/NCI (R01CA207189, R21CA243701) dla C.C. KMO.G. jest laureatem TRDRP Postdoctoral Fellowship Award (T30FT0952). BioTek Cytation 5 jest częścią Sanford Burnham Prebys Cell Imaging Core, który otrzymuje wsparcie finansowe z NCI Cancer Center Support Grant (P30 CA030199). Rysunki 1-3 zostały stworzone przy użyciu BioRender.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,25% Trypsyna | Corning | 25053CI | 0,1% EDTA w HBSS bez wodorowęglanu wapnia, magnezu i sodu |
| 1,5 ml Probówka do mikrowirówek | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 10 cm Naczynie do hodowli tkankowych | Greiner Bio-One | 664160 | CELLSTAR |
| 15 ml Probówka wirówkowa | Fisherbrand | 07-200-886 | |
| Zlewka 2 L | Fisherbrand | 02-591-33 | |
| 24-dołkowa płytka do hodowli tkankowych | Greiner Bio-One | 662160 | CELLSTAR |
| 25 ml Zbiornik na odczynnik | Genesee Scientific Corporation | 28-121 | |
| 500 ml Zlewka | Fisherbrand | 02-591-30 | |
| 6-centymetrowa miska do hodowli tkankowych | Greiner Bio-One | 628160 | CELLSTAR |
| 8-kanałowy adapter aspiracyjny | Integra Biosciences | 155503 | |
| 8-kanałowy adapter aspiracyjny do standardowych końcówek | Integra Biosciences | 159024 | |
| 95% etanolu | Decon Laboratories Inc | 4355226 | |
| Płyn do mycia szkła bez amoniaku | Sparkle | FUN20500CT | |
| Black 96-dołkowa mikropłytka przesiewowa o wysokiej zawartości | PerkinElmer | 6055300 | CellCarrier-96 Ultra |
| Aplikator z bawełnianą końcówką | Fisherbrand | 23-400-101 | |
| Szkiełka nakrywkowe | Fisherbrand | 12-545-80 | o średnicy 12 mm |
| Cytation 5 Obrazowanie komórek Czytnik wielomodowy | Biotek | CYT5FW | |
| DAPI | Millipore Sigma | 5.08741 | |
| Dekstran 70 kDa - FITC | Life Technologies | D1822 | Utrwalany lizyną |
| Dekstran 70 kDa - TMR | Life Technologies | D1819 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D1435 | |
| DPBS | Corning | 21031CV | wapniowych i magnezowych |
| Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 | |
| Formaldehyd, 37% | Ricca Chemical | RSOF0010-250A | ACS Odczynnik do |
| glicerolu | Fisher BioReagents | BP229-1 | |
| Utwardzające fluorescencyjne media montażowe | Agilent Tech | S302380-2 | DAKO |
| Hoechst 33342 | Millipore Sigma | B2261 | |
| Kwas solny (HCl) | Fisher Chemical | A144-212 | Certyfikowany ACS Plus, 36.5%– 38.0% |
| Niestrzępiące się chusteczki | Kimberly-Clark | 34155 | Kimwipes |
| Szkiełka Miscroscope | Fisherbrand | 12-544-1 | Wysokiej jakości szklana pipeta |
| wielokanałowa | Gilson | FA10013 | 8 kanałów, 0,5– 10 &mikro; L |
| Pipeta wielokanałowa | Gilson | FA10012 | 12 kanałów, 20– 200 i mikro; L |
| Pipeta wielokanałowa | Gilson | FA10011 | 8 kanałów, 20– 200 i mikro; L |
| Parafilm M | Pechiney | PM996 | |
| Folia plastikowa | Kirkland Signature | 208733 | Stretch-Tite |
| Izolatory silikonowe | Grace Bio Labs Inc | 664107 | 13 mm Średnica X 0,8 mm ID głębokości, 25 mm X 25 mm |
| Adapter suwaka | Biotek | 1220548 | |
| Butelka do mycia | Fisherbrand | FB0340922C |
Bibliografia
- Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences. Membranes. 10 (8), 21(2020).
- Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontier....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
