Artykuł metodologiczny

Opracowanie procesu produkcji i oczyszczania wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV)2 przy użyciu systemu hodowli komórek bakulowirusa i owadów

DOI:

10.3791/62829

⸱

13 stycznia 2022

 ,  ,  , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine, 3Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole, wektor AAV2 jest wytwarzany przez kokulturację komórek owadów Spodoptera frugiperda (Sf9) z białkiem zielonej fluorescencji (GFP) wirusa bakulowirusa (BV)-AAV2-AAV2 lub genem terapeutycznym oraz komórkami Sf9 zakażonymi BV-AAV2-rep-cap w hodowli zawiesinowej. Cząsteczki AAV są uwalniane z komórek za pomocą detergentu, klarowane, oczyszczane za pomocą chromatografii kolumnowej powinowactwa i zagęszczane przez filtrację o przepływie stycznym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirusy związane z adenowirusami (AAV) są obiecującymi wektorami do zastosowań terapii genowej. W tym przypadku wektor AAV2 jest wytwarzany przez kokulturę komórek Spodoptera frugiperda (Sf9) z komórkami Sf9 zakażonymi bakulowirusem (BV)-AAV2-GFP (lub genem terapeutycznym) i BV-AAV2-rep-cap w hodowli zawiesinowej bez surowicy. Komórki są hodowane w kolbie w wytrząsarce orbitalnej lub bioreaktorze falowym. Aby uwolnić cząstki AAV, komórki produkcyjne są poddawane lizie w buforze zawierającym detergent, który jest następnie klarowany przez wirowanie i filtrację przy niskiej prędkości. Cząsteczki AAV są oczyszczane z lizatu komórkowego za pomocą chromatografii kolumnowej AVB Sepharose, która wiąże cząsteczki AAV. Związane cząstki przemywa się PBS w celu usunięcia zanieczyszczeń i eluuje z żywicy za pomocą buforu cytrynianu sodu o pH 3,0. Kwaśny eluat jest neutralizowany alkalicznym buforem Tris-HCl (pH 8,0), rozcieńczany solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i dalej zagęszczany filtracją o przepływie stycznym (TFF). Protokół opisuje przedkliniczną produkcję wektorów na małą skalę, kompatybilną ze skalowaniem do produkcji AAV na dużą skalę klasy klinicznej do zastosowań w terapii genowej u ludzi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirusy związane z adenowirusami (AAV) to bezotoczkowe ludzkie parwowirusy zawierające jednoniciowe DNA o wielkości 4,6 kb. Wektory AAV mają kilka zalet w porównaniu z innymi wektorami wirusowymi do zastosowań w terapii genowej1,2,3,4. AAV są z natury niekompetentne do replikacji, dlatego do replikacji wymagają wirusa pomocniczego i maszyny hosta. AAV nie wywołują żadnej choroby i mają niską immunogenność u zakażonego hosta3,5. AAV może infekować zarówno komórki w stanie spoczynku, jak i aktywnie dzielące się i może utrzymywać się jako episom bez integracji z genomem komórek gospodarza (AAV rzadko integruje się z genomem gospodarza)1,3. Cechy te sprawiły, że AAV jest pożądanym narzędziem do zastosowań w terapii genowej.

Aby wygenerować wektor transferu genu AAV, kaseta transgenu, w tym gen terapeutyczny, jest klonowana pomiędzy dwoma wewnętrznymi powtórzeniami końcowymi (ITR), które zazwyczaj pochodzą z serotypu 2 AAV. Maksymalny rozmiar od 5' ITR do 3' ITR, łącznie z sekwencją transgenu, wynosi 4,6 kb6. Różne kapsydy mogą mieć różny tropizm komórkowy lub tkankowy. Dlatego kapsydy powinny być wybierane na podstawie typu tkanki lub komórki, która ma być celem AAV vector7.

Rekombinowane wektory AAV są powszechnie wytwarzane w liniach komórkowych ssaków, takich jak ludzkie embrionalne komórki nerkowe, HEK293 przez przejściową transfekcję wektora transferu genu AAV, AAV rep-cap i plazmidów wirusa pomocniczego2,3. Istnieje jednak kilka ograniczeń w produkcji AAV na dużą skalę przez przejściową transfekcję przylegających komórek HEK293. Po pierwsze, potrzebna jest duża liczba stosów komórek lub butelek rolkowych. Po drugie, potrzebne jest wysokiej jakości plazmidowe DNA i odczynniki do transfekcji, co zwiększa koszty produkcji. Wreszcie, w przypadku stosowania przylegających komórek HEK293, surowica jest często potrzebna do optymalnej produkcji, co komplikuje dalsze przetwarzanie1,2,3. Alternatywna metoda wytwarzania AAV polega na wykorzystaniu linii komórkowej owadów, komórek Spodoptera frugiperda (Sf9) i wirusa owadziego zwanego rekombinowanym wirusem polihedrozy jądrowej Autographa californica multicapsid (AcMNPV lub bakulowirus)8,9,10. Komórki Sf9 są hodowane w hodowli zawiesiny bez surowicy, która jest łatwa do skalowania i jest zgodna z obecną produkcją dobrej praktyki produkcyjnej (cGMP) na dużą skalę, która nie wymaga odczynników plazmidowych ani transfekcji. Co więcej, koszt produkcji AAV przy użyciu systemu Sf9-bakulowirusa jest niższy niż koszt zastosowania przejściowej transfekcji plazmidów do komórek HEK29311.

Oryginalny system produkcji rAAV wykorzystujący komórki bakulowirusa-Sf9 używał trzech bakulowirusów: jednego bakulowirusa zawierającego kasetę transferu genów, drugiego bakulowirusa zawierającego gen rep i trzeciego bakulowirusa zawierającego gen kapsydu specyficzny dla serotypu12,13. Jednak konstrukt bakulowirusa zawierający rep był genetycznie niestabilny po wielu rundach pasażów, co uniemożliwiało amplifikację bakulowirusa do produkcji AAV na dużą skalę. Aby rozwiązać ten problem, opracowano nowy system wektorów rAAV, który zawierał dwa bakulowirusy (TwoBac): jeden bakulowirus zawierający kasetę transferu genu AAV i drugi bakulowirus zawierający razem geny AAV rep-cap, które są genetycznie bardziej stabilne niż oryginalny system i wygodniejsze do produkcji rAAV dzięki użyciu TwoBac zamiast three14, 15. System OneBac wykorzystuje kasetę transferu genu AAV i geny rep-cap w pojedynczym bakulowirusie, co jest wygodniejsze do produkcji rAAV ze względu na użycie jednego bakulowirusa zamiast użycia TwoBac lub ThreeBac2,16,17. W naszym badaniu do optymalizacji wykorzystano system TwoBac.

System bakulowirusa do produkcji AAV ma również ograniczenia: cząsteczki bakulowirusa są niestabilne do długotrwałego przechowywania w pożywce bez surowicy11, a jeśli miano bakulowirusa jest niskie, potrzebna jest duża ilość supernatantu bakulowirusa, który może stać się toksyczny dla wzrostu komórek Sf9 podczas produkcji AAV (osobista obserwacja). Wykorzystanie komórek zakażonych bez miana (TIPS) lub komórek owadów zakażonych bakulowirusem (BIIC) stanowi dobrą opcję do produkcji AAV, w której komórki Sf9 zakażone bakulowirusem są przygotowywane, kriokonserwowane, a następnie wykorzystywane do infekcji świeżych komórek Sf9. Kolejną zaletą jest zwiększona stabilność bakulowirusa (BV) w komórkach Sf9 po krioprezerwacji10,11.

Dwa rodzaje komórek TIPS są generowane w celu umożliwienia produkcji AAV: pierwszy przez zakażenie komórek Sf9 genem BV-AAV2-GFP lub terapeutycznym, a drugi przez zakażenie komórki Sf9 za pomocą BV-AAV2-rep-cap. Komórki TIPS są kriokonserwowane w małych i gotowych do użycia podwielokrotnościach. Wektory AAV są wytwarzane w hodowli zawiesinowej bez surowicy w kolbie umieszczonej w wytrząsarce orbitalnej lub bioreaktorze Wave poprzez kohodowlę komórek TIPS, które wytwarzają bakulowirusy i świeże komórki Sf9. Komórki Sf9 są zakażone przez bakulowirusy, które przenoszą wektor AAV2-GFP i sekwencje rep-cap w celu wytworzenia AAV. Cztery do pięciu dni później, kiedy plony AAV są najwyższe, komórki produkcyjne są poddawane lizie detergentu w celu uwolnienia cząsteczek AAV. Lizat komórkowy jest następnie klarowany przez wirowanie i filtrację z niską prędkością. Cząstki AAV są oczyszczane z lizatu za pomocą chromatografii kolumnowej AVB Sepharose. Wreszcie, wektory AAV są skoncentrowane za pomocą TFF. Protokół opisuje produkcję AAV na małą skalę, przydatną do badań naukowych i przedklinicznych. Metody te są jednak skalowalne i kompatybilne z wytwarzaniem wektorów AAV klasy klinicznej do zastosowań w terapii genowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zobacz Rysunek 1 dla ilustracji podsumowującej protokół.

1. Generowanie komórek TIPS zakażonych bakulowirusem

  1. Rozmrozić jedną fiolkę z komórkami Sf9 i natychmiast zasiać je w 50 ml pożywki do hodowli komórek owadów. Hoduj komórki Sf9 w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną z prędkością 125 obr./min i 28 °C w kolbach okrągłodennych z luźno przymocowaną nasadką do wymiany powietrza8,9. Rozmnażać komórki w kolbie o pojemności 1 litra zawierającej 200 ml pożywki, aby uzyskać wystarczającą ilość komórek do produkcji komórek TIPS.
  2. Dodaj 50 ml komórek Sf9 w proporcjach 2 x 106 komórek/ml do dwóch kolb: zainfekuj jedną kolbę komórek Sf9 0,5 ml bakulowirusa (BV)-AAV2-GFP (lub genu terapeutycznego), a drugą kolbę komórek 0,5 ml BV-AAV2-rep-cap.
    UWAGA: Plazmidy wektorowe AAV zostały hojnie dostarczone przez dr Roberta M. Kotina (NIH). Produkcja bakulowirusa z bakimidowego DNA (Bac-to-Bac System) została opisana wcześniej8,9. Stabilność bakulowirusa podczas pasażu stanowi krytyczny problem dla zwiększenia skali produkcji rAAV. Lepiej jest użyć niższego numeru pasażu bakulowirusa (do pasażu numer 4). Określ empirycznie optymalną objętość supernatantu bakulowirusa, sprawdzając skuteczność infekcji bakulowirusem za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 2) podczas produkcji komórek TIPS.
  3. Monitoruj zakażenie bakulowirusem 3-4 dni po zakażeniu, barwiąc bakulowirusa gp64 w zakażonych komórkach Sf9 w następujący sposób.
    1. Wybarwić 2 x 105 komórek Sf9 (zarówno komórek niezakażonych, jak i zakażonych bakulowirusem) 0,5 μg mysiego przeciwciała antybakulowirusowego gp64 (1:200) zawierającego barwnik fluorescencyjny w 100 μl buforu blokującego przez 30 min w temperaturze otoczenia.
    2. Przemyć komórki 1 ml PBS w celu usunięcia przeciwciała i ponownie zawiesić wybarwione komórki w 300 μl PBS zawierającym 0,5% albuminy surowicy bydlęcej.
    3. Analizuj ekspresję bakulowirusa gp64 na komórkach za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 2).
      UWAGA: Określ empirycznie strategię bramkowania dla akwizycji i analizy cytometrii przepływowej. W sumie pozyskiwanych jest 10 000 pojedynczych żywych komórek. Ekspresja bakulowirusa gp64 na powierzchni komórek Sf9 wskazuje na zakażenie bakulowirusem. Po 3-4 dniach większość komórek Sf9 zostaje zakażona bakulowirusem, o czym świadczy ekspresja gp64 bakulowirusa (Ryc. 2).
  4. Gdy komórki osiągną 80%-90% żywotności wraz ze wzrostem średnicy (Rysunek 3), zbierz komórki i kriozakonserwuj 1 x 107 komórek w 1 ml pożywki do hodowli owadów uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 10% dimetylosulfotlenku w pojemniku do powolnego zamrażania w temperaturze -80 °C. Następnego dnia przenieś probówkę zawierającą komórki TIPS do zamrażarki z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.
    UWAGA: Przeprowadzić hodowlę komórkową w komorze bezpieczeństwa biologicznego zgodnie ze standardową aseptyczną techniką laboratoryjną na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).

2. Produkcja wektora AAV

  1. Dzień 1: Wspólna hodowla komórek Sf9 z komórkami TIPS zakażonymi bakulowirusem
    1. Hodowla i hodowla naiwnych komórek Sf9 w temperaturze 1 x 106 komórek/ml w temperaturze 28 °C w kilku 2-litrowych kolbach zawierających 400 ml pożywki do hodowli komórek owadów w inkubatorze z wytrząsarką, która jest potrzebna do produkcji AAV. Po 3-4 dniach gęstość komórek zwiększa się do 5 x 106-6 x 106 komórek/ml.
      UWAGA: CO2 i wilgotność nie są ważnymi czynnikami wzrostu komórek Sf9.
    2. Zasiać komórki Sf9 w kolbach do wytrząsania lub w bioreaktorze w następujący sposób.
      1. Wytwarzanie AAV w kolbach w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną: Za pomocą pipety lub pompy perystaltycznej wysiać 400 ml kultury Sf9 w stężeniu 2 x 106 komórek/ml do kolby o pojemności 2 l w sposób aseptyczny. Ustaw wytrząsarkę orbitalną na 125 obr./min i 28 °C.
        UWAGA: Użyj pompy perystaltycznej lub standardowej pipety w zależności od skali produkcji AAV.
      2. Produkcja AAV w bioreaktorze: Za pomocą pompy perystaltycznej wysiewać 1 l kultury Sf9 w ilości 2 x 106 komórek/ml do 10-litrowego worka bioreaktora w sposób aseptyczny. Załaduj worek na jednostkę bioreaktora w celu hodowli w temperaturze 28 °C. Dodaj 40% tlenu do worka bioreaktora przy 0,1 psi. Ustaw bioreaktor pod kątem 20° i potrząśnij workiem z prędkością 25 obr./min.
    3. Rozmrozić jedną fiolkę z każdym BV-AAV2-GFP (lub genem terapeutycznym) i komórkami BV-AAV2-rep-cap TIPS. Rozcieńczyć komórki 20 ml pożywki do hodowli owadów i przeprowadzić liczenie żywotności komórek za pomocą błękitu trypanowego. Zaszczepić obie komórki TIPS w stosunku 1:10 000 w stosunku do naiwnych komórek Sf9 hodowanych w kolbie wytrząsającej lub bioreaktorze.
      UWAGA: Przeżywalność komórek TIPS jest zmniejszona z powodu krioprezerwacji, a wskaźnik odzysku wynosi około 50%, gdy żywotność komórek określa się za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Przeprowadzenie eksperymentu pilotażowego w celu empirycznego określenia stosunku komórek TIPS do naiwnych komórek Sf9 przed produkcją rAAV na dużą skalę.
  2. Dzień 2: Monitorowanie kultur
    1. Zbierz 1 ml kultury Sf9 w sposób aseptyczny. Zabarwić niebieskim barwnikiem Trypan, aby przeanalizować liczbę komórek, żywotność i morfologię.
  3. Dzień 3: Monitorowanie hodowli i karmienie
    1. Zbierz 1 ml kultury Sf9 i przeanalizuj liczbę komórek, żywotność i morfologię. Sprawdź stan infekcji bakulowirusem po wybarwieniu komórek Sf9, jak wspomniano w kroku 1.3.
      UWAGA: Zwiększenie średnicy komórek i efekt cytopatyczny wskazują na zakażenie bakulowirusem. Wzrost średnicy poprzedza spadek żywotności komórek, a parametry te są wykorzystywane do określenia czasu zbioru komórek podczas produkcji AAV. Określ empirycznie optymalny punkt czasowy.
    2. Podawaj kulturę Sf9 świeżą pożywką do hodowli owadów w proporcji 1:5 aseptycznie.
  4. Dzień 4: Monitorowanie kultur
    1. Zbierz 1 ml kultury Sf9 i przeanalizuj liczbę komórek, żywotność i morfologię. Odłączyć dopływ tlenu od worka bioreaktora.
  5. Dzień 5: Monitorowanie kultur i zbiory
    1. Zbierz 1 ml kultury Sf9 i przeanalizuj liczbę komórek, żywotność i morfologię. Zbierz pożywkę hodowlaną i komórki, gdy żywotność komórek Sf9 spadnie do około 50% (Rysunek 4).
    2. Wirować zawiesinę komórek w temperaturze 2100 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i osad komórkowy i przechowywać je w temperaturze -80 °C.

3. Liza komórek i uwolnienie AAV

  1. Rozmrozić osad komórkowy producenta AAV. Dodać 100 ml buforu do lizy komórek (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM chlorku sodu, 0,5% Triton-X-100) do osadu komórkowego, energicznie wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze otoczenia w celu uwolnienia cząstek AAV.
  2. Odwirować w temperaturze 2100 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i przenieść lizat komórkowy do nowego pojemnika. Po rozmrożeniu wymieszać lizat komórkowy i supernatant do hodowli komórkowych.
  3. Dodaj 20 U/ml nukleazy i 10 mM MgCl2 do lizatu komórkowego w celu strawienia DNA i RNA. Inkubować przez 2-4 godziny w temperaturze 37 °C.
  4. Przefiltrować lizat przez system podwójnej filtracji polieterosulfonu 0,8 μm i 0,2 μm za pomocą pompy.
  5. Oczyszczony lizat komórkowy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C lub natychmiast oczyścić AAV.

4. Oczyszczanie wektora AAV za pomocą systemu chromatografii kolumnowej o powinowactwie

  1. Przygotować przyrząd chromatograficzny, kolejno przemłukując próbkę i przewody buforowe sterylną wodą, 1 N wodorotlenkiem sodu, wodą i solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, pH 7,4) przy natężeniu przepływu 50 ml/min.
  2. Zamontuj kolumnę AVB Sepharose (10,0 ml) w systemie chromatograficznym i uruchom 100 ml PBS przy natężeniu przepływu 5 ml/min.
    UWAGA: Użyj mniejszej lub większej objętości kolumny AVB Sepharose w zależności od skali produkcji AAV i ustaw natężenie przepływu zgodnie z sugestiami producenta kolumny lub żywicy (patrz Tabela materiałów).
  3. W celu zebrania frakcji roztworu przepływającego przez kolumnę, buforu płuczącego i buforu elucyjnego zawierającego cząstki AAV, należy włożyć probówki do szczelin kolektora frakcji przyrządu chromatograficznego.
  4. Zrównoważyć kolumnę z PBS przy natężeniu przepływu 5,0 ml/min.
  5. Załadować przefiltrowany lizat komórkowy zawierający cząstki AAV do kolumny za pomocą chromatografa wyposażonego w pompę do pobierania próbek. Badać próbkę z natężeniem przepływu 3,0 ml na minutę.
  6. Przepuścić PBS przez kolumnę sefarozy AVB z natężeniem przepływu 3,0 ml/min, aż krzywa absorbancji ultrafioletu (UV) (280 nm) powróci do linii podstawowej i stanie się stabilna.
  7. Eluować cząstki AAV z kolumny za pomocą buforu 50 mM cytrynianu sodu (pH 3,0) przy natężeniu przepływu 3,0 ml / min ( Rysunek 5).
    UWAGA: Podczas gdy cząsteczki AAV dysocjują od żywicy i przechodzą przez detektor UV, na chromatogramie można zobaczyć pik elucji białka.
  8. Natychmiast rozcieńczyć supernatant AAV jedną piątą objętości 500 mM Tris-HCl (pH 8,0), aby zwiększyć pH supernatantu zawierającego AAV do około pH 5,5, aby zapobiec degradacji za pośrednictwem pH za pomocą kwaśnego buforu elucyjnego. Następnie rozcieńczyć supernatant AAV 10-krotnie PBS, aby całkowicie zneutralizować pH.
    UWAGA: Wartość pH wynosi około 5,5 po zobojętnieniu roztworu rAAV. Po zobojętnieniu AAV rozcieńczyć roztwór rAAV 10-krotnie PBS (pH 7,4), tak aby AAV znalazł się w buforze fizjologicznym.
  9. Przechowywać 1 ml każdej próbki przepływowej kolumny, bufor do przemywania i 100 μl eluowanego supernatantu AAV w celu oceny obecności AAV przez zakażenie komórek docelowych.
  10. Oczyścić kolumnę sefarozy AVB 100 ml 100 mM kwasu cytrynowego (pH 2,1) i 100 ml PBS (pH 7,4) przy natężeniu przepływu 5,0 ml/min. Przepłukać kolumnę 20% etanolem przy natężeniu przepływu 5,0 ml/min i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  11. Oczyścić rurociągi przyrządu chromatograficznego z kolumną w pozycji offline, jak opisano w ppkt 4.1. Na koniec przepłukać system chromatograficzny 200 ml 20% etanolu przy natężeniu przepływu 50,0 ml/min i przechowywać w 20% etanolu.

5. Zagęszczenie i diafiltracja wektora AAV za pomocą filtracji o przepływie stycznym (TFF)

  1. Skonfiguruj system TFF wyposażony we wkład z membraną polisulfonową (100 kDa Molecular Weight Cut Off) w celu zagęszczenia AAV.
  2. Równoważyć moduł TFF z 200 ml PBS przez 10 minut.
  3. Załaduj próbkę AAV, kontrolując przepływ pompy, aż próbka zostanie zredukowana do pożądanej objętości, utrzymując ciśnienie transmembranowe na poziomie 2-3 psi.
  4. Diafiltruj retentat za pomocą 100 ml PBS, jak zastosowano w tym badaniu, lub empirycznie zdefiniuj alternatywny bufor, który wspiera długoterminową stabilność AAV.
  5. Po zagęszczeniu próbki AAV do żądanej objętości, należy pobrać próbkę AAV, przefiltrować ją przez filtr polieterosulfonowy o wielkości 0,2 μm, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C.

6. Zakażenie próbek AAV do komórek docelowych w celu oceny obecności AAV w etapach oczyszczania

  1. Zaszczepić 7 x 104 komórek HT1080 / studzienkę na 24-dołkowej płytce w 500 μl zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 1% L-glutaminy, 1% pirogronianu sodu i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) dzień przed zakażeniem. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Policz komórki przed infekcją. Dodać rozcieńczoną, nieoczyszczoną próbkę objętościową AAV przed uruchomieniem kolumny, próbki przepływowe kolumny, bufor płuczący i eluowaną oczyszczoną próbkę AAV.
    UWAGA: Policz komórki zabarwione na niebiesko trypanem za pomocą hemocytometru. Oznaczyć empirycznie współczynnik rozcieńczenia i objętość (μl) próbek AAV. Im wyższe miana AAV, tym większe rozcieńczenie jest potrzebne. Upewnić się, że cząstki bakulowirusa w nieoczyszczonej próbce zbiorczej przed przebiegiem kolumny, próbkami przepływowymi kolumny, buforem do płukania są inaktywowane termicznie w temperaturze 50 °C przez 50 minut przed zakażeniem komórek docelowych w celu określenia zakaźnych mian AAV.
  3. Dwa dni po zakażeniu przeanalizuj ekspresję białka (np. GFP lub genu terapeutycznego) w komórkach za pomocą cytometru przepływowego.
  4. Obliczać zakaźne miana AAV przy użyciu liczby komórek w momencie infekcji, współczynnika rozcieńczenia i procentu komórek GFP+ według wzoru: (Całkowita liczba komórek x Procenty komórek GFP+ x Współczynnik rozcieńczenia) / Objętość AAV w mililitrach.
    UWAGA: Na przykład liczba komórek wynosi 1 x 105, procent komórek GFP+ wynosi 3,4%, współczynnik rozcieńczenia wynosi 100, a objętość dodanego AAV wynosi 2 μL. Miano AAV wynosi 1,7 x 108 jednostek zakaźnych (j.m.)/ml. Całkowita ilość oczyszczonych cząstek AAV w 25 ml eluowanej frakcji wynosi 4,3 x 109 jednostek zakaźnych (IU)/ml (Rysunek 6). Całkowita liczba początkowych nieoczyszczonych cząstek AAV wynosi 1,09 x10 10 IU/ml, a oczyszczonych cząstek AAV wynosi 4,3 x 109 IU/ml. W związku z tym odsetek odzysku wynosi 39,4%. Odsetek komórek GFP+ powinien wynosić od 1% do 30%, co odpowiada zakresowi liniowemu stosowanemu do obliczania zakaźnego miana AAV. Jeśli bardziej skoncentrowane cząstki wektora AAV zostaną zainfekowane do komórek docelowych; istnieje możliwość, że wiele kopii cząstek AAV może zainfekować pojedynczą komórkę, która pokaże się jako pojedyncza kopia wektora. Dlatego rozcieńczyć supernatant wektora AAV, aby uzyskać 1%-30% infekcji wektorem w komórkach docelowych. Jeśli wektor AAV nie ma genu reporterowego, należy zabarwić transgen lub gen terapeutyczny wyrażany przez wektor AAV przeciwciałem zawierającym barwnik fluorescencyjny, który można wykryć i określić ilościowo za pomocą cytometru przepływowego. Nie wszystkie serotypy AAV mogą skutecznie infekować komórki HT1080. Dlatego, aby przeprowadzić test zakaźności dla innych serotypów AAV, należy użyć różnych linii komórkowych. Mianować cząstki AAV2-GFP przed oczyszczeniem i po oczyszczeniu na komórkach HT1080 i zmierzyć ekspresję GFP za pomocą cytometrii przepływowej. Obliczyć odzysk (%) poprzez stosunek liczby oczyszczonych cząstek AAV do liczby cząstek AAV przed oczyszczeniem pomnożony przez 100.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazane są reprezentatywne wyniki rozwoju procesu produkcji i oczyszczania wektorów AAV przy użyciu systemu komórek owadów Sf9. Metoda obejmuje kohodowlę komórek Sf9 z komórkami TIPS zakażonymi bakulowirusem, karmienie komórek pożywką wzrostową, zbieranie i lizę komórek produkcyjnych w celu uwolnienia cząstek AAV, klarowanie lizatu komórkowego z traktowaniem nukleazą, wirowanie i filtrację, oczyszczanie AAV za pomocą chromatografii powinowactwa AVB Sepharose oraz zatężanie TFF (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parametry stosowane w tym protokole do opracowywania procesu produkcji, oczyszczania i koncentracji wektorów AAV mogą być stosowane zarówno do małej, jak i dużej produkcji wektorów AAV do zastosowań w terapii genowej. Cały proces upstream i downstream może być prowadzony w zamkniętym systemie zgodnym z aktualnymi Dobrymi Praktykami Wytwarzania (cGMP). Głównymi zaletami systemu Sf9-bakulowirus jest skalowalność do produkcji AAV na dużą skalę klasy GMP w przystępnej cenie. System nie wymaga drogich plazmidów i odczynników ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Dr. Robertowi M. Kotinowi (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) za hojne dostarczenie nam plazmidów AAV oraz Danielle Steele i Rebecce Ernst (Cincinnati Children's Hospital) za ich pomoc techniczną. Praca ta jest wspierana przez Start-Up Fund od Cincinnati Children's Research Foundation do M.N.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 N Wodorotlenek soduSigma-Aldrich1.09137Do czyszczenia Akta Avant
Kolby 2 LThermoFisher Scientific431281Kolba do hodowli zawiesinowych
50 ml Rurka stożkowaThermoFisher Scientific14-959-49ADo pobierania supernatantów
Płytka 24-dołkowaThermoFisher Scientific07-200-80Płytka do hodowli komórek adherentnych
Kolby 250 mlThermoFisher Scientific238071Kolba do hodowli zawiesinowych
Akta Avant 150 z oprogramowaniem UnicornSystem chromatograficznyCytiva28976337
AVB Sepharose High PerformanceCytiva28411210Chromatografia Podłoże
Bakulowirus-AAV-2 GFPWektor
transferowy AAV spoza kataloguBaculovirus-AAV-2 rep-capWewnętrznywektor opakowania AAVspoza katalogu
NukleazaSigma-AldrichE1014Enzym do degradacji DNA i RNA
Bufor blokującySanta Cruz Biotechnologies516214Blokowanie zapobiegające nieswoistemu wiązaniu przeciwciał z komórkami
Bufor do lizy komórekIn-houseNon-katalog20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,5 % Titron X-100
Worek na komórki, 2 L i 10 LCytiva28937662Worek do bioreaktora
Bufor czyszczącyWłasnoręczniePozycja niekatalogowa100 mM kwas cytrynowy (pH 2,1) 
CryovialThomas Scientific1222C24Do kriokonserwacji
DMEMSigma-AldrichD6429Pożywka wzrostowa dla linii komórkowych
Bufor elucyjnyIn-housePozycja niekatalogowa50 mM bufor cytrynianu sodu (pH 3,0)
EtanolSigma-AldrichE7073Do dezynfekcji i przechowywania chromatografii
Jednostka filtracyjna Pall Corporation12941Filtr membranowy
HT1080 linia komórkowa ATCCCCL-121Linia komórkowa fibroblastów
HyClone™ SFX-Pożywka do hodowli owadówCytivaSH30278.02Pożywka do wzrostu komórek owadów bez surowicy
Pompa perystaltycznaPall CorporationPozycja niekatalogowaPompa TFF
Inkubator z wytrząsarką orbitalną MaxQ 8000 ThermoFisher Scientific PozycjaniekatalogowaWytrząsarka do hodowli zawiesinowych
MikroskopNikonPozycja niekatalogowaMonitorowanie i liczenie komórek 
Mysie przeciwciało antybakulowirusowe gp64 PESanta Cruz Biotechnologies65498 PEMonitorowanie zakażenia bakulowirusem w komórkach Sf9
Zbiornik tlenuPraxairPozycja niekatalogowa40 % Do wzrostu komórek Sf9 potrzebne jest zaopatrzenie w tlen
PBSThermoFisher Scientific20012027Bufor do płukania
Zestaw do barwienia srebraThermoFisher ScientificLC6100Barwienie AAV białka kapsydu
Komórki Sf9ThermoFisher Scientific11496-015Komórki owadów
Woda SteileIn-housePozycja niekatalogowaDo czyszczenia Akta Avant
Wirówka stołowaThermoFisher Scientific75253839/433607Do klarowania supernatantu Baculovirus
Wkład z filtracją o przepływie stycznym (TFF)Pall CorporationOA100C12Kartridż TFF do zagęszczenia
Tris-HCl, pH 8,0ThermoFisher15568025do neutralizacji eluowanego
bioreaktora AAV WAVE Bioreactor System 20/50Cytiva28-9378-00
pozycja buforu alkalicznego AAV

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
  2. Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).
  3. Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
  4. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  5. Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 122 (1), 23-36 (2013).
  6. Grieger, J. C., Samulski, R. J. Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps. Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).
  7. Rabinowitz, J. E., et al. Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups. Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).
  8. Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 16071(2016).
  9. Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019(2018).
  10. Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System. Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).
  11. Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures. Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).
  12. Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors. Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).
  13. Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).
  14. Chen, H. Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells. Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).
  15. Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. Chromatography-based purification of adeno-associated virus. Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).
  16. Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).
  17. Wu, Y., et al. Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes. Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).
  18. Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).
  19. Joshi, P. R. H., et al. Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 341-356 (2021).
  20. Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography. Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015(2021).
  21. Wright, J. F. Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies. Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).
  22. Tomono, T., et al. highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 11, 180-190 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

AAV ProductionBaculovirus Insect SystemSf9 CellsAAV PurificationAVB Sepharose ChromatographyTangential Flow FiltrationCell Lysis BufferFlow CytometryGene Therapy VectorSuspension Cell Culture

Powiązane artykuły