Method Article

Zautomatyzowane obrazowanie i analiza w celu ilościowego oznaczania makropinosomów znakowanych fluorescencyjnie

DOI:

10.3791/62828

⸱

August 24th, 2021

 ,  ,  , 
1Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, NCI-designated Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zautomatyzowane testy wykorzystujące wielodołkowe mikropłytki są korzystnym podejściem do identyfikacji regulatorów szlaku, umożliwiając ocenę wielu warunków w jednym eksperymencie. W tym przypadku dostosowaliśmy dobrze znany protokół obrazowania i kwantyfikacji makropinosomów do 96-dołkowego formatu mikropłytek i zapewniamy kompleksowy zarys automatyzacji przy użyciu wielomodowego czytnika płytek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makropinocytoza to niespecyficzny szlak absorpcji w fazie płynnej, który pozwala komórkom na internalizację dużych ładunków zewnątrzkomórkowych, takich jak białka, patogeny i resztki komórek, poprzez endocytozę masową. Szlak ten odgrywa istotną rolę w różnych procesach komórkowych, w tym w regulacji odpowiedzi immunologicznej i metabolizmie komórek rakowych. Biorąc pod uwagę to znaczenie dla funkcji biologicznych, badanie warunków hodowli komórkowej może dostarczyć cennych informacji poprzez identyfikację regulatorów tego szlaku i optymalizację warunków, które zostaną wykorzystane do odkrywania nowych podejść terapeutycznych. W badaniu opisano zautomatyzowaną technikę obrazowania i analizy przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego i wielotrybowego czytnika płytek do obrazowania komórek w celu szybkiej kwantyfikacji indeksu makropinocytarnego w przylegających komórkach. Zautomatyzowana metoda opiera się na wychwytywaniu dekstranu fluorescencyjnego o wysokiej masie cząsteczkowej i może być stosowana do 96-dołkowych mikropłytek w celu ułatwienia oceny wielu warunków w jednym eksperymencie lub utrwalonych próbkach zamontowanych na szklanych szkiełkach nakrywkowych. Takie podejście ma na celu maksymalizację odtwarzalności i zmniejszenie zmienności eksperymentalnej, a jednocześnie jest zarówno czasooszczędne, jak i opłacalne.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niespecyficzny szlak endocytarny makropinocytozy pozwala komórkom na internalizację różnych składników zewnątrzkomórkowych, w tym składników odżywczych, białek, antygenów i patogenów, poprzez masowy pobór płynu zewnątrzkomórkowego i jego składników1. Chociaż szlak makropinocytozy jest ważny dla biologii wielu typów komórek, coraz częściej opisuje się, że odgrywa istotną rolę w biologii nowotworu, gdzie poprzez wychwyt makropinocytarów komórki nowotworowe są w stanie przetrwać i namnażać się w obecności mikrośrodowiska zubożonego w składniki odżywcze2,3. Wychwyt makrocząsteczek zewnątrzkomórkowych, w tym albuminy i macierzy zewnątrzkomórkowej oraz martwiczych szczątków komórek, stanowi alternatywne źródło składników odżywczych do produkcji biomasy poprzez tworzenie aminokwasów, cukrów, lipidów i nukleotydów poprzez katabolizm ładunku za pośrednictwem fuzji makropinosomów i lizosomów4,5,6,7,8.

Indukcja i regulacja makropinocytozy są skomplikowane i mogą się różnić w zależności od kontekstu komórkowego. Do tej pory zidentyfikowano kilka induktorów makropinocytozy, w tym ligandy, takie jak naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF), galektyna-3 i Wnt3A9,10,11,12,13. Ponadto warunki hodowli, które naśladują mikrośrodowisko guza, mogą wywołać aktywację szlaku. Guzy gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC) są pozbawione składników odżywczych, zwłaszcza aminokwasu glutaminy, który powoduje, że zarówno komórki rakowe, jak i fibroblasty związane z rakiem (CAF) polegają na makropinocytozie, aby przeżyć7,13,14,15. Co więcej, stresy nowotworowe, takie jak niedotlenienie i stres oksydacyjny, mogą aktywować ten szlak oczyszczania16. Oprócz licznych zewnętrznych czynników wpływających, które mogą indukować makropinocytozę, różne szlaki wewnątrzkomórkowe kontrolują tworzenie makropinosomów. Onkogenna transformacja za pośrednictwem Ras jest wystarczająca do zainicjowania maszynerii makropinocytów, a wiele typów nowotworów wykazuje onkogenną konstytutywną makropinocytozę napędzaną przez Ras4,5,9,17. Alternatywnie, zidentyfikowano aktywację Ras typu dzikiego i szlaki niezależne od Ras, które aktywują makropinocytozę w komórkach nowotworowych i CAF10,11,15,18. Zastosowanie różnych modeli in vitro w połączeniu z leczeniem inhibitorami doprowadziło do zidentyfikowania kilku modulatorów makropinocytozy, do których należą wymienniki sodowo-wodorowe, mała GTPaza Rac1, kinaza fosfoinozytolu 3 (PI3K), kinaza aktywowana p21 (Pak) i kinaza białkowa aktywowana AMP (AMPK)4,13,15. Biorąc jednak pod uwagę mnogość opisanych czynników i stanów regulujących makropinocytozę, można sobie wyobrazić, że znacznie więcej modulatorów i bodźców pozostaje nieodkrytych. Identyfikacja nowych modulatorów i bodźców może być ułatwiona dzięki automatycznej ocenie wielu warunków w jednym eksperymencie. Metodologia ta może rzucić światło na czynniki zaangażowane w powstawanie makropinosomów i może pozwolić na odkrycie nowych małych cząsteczek lub leków biologicznych, które są ukierunkowane na ten szlak.

Tutaj dostosowaliśmy nasz wcześniej ustalony protokół określania zakresu makropinocytozy w komórkach nowotworowych in vitro do 96-dołkowego formatu mikropłytki oraz automatycznego obrazowania i kwantyfikacji19,20. Protokół ten opiera się na mikroskopii fluorescencyjnej, która stała się standardem w tej dziedzinie do określania makropinocytozy in vitro i in vivo4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18,19,20,21,22. Makropinosomy można odróżnić od innych szlaków endocytarnych dzięki ich zdolności do internalizacji dużych makrocząsteczek, takich jak dekstran o dużej masie cząsteczkowej (tj. 70 kDa)2,3,4,20,21,22,23. W ten sposób makropinosomy można zdefiniować poprzez wychwyt pozakomórkowo podanego dekstranu znakowanego fluoroforem o masie 70 kDa. W rezultacie pęcherzyki makropinocytyczne objawiają się jako wewnątrzkomórkowe skupiska fluorescencyjnych puncta o rozmiarach od 0,2 do 5 μm. Te punkty mogą być obrazowane mikroskopowo, a następnie oznaczane ilościowo w celu określenia zakresu makropinocytozy w komórce - "indeksu makropinocytarnego".

W tym protokole opisane są podstawowe kroki do wizualizacji makropinosomów w przylegających komórkach in vitro na 96-dołkowej mikropłytce i szkiełkach nakrywkowych przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego (Rysunek 1). Ponadto podano wskazówki dotyczące automatyzacji akwizycji obrazu i kwantyfikacji indeksu makropinocytarnego za pomocą wielomodowego czytnika płytek do obrazowania komórek. Ta automatyzacja skraca czas, koszty i wysiłek w porównaniu z naszymi wcześniej opisanymi protokołami19,20. Ponadto pozwala uniknąć niezamierzonej stronniczości pozyskiwania i analizy obrazu, a tym samym zwiększa odtwarzalność i niezawodność. Metodę tę można łatwo dostosować do różnych typów komórek lub czytników płytek lub wykorzystać do określenia alternatywnych cech makropinosomów, takich jak rozmiar, liczba i lokalizacja. Opisana w niniejszym dokumencie metoda jest szczególnie przydatna do badań przesiewowych warunków hodowli komórkowych, które indukują makropinocytozę, identyfikacji nowych modulatorów lub optymalizacji stężeń leków znanych inhibitorów.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat automatycznego testu do określania 'indeksu makropinocytarnego' w przylegających komórkach. Stworzony przy użyciu BioRender. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie materiałów

  1. Rozpuścić dekstran o stężeniu 70 kDa znakowany FITC lub tetrametylorodaminą (TMR) w PBS w celu uzyskania roztworu o stężeniu 20 mg/ml. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
  2. Rozpuścić DAPI w ddH2O, aby otrzymać roztwór o stężeniu 1 mg/ml. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: DAPI jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
  3. W dniu utrwalenia przygotuj świeży formaldehyd klasy ACS 3,7% w PBS.
    UWAGA: Formaldehyd jest utrwalaczem, znanym czynnikiem rakotwórczym i jest toksyczny w przypadku wdychania. Przygotuj roztwór w dygestorii chemicznej, aby uniknąć wdychania i obchodzić się z nim ostrożnie.
  4. Przygotuj szkiełka nakrywkowe umyte kwasem.
    1. Za pomocą zlewki o pojemności 500 ml i łaźni wodnej podgrzać 28 g szkiełek nakrywkowych ze szkła borokrzemianowego o średnicy 12 mm i grubości #1,5 przez 24 godziny w temperaturze 56 °C w 100 ml 1 M HCl. Uszczelnić zlewkę folią spożywczą, aby uniknąć nadmiernego parowania.
      UWAGA: HCl jest mocnym kwasem, który jest silnie i dlatego należy obchodzić się z nim ostrożnie i stosować w chemicznym dygestorium, aby uniknąć wdychania.
    2. Umyj szkiełka nakrywkowe wodą destylowaną. Powtórz pranie 4 razy. Następnie umyj szkiełka nakrywkowe 95% etanolem. Powtórz pranie 4 razy.
    3. Szkiełka nakrywkowe umyte kwasem należy przechowywać w naczyniu do hodowli komórkowych w temperaturze pokojowej do wykorzystania w przyszłości, zachowując sterylność poprzez zanurzenie w 95% etanolu. Uszczelnij naczynie parafilmem, aby uniknąć nadmiernego parowania.

2. Przygotowanie komórek

  1. Używając zlewającej się 10 cm płytki do hodowli tkankowej z przylegającymi komórkami, które są przedmiotem zainteresowania, odessać pożywkę i przepłukać komórki 5 ml DPBS, wstępnie podgrzanym w temperaturze 37 °C.
  2. Odłączyć komórki od płytki, dodając 1,5 ml podgrzanej 0,25% trypsyny i inkubując w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Czas inkubacji trypsyny wymagany do odłączenia komórek będących przedmiotem zainteresowania powinien być określony empirycznie i może być potwierdzony przez obserwację oderwania pod konwencjonalnym mikroskopem świetlnym.
  3. Zbierz komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodaj 4,5 ml kompletnej pożywki, aby schłodzić trypsynę.
  4. Osadzać komórki przez odwirowywanie przez 3 minuty przy 200 x g i odessać supernatant.
  5. Zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową do wysiewu.
  6. Przystąp do wysiewu komórek na 24-dołkowej płytce z szkiełkami nakrywkowymi lub 96-dołkowej mikropłytce (Rysunek 1).
    UWAGA: Liczba komórek do wysiewu powinna być empirycznie określona dla każdej linii komórkowej, ponieważ tempo proliferacji i rozmiar różnią się między liniami komórkowymi. Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem przylegających komórek rakowych z 80% zbieżnością komórek w dniu znakowania makropinosomów. Zbieganie się komórek może wpływać na pojemność makropinocytów, co również powinno być określone empirycznie.
    1. Płytka 24-dołkowa z formatem szkiełka nakrywkowego
      1. Dodaj szkiełka nakrywkowe do 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, użyj kleszczyków, aby chwycić pojedyncze szkiełko nakrywkowe z kąpieli etanolowej. Przyłóż szkiełko nakrywkowe do wewnętrznej ścianki płytki, aby usunąć nadmiar etanolu i umieść szkiełko nakrywkowe płasko na dnie studzienki.
      2. Pozwól etanolowi odparować i umyj szkiełko nakrywkowe 2 razy DPBS.
      3. Wysiewaj komórki na wierzchu szkiełka nakrywkowego, dodając 500 μl zawiesiny komórkowej do każdej studzienki. Umieść komórki w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C z 5% CO2 do momentu, aż zbieg komórek osiągnie 60%-80% w dniu poprzedzającym znakowanie makropinosomów.
      4. Dzień przed znakowaniem makropinosomów odessać pożywkę z dołków i dodać 500 μl wstępnie podgrzanej pożywki bez surowicy do każdej studzienki i umieścić komórki w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 16-24 h.
        UWAGA: W zależności od warunków, które mają być badane, zaleca się stosowanie pożywek bez surowicy w celu zmniejszenia wpływu czynników wzrostu, które mogą indukować makropinocytozę i które są normalnie obecne w surowicy. Należy jednak wziąć pod uwagę, że głód surowicy może wpływać na inne procesy komórkowe, takie jak proliferacja i autofagia. Ponieważ resztkowa surowica może wpływać na zdolność makropinocytarną komórek, a także na aktywność inhibitorów, usuwanie surowicy można poprawić, delikatnie przepłukując komórki 1 lub 2 razy 500 μl wstępnie podgrzanego DPBS.
    2. Format mikropłytki 96-dołkowej
      1. Przenieść zawiesinę komórek do zbiornika odczynnika o pojemności 25 ml. Za pomocą pipety wielokanałowej (8 lub 12 kanałów) rozsiewać 100 μl zawiesiny komórek do każdego dołka czarnej 96-dołkowej mikropłytki przesiewowej o wysokiej zawartości z optycznie przezroczystą cykliczną olefiną lub szklanym dnem.
      2. Umieść komórki w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C z 5% CO2 do momentu, aż zbieg komórek osiągnie 60%-80% w dniu poprzedzającym znakowanie makropinosomów.
      3. Dzień przed znakowaniem makropinosomów należy usunąć i wyrzucić pożywkę z każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej (8 lub 12 kanałów) lub wielokanałowego adaptera do aspiracji w przypadku standardowych końcówek podłączonych do pompy próżniowej.
      4. Używając zbiornika na odczynnik i pipety wielokanałowej (8 lub 12 kanałów), delikatnie dodaj 100 μl wstępnie podgrzanej pożywki bez surowicy do każdego dołka. Umieścić komórki w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 16-24 h.
        UWAGA: W zależności od warunków, które mają być badane, zaleca się stosowanie pożywek bez surowicy w celu zmniejszenia wpływu czynników wzrostu, które mogą indukować makropinocytozę i które są normalnie obecne w surowicy. Należy jednak wziąć pod uwagę, że głód surowicy może wpływać na inne procesy komórkowe, takie jak proliferacja i autofagia. Ponieważ resztki surowicy mogą wpływać na zdolność makropinocytarną komórek, a także na aktywność inhibitorów, usuwanie surowicy można poprawić, delikatnie przepłukując komórki 1 lub 2 razy 100 μl podgrzanego DPBS.

3. Znakowanie makropinosomów

  1. Płytka 24-dołkowa z formatem szkiełka nakrywkowego
    1. Odessać studzienki i dodać z powrotem 200 μl pożywki bez surowicy z 1 mg/ml znakowanego fluoroforem dekstranem o wysokiej masie cząsteczkowej (70 kDa). Umieścić komórki w inkubatorze do komórek w temperaturze 37 °C na 30 min.
      UWAGA: W zależności od warunków, które mają być badane, zamiast używać świeżej pożywki, preferowane może być ponowne użycie kondycjonowanej pożywki do ładowania dekstranu, ponieważ zawierałaby ona wydzielane lub uzupełniane czynniki, takie jak odpowiednio EGF lub związki inhibitorowe, które mogą wpływać na pojemność makropinocytarną komórek.
    2. Odessać pożywkę i delikatnie, ale szybko umyć komórki 5 razy lodowatym PBS za pomocą wstępnie schłodzonej butelki do mycia. Podczas mycia należy mocno potrząsnąć płytką ręcznie, aby ułatwić usuwanie kruszyw dekstranu, które przyklejają się do szkiełek nakrywkowych.
    3. Utrwal komórki, dodając 350 μl 3,7% formaldehydu i inkubując przez 20 minut. Następnie odessać roztwór utrwalający i dwukrotnie przemyć komórki PBS.
    4. Wybarwić jądra 350 μl 2 μg/ml DAPI w PBS. Po 20 minutach odessać roztwór DAPI i trzykrotnie przemyć komórki PBS.
    5. Izolatory silikonowe należy przykleić obok siebie na szkiełku mikroskopowym, aby uzyskać równomierne odstępy i powtarzalną lokalizację szkiełek nakrywkowych, co jest wymagane do automatyzacji obrazowania (Rysunek 2A,B).
      UWAGA: Na całym szkiełku mikroskopowym można umieścić łącznie 3 izolatory.
    6. Do każdego szkiełka nakrywkowego dodaj kroplę utwardzającego fluorescencyjnego podłoża mocującego na szkiełku mikroskopowym w otwartej przestrzeni izolatora (Rysunek 2C). Podnieś szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszków i usuń nadmiar PBS, delikatnie stukając w bok szkiełek nakrywkowych niestrzępiącą się chusteczką.
    7. Umieść szkiełko nakrywkowe do góry nogami na upuszczeniu nośnika montażowego (Rysunek 2D). Delikatnie postukaj w szkiełko nakrywkowe za pomocą zamkniętych kleszczyków, aby usunąć bąbelki z nośnika montażowego ( Rysunek 2E).
    8. Przechowuj szkiełka w ciemnym otoczeniu i pozwól nośnikom montażowym wyschnąć w temperaturze pokojowej, co zwykle zajmuje 16-24 godziny. Szkiełka można teraz obrazować lub przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 2 tygodni.
    9. Przed obrazowaniem należy zdjąć izolatory ze szkiełka mikroskopowego. Pozwól szkiełkom zrównoważyć się do temperatury pokojowej i wyczyść szkiełka nakrywkowe za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką zwilżonego środkiem do czyszczenia szkła bez amoniaku. Następnie użyj czystego aplikatora z bawełnianą końcówką zwilżonego 70% etanolem, aby wyczyścić i pozostawić szkiełko nakrywkowe do wyschnięcia.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Umieszczanie szkiełek nakrywkowych na szkiełku mikroskopowym za pomocą silikonowych izolatorów. (A) Izolatory silikonowe są dociskane i przyklejane do szkiełka mikroskopowego. (B) Całe szkiełko mikroskopowe można wypełnić łącznie 3 izolatorami, co zapewnia równomierne odstępy i powtarzalną lokalizację szkiełek nakrywkowych. (C) Do każdego szkiełka nakrywkowego dodać kroplę fluorescencyjnego podłoża mocującego na szkiełko mikroskopowe w otwartej przestrzeni izolatora. (D) Za pomocą kleszczy podnieś szkiełko nakrywkowe z płytki 24-dołkowej i połóż je do góry nogami na upuszczeniu podłoża montażowego. (E) Gdy między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem mikroskopowym znajdują się pęcherzyki, delikatnie postukaj w szkiełko nakrywkowe za pomocą zamkniętych kleszczy, aby usunąć pęcherzyki. Stworzony przy użyciu BioRender. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Format mikropłytki 96-dołkowej
    1. Odessać studzienki za pomocą wielokanałowego adaptera do aspiracji podłączonego do próżni i dodać 40 μl pożywki bez surowicy z 1 mg/ml znakowanego fluoroforem dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej (70 kDa) z powrotem do studzienek. Inkubować komórki w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C przez 30 min.
      UWAGA: W zależności od warunków, które mają być badane, zamiast używania świeżej pożywki, preferowane może być ponowne użycie kondycjonowanej pożywki do ładowania dekstranu, ponieważ zawierałoby ono odpowiednio wydzielane lub uzupełniane czynniki, takie jak EGF lub związki inhibitorowe, które mogą wpływać na pojemność makropinocytarną komórek.
    2. Wyrzuć pożywkę z mikropłytki, ręcznie przesuwając płytkę do góry nogami do pustej zlewki o pojemności 5 l (Rysunek 3A).
    3. Opłucz komórki na mikropłytce, powoli zanurzając płytkę pionowo, pod niewielkim kątem, w 2-litrowej zlewce wypełnionej lodowatym PBS (Rysunek 3B), a następnie wyrzuć PBS do mikropłytki, przesuwając płytkę do góry nogami do 5-litrowej zlewki (Rysunek 3C). Powtórz 2 razy.
      UWAGA: Komórki, które słabo przyczepiają się do mikropłytki obrazowania, mogą odłączyć się podczas tego procesu. W razie potrzeby studzienki można również zassać za pomocą wielokanałowego adaptera do aspiracji lub delikatnie przemyć PBS za pomocą pipety wielokanałowej. Przetwarzanie jednej 96-dołkowej mikropłytki będzie wymagało około 2 litrów lodowatego PBS. Jeżeli ma być analizowanych więcej płytek, należy użyć większej zlewki i dodać 1 l lodowatego PBS na każdą dodatkową płytkę lub w razie potrzeby odświeżyć lodowaty PBS.
    4. Po usunięciu PBS z ostatniego płukania, utrwal komórki na 20 minut w temperaturze pokojowej, dodając 100 μl 3,7% formaldehydu w PBS do każdej studzienki za pomocą 25 ml zbiornika na odczynnik i wielokanałowej pipety (Rysunek 3D).
    5. Usunąć roztwór utrwalający i dwukrotnie przemyć komórki PBS, stosując technikę zanurzania i trzepania. Wybarwić jądra 100 μl 2 μg/ml DAPI w PBS na studzienkę.
    6. Po 20 minutach przepłukać komórki trzykrotnie lodowatym PBS, stosując opisaną powyżej technikę zanurzania i migotania (krok 3.2.3). Usuń wszelkie pozostałości PBS, stukając mikropłytką do góry nogami w niestrzępiącą się chusteczkę i dodaj 100 μl świeżego PBS do każdej studzienki za pomocą zbiornika na odczynnik o pojemności 25 ml i pipety wielokanałowej. Zobrazuj komórki teraz lub przechowuj je pod osłoną przed światłem w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
      UWAGA: Alternatywnie, roztwór glicerolu w PBS (zamiast PBS) może być użyty do obrazowania i przechowywania, aby lepiej ustabilizować fluorescencję (Rysunek 4A).
    7. Przed obrazowaniem pozwól płytce zrównoważyć się do temperatury pokojowej. Wytrzyj mikropłytkę do sucha niestrzępiącą się chusteczką.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Płukanie 96-dołkowej mikropłytki w celu przygotowania do utrwalenia. (A) Opróżnij mikropłytkę z pożywką do zlewki o pojemności 5 l, ręcznie trzepając. (B) Pionowo i pod niewielkim kątem, powoli zanurzyć mikropłytkę w zlewce o pojemności 2 litrów wypełnionej lodowatym PBS. (C) Opróżnić mikropłytkę PBS do zlewki o pojemności 5 l, ręcznie trzepiąc. Powtórz kroki prania zgodnie z opisem w B dwa razy. (D) Po ostatnim opróżnieniu PBS z mikropłytki, dodać 100 μl 3,7% formaldehydu do studzienek, używając pipety wielokanałowej. Stworzony przy użyciu BioRender. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Zautomatyzowane obrazowanie makropinosomów

Obrazy makropinosomów można uchwycić za pomocą standardowego mikroskopu fluorescencyjnego, jak wcześniej opisano19,20. Jednak taka procedura może zostać ulepszona pod względem wydajności dzięki automatyzacji, zwłaszcza przy ocenie wielu różnych warunków hodowli komórkowych. Automatyzację akwizycji obrazu można osiągnąć za pomocą wielotrybowego czytnika płytek do obrazowania komórek, co zmniejsza wysiłek poprzez ograniczenie procedur obsługi i, co ważne, zwiększa odtwarzalność i niezawodność danych dzięki pozyskiwaniu obrazów w bezstronny sposób. Na rynku dostępnych jest wiele systemów obrazowania, a kierunki będą się różnić w zależności od instrumentu. W tym miejscu opisano pozyskiwanie obrazów za pomocą Cytacji 5. Jednak poniższy protokół można dostosować do każdego instrumentu z osobna, przestrzegając następujących wytycznych:

  1. Stwórz protokół automatyzacji do pozyskiwania obrazów za pomocą obiektywu powietrznego o powiększeniu 40x w kanale długości fali fluoroforu dekstranowego (FITC/TMR) i DAPI.
    UWAGA: Powszechnie stosowany inhibitor makropinocytozy EIPA wykazuje autofluorescencję w kanale FITC, zwłaszcza gdy został wcześniej wzbudzony w kanale DAPI. Inne badane związki mogą również wykazywać autofluorescencję. Aby obejść ten problem, ustawienie akwizycji obrazu tak, aby odbywała się najpierw w kanale o najwyższej długości fali wzbudzenia (FITC/TMR), a następnie w kanale DAPI, co pomaga uniknąć tego zjawiska.
  2. Zoptymalizuj ustawienia ekspozycji, używając próbki, co do której przewiduje się, że będzie miała najwyższy poziom makropinocytozy, aby uniknąć prześwietlenia, które może spowodować nasycenie sygnału i utratę danych o intensywności. Korzystaj z ustawień ostrości, które łatwo i spójnie lokalizują próbkę, aby uzyskać obrazy o wysokiej jakości.
  3. Uzyskaj wiele obrazów w każdym dołku lub szkiełku nakrywkowym, aby uwzględnić zmienność próbki i uzyskać dokładne odwzorowanie próbki.
  4. Po ustaleniu ustawień obrazowania użyj tych samych ustawień dla każdej próbki w eksperymencie.
  5. Postępuj zgodnie z poniższymi instrukcjami dotyczącymi akwizycji obrazu makropinosomów podczas korzystania z oprogramowania Cytation 5 i Gen5:
    1. Płytka 24-dołkowa z formatem szkiełka nakrywkowego
      1. Uruchom czytnik płytek i włóż szkiełka mikroskopowe do góry nogami za pomocą uchwytu na szkiełka.
      2. Otwórz czytnik mikropłytek i oprogramowanie do obrazowania, utwórz nowy protokół, klikając Protokoły i utwórz nowy. Kliknij dwukrotnie Procedura i wybierz typ tabliczki.
        UWAGA: Jeśli typ blachy nie jest dostępny, dodaj typ blachy do oprogramowania, klikając System > Typy blach > Dodaj blachę i używając wymiarów blachy podanych przez producenta. Dla ułatwienia stosowania szablon dla dwóch szkiełek mikroskopowych z trzema szkiełkami nakrywkowymi rozmieszczonymi za pomocą izolatorów silikonowych znajduje się w pliku uzupełniającym 1.
      3. Aby uzyskać dostęp do ustawień obrazowania, wybierz Akcje > Obraz > Odwrócony imager i kliknij OK. Korzystaj z obiektywu 40x, PL FL Phase z szerokim polem widzenia i grupowaniem autofokusa.
      4. Dla pierwszego kanału wybierz sześcian LED odpowiadający etykiecie fluoroforowej dekstranu (GFP lub RFP). Usuń zaznaczenie opcji Automatyczna ekspozycja i kliknij przycisk ikony mikroskopu, aby zoptymalizować ustawienia ekspozycji. Po ustaleniu odpowiednich ustawień ekspozycji kliknij Zapisz ustawienia.
        UWAGA: Dostosuj ustawienia ekspozycji, używając próbki, co do której przewiduje się, że będzie miała najwyższy poziom makropinocytozy, aby uniknąć prześwietlenia obrazów, co może spowodować nasycenie sygnału i utratę danych o intensywności.
      5. Powtórz poprzedni krok dla drugiego kanału za pomocą kostki LED DAPI.
      6. Ustaw ustawienia autofokusa dla każdego kanału fluorescencji, wybierz Opcje ostrości. Usuń zaznaczenie domyślnej metody ustawiania ostrości i użyj autofokusa z opcjonalnym skanowaniem i autofokusa bez opcjonalnego skanowania odpowiednio dla kanału dekstran-fluorofor i DAPI. Kliknij OK, aby zapisać ustawienia.
        UWAGA: Odległość skanowania można zmniejszyć do 200 μm, a przyrost do 20 μm, aby zwiększyć wydajność autofokusa. Opcjonalne skanowanie jest wymagane do odpowiedniego autofokusa na próbkach o niskiej fluorescencji. Zwykle dzieje się tak podczas analizowania warunków z niską makropinocytozą, na przykład gdy makropinocytoza jest zahamowana lub nie występuje wrodzona.
      7. Użyj opcji Zdefiniuj sygnały nawigacyjne, aby zautomatyzować pozyskiwanie obrazów w różnych obszarach szkiełka nakrywkowego. Kliknij ikonę mikroskopu i dodaj sygnalizatory, klikając w oknie obrazu i przesuwając stolik do następnego regionu. Po wybraniu odpowiedniej liczby regionów przejdź do następnego szkiełka nakrywkowego i powtórz proces. Aby sfinalizować, kliknij Zapisz ustawienia.
        UWAGA: Aby uzyskać dobre odwzorowanie makropinocytozy w próbce, wybierz około 20 latarni, które są równomiernie rozmieszczone na szkiełku nakrywkowym (Rysunek 4B). Można użyć mniejszej liczby sygnalizatorów świetlnych, ale niektóre obrazy mogą wymagać wykluczenia z analizy obrazu po akwizycji ze względu na rozbieżności w jakości, na przykład gdy obraz jest nieostry lub zawiera bąbelki lub fluorescencyjne plamy i smugi.
      8. Aby zakończyć dostosowywanie ustawień obrazowania, kliknij OK. Aby zobrazować szkiełka nakrywkowe, wybierz opcję Utwórz nowy eksperyment i Przeczytaj teraz w narzędziach protokołu. Zapisz protokół i eksperyment, gdy zostaniesz o to poproszony.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Optymalizacja warunków pozyskiwania obrazów. (A) Zwiększenie stężenia glicerolu zwiększa fluorescencję TMR-dekstranu, co stwierdzono w komórkach AsPC-1 traktowanych EGF. (B) Przykładowe współrzędne sygnalizatorów obrazowania do automatycznego pozyskiwania obrazu przy użyciu 24-dołkowej płytki w formacie szkiełek nakrywkowych. Wykres słupkowy przedstawia średnią względną fluorescencję z SEM z 5 eksperymentów. Istotność statystyczną określono za pomocą dwukierunkowej analizy ANOVA w stosunku do PBS. ** p < 0,01; p < 0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Format mikropłytki 96-dołkowej
    1. Uruchomić czytnik płytek i włożyć mikropłytkę.
    2. Otwórz czytnik mikropłytek i oprogramowanie do obrazowania, utwórz nowy protokół, klikając Protokoły i utwórz nowy. Kliknij dwukrotnie Procedura i wybierz typ tabliczki.
      UWAGA: Jeśli typ blachy nie jest dostępny, dodaj typ blachy do oprogramowania, klikając System > Typy blach > Dodaj blachę i używając wymiarów blachy podanych przez producenta. Dla ułatwienia użytkowania, szablon dla CellCarrier-96 Ultra Microplates firmy PerkinElmer znajduje się w pliku uzupełniającym 2.
    3. Aby uzyskać dostęp do ustawień obrazowania, wybierz Akcje > Obraz > Odwrócony imager i kliknij OK. Użyj obiektywu 40x PL FL Phase z szerokim polem widzenia i grupowaniem autofokusa.
    4. Dla pierwszego kanału wybierz sześcian LED odpowiadający etykiecie fluoroforowej dekstranu (GFP lub RFP). Usuń zaznaczenie opcji Automatyczna ekspozycja i kliknij przycisk ikony mikroskopu, aby zoptymalizować ustawienia ekspozycji. Po ustaleniu odpowiednich ustawień ekspozycji kliknij Zapisz ustawienia.
      UWAGA: Podczas optymalizacji ustawień ekspozycji może wystąpić znaczne wybielanie fluorescencyjne. Może to spowodować prześwietlenie ustawień podczas obrazowania nowego pola. Dlatego sprawdź ustawienia ekspozycji, sprawdzając jeszcze nienaświetlone pole i upewniając się, że przy wybranych ustawieniach nie występuje nasycenie sygnału. Nie należy uwzględniać studzienek używanych do optymalizacji ustawienia ekspozycji w oznaczaniu ilościowym makropinosomów, ponieważ fluorescencja zmniejszyła się w wyniku wybielania podczas optymalizacji. Dostosuj ustawienia ekspozycji, używając próbki, co do której przewiduje się, że będzie miała najwyższy poziom makropinocytozy, aby uniknąć prześwietlenia obrazów, które może spowodować nasycenie sygnału i utratę danych o intensywności.
    5. Powtórz poprzedni krok dla drugiego kanału za pomocą kostki LED DAPI.
    6. Ustaw ustawienia autofokusa dla każdego kanału fluorescencji, wybierz Opcje ostrości. Usuń zaznaczenie domyślnej metody ustawiania ostrości i użyj laserowego autofokusa. Wykonaj skan referencyjny po określeniu płaszczyzny ogniskowej w celu optymalnej wizualizacji makropinosomów i jąder. Kliknij OK, aby zapisać ustawienia.
      UWAGA: Odległość skanowania można zmniejszyć do 400 μm, a przyrost do 3 μm, aby zwiększyć wydajność autofokusa. Aby opcja laserowego autofokusa działała prawidłowo, przed obrazowaniem wyczyść spód płytki, osusz i przetrzyj płytkę niestrzępiącą się ściereczką. Autofokus laserowy jest lepszą metodą ustawiania ostrości, ponieważ wymaga minimalnego czasu na znalezienie płaszczyzny ogniskowej. Można stosować inne metody ogniskowania, ale ponieważ do studzienek nie dodano środka zapobiegającego blaknięciu, metody te mogą spowodować znaczne wybielenie próbek, co negatywnie wpłynie na gromadzenie danych.
    7. Ustaw przesunięcie poziome i pionowe na zero, a następnie w obszarze Pojedynczy obraz wybierz opcję Montaż bez nakładania się i użyj obrazów 3 x 3, w zależności od tego, ile komórek ma zostać uwzględnionych w analizie.
      UWAGA: W zależności od wielkości i gęstości komórek można wykonać mniej więcej obrazy, aby uzyskać reprezentatywną ocenę makropinocytozy w całej próbce. Oceniając makropinocytozę w komórkach AsPC-1 lub MIA PaCa-2 w różnych warunkach, nie obserwuje się różnic w interpretacji danych między ramką na zdjęcia 2 x 2 lub 4 x 4, chociaż różnice między powtórzonymi próbkami mogą wzrosnąć przy robieniu mniejszej liczby zdjęć (Rysunek 5A,B). Zwiększanie lub zmniejszanie rozmiaru ramki wpłynie na czas potrzebny na zeskanowanie płyty. W zależności od czasu naświetlania, pełna 96-dołkowa mikropłytka potrzebuje około 1-1,5 godziny, aby całkowicie zeskanować przy użyciu ramki 3 x 3. Ramka 2 x 2 i 4 x 4 skróci odpowiednio o połowę lub podwoi ten czas.
    8. Aby zakończyć dostosowywanie ustawień obrazowania, kliknij OK.
    9. Aby zobrazować płytę, wybierz opcję Utwórz nowy eksperyment i Przeczytaj teraz w narzędziach protokołu. Zapisz protokół i eksperyment, gdy zostaniesz o to poproszony.

figure-protocol-4
Rysunek 5: Warunki kontrolne do oceny makropinocytozy w komórkach PDAC. (A) Komórki AsPC-1 wykazują makropinocytozę w odpowiedzi na stymulację EGF 100 ng/mL przez 5 minut lub deprywację glutaminy przez 24 godziny. W celu pozyskania obrazu pobrano klatki obrazu o wymiarach 4 x 4, 3 x 3, 2 x 3 lub 2 x 2 w celu określenia wpływu liczby zdjęć na jakość danych. (B) Komórki MIA PaCa-2 wykazują konstytutywną makropinocytozę, która jest hamowana przez 30-minutowe leczenie 75 μM EIPA lub 2-godzinne leczenie 10 μM EHop-016. Ramki do zdjęć zostały wykonane jak w A. Podziałka = 25 μm. Wykresy słupkowe pokazują średni względny indeks makropinocytarny z SD wynoszący 1 eksperyment z 4 powtórzeniami. Istotność statystyczną określono na podstawie dwukierunkowej ANOVA w odniesieniu do +Q lub stanu pojazdu. p < 0.001 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Określanie indeksu makropinocytarnego

' 'Indeks makropinocytozy' to zakres komórkowej makropinocytozy, który jest określany przez ilościowe określenie wychwytu dekstranu fluorescencyjnego na komórkę za pomocą obrazowania mikroskopowego19. W tym celu uzyskane obrazy są wykorzystywane do określenia ilości zinternalizowanego dekstranu poprzez pomiar całkowitej intensywności fluorescencji lub obszaru fluorescencyjno-dodatniego oraz całkowitej liczby komórek określonej przez barwienie DAPI. Analizę tę można przeprowadzić za pomocą oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów typu open source, takiego jak Cell Profiler lub FIJI/ImageJ, zgodnie z wcześniejszym opisem19,20. Jednak podczas pracy z wielomodowym czytnikiem płytek oprogramowanie dostarczone z urządzeniem może zawierać wbudowane aplikacje analityczne, które można wykorzystać do obliczania indeksu makropinocytarnego. W niektórych przypadkach wbudowany potok analizy oprogramowania może nie być całkowicie widoczny dla użytkownika. W związku z tym zaleca się walidację oprogramowania na wczesnym etapie poprzez porównanie z procedurą niezautomatyzowaną, taką jak Cell Profiler lub FIJI/ImageJ. Protokół ten można dostosować do innych narzędzi programowych do przetwarzania i analizy obrazu, postępując zgodnie z następującymi instrukcjami ogólnymi:

  1. W przypadku DAPI i odpowiadającego mu obrazu dekstranu odejmij tło, stosując odpowiednią funkcję, często nazywaną funkcją toczącej się piłki. Dostosuj ustawienia tak, aby szum tła był zminimalizowany, a efekt odejmowania sygnału DAPI i dekstranu był minimalny lub żaden.
  2. Korzystając z pola o wysokim sygnale dekstranu, określ ustawienia sygnału intensywności, często nazywane funkcją progową, aby wybrać jądra i określić minimalne ustawienie sygnału intensywności wymagane do wybrania tylko makropinosomów.
  3. W przypadku obrazu dekstranu oblicz całkowitą fluorescencję w utworzonym zaznaczeniu makropinosomów lub użyj zaznaczenia, aby określić całkowitą powierzchnię dodatnią dla dekstranu.
  4. W przypadku obrazu DAPI użyj zaznaczenia, aby określić liczbę jąder na obrazie, aby odzwierciedlić liczbę obecnych komórek.
  5. Aby określić indeks makropinocytarny, podziel całkowitą fluorescencję lub powierzchnię dekstranu przez liczbę komórek określoną przez DAPI.
  6. Powtórz te kroki analizy dla wszystkich uzyskanych obrazów, stosując te same ustawienia numeryczne w całym tekście.
  7. Postępuj zgodnie z poniższymi instrukcjami, aby określić indeks makropinocytarny podczas korzystania z oprogramowania Gen5:
    UWAGA: Wbudowany potok analizy został zweryfikowany i nie wykrył żadnych różnic w obliczeniach w stosunku do Fiji/ImageJ (Rysunek 6A).
    1. Po zakończeniu obrazowania wybierz obraz z wysokim poziomem makropinocytozy. Usuń sygnał tła, kliknij przycisk Process (Rysunek uzupełniający 1A) i wybierz opcję Image Preprocessing (Wstępne przetwarzanie obrazu).
    2. W przypadku kanału dekstranu usuń zaznaczenie opcji Auto i użyj toczącej się kuli o średnicy 5 μm, priorytetowo traktuj doskonałe wyniki i wygładź obraz po 1 cyklu.
    3. W przypadku kanału DAPI użyj automatycznego przetwarzania wstępnego i 1 cyklu gładkiego. Kliknij OK i dodaj krok wstępnego przetwarzania obrazu do protokołu; kliknij przycisk DODAJ KROK. Następnie wybierz przetworzony obraz w obszarze Rozwijanie obrazu (Rysunek uzupełniający 1B) i kliknij przycisk Analizuj (Rysunek uzupełniający 1C).
    4. W obszarze USTAWIENIA ANALIZY ustaw Typ na Analiza komórkowa. Wybierz kanał DAPI i kliknij Opcje (Rysunek uzupełniający 2A).
    5. W przypadku maski podstawowej, korzystając z przetworzonego obrazu DAPI, utwórz maskę, aby zaznaczyć pojedyncze jądra. Użyj ciemnego tła i opcji Auto. Dodatkowo określ, które ustawienia pozwalają na wybór maski pojedynczych jąder, a po zakończeniu kliknij przycisk Zastosuj, aby określić, czy maska jest prawidłowo zastosowana.
      UWAGA: Aktywacja opcji Podziel dotykające się obiekty i Wypełnij otwory w maskach może działać najlepiej w przypadku zaznaczania pojedynczych jąder. Minimalne i maksymalne rozmiary obiektów mogą wymagać dostosowania w zależności od linii komórkowej i są najczęściej ustawiane w zakresie 5-40 μm. Obiekty krawędzi głównej mogą być dołączane, a cały obraz powinien być analizowany. Suwak można zastosować, aby dostosować wybór maski do intensywności sygnału.
    6. Następnie zastosuj maskę drugorzędną, aby zoptymalizować ustawienia wyboru punkty fluorescencji makropinosomów. Użyj funkcji Zmierz w masce dodatkowej i rozszerz maskę podstawową o 40 μm w zależności od rozmiaru komórek.
    7. Użyj funkcji Threshold i metody Threshold in Mask, aby wybrać dodatnie obszary dekstranu. Kliknij Zastosuj, aby określić, czy ustawienia są stosowane poprawnie.
      UWAGA: Aby określić wartość progową, użyj narzędzia Wyświetl profil linii (Rysunek uzupełniający 2B) i narysuj linię nad obszarem dekstran-dodatnim (Rysunek uzupełniający 2C). Użyj zmierzonej intensywności, aby określić najlepsze ustawienie do stworzenia maski, która wybiera makropinosomy i wyklucza sygnał tła (rysunek uzupełniający 2D).
    8. Po utworzeniu odpowiednich masek do wyboru jąder i makropinosomów, należy kliknąć na zakładkę Calculated Metrics i wybrać Select lub Create Object-Level Metric of Interest.
    9. Usuń wszystkie obecne metryki i dodaj metryki całkowite i obszarowe do analizy maski pomocniczej. Kliknij OK i wybierz Oblicz i pokaż dla nowych danych. Po zakończeniu kliknij OK i wybierz DODAJ KROK, aby dodać analizę i obliczenia do protokołu.
    10. Zapisz sfinalizowany protokół do wykorzystania w przyszłości, kliknij Plik i Zapisz protokół jako.
    11. Po zakończeniu analizy danych wybierz interesujące Cię metryki i wyeksportuj dane, aby określić indeks makropinocytarny. Określ indeks makropinocytarny w następujący sposób:
      Fluorescencja dekstranu na komórkę = Obiekt Int_2[Fluorofor dekstranu]
      Powierzchnia dekstranu na komórkę = Obiekt Area_2[Fluorofor dekstranu]
      UWAGA: W przypadku płytki 24-dołkowej z formatem szkiełek nakrywkowych metryki odzwierciedlają średnią średniego indeksu makropinocytarnego na obraz. Alternatywnie, indeks makropinocytarny można obliczyć ręcznie dla całej próbki, dzieląc sumę "Obszaru" lub "Całki" dla wszystkich obrazów przez całkowitą "Liczbę komórek". Różnica między tymi podejściami w obliczaniu indeksu makropinocytarnego jest minimalna w większości ustawień. W przypadku 96-dołkowego formatu mikropłytki liczbę makropinocytarną oblicza się jako średnią dla całej próbki.
    12. Zapisz protokół do obrazowania i późniejszej automatycznej analizy. Ponownie wykorzystaj protokół do przyszłych eksperymentów z tymi samymi fluoroforami.
      UWAGA: W przypadku korzystania z funkcji laserowego autofokusa należy wykonać nowy skan referencyjny, gdy ma być analizowana inna linia komórkowa, ponieważ jądra i makropinosomy są prawdopodobnie zlokalizowane w innej płaszczyźnie. Za każdym razem, gdy nowy eksperyment jest wykonywany przy użyciu wcześniej ustalonego protokołu, ustawienia ekspozycji dla tego eksperymentu muszą zostać zoptymalizowane.

6. Dodawanie zabiegów

Leczenie komórkami (małe cząsteczki, leki biologiczne, czynniki wzrostu, metabolity itp.) może być włączone na dowolnym etapie protokołu, a dokładny czas będzie zależał od celów i założeń badania.

  1. Przygotuj komórki jak w sekcji 2.
  2. Tuż przed dodaniem interesujących nas zabiegów, przygotuj zabiegi i odpowiednie kontrole w dwukrotnie wyższych stężeniach końcowych w pożywce bez surowicy. Przygotować zabiegi w objętości równej objętości liczby ocenianych duplikatów.
    UWAGA: Biorąc pod uwagę rolę, jaką wydzielane czynniki mogą odgrywać w kontrolowaniu funkcji komórkowych, preferowane może być rozcieńczenie interesujących nas zabiegów w pożywkach kondycjonowanych. W tym celu pomocne może być wysiewanie dodatkowych płytek, takich jak 6-centymetrowe lub 10-centymetrowe szalki do hodowli komórkowych, podczas przygotowywania komórek zgodnie z opisem w sekcji 2 w celu wytworzenia kondycjonowanych pożywek do przygotowania roztworów do traktowania.
  3. Nie usuwając pożywki ze studzienki, dodaj jedną objętość roztworu zabiegowego do każdej studzienki. Potrząśnij talerzem, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie. Inkubuj komórki przez żądany czas.
  4. Dalej przejść do punktu 3.
    UWAGA: Podczas dodawania dekstranu użycie świeżych pożywek powoduje usunięcie dodanych zabiegów, co może wpływać na poziom makropinocytozy. W związku z tym preferowane może być dodawanie dekstranu bezpośrednio do studzienek bez zasysania lub alternatywnego ponownego dodawania zabiegów lub ponownego wykorzystania kondycjonowanych pożywek do przygotowania roztworu dekstranu.

figure-protocol-5
Rysunek 6: Wykonywanie krzywej dawka-odpowiedź dla inhibitorów makropinocytozy. Przykładowe dane uzyskane podczas testowania znanych inhibitorów makropinocytozy w nowej linii komórkowej. PATU8998T komórki użyto do 96-dołkowego formatu mikropłytki i traktowano przez 2 godziny i 30 minut wskazanymi stężeniami odpowiednio (A) EHop-16 i (B) EIPA. Porównanie wyników uzyskanych w wyniku analizy obrazu przez oprogramowanie Gen5 lub ImageJ nie wykazuje istotnych różnic między tymi dwoma podejściami, jak wskazano ns w (A). Podziałka = 25 μm. Wykresy słupkowe pokazują średnią i SD pojedynczego eksperymentu z 4 powtórzeniami. Istotność statystyczną określono na podstawie jedno- lub dwuczynnikowej ANOVA, w porównaniu z chorobami nieleczonymi. * p < 0,05; p < 0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gdy kroki i dostosowanie wyżej opisanego protokołu są odpowiednio przestrzegane, końcowe wyniki eksperymentu powinny dostarczyć informacji o tym, czy badane warunki hodowli komórkowej lub inhibitory indukują lub redukują makropinocytozę w interesującej nas linii komórkowej. Aby wzmocnić wiarygodność tych ustaleń, włączenie warunków kontrolnych pozwoli na analizę wyników w celu ustalenia, czy eksperyment został zakończony pomyślnie. Kontrole indukcji makropinocytozy dostarczą informacji o względnym poziomie makropinocytoz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jakość eksperymentów i pozyskiwania danych w dużym stopniu zależy od jakości odczynników, optymalizacji ustawień oraz czystości szkiełek nakrywkowych i mikropłytki. Końcowe wyniki powinny dawać minimalne różnice między kontrpróbami; Jednak zmiany biologiczne występują naturalnie lub mogą być spowodowane wieloma czynnikami. Zagęszczenie komórek może powodować, że komórki reagują mniej więcej na induktory lub inhibitory makropinocytozy. W związku z tym kluczowe znaczenie ma przestrzeganie 80-procentowej zbieżności, zgodnie...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.C. jest wynalazcą patentu zatytułowanego "Diagnostyka, terapia i odkrywanie leków związanych z makropinocytozą", nr patentu: 9,983,194.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty NIH/NCI (R01CA207189, R21CA243701) dla C.C. KMO.G. jest laureatem TRDRP Postdoctoral Fellowship Award (T30FT0952). BioTek Cytation 5 jest częścią Sanford Burnham Prebys Cell Imaging Core, który otrzymuje wsparcie finansowe z NCI Cancer Center Support Grant (P30 CA030199). Rysunki 1-3 zostały stworzone przy użyciu BioRender.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25% TrypsynaCorning25053CI0,1% EDTA w HBSS bez wodorowęglanu wapnia, magnezu i sodu
1,5 ml Probówka do mikrowirówekFisherbrand05-408-129
10 cm Naczynie do hodowli tkankowychGreiner Bio-One664160CELLSTAR
15 ml Probówka wirówkowaFisherbrand07-200-886
Zlewka 2 LFisherbrand02-591-33
24-dołkowa płytka do hodowli tkankowychGreiner Bio-One662160CELLSTAR
25 ml Zbiornik na odczynnikGenesee Scientific Corporation28-121
500 ml ZlewkaFisherbrand02-591-30
6-centymetrowa miska do hodowli tkankowychGreiner Bio-One628160CELLSTAR
8-kanałowy adapter aspiracyjnyIntegra Biosciences155503
8-kanałowy adapter aspiracyjny do standardowych końcówekIntegra Biosciences159024
95% etanoluDecon Laboratories Inc4355226
Płyn do mycia szkła bez amoniakuSparkleFUN20500CT
Black 96-dołkowa mikropłytka przesiewowa o wysokiej zawartościPerkinElmer6055300CellCarrier-96 Ultra
Aplikator z bawełnianą końcówkąFisherbrand23-400-101
Szkiełka nakrywkoweFisherbrand12-545-80o średnicy 12 mm
Cytation 5 Obrazowanie komórek Czytnik wielomodowyBiotekCYT5FW
DAPIMillipore Sigma5.08741
Dekstran 70 kDa - FITCLife TechnologiesD1822Utrwalany lizyną
Dekstran 70 kDa - TMRLife TechnologiesD1819
DMSOMillipore SigmaD1435
DPBSCorning21031CVwapniowych i magnezowych
Fine Science Tools11251-20Dumont #5
Formaldehyd, 37%Ricca ChemicalRSOF0010-250AACS Odczynnik do
gliceroluFisher BioReagentsBP229-1
Utwardzające fluorescencyjne media montażoweAgilent TechS302380-2DAKO
Hoechst 33342Millipore SigmaB2261
Kwas solny (HCl)Fisher ChemicalA144-212Certyfikowany ACS Plus, 36.5%– 38.0%
Niestrzępiące się chusteczkiKimberly-Clark34155Kimwipes
Szkiełka MiscroscopeFisherbrand12-544-1Wysokiej jakości szklana pipeta
wielokanałowaGilsonFA100138 kanałów, 0,5– 10 &mikro; L
Pipeta wielokanałowaGilsonFA10012 12 kanałów, 20– 200 i mikro; L
Pipeta wielokanałowaGilsonFA100118 kanałów, 20– 200 i mikro; L
Parafilm MPechineyPM996
Folia plastikowaKirkland Signature208733Stretch-Tite
Izolatory silikonoweGrace Bio Labs Inc66410713 mm Średnica X 0,8 mm ID głębokości, 25 mm X 25 mm
Adapter suwakaBiotek1220548
Butelka do myciaFisherbrandFB0340922C
Bez kleszczyków

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences. Membranes. 10 (8), 21(2020).
  2. Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
  3. Zhang, Y. J., Commisso, C. Macropinocytosis in cancer: a complex signaling network. Trends in Cancer. 5 (6), 332-334 (2019).
  4. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
  5. Kim, S. M., et al. PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells. Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).
  6. Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communications. 11 (1), (2020).
  7. Kamphorst, J. J., et al. Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein. Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).
  8. Olivares, O., et al. Collagen-derived proline promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell survival under nutrient limited conditions. Nature Communications. 8, (2017).
  9. Seguin, L., et al. Galectin-3, a druggable vulnerability for KRAS-addicted cancers. Cancer Discovery. 7 (12), 1464-1479 (2017).
  10. Redelman-Sidi, G., et al. The canonical Wnt pathway drives macropinocytosis in cancer. Cancer Research. 78 (16), 4658-4670 (2018).
  11. Tejeda-Munoz, N., Albrecht, L. V., Bui, M. H., De Robertis, E. M. Wnt canonical pathway activates macropinocytosis and lysosomal degradation of extracellular proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (21), 10402-10411 (2019).
  12. Schmees, C., et al. Macropinocytosis of the PDGF beta-receptor promotes fibroblast transformation by H-RasG12V. Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2571-2582 (2012).
  13. Lee, S. -W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50 (3), 381-392 (2019).
  14. Recouvreux, M. V., et al. Glutamine depletion regulates Slug to promote EMT and metastasis in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), (2020).
  15. Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. 11 (7), 1808-1825 (2021).
  16. Su, H., et al. Cancer cells escape autophagy inhibition via NRF2-induced macropinocytosis. Cancer Cell. 39 (5), 678-693 (2021).
  17. Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins. Science. 233 (4768), New York, N.Y. 1061-1068 (1986).
  18. Mishra, R., et al. Stromal epigenetic alterations drive metabolic and neuroendocrine prostate cancer reprogramming. Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4472-4484 (2018).
  19. Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).
  20. Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, Clifton, N.J. 113-123 (2019).
  21. Wang, J. T. H., Teasdale, R. D., Liebl, D. Macropinosome quantitation assay. MethodsX. 1, 36-41 (2014).
  22. Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton, N.J. 171-181 (2019).
  23. Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Macropinocytosis QuantificationAutomated ImagingFluorescent Dextran UptakeMacropinosome AnalysisHigh Content ScreeningCell Imaging Plate ReaderDAPI StainingSerum Free MediaCell Viability AssayRac1 Dependent Macropinocytosis

Related Articles