Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowane obrazowanie i analiza w celu ilościowego oznaczania makropinosomów znakowanych fluorescencyjnie

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62828

⸱

24 sierpnia 2021

 ,  ,  , 
1Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, NCI-designated Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Zautomatyzowane testy wykorzystujące wielodołkowe mikropłytki są korzystnym podejściem do identyfikacji regulatorów szlaku, umożliwiając ocenę wielu warunków w jednym eksperymencie. W tym przypadku dostosowaliśmy dobrze znany protokół obrazowania i kwantyfikacji makropinosomów do 96-dołkowego formatu mikropłytek i zapewniamy kompleksowy zarys automatyzacji przy użyciu wielomodowego czytnika płytek.

Streszczenie

Makropinocytoza to niespecyficzny szlak absorpcji w fazie płynnej, który pozwala komórkom na internalizację dużych ładunków zewnątrzkomórkowych, takich jak białka, patogeny i resztki komórek, poprzez endocytozę masową. Szlak ten odgrywa istotną rolę w różnych procesach komórkowych, w tym w regulacji odpowiedzi immunologicznej i metabolizmie komórek rakowych. Biorąc pod uwagę to znaczenie dla funkcji biologicznych, badanie warunków hodowli komórkowej może dostarczyć cennych informacji poprzez identyfikację regulatorów tego szlaku i optymalizację warunków, które zostaną wykorzystane do odkrywania nowych podejść terapeutycznych. W badaniu opisano zautomatyzowaną technikę obrazowania i analizy przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego i wielotrybowego czytnika płytek do obrazowania komórek w celu szybkiej kwantyfikacji indeksu makropinocytarnego w przylegających komórkach. Zautomatyzowana metoda opiera się na wychwytywaniu dekstranu fluorescencyjnego o wysokiej masie cząsteczkowej i może być stosowana do 96-dołkowych mikropłytek w celu ułatwienia oceny wielu warunków w jednym eksperymencie lub utrwalonych próbkach zamontowanych na szklanych szkiełkach nakrywkowych. Takie podejście ma na celu maksymalizację odtwarzalności i zmniejszenie zmienności eksperymentalnej, a jednocześnie jest zarówno czasooszczędne, jak i opłacalne.

Wprowadzenie

Niespecyficzna ścieżka endocytozy, jaką jest makropinocytoza, umożliwia komórkom internalizację różnych komponentów zewnątrzkomórkowych, w tym składników odżywczych, białek, antygenów i patogenów, poprzez masowe pobieranie płynu zewnątrzkomórkowego i jego składników1. Choć jest ona istotna dla biologii wielu typów komórek, coraz częściej opisuje się, że ścieżka makropinocytozy odgrywa kluczową rolę w biologii nowotworów, gdzie dzięki pobieraniu makropinocytycznemu komórki nowotworowe są w stanie przetrwać i proliferować w środowisku mikrotoksycznym pozbawionym składników odżywczych2,3. Pobieranie zewnątrzkomórkowych makrocząsteczek, w tym albuminy i macierzy zewnątrzkomórkowej, a także szczątków komórek nekrotycznych, zapewnia alternatywne źródło składników odżywczych do produkcji biomasy poprzez wytwarzanie aminokwasów, cukrów, lipidów i nukleotydów w procesie katabolizmu ładunku zapośredniczonego przez fuzję makropinosomów z lizosomami4,5,6,7,8.

Indukcja i regulacja makropinocytozy są złożone i mogą różnić się w zależności od kontekstu komórkowego. Do tej pory zidentyfikowano kilka induktorów makropinocytozy, do których należą ligandy, takie jak czynnik wzrostu naskórka (EGF), czynnik wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGF), galektyna-3 oraz Wnt3A9,10,11,12,13. Ponadto warunki hodowli naśladujące mikrośrodowisko guza mogą wywołać aktywację tej ścieżki. Guzy gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC) charakteryzują się niedoborem składników odżywczych, zwłaszcza aminokwasu glutaminy, co zmusza zarówno komórki nowotworowe, jak i fibroblasty związane z nowotworem (CAFs) do polegania na makropinocytozie w celu przetrwania7,13,14,15. Co więcej, stresy nowotworowe, takie jak hipoksja i stres oksydacyjny, mogą aktywować tę ścieżkę wychwytu substancji16. Oprócz licznych czynników zewnętrznych, które mogą indukować makropinocytozę, za tworzenie makropinosomów odpowiada szereg ścieżek wewnątrzkomórkowych. Transformacja zależna od onkogennego Ras jest wystarczająca do uruchomienia mechanizmu makropinocytozy, a w wielu typach nowotworów występuje konstytutywna makropinocytoza napędzana przez onkogenny Ras4,5,9,17. Alternatywnie, zidentyfikowano aktywację Ras typu dzikiego oraz ścieżki niezależne od Ras, które aktywują makropinocytozę w komórkach nowotworowych i CAFs10,11,15,18. Zastosowanie różnych modeli in vitro w połączeniu z traktowaniem inhibitorami pozwoliło na zidentyfikowanie kilku modulatorów makropinocytozy, wśród których znajdują się wymienniki sodowo-wodorowe, mała GTPaza Rac1, fosfoinozytydo-3-kinaza (PI3K), kinaza aktywowana przez p21 (Pak) oraz kinaza białkowa aktywowana przez AMP (AMPK)4,13,15. Jednak biorąc pod uwagę wielość opisanych czynników i warunków regulujących makropinocytozę, można przypuszczać, że wiele innych modulatorów i bodźców pozostaje nieodkrytych. Identyfikacja nowych modulatorów i bodźców może zostać ułatwiona dzięki zautomatyzowanej ocenie wielu warunków w ramach jednego eksperymentu. Metodologia ta może rzucić światło na czynniki zaangażowane w tworzenie makropinosomów i pozwolić na odkrycie nowych cząsteczek małocząsteczkowych lub leków biologicznych celujących w tę ścieżkę.

W niniejszej pracy zaadaptowaliśmy nasz wcześniej opracowany protokół do określania zakresu makropinocytozy w komórkach nowotworowych in vitro do formatu mikropłytek 96-dołkowych oraz zautomatyzowanego obrazowania i kwantyfikacji19,20. Protokół ten opiera się na mikroskopii fluorescencyjnej, która stała się standardem w badaniu makropinocytozy in vitro oraz in vivo4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18,19,20,21,22. Makropinosomy można odróżnić od innych szlaków endocytozy dzięki ich zdolności do internalizacji dużych makrocząsteczek, takich jak dekstran o wysokiej masie cząsteczkowej (tj. 70 kDa)2,3,4,20,21,22,23. Zatem makropinosomy można zdefiniować poprzez wychwyt podanego zewnątrzkomórkowo dekstranu 70 kDa znakowanego fluorophorem. W rezultacie pęcherzyki makropinocytyczne objawiają się jako wewnątrzkomórkowe skupiska fluorescencyjnych punktów o rozmiarach od 0,2-5 µm. Punkty te mogą być obrazowane mikroskopowo, a następnie kwantyfikowane w celu określenia zakresu makropinocytozy w komórce – tzw. „indeksu makropinocytycznego”.

W niniejszym protokole opisano kluczowe etapy wizualizacji makropinosomów w adherentnych komórkach in vitro na mikropłytkach 96-dołkowych oraz szkiełkach podstawowych z wykorzystaniem standardowego sprzętu laboratoryjnego (Rycina 1). Ponadto przedstawiono instrukcje dotyczące automatyzacji akwizycji obrazów i kwantyfikacji indeksu makropinocytozy przy użyciu wielomodułowego czytnika płytek do obrazowania komórek. Automatyzacja ta pozwala na skrócenie czasu, obniżenie kosztów i zmniejszenie nakładu pracy w porównaniu z naszymi wcześniej opisanymi protokołami19,20. Dodatkowo zapobiega ona niezamierzonej stronniczości w akwizycji i analizie obrazów, co zwiększa powtarzalność i wiarygodność wyników. Metodę tę można łatwo dostosować do różnych typów komórek lub czytników płytek, a także wykorzystać do określania innych cech makropinosomów, takich jak ich rozmiar, liczba i lokalizacja. Opisana tutaj metoda jest szczególnie odpowiednia do przesiewania warunków hodowli komórkowej indukujących makropinocytozę, identyfikacji nowych modulatorów lub optymalizacji stężeń leków w przypadku znanych inhibitorów.

Schemat poboru dekstranu znakowanego fluoroforem z formatami płytek 24- i 96-dołkowych oraz procesem obrazowania.
Rysunek 1: Schemat zautomatyzowanego testu do wyznaczania „indeksu makropinocytozy” w komórkach adherentnych. Utworzono przy użyciu BioRender. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie materiałów

  1. Rozpuścić dekstran 70 kDa znakowany FITC lub tetrametylorodaminą (TMR) w PBS, aby uzyskać roztwór o stężeniu 20 mg/mL. Alikwoty przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Rozpuścić DAPI w ddH2O, aby uzyskać roztwór o stężeniu 1 mg/mL. Alikwoty przechowywać w temperaturze -20 °C.
    OSTROŻNIE: DAPI jest potencjalnym kancerogenem i należy z nim obchodzić się ostrożnie.
  3. W dniu fiksacji przygotować świeży 3,7% formaldehyd klasy ACS w PBS.
    OSTROŻNIE: Formaldehyd jest utrwalaczem, znanym kancerogenem i jest toksyczny w przypadku inhalacji. Roztwór należy przygotować w dygestorium chemicznym, aby uniknąć wdychania oparów, i obchodzić się z nim ostrożnie.
  4. Przygotować szkiełka nakrywkowe płukane kwasem.
    1. Używając zlewki 500 mL i łaźni wodnej, podgrzewać 28 g borokrzemowych szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm i grubości #1,5 przez 24 h w temperaturze 56 °C w 100 mL 1 M HCl. Zlewekę szczelnie owinąć folią spożywczą, aby uniknąć nadmiernego odparowania.
      OSTROŻNIE: HCl jest silnym kwasem, który jest silnie żrący, dlatego należy z nim obchodzić się ostrożnie i używać go w dygestorium chemicznym, aby uniknąć inhalacji.
    2. Przemyć szkiełka nakrywkowe wodą destylowaną. Powtórzyć płukanie 4 razy. Następnie przemyć szkiełka nakrywkowe 95% etanolem. Powtórzyć płukanie 4 razy.
    3. Przechowywać szkiełka nakrywkowe płukane kwasem w naczyniu do hodowli komórkowej w temperaturze pokojowej do późniejszego użycia, utrzymując sterylność poprzez zanurzenie w 95% etanolu. Naczynie szczelnie zamknąć parafilmem, aby uniknąć nadmiernego odparowania.

2. Przygotowanie komórek

  1. Używając w pełni zrośniętej kultury komórek adhezyjnych na 10 cm płytce hodowlanej, odessać pożywkę i wypłukać komórki 5 mL DPBS uprzednio ogrzanego do 37 °C.
  2. Odczepić komórki od płytki, dodając 1,5 mL ogrzanej trypsyny 0,25% i inkubując w 37 °C.
    UWAGA: Czas inkubacji z trypsyną wymagany do odczepienia badanych komórek należy wyznaczyć empirycznie; można go potwierdzić, obserwując odczepianie komórek pod zwykłym mikroskopem świetlnym.
  3. Zebrać komórki do 15 mL probówki wirówkowej i dodać 4,5 mL pełnej pożywki w celu zneutralizowania trypsyny.
  4. Osadzić komórki poprzez wirowanie przez 3 min przy 200 x g, a następnie odessać nadsącz.
  5. Resuspendować osad komórkowy w odpowiedniej objętości ogrzanej pełnej pożywki, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek do wysiewu.
  6. Przejść do wysiewu komórek na płytkę 24-dołkową z szkiełkami nakrywkowymi lub w formacie mikropłytki 96-dołkowej (Rysunek 1).
    UWAGA: Liczbę wysiewanych komórek należy wyznaczyć empirycznie dla każdej linii komórkowej, ponieważ tempo proliferacji i wielkość komórek różnią się między liniami. Niniejszy protokół został zoptymalizowany dla adhezyjnych komórek nowotworowych o 80% konfluencji w dniu znakowania makropinosomów. Konfluencja komórek może wpływać na zdolność do makropinocytozy, co również należy wyznaczyć empirycznie.
    1. Format płytki 24-dołkowej ze szkiełkami nakrywkowymi
      1. Umieścić szkiełka nakrywkowe w 24-dołkowej płytce hodowlanej; za pomocą pęsety chwytać pojedyncze szkiełko z kąpieli etanolowej. Stukać szkiełkiem o wewnętrzną ściankę płytki, aby usunąć nadmiar etanolu, a następnie położyć je płasko na dnie dołka.
      2. Pozostawić etanol do odparowania i wypłukać szkiełko 2 razy DPBS.
      3. Wysiać komórki na szkiełko, dodając 500 µL zawiesiny komórkowej do każdego dołka. Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w 37 °C i 5% CO2 aż do osiągnięcia konfluencji na poziomie 60%-80% w dniu poprzedzającym znakowanie makropinosomów.
      4. W dniu poprzedzającym znakowanie makropinosomów odessać pożywkę z dołków, dodać 500 µL ogrzanej pożywki bezzerowej do każdego dołka i inkubować komórki w 37 °C i 5% CO2 przez 16-24 h.
        UWAGA: W zależności od badanych warunków zaleca się stosowanie pożywki bezzerowej, aby zmniejszyć wpływ czynników wzrostu, które mogą indukować makropinocytozę i które są zazwyczaj obecne w surowicy. Należy jednak wziąć pod uwagę, że głodzenie surowicze może wpływać na inne procesy komórkowe, takie jak proliferacja i autofagia. Ponieważ resztkowa surowica może wpływać na zdolność makropinocytyczną komórek, a także na aktywność inhibitorów, usunięcie surowicy można usprawnić poprzez delikatne wypłukanie komórek 1 lub 2 razy 500 µL ogrzanego DPBS.
    2. Format mikropłytki 96-dołkowej
      1. Przenieść zawiesinę komórkową do 25 mL zbiornika na odczynniki. Używając pipety wielokanałowej (8 lub 12 kanałów), wysiać 100 µL zawiesiny komórkowej do każdego dołka czarnej 96-dołkowej mikropłytki do wysokoprzepustowego screeningu (high-content screening) z optycznie przejrzystym dnem z cyklicznej olefiny lub szkła.
      2. Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w 37 °C i 5% CO2 aż do osiągnięcia konfluencji na poziomie 60%-80% w dniu poprzedzającym znakowanie makropinosomów.
      3. W dniu poprzedzającym znakowanie makropinosomów usunąć i odrzucić pożywkę z każdego dołka, używając pipety wielokanałowej (8 lub 12 kanałów) lub wielokanałowego adaptera aspiracyjnego do standardowych końcówek podłączonego do pompy próżniowej.
      4. Używając zbiornika na odczynniki i pipety wielokanałowej (8 lub 12 kanałów), delikatnie dodać 100 µL ogrzanej pożywki bezzerowej do każdego dołka. Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w 37 °C i 5% CO2 przez 16-24 h.
        UWAGA: W zależności od badanych warunków zaleca się stosowanie pożywki bezzerowej, aby zmniejszyć wpływ czynników wzrostu, które mogą indukować makropinocytozę i które są zazwyczaj obecne w surowicy. Należy jednak wziąć pod uwagę, że głodzenie surowicze może wpływać na inne procesy komórkowe, takie jak proliferacja i autofagia. Ponieważ resztkowa surowica może wpływać na zdolność makropinocytyczną komórek, a także na aktywność inhibitorów, usunięcie surowicy można usprawnić poprzez delikatne wypłukanie komórek 1 lub 2 razy 100 µL ogrzanego DPBS.

3. Znakowanie makropinosomów

  1. Płytka 24-dołkowa w formacie z szkiełkami podstawowymi
    1. Odssać medium z dołków i dodać z powrotem 200 µL medium bezsurowiczego z dodatkiem 1 mg/mL znakowanego fluorophorem dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej (70 kDa). Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C na 30 min.
      UWAGA: W zależności od badanych warunków, zamiast stosowania świeżego medium, preferowane może być ponowne wykorzystanie medium kondycjonowanego do obciążania dekstranem, ponieważ zawiera ono czynniki wydzielane lub suplementowane, takie jak odpowiednio EGF lub związki inhibitorowe, które mogą wpływać na zdolność makropinocytozy komórek.
    2. Odssać medium i delikatnie, lecz szybko przemyć komórki 5 razy lodowatym PBS za pomocą schłodzonej butelki do płukania. Podczas płukania mocno potrząsać płytką ręcznie, aby pomóc w usunięciu agregatów dekstranu, które przywarły do szkiełek podstawowych.
    3. Utrwalić komórki, dodając 350 µL 3,7% formaldehydu i inkubując przez 20 min. Następnie odssać roztwór utrwalający i dwukrotnie przemyć komórki PBS.
    4. Przebarwić jądra komórkowe za pomocą 350 µL roztworu 2 µg/mL DAPI w PBS. Po 20 min odssać roztwór DAPI i trzykrotnie przemyć komórki PBS.
    5. Przykleić izolatory silikonowe obok siebie na szkiełku mikroskopowym, aby uzyskać równomierne odstępy i powtarzalną lokalizację szkiełek podstawowych, co jest niezbędne do automatyzacji obrazowania (Rysunek 2A,B).
      UWAGA: Na całym szkiełku mikroskopowym można umieścić łącznie 3 izolatory.
    6. Dla każdego szkiełka podstawowego nanieść kroplę twardniejącego medium montażowego do fluorescencji na szkiełko mikroskopowe w wolnej przestrzeni izolatora (Rysunek 2C). Podnieść szkiełko podstawowe pęsetą i usunąć nadmiar PBS, delikatnie stukając bokiem szkiełka o chusteczkę bezpyłową.
    7. Umieścić szkiełko podstawowe odwrócone do góry dnem na kropli medium montażowego (Rysunek 2D). Delikatnie opukać szkiełko zamkniętą pęsetą, aby usunąć pęcherzyki powietrza z medium montażowego (Rysunek 2E).
    8. Przechowywać szkiełka w ciemnym miejscu i pozwolić medium montażowemu wyschnąć w temperaturze pokojowej, co zazwyczaj trwa 16-24 h. Szkiełka można teraz obrazować lub przechowywać w temperaturze -20 °C do 2 tygodni.
    9. Przed obrazowaniem usunąć izolatory ze szkiełka mikroskopowego. Pozostawić szkiełka do wyrównania temperatury do temperatury pokojowej i oczyścić szkiełka podstawowe za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką zwilżonej bezamonowym środkiem do mycia szkła. Następnie użyć czystego aplikatora z bawełnianą końcówką zwilżonej 70% etanolem, aby oczyścić i osuszyć szkiełko podstawowe.

Schemat przygotowania TLC; kroki A-E, płytka krzemionkowa, aplikacja rozpuszczalnika, ustawienie chromatografii.
Rysunek 2: Umieszczanie szkiełek nakrywkowych na szkiełku przedmiotowym z izolatorami silikonowymi. (A) Izolatory silikonowe są dociskane i przyklejane do szkiełka przedmiotowego. (B) Na całym szkiełku przedmiotowym można umieścić łącznie 3 izolatory, co zapewnia równomierne odstępy i powtarzalną lokalizację szkiełek nakrywkowych. (C) Dla każdego szkiełka nakrywkowego należy nanieść kroplę medium montażowego do fluorescencji na szkiełko przedmiotowe w wolnej przestrzeni izolatora. (D) Za pomocą pęsety należy pobrać szkiełko nakrywkowe z płytki 24-dołkowej i położyć je odwrócone do góry dnem na kropli medium montażowego. (E) W przypadku obecności pęcherzyków powietrza między szkiełkiem nakrywkowym a przedmiotowym, należy delikatnie stuknąć w szkiełko nakrywkowe zamkniętą pęsetą, aby usunąć pęcherzyki. Utworzono przy użyciu BioRender. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Format mikropłytki 96-dołkowej
    1. Odssać zawartość dołków za pomocą wielokanałowego adaptera aspiracyjnego podłączonego do pompy próżniowej i dodać do dołków 40 µL pożywki bez surowicy z dodatkiem 1 mg/mL znakowanego fluorophorem dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej (70 kDa). Inkubować komórki w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C przez 30 min.
      UWAGA: W zależności od badanych warunków, zamiast świeżej pożywki, można preferować ponowne użycie pożywki kondycjonowanej do ładowania dekstranu, ponieważ zawiera ona wydzielone lub dodane czynniki, takie jak odpowiednio EGF lub związki inhibitorowe, które mogą wpływać na zdolność makropinocytozy komórek.
    2. Usunąć pożywkę z mikropłytki poprzez ręczne odwrócenie płyty do góry dnem i energiczne potrząśnięcie nad pustym zlewkiem o pojemności 5 L (Ryc. 3A).
    3. Przepłukać komórki w mikropłytce poprzez powolne zanurzenie płyty pionowo, pod lekkim kątem, w zlewce o pojemności 2 L wypełnionej lodowatym PBS (Ryc. 3B), a następnie usunąć PBS z mikropłytki poprzez odwrócenie płyty do góry dnem i potrząśnięcie nad zlewkiem 5 L (Ryc. 3C). Powtórzyć 2 razy.
      UWAGA: Komórki słabo przylegające do mikropłytki do obrazowania mogą odkleić się podczas tego procesu. W razie potrzeby dołków można również odessać zawartość za pomocą wielokanałowego adaptera aspiracyjnego lub delikatniej przemyć je PBS za pomocą pipety wielokanałowej. Przetwarzanie jednej mikropłytki 96-dołkowej wymaga około 2 L lodowatego PBS. W przypadku analizy większej liczby płytek należy użyć większego zlewka i dodać 1 L lodowatego PBS dla każdej dodatkowej płytki lub wymieniać lodowaty PBS w razie potrzeby.
    4. Po usunięciu PBS z ostatniego płukania, utrwalić komórki przez 20 min w temperaturze pokojowej, dodając do każdego dołka 100 µL 3,7% formaldehydu w PBS, korzystając z 25 mL rezerwuaru na odczynniki i pipety wielokanałowej (Ryc. 3D).
    5. Usunąć roztwór utrwalający i dwukrotnie przemyć komórki PBS, stosując technikę zanurzania i potrząsania. Przebarwić jądra komórkowe za pomocą 100 µL DAPI w stężeniu 2 µg/mL w PBS na dołek.
    6. Po 20 min trzykrotnie przepłukać komórki lodowatym PBS, stosując opisaną powyżej technikę zanurzania i potrząsania (krok 3.2.3). Usunąć resztki PBS, uderzając mikropłytką odwróconą do góry dnem o chusteczkę bezpyłową, a następnie dodać 100 µL świeżego PBS do każdego dołka, używając 25 mL rezerwuaru na odczynniki i pipety wielokanałowej. Wykonać obrazowanie komórek teraz lub przechowywać je w ciemności w temperaturze 4 °C do jednego tygodnia.
      UWAGA: Alternatywnie, do obrazowania i przechowywania można użyć roztworu glicerolu w PBS (zamiast samego PBS), aby lepiej ustabilizować fluorescencję (Ryc. 4A).
    7. Przed obrazowaniem pozwolić płytce wyrównać temperaturę do temperatury pokojowej. Osuszyć mikropłytkę chusteczką bezpyłową.

Proces fiksacji komórek, schemat płukania płytki wielodołkowej, fiksacja formaldehydem, procedura laboratoryjna.
Rysunek 3: Płukanie mikropłytki 96-dołkowej w celu przygotowania do fiksacji. (A) Usunięcie medium z mikropłytki do zlewki o pojemności 5 L poprzez ręczne potrząsanie i odwracanie. (B) Powolne zanurzenie mikropłytki w zlewce o pojemności 2 L wypełnionej lodowatym PBS, trzymając ją pionowo i pod lekkim kątem. (C) Usunięcie PBS z mikropłytki do zlewki o pojemności 5 L poprzez ręczne potrząsanie i odwracanie. Powtórzenie etapów płukania opisanych w punkcie B dwukrotnie. (D) Po ostatnim usunięciu PBS z mikropłytki, dodanie 100 µL 3,7% formaldehydu do dołków za pomocą pipety wielokanałowej. Utworzono przy użyciu BioRender. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Zautomatyzowane obrazowanie makropinosomów

Obrazy makropinosomów można zarejestrować przy użyciu standardowego mikroskopu fluorescencyjnego, zgodnie z wcześniejszymi opisami19,20. Procedurę tę można jednak usprawnić pod kątem wydajności poprzez automatyzację, zwłaszcza podczas oceny wielu różnych warunków hodowli komórkowych. Automatyzacja akwizycji obrazów może zostać zrealizowana za pomocą wielofunkcyjnego czytnika płytek do obrazowania komórek, co zmniejsza nakład pracy poprzez ograniczenie procedur manipulacyjnych i, co istotne, zwiększa odtwarzalność oraz wiarygodność danych dzięki obiektywnemu pozyskiwaniu obrazów. Na rynku dostępnych jest wiele systemów obrazowania, a instrukcje będą się różnić w zależności od urządzenia. W niniejszej pracy opisano akwizycję obrazów z wykorzystaniem systemu Cytation 5. Poniższy protokół można jednak dostosować do każdego konkretnego instrumentu, stosując się do następujących wytycznych:

  1. Utwórz protokół automatyzacji w celu pozyskania obrazów przy użyciu obiektywu powietrznego 40x w kanale długości fali odpowiadającym fluoroforowi dekstranu (FITC/TMR) oraz DAPI.
    UWAGA: Powszechnie stosowany inhibitor makropinocytozy EIPA wykazuje autofluorescencję w kanale FITC, szczególnie po uprzednim pobudzeniu w kanale DAPI. Inne testowane związki mogą również wykazywać autofluorescencję. Aby uniknąć tego problemu, pomocne jest ustawienie akwizycji obrazu tak, aby odbywała się ona najpierw w kanale o najwyższej długości fali pobudzenia (FITC/TMR), a następnie w kanale DAPI.
  2. Zoptymalizuj ustawienia czasu ekspozycji, korzystając z próbki, w której przewiduje się najwyższy poziom makropinocytozy, aby uniknąć prześwietlenia, które może prowadzić do nasycenia sygnału i utraty danych o intensywności. Zastosuj ustawienia ostrzenia, które szybko i spójnie lokalizują próbkę, aby uzyskać obrazy wysokiej jakości.
  3. Pozyskaj wiele obrazów z każdej studni lub szkiełka nakrywkowe, aby uwzględnić zmienność próbki i uzyskać jej dokładną reprezentację.
  4. Po ustaleniu ustawień obrazowania zastosuj te same parametry dla każdej próbki w ramach eksperymentu.
  5. Postępuj zgodnie z poniższymi instrukcjami pozyskiwania obrazów makropinosomów podczas korzystania z urządzenia Cytation 5 i oprogramowania Gen5:
    1. Płytka 24-dołkowa w formacie ze szkiełkami nakrywowymi
      1. Uruchom czytnik płytek i włóż szkiełka mikroskopowe do góry dnem, korzystając z uchwytu na szkiełka.
      2. Otwórz oprogramowanie do czytania mikropłytek i obrazowania, utwórz nowy protokół, klikając Protocols, a następnie Create New. Kliknij dwukrotnie Procedure i wybierz typ płytki.
        UWAGA: Jeśli typ płytki jest niedostępny, dodaj go do oprogramowania, klikając System > Plate Types > Add Plate i wprowadzając wymiary płytki podane przez producenta. Dla ułatwienia w Supplementary File 1 udostępniono szablon dla dwóch szkiełek mikroskopowych z trzema szkiełkami nakrywowymi rozmieszczonymi za pomocą izolatorów silikonowych.
      3. Aby uzyskać dostęp do ustawień obrazowania, wybierz Actions > Image > Inverted imager i kliknij OK. Użyj obiektywu 40x, PL FL Phase z ustawieniami Wide FOV oraz Autofocus Binning.
      4. Dla pierwszego kanału wybierz kostkę LED odpowiadającą znacznikowi fluoroforowemu dekstranu (GFP lub RFP). Odznacz Auto Exposure i kliknij przycisk z ikoną mikroskopu, aby zoptymalizować ustawienia ekspozycji. Po ustaleniu odpowiednich ustawień ekspozycji kliknij Save Settings.
        UWAGA: Dostosuj ustawienia ekspozycji, korzystając z próbki, w której przewiduje się najwyższy poziom makropinocytozy, aby uniknąć prześwietlonych obrazów, co może skutkować nasyceniem sygnału i utratą danych o intensywności.
      5. Powtórz poprzedni krok dla drugiego kanału, korzystając z kostki LED dla DAPI.
      6. Ustaw parametry autofokusa dla każdego kanału fluorescencji, wybierając Focus Options. Odznacz domyślną metodę ostrzenia i użyj Autofocus with Optional Scan oraz Autofocus without Optional Scan odpowiednio dla kanału fluoroforu dekstranu i kanału DAPI. Kliknij OK , aby zapisać ustawienia.
        UWAGA: Odległość skanowania można zmniejszyć do 200 µm, a przyrost do 20 µm, aby zwiększyć wydajność autofokusa. Opcjonalne skanowanie jest wymagane do prawidłowego ustawienia ostrości w próbkach o niskiej fluorescencji. Dzieje się to zazwyczaj podczas analizy warunków z niską makropinocytozą, np. gdy makropinocytoza jest hamowana lub nie występuje naturalnie.
      7. Użyj opcji Define Beacons, aby zautomatyzować pozyskiwanie obrazów z różnych obszarów szkiełka nakrywkowe. Kliknij ikonę mikroskopu i dodaj punkty orientacyjne (beacons), klikając w oknie obrazu i przesuwając stolik do następnego obszaru. Po wybraniu odpowiedniej liczby obszarów przejdź do następnego szkiełka nakrywkowe i powtórz proces. Na koniec kliknij Save Settings.
        UWAGA: Aby uzyskać dobrą reprezentację makropinocytozy w całej próbce, wybierz około 20 punktów orientacyjnych równomiernie rozłożonych na szkiełku nakrywowym (Rysunek 4B). Można użyć mniejszej liczby punktów, ale niektóre obrazy mogą wymagać wykluczenia z analizy po akwizycji ze względu na różnice w jakości, np. gdy obraz jest nieostry lub zawiera pęcherzyki powietrza, fluorescencyjne plamy lub smugi.
      8. Aby zakończyć regulację ustawień obrazowania, kliknij OK. Aby obrazować szkiełka nakrywkowe, wybierz Create a New Experiment and Read Now z menu Protocol Tools. Zapisz protokół i eksperyment, gdy zostaniesz o to poproszony.

Fluorescencja w zależności od stężenia glicerolu, wykres słupkowy i schemat rozmieszczenia punktów referencyjnych.
Rysunek 4: Optymalizacja warunków akwizycji obrazów. (A) Zwiększenie stężenia glicerolu zwiększa fluorescencję TMR-dekstranu, co określono w komórkach AsPC-1 traktowanych EGF. (B) Przykładowe współrzędne punktów referencyjnych (beacon) do automatycznej akwizycji obrazów przy zastosowaniu formatu płytki 24-dołkowej z szkiełkami nakrywkowymi. Wykres słupkowy przedstawia średnią względną fluorescencję wraz z SEM z 5 eksperymentów. Istotność statystyczną określono za pomocą dwuczynnikowej analizy ANOVA względem PBS. ** p < 0,01; *** p < 0,001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Format mikropłytek 96-dołkowych
    1. Uruchom czytnik płytek i włóż mikropłytkę.
    2. Otwórz oprogramowanie czytnika mikropłytek i obrazowania, utwórz nowy protokół, klikając Protocols, a następnie Create New. Dwukrotnie kliknij Procedure i wybierz typ płytki.
      UWAGA: Jeśli typ płytki jest niedostępny, dodaj go do oprogramowania, klikając System > Plate Types > Add Plate i wprowadzając wymiary płytki podane przez producenta. Dla ułatwienia w Supplementary File 2 udostępniono szablon dla mikropłytek CellCarrier-96 Ultra firmy PerkinElmer.
    3. Aby uzyskać dostęp do ustawień obrazowania, wybierz Actions > Image > Inverted Imager i kliknij OK. Użyj obiektywu 40x PL FL Phase z ustawieniami Wide FOV oraz Autofocus Binning.
    4. Dla pierwszego kanału wybierz kostkę LED odpowiadającą fluoroforowi znakującemu dekstran (GFP lub RFP). Odznacz Auto Exposure i kliknij przycisk z ikoną mikroskopu, aby zoptymalizować ustawienia ekspozycji. Po ustaleniu odpowiednich ustawień ekspozycji kliknij Save Settings.
      UWAGA: Podczas optymalizacji ustawień ekspozycji może dojść do znacznego blaknięcia fluorescencji. Może to doprowadzić do ustawień powodujących prześwietlenie podczas obrazowania nowego pola. Należy zatem zweryfikować ustawienia ekspozycji, sprawdzając pole, które nie było jeszcze naświetlane, i upewniając się, że przy wybranych ustawieniach nie występuje nasycenie sygnału. Do kwantyfikacji makropinosomów nie należy włączać dołków użytych do optymalizacji ustawień ekspozycji, ponieważ w wyniku blaknięcia podczas optymalizacji fluorescencja uległa zmniejszeniu. Ustawienia ekspozycji należy dostosować, używając próbki, w której przewiduje się najwyższy poziom makropinocytozy, aby uniknąć prześwietlonych obrazów, które mogą skutkować nasyceniem sygnału i utratą danych o intensywności.
    5. Powtórz poprzedni krok dla drugiego kanału, korzystając z kostki LED dla DAPI.
    6. Ustaw parametry autofokusa dla każdego kanału fluorescencji, wybierając Focus Options. Odznacz domyślną metodę ostrzenia i wybierz Laser Autofocus. Wykonaj skan referencyjny po ustaleniu płaszczyzny ogniskowania dla optymalnej wizualizacji makropinosomów i jąder komórkowych. Kliknij OK , aby zapisać ustawienia.
      UWAGA: Aby zwiększyć wydajność autofokusa, można zmniejszyć odległość skanowania do 400 µm, a przyrost do 3 µm. Aby opcja laserowego autofokusa działała prawidłowo, przed obrazowaniem należy oczyścić dno płytki, osuszyć ją i przetrzeć ściereczką beztkaninową. Laserowy autofokus jest lepszą metodą ostrzenia, ponieważ wymaga minimalnego czasu na znalezienie płaszczyzny ogniskowania. Można stosować inne metody ostrzenia, jednak ze względu na brak dodatku środków zapobiegających blaknięciu (anti-fade) do dołków, metody te mogą spowodować znaczne blaknięcie próbek, co negatywnie wpłynie na zbieranie danych.
    7. Ustaw przesunięcie poziome i pionowe na zero, a w sekcji Single Image wybierz Montage z opcją No Overlap i użyj układu 3 x 3 obrazów, w zależności od tego, ile komórek ma zostać uwzględnionych w analizie.
      UWAGA: W zależności od wielkości i gęstości komórek można wykonać więcej lub mniej obrazów, aby uzyskać reprezentatywną ocenę makropinocytozy w całej próbce. Podczas oceny makropinocytozy w komórkach AsPC-1 lub MIA PaCa-2 w różnych warunkach nie zaobserwowano różnic w interpretacji danych między ramką zdjęć 2 x 2 a 4 x 4, choć zmienność między próbkami powtórzonymi może wzrosnąć przy wykonywaniu mniejszej liczby zdjęć (Rysunek 5A,B). Zwiększenie lub zmniejszenie rozmiaru ramki wpłynie na czas skanowania płytki. W zależności od czasu ekspozycji całkowite zeskanowanie mikropłytki 96-dołkowej przy użyciu ramki 3 x 3 zajmie około 1-1,5 h. Ramka 2 x 2 i 4 x 4 odpowiednio skróci lub wydłuży ten czas dwukrotnie.
    8. Aby zakończyć regulację ustawień obrazowania, kliknij OK.
    9. Aby obrazować płytkę, wybierz Create a New Experiment and Read Now z menu Protocol Tools. Zapisz protokół i eksperyment, gdy pojawi się odpowiedni komunikat.

Analiza makropinocytozy, wykresy słupkowe z obrazami mikroskopii fluorescencyjnej, barwienie Hoechst 33342 i dekstraną.
Rycina 5: Warunki kontrolne dla oceny makropinocytozy w komórkach PDAC. (A) Komórki AsPC-1 wykazują makropinocytozę w odpowiedzi na stymulację EGF w stężeniu 100 ng/mL przez 5 min lub deprywację glutaminy przez 24 h. W celu pozyskania obrazów wykonano serie zdjęć w układach 4 x 4, 3 x 3, 2 x 3 lub 2 x 2, aby określić wpływ liczby zdjęć na jakość danych. (B) Komórki MIA PaCa-2 wykazują konstytutywną makropinocytozę, która jest hamowana przez 30-minutowe traktowanie EIPA w stężeniu 75 µM lub 2-godzinne traktowanie EHop-016 w stężeniu 10 µM. Serie zdjęć wykonano analogicznie jak w punkcie A. Pasek skali = 25 µm. Wykresy słupkowe przedstawiają średni względny indeks makropinocytozy z odchyleniem standardowym (SD) z 1 eksperymentu z 4 powtórzeniami. Istotność statystyczną określono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (two-way ANOVA) względem warunku +Q lub nośnika. *** p < 0.001 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Wyznaczanie indeksu makropinocytozy

„Indeks makropinocytozy” to stopień komórkowej makropinocytozy określany poprzez ilościowe oznaczenie wychwytu fluorescencyjnego dekstranu na komórkę przy użyciu obrazowania mikroskopowego19. W tym celu pozyskane obrazy są wykorzystywane do określenia ilości zinternalizowanego dekstranu poprzez pomiar całkowitej intensywności fluorescencji lub obszaru wykazującego fluorescencję oraz całkowitej liczby komórek określonej na podstawie barwienia DAPI. Analizę tę można przeprowadzić przy użyciu otwartoźródłowego oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów, takiego jak Cell Profiler lub FIJI/ImageJ, zgodnie z wcześniejszymi opisami19,20. Jednakże podczas pracy z wielomodalnym czytnikiem płytek oprogramowanie dołączone do instrumentu może zawierać wbudowane aplikacje analityczne, które można wykorzystać do obliczenia indeksu makropinocytozy. W niektórych przypadkach przebieg analizy wbudowanego oprogramowania może nie być w pełni przejrzysty dla użytkownika. Zaleca się zatem walidację oprogramowania na wczesnym etapie poprzez porównanie z procedurą nieautomatyczną, taką jak Cell Profiler lub FIJI/ImageJ. Niniejszy protokół można dostosować do innych narzędzi programowych do przetwarzania i analizy obrazów, stosując się do następujących ogólnych instrukcji:

  1. W przypadku obrazu DAPI i odpowiadającego mu obrazu dekstranu należy odjąć tło, stosując odpowiednią funkcję, często nazywaną funkcją rolling ball. Dostosuj ustawienia tak, aby zminimalizować szum tła i ograniczyć do minimum lub całkowicie wyeliminować efekt odejmowania sygnału DAPI i dekstranu.
  2. Wykorzystując pole o wysokim sygnale dekstranu, określ ustawienia sygnału intensywności (często nazywane funkcją progu/threshold), aby wybrać jądra komórkowe, oraz określ minimalne ustawienie sygnału intensywności wymagane do wybrania wyłącznie makropinosomów.
  3. W przypadku obrazu dekstranu oblicz całkowitą fluorescencję w obrębie utworzonego zaznaczenia makropinosomów lub wykorzystaj zaznaczenie do określenia całkowitej powierzchni pozytywnej pod kątem obecności dekstranu.
  4. W przypadku obrazu DAPI wykorzystaj zaznaczenie do określenia liczby jąder komórkowych na obrazie, co odzwierciedla liczbę obecnych komórek.
  5. Aby wyznaczyć indeks makropinocytozy, podziel całkowitą fluorescencję lub powierzchnię dekstranu przez liczbę komórek wyznaczoną za pomocą DAPI.
  6. Powtórz te kroki analizy dla wszystkich pozyskanych obrazów, stosując w całym procesie te same ustawienia numeryczne.
  7. Postępuj zgodnie z poniższymi instrukcjami w celu wyznaczenia indeksu makropinocytozy przy użyciu oprogramowania Gen5:
    UWAGA: Wbudowany potok analizy został zwalidowany i nie wykazał różnic w obliczeniach w stosunku do Fiji/ImageJ (Rycina 6A). 
    1. Po zakończeniu obrazowania wybierz obraz z wysokim poziomem makropinocytozy. Usuń sygnał tła, kliknij Process (Rycina uzupełniająca 1A) i wybierz opcję Image Preprocessing.
    2. Dla kanału dekstranu odznacz opcję Auto i ustaw średnicę rolling ball na 5 µm, nadaj priorytet precyzyjnym wynikom (fine results) i wygładź obraz w 1 cyklu.
    3. Dla kanału DAPI zastosuj wstępne przetwarzanie Auto i 1 cykl wygładzania. Kliknij OK i dodaj krok wstępnego przetwarzania obrazu do protokołu; kliknij ADD STEP. Następnie wybierz przetworzony obraz w rozwijanym menu Image (Rycina uzupełniająca 1B) i kliknij przycisk Analyze (Rycina uzupełniająca 1C).
    4. W sekcji ANALYSIS SETTINGS ustaw Type na Cellular Analysis. Wybierz kanał DAPI i kliknij Options (Rycina uzupełniająca 2A).
    5. Dla maski podstawowej, korzystając z przetworzonego obrazu DAPI, utwórz maskę w celu wybrania pojedynczych jąder. Użyj ciemnego tła i opcji Auto . Dodatkowo określ, które ustawienia umożliwiają wybór pojedynczych jąder za pomocą maski, a po zakończeniu kliknij przycisk Apply , aby sprawdzić, czy maska została zastosowana prawidłowo.
      UWAGA: Aktywacja opcji Split Touching Objects oraz Fill Holes in Masks może przynieść najlepsze efekty przy wyborze pojedynczych jąder. Minimalne i maksymalne rozmiary obiektów mogą wymagać dostosowania w zależności od linii komórkowej i najczęściej ustawia się je w zakresie 5-40 µm. Można uwzględnić Primary Edge Objects, a analizie powinien zostać poddany cały obraz. Suwak można wykorzystać do dostosowania wyboru maski do intensywności sygnału.
    6. Następnie zastosuj maskę wtórną, aby zoptymalizować ustawienia wyboru fluorescencyjnych punktów makropinosomów. Skorzystaj z funkcji Measure within a Secondary Mask i rozszerz maskę podstawową o 40 µm, w zależności od wielkości komórek.
    7. Użyj funkcji Threshold i metody Threshold in Mask, aby wybrać obszary pozytywne pod kątem dekstranu. Kliknij Apply , aby sprawdzić, czy ustawienia zostały zastosowane poprawnie.
      UWAGA: Aby określić wartość progu, użyj narzędzia View Line Profile (Rycina uzupełniająca 2B) i narysuj linię nad obszarem pozytywnym pod kątem dekstranu (Rycina uzupełniająca 2C). Wykorzystaj zmierzoną intensywność, aby dobrać najlepsze ustawienie dla utworzenia maski, która wybiera makropinosomy i wyklucza sygnał tła (Rycina uzupełniająca 2D).
    8. Po utworzeniu odpowiednich masek do wyboru jąder i makropinosomów kliknij kartę Calculated Metrics i wybierz Select or Create Object-Level Metrics of Interest.
    9. Usuń wszystkie obecne metryki i dodaj metryki Integral oraz Area do analizy maski wtórnej. Kliknij OK , a następnie wybierz Calculate i Show dla nowych metryk. Po zakończeniu kliknij OK i wybierz ADD STEP , aby dodać analizę i obliczenia do protokołu.
    10. Zapisz sfinalizowany protokół do przyszłego użytku: kliknij File, a następnie Save Protocol As.
    11. Po zakończeniu analizy danych wybierz interesujące metryki i wyeksportuj dane w celu wyznaczenia indeksu makropinocytozy. Oblicz indeks makropinocytozy w następujący sposób:
      Fluorescencja dekstranu na komórkę = Object Int_2[Dextran fluorophore]
      Powierzchnia dekstranu na komórkę = Object Area_2[Dextran fluorophore]
      ​UWAGA: W formacie płytki 24-dołkowej z szkiełkami podstawowymi metryki odzwierciedlają średnią z przeciętnego indeksu makropinocytozy na obraz. Alternatywnie, indeks makropinocytozy można obliczyć ręcznie dla całej próbki, dzieląc sumę parametrów „Area” lub „Integral” dla wszystkich obrazów przez całkowitą liczbę komórek („Cell Count”). Różnica między tymi podejściami w obliczaniu indeksu makropinocytozy jest w większości przypadków minimalna. W formacie mikropłytki 96-dołkowej indeks makropinocytozy oblicza się jako średnią dla całej próbki.
    12. Zapisz protokół obrazowania i późniejszej zautomatyzowanej analizy. Użyj ponownie protokołu w przyszłych eksperymentach z tymi samymi fluoroforami.
      UWAGA: Przy korzystaniu z funkcji laserowego autofokusu należy wykonać nowy skan referencyjny przy analizie innej linii komórkowej, ponieważ jądra i makropinosomy mogą znajdować się w innej płaszczyźnie. Przy każdym przeprowadzeniu nowego eksperymentu z użyciem wcześniej ustalonego protokołu należy zoptymalizować ustawienia czasu ekspozycji dla tego konkretnego eksperymentu.

6. Dodanie substancji terapeutycznych

Opracowania komórkowe (małe cząsteczki, leki biologiczne, czynniki wzrostu, metabolity itp.) mogą zostać wprowadzone na dowolnym etapie protokołu, a dokładny czas ich podania będzie zależał od celów i założeń badania.

  1. Przygotować komórki zgodnie z opisem w sekcji 2.
  2. Tuż przed dodaniem odpowiednich substancji traktujących, przygotować roztwory tych substancji oraz odpowiednie kontrole w stężeniach dwukrotnie wyższych niż stężenia końcowe, w pożywce bezzaserowej. Substancje traktujące należy przygotować w objętości odpowiadającej łącznej objętości wszystkich analizowanych studzienek powtórzeń.
    UWAGA: Biorąc pod uwagę rolę, jaką czynniki wydzielnicze mogą odgrywać w kontrolowaniu funkcji komórkowych, można rozważyć rozcieńczenie analizowanych substancji w pożywce warunkowanej. W tym celu, podczas przygotowywania komórek zgodnie z sekcją 2, pomocne może być wysianie dodatkowych naczyń, np. szalek hodowlanych o średnicy 6 cm lub 10 cm, w celu uzyskania pożywki warunkowanej do przygotowania roztworów substancji traktujących.
  3. Bez usuwania pożywki ze studzienki, dodać do każdej studzienki objętość roztworu substancji traktującej równą objętości pożywki w studzience. Wstrząsnąć płytką, aby zapewnić właściwe wymieszanie. Inkubować komórki przez wymagany czas.
  4. Przejść do sekcji 3.
    UWAGA: Podczas dodawania dekstranu zastosowanie świeżej pożywki powoduje usunięcie wcześniej dodanych substancji traktujących, co może wpłynąć na poziom makropinocytozy. Dlatego można rozważyć dodanie dekstranu bezpośrednio do studzienek bez aspiracji lub alternatywnie ponowne dodanie substancji traktujących bądź wykorzystanie pożywki warunkowanej do przygotowania roztworu dekstranu.

Wykres słupkowy indeksu makropinocytozy; efekty EHOP-016, EIPA, obrazy mikroskopowe; analiza danych.
Rysunek 6: Wykonanie krzywej zależności dawka-odpowiedź dla inhibitorów makropinocytozy. Przykładowe dane uzyskane podczas testowania znanych inhibitorów makropinocytozy w nowej linii komórkowej. Do formatu mikropłytek 96-dołkowych wykorzystano komórki PATU8998T, które inkubowano przez odpowiednio 2 h i 30 min z wskazanymi stężeniami (A) EHop-16 oraz (B) EIPA. Porównanie wyników uzyskanych w drodze analizy obrazu za pomocą oprogramowania Gen5 lub ImageJ nie wykazuje istotnych różnic między obydwoma podejściami, co zaznaczono jako ns w (A). Pasek skali = 25 µm. Wykresy słupkowe przedstawiają średnią i SD z jednego eksperymentu z 4 powtórzeniami. Istotność statystyczną określono za pomocą jednoczynnikowej lub dwuczynnikowej analizy ANOVA w porównaniu do warunków bez inkubacji z inhibitorem. * p < 0.05; *** p < 0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jeśli kroki i dostosowania opisanego powyżej protokołu zostaną odpowiednio zastosowane, końcowe wyniki eksperymentalne powinny dostarczyć informacji o tym, czy badane warunki hodowli komórkowej lub inhibitory indukują bądź redukują makropinocytozę w badanej linii komórkowej. Aby wzmocnić wiarygodność tych ustaleń, uwzględnienie warunków kontrolnych pozwoli na weryfikację wyników w celu ustalenia, czy eksperyment został pomyślnie przeprowadzony. Kontrole indukcji makropinocytozy dostarczą informacji o względnym poziomie m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jakość eksperymentów i pozyskiwania danych w dużym stopniu zależy od jakości odczynników, optymalizacji ustawień oraz czystości szkiełek nakrywkowych i mikropłytki. Końcowe wyniki powinny dawać minimalne różnice między kontrpróbami; Jednak zmiany biologiczne występują naturalnie lub mogą być spowodowane wieloma czynnikami. Zagęszczenie komórek może powodować, że komórki reagują mniej więcej na induktory lub inhibitory makropinocytozy. W związku z tym kluczowe znaczenie ma przestrzeganie 80-procentowej zbieżności, zgodnie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

C.C. jest wynalazcą patentu zatytułowanego "Diagnostyka, terapia i odkrywanie leków związanych z makropinocytozą", nr patentu: 9,983,194.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty NIH/NCI (R01CA207189, R21CA243701) dla C.C. KMO.G. jest laureatem TRDRP Postdoctoral Fellowship Award (T30FT0952). BioTek Cytation 5 jest częścią Sanford Burnham Prebys Cell Imaging Core, który otrzymuje wsparcie finansowe z NCI Cancer Center Support Grant (P30 CA030199). Rysunki 1-3 zostały stworzone przy użyciu BioRender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% TrypsynaCorning25053CI0,1% EDTA w HBSS bez wodorowęglanu wapnia, magnezu i sodu
1,5 ml Probówka do mikrowirówekFisherbrand05-408-129
10 cm Naczynie do hodowli tkankowychGreiner Bio-One664160CELLSTAR
15 ml Probówka wirówkowaFisherbrand07-200-886
Zlewka 2 LFisherbrand02-591-33
24-dołkowa płytka do hodowli tkankowychGreiner Bio-One662160CELLSTAR
25 ml Zbiornik na odczynnikGenesee Scientific Corporation28-121
500 ml ZlewkaFisherbrand02-591-30
6-centymetrowa miska do hodowli tkankowychGreiner Bio-One628160CELLSTAR
8-kanałowy adapter aspiracyjnyIntegra Biosciences155503
8-kanałowy adapter aspiracyjny do standardowych końcówekIntegra Biosciences159024
95% etanoluDecon Laboratories Inc4355226
Płyn do mycia szkła bez amoniakuSparkleFUN20500CT
Black 96-dołkowa mikropłytka przesiewowa o wysokiej zawartościPerkinElmer6055300CellCarrier-96 Ultra
Aplikator z bawełnianą końcówkąFisherbrand23-400-101
Szkiełka nakrywkoweFisherbrand12-545-80o średnicy 12 mm
Cytation 5 Obrazowanie komórek Czytnik wielomodowyBiotekCYT5FW
DAPIMillipore Sigma5.08741
Dekstran 70 kDa - FITCLife TechnologiesD1822Utrwalany lizyną
Dekstran 70 kDa - TMRLife TechnologiesD1819
DMSOMillipore SigmaD1435
DPBSCorning21031CVwapniowych i magnezowych
Fine Science Tools11251-20Dumont #5
Formaldehyd, 37%Ricca ChemicalRSOF0010-250AACS Odczynnik do
gliceroluFisher BioReagentsBP229-1
Utwardzające fluorescencyjne media montażoweAgilent TechS302380-2DAKO
Hoechst 33342Millipore SigmaB2261
Kwas solny (HCl)Fisher ChemicalA144-212Certyfikowany ACS Plus, 36.5%– 38.0%
Niestrzępiące się chusteczkiKimberly-Clark34155Kimwipes
Szkiełka MiscroscopeFisherbrand12-544-1Wysokiej jakości szklana pipeta
wielokanałowaGilsonFA100138 kanałów, 0,5– 10 &mikro; L
Pipeta wielokanałowaGilsonFA10012 12 kanałów, 20– 200 i mikro; L
Pipeta wielokanałowaGilsonFA100118 kanałów, 20– 200 i mikro; L
Parafilm MPechineyPM996
Folia plastikowaKirkland Signature208733Stretch-Tite
Izolatory silikonoweGrace Bio Labs Inc66410713 mm Średnica X 0,8 mm ID głębokości, 25 mm X 25 mm
Adapter suwakaBiotek1220548
Butelka do myciaFisherbrandFB0340922C
Bez kleszczyków

Bibliografia

  1. Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences. Membranes. 10 (8), 21(2020).
  2. Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
  3. Zhang, Y. J., Commisso, C. Macropinocytosis in cancer: a complex signaling network. Trends in Cancer. 5 (6), 332-334 (2019).
  4. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
  5. Kim, S. M., et al. PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells. Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).
  6. Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communications. 11 (1), (2020).
  7. Kamphorst, J. J., et al. Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein. Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).
  8. Olivares, O., et al. Collagen-derived proline promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell survival under nutrient limited conditions. Nature Communications. 8, (2017).
  9. Seguin, L., et al. Galectin-3, a druggable vulnerability for KRAS-addicted cancers. Cancer Discovery. 7 (12), 1464-1479 (2017).
  10. Redelman-Sidi, G., et al. The canonical Wnt pathway drives macropinocytosis in cancer. Cancer Research. 78 (16), 4658-4670 (2018).
  11. Tejeda-Munoz, N., Albrecht, L. V., Bui, M. H., De Robertis, E. M. Wnt canonical pathway activates macropinocytosis and lysosomal degradation of extracellular proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (21), 10402-10411 (2019).
  12. Schmees, C., et al. Macropinocytosis of the PDGF beta-receptor promotes fibroblast transformation by H-RasG12V. Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2571-2582 (2012).
  13. Lee, S. -W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50 (3), 381-392 (2019).
  14. Recouvreux, M. V., et al. Glutamine depletion regulates Slug to promote EMT and metastasis in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), (2020).
  15. Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. 11 (7), 1808-1825 (2021).
  16. Su, H., et al. Cancer cells escape autophagy inhibition via NRF2-induced macropinocytosis. Cancer Cell. 39 (5), 678-693 (2021).
  17. Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins. Science. 233 (4768), New York, N.Y. 1061-1068 (1986).
  18. Mishra, R., et al. Stromal epigenetic alterations drive metabolic and neuroendocrine prostate cancer reprogramming. Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4472-4484 (2018).
  19. Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).
  20. Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, Clifton, N.J. 113-123 (2019).
  21. Wang, J. T. H., Teasdale, R. D., Liebl, D. Macropinosome quantitation assay. MethodsX. 1, 36-41 (2014).
  22. Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton, N.J. 171-181 (2019).
  23. Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ilościowe oznaczanie makropinocytozypobieranie fluorescencyjnego dekstranuanaliza makropinosomówwysokoprzepustowy screening (HCS)czytnik płytek do obrazowania komórekbarwienie DAPIpożywka bezsurowiczatest żywotności komórekmakropinocytoza zależna od Rac1
Zautomatyzowane obrazowanie i analiza w celu ilościowego oznaczania makropinosomów znakowanych fluorescencyjnie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.