Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Budowa modelowych błon lipidowych zawierających receptory sprzężone z białkiem G (GPCR)

3.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62830

⸱

5 lutego 2022

 ,  , 
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół wykorzystuje pęcznienie agarozy jako potężną i dającą się uogólnić technikę włączania integralnych białek błonowych (IMP) do gigantycznych jednopłytkowych pęcherzyków lipidowych (GUV), jak opisano tutaj dla rekonstytucji ludzkiego białka receptora serotoninowego 1A (5-HT1AR), jednej z klas farmakologicznie ważnych receptorów sprzężonych z białkiem G.

Streszczenie

Solidne badania in vitro struktury i funkcji integralnych białek błonowych były wyzwaniem ze względu na złożoność błony plazmatycznej i liczne czynniki wpływające na zachowanie białek w żywych komórkach. Gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV) to biomimetyczny i wysoce przestrajalny system modelowy in vitro do badania interakcji białko-błona i sondowania zachowania białek w precyzyjny, zależny od bodźca sposób. W tym protokole przedstawiamy niedrogą i skuteczną metodę wytwarzania GUV z ludzkim receptorem serotoniny 1A (5-HT1AR) stabilnie zintegrowanym z błoną. Wytwarzamy GUV metodą pęcznienia modyfikowanego hydrożelu; poprzez osadzenie filmu lipidowego na mieszaninie agarozy i 5-HT1AR, a następnie uwodnienie całego systemu, można utworzyć pęcherzyki z odpowiednio zorientowanym i funkcjonalnym 5-HT1AR wbudowanym w błonę. Te GUV mogą być następnie wykorzystane do badania interakcji białko-błona i zachowania lokalizacyjnego za pomocą mikroskopii. Ostatecznie protokół ten może pogłębić naszą wiedzę na temat funkcjonalności integralnych białek błonowych, zapewniając głęboki wgląd fizjologiczny.

Wprowadzenie

Syntetyczne membrany modelowe są potężnymi narzędziami w badaniu podstawowych właściwości i funkcji biomembran. Gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV) są jedną z najbardziej znanych platform do badania różnych właściwości błony plazmatycznej i mogą być zaprojektowane tak, aby naśladować różne warunki fizjologiczne1,2,3,4,5,6,7,8. Powszechnie wiadomo, że błona plazmatyczna i jej organizacja odgrywają kluczową rolę w wielu procesach komórkowych, takich jak transdukcja sygnału, adhezja, endocytoza i transport9,10,11,12,13,14,15.

GUV zostały wytworzone przy użyciu różnych metod, w tym delikatnego nawilżania16, hydrożelowe pęcznienie17, electroformation18, techniki mikroprzepływowe19,20,21,22, jetting23, oraz wymiana rozpuszczalników24, 25,26. Ze względu na wyzwania związane z obsługą integralnych białek błonowych (IMP), platformy do ich badania in vitro były ograniczone. GUV stanowią uproszczoną platformę do badania badanych produktów leczniczych w środowisku, które naśladuje ich środowisko naturalne. Chociaż istnieje kilka podejść do rekonstytucji białek w GUV, pojawiają się wyzwania związane z włączeniem białek o prawidłowej orientacji i utrzymaniem funkcjonalności białka27.

Najbardziej udana rekonstytucja białek w GUV wymaga metody wymiany detergentu; która polega na rozpuszczeniu białek z ich rodzimego środowiska przez detergenty, następnie oczyszczeniu białek, a następnie zastąpieniu cząsteczek detergentu lipidami za pomocą różnych metod28. Podczas gdy detergenty służą do stabilizacji trzeciorzędowej struktury badanych produktów leczniczych podczas oczyszczania, micele detergentów są stosunkowo nienaturalnym środowiskiem dla tych białek, które są lepiej ustabilizowane, szczególnie w badaniach funkcjonalnych, w dwuwarstwach lipidowych28,29,30. Co więcej, włączenie funkcjonalnych białek transbłonowych do dwuwarstwy lipidowej przy użyciu tradycyjnych technik wytwarzania GUV było trudne ze względu na rozmiar, delikatność tych białek i dodatkowe etapy wymiany detergentów, które byłyby potrzebne27,31,32,33. Użycie rozpuszczalnika organicznego do usuwania detergentów powoduje agregację i denaturację białek34. Ulepszona metoda za pośrednictwem detergentu jest obiecująca, jednak należy zachować ostrożność na etapie usuwania detergentu i może być konieczna optymalizacja dla określonych białek31,35. Ponadto metody wykorzystujące elektroformację mogą ograniczać wybór białka i mogą nie być odpowiednie dla wszystkich kompozycji lipidowych, zwłaszcza naładowanych lipidów31,36,37. Inną techniką, która została zastosowana, jest indukowana peptydami fuzja dużych pęcherzyków jednowarstwowych (LUV) zawierających pożądane białko z GUV, chociaż okazało się, że jest to pracochłonne i może prowadzić do wprowadzenia obcych cząsteczek - peptydów fuzogennych33,38,39. Gigantyczne pęcherzyki błony komórkowej (GPMV), które pochodzą z żywych komórek, mogą być używane do przezwyciężenia niektórych z tych problemów, jednak pozwalają na minimalną kontrolę wynikowego składu lipidów i białek14,40,41. Dlatego integracja IMP w warstwie bilipidowej GUV przy użyciu naszej zmodyfikowanej metody pęcznienia agarozy stanowi wiarygodną metodę dalszego badania tych białek w środowisku błonowym42,43,44,45.

Sygnalizacja komórkowa i komunikacja obejmuje rodzinę białek znanych jako receptory sprzężone z białkiem G (GPCR); GPCR należą do największej rodziny białek i są związane z modulacją nastroju, apetytu, ciśnienia krwi, funkcji układu sercowo-naczyniowego, oddychania i snu oraz wieloma innymi funkcjami fizjologicznymi46. W tym badaniu wykorzystano ludzki receptor serotoninowy 1A (5-HT1AR), który jest prototypowym członkiem rodziny GPCR. 5-HT1AR można znaleźć w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i naczyniach krwionośnych; Wpływa na liczne funkcje, takie jak funkcje sercowo-naczyniowe, żołądkowo-jelitowe, hormonalne, a także uczestniczy w regulacji nastroju47. Dużą przeszkodą w badaniach nad GPCR jest ich złożona amfifilowa struktura, a GUV stanowią obiecującą platformę do badania różnych właściwości będących przedmiotem zainteresowania, począwszy od funkcjonalności białek, interakcji lipid-białko i interakcji białko-białko. Do badania interakcji lipidowo-białkowych zastosowano różne podejścia, takie jak powierzchniowy rezonans plazmonów (SPR)48,49, spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)50,51, test nakładki lipidów białkowych (PLO)51,52,53,54, masa natywna spektrometria55, izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC)56,57, oraz test sedymentacji liposomów58,59. Nasze laboratorium wykorzystało uproszczone podejście GUV do zbadania wpływu interakcji lipid-białko na funkcjonalność białka poprzez inkapsulację BODIPY-GTPγS, który wiąże się z podjednostką Giα w stanie aktywnym receptora. Ich wiązanie uwalnia fluorofor, wytwarzając sygnał fluorescencyjny, który może być wykryty w czasie45. Co więcej, w różnych badaniach analizowano interakcje lipidowo-białkowe i rolę białek w wykrywaniu lub stabilizowaniu krzywizny błony60,61, a wykorzystanie wykonalnego podejścia GUV może być kluczową zaletą.

Ten protokół demonstruje prostą metodę wprowadzania GPCR do membrany GUV za pomocą zmodyfikowanego systemu hydrożelu agarozowego17,42. Ponadto, w oparciu o nasze wcześniejsze prace, nasza metoda może być odpowiednia dla badanych produktów morskich, które mogą wytrzymać krótkotrwałą ekspozycję na temperaturę 30-40 °C. Krótko mówiąc, rozprowadzamy cienką warstwę agarozy w połączeniu z fragmentami membrany zawierającymi interesujący nas GPCR. Po żelowaniu tej warstwy osadzamy roztwór lipidowy na wierzchu agarozy i pozwalamy rozpuszczalnikowi odparować. Następnie przeprowadzono rehydratację systemu za pomocą buforu wodnego, w wyniku czego powstały GUV z białkiem wbudowanym w dwuwarstwę lipidową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Znakowanie białek

  1. Pozostaw NHS-rodaminę, fragmenty błon 5-HT1A oraz jedną kolumnę odsalającą do wirowania o MWCO 7 K w celu wyrównania temperatury do temperatury pokojowej.
  2. Rozpuść 1 mg NHS-rodaminy w 100 µL dimetylosulfotlenku (DMSO).
  3. Dodaj 5 µL 1 M roztworu wodorowęglanu sodu, aby zwiększyć pH roztworu 5-HT1AR do pH 8.
  4. Dodaj 3,66 µL roztworu NHS-rodaminy do 50 µL roztworu 5-HT1AR i delikatnie wymieszaj za pomocą pipety w probówce do mikrocentryfugi.
    UWAGA: Należy zapewnić co najmniej 10-krotny nadmiar molowy NHS-rodaminy.
  5. Przechowuj mieszaninę w ciemności i umieść na rotatorze w temperaturze pokojowej na 1 h.
  6. Przemyj kolumnę do wirowania o MWCO 7 k 200 µL 1x fosforanowym buforem solnym (1x PBS) trzy razy, wirując przez 1,5 min przy 1,5 RCF podczas każdego płukania.
  7. Przenieś znakowane białko do jednej kolumny, a w drugiej probówce do mikrocentryfugi wyrównaj masę.
  8. Odwiruj znakowane białko raz przez 5 min przy 1,5 RCF.
  9. Wykonaj pomiar widma UV-Vis za pomocą spektrofotometru NanoDrop przy 280 nm i 554 nm, a następnie oblicz wydajność znakowania zgodnie z instrukcją producenta.
  10. Przechowuj znakowane białko w szczelnym zamknięciu w temperaturze 5 °C do czasu dalszego użycia. Roztwór jest stabilny przez około tydzień po znakowaniu.

2. GUV z wbudowanymi w błonę receptorami 5-HT 1A

  1. Przygotowanie materiałów i odczynników
    1. Pozostawić białko, lipidy i BSA (albuminę surowicy bydlęcej) do wyrównania temperatury do temperatury pokojowej.
    2. W tym czasie oczyścić szkiełka zakrywkowe, umieszczając je w metanolu i poddając sonikacji przez 30 min w 40 °C. Należy upewnić się, że metanol całkowicie pokrywa szkiełka, a poziom wody w kąpieli wodnej znajduje się powyżej poziomu metanolu w pojemniku.
      UWAGA: Metanol jest toksyczny i należy z nim pracować w odpowiednim dygestorium chemicznym.
    3. Osuszyć nadmiar metanolu ze szkiełek zakrywkowych delikatnym strumieniem powietrza. Umieścić statyw ze szkiełkami w inkubatorze w 40 °C na 15 min, aby upewnić się, że nadmiar cieczy odparował.
    4. Rozpocząć proces czyszczenia plazmowego. Najpierw umieścić szkiełka zakrywkowe w urządzeniu do czyszczenia plazmowego i zamknąć zawór dopływu powietrza, aby odessać całe powietrze z komory.
    5. Po wytworzeniu próżni w komorze, czyścić szkiełka przez 5 min przy wysokim ustawieniu mocy RF i niemal całkowitej próżni, z jedynie niewielkim dopływem powietrza do komory próżniowej. Aby zapewnić odpowiedni poziom plazmy, należy dostosować otwór komory próżniowej tak, aby wypadkowy kolor plazmy był stałym, jasnoróżowym.
      UWAGA: Podczas stosowania powietrza kluczowe jest, aby plazma zachowała jasnoróżowy kolor przez cały czas trwania etapu traktowania plazmą, ponieważ ciemniejszy fioletowy kolor wskazuje na niewłaściwą ilość powietrza w komorze i doprowadzi do suboptimalnego traktowania plazmowego.
    6. Po upływie 5 min wyłączyć zasilanie RF i zwolnić próżnię.
      UWAGA: Po wyjęciu z komory plazmowej należy upewnić się, że szkiełka zakrywkowe pozostają przykryte.
  2. Przygotowanie hydrożelu
    1. Połączyć 6 mg agarozy o ultra-niskiej temperaturze topnienia z 300 µL wody ultrapure (tj. 2% (w/v) agarozy).
      UWAGA: Agaroza 2% zostanie użyta do otrzymania GUV bez białek. Roztwór agarozy można przechowywać w 45 °C przez dwa dni.
    2. Połączyć 9 mg agarozy o ultra-niskiej temperaturze z 300 µL wody ultrapure w celu otrzymania agarozy 3% (w/v) zgodnie z procedurą opisaną w kroku 3.1. Agaroza 3% zostanie użyta do otrzymania GUV z wbudowanymi białkami.
    3. Krótko wymieszać roztwór w wirówce vortex przed umieszczeniem go na bloku grzejnym w 90 °C na 10 min. Następnie ponownie wymieszać probówkę w vortexie przed przeniesieniem jej na blok grzejny w 45 °C, aby utrzymać ją w formie stopionej do czasu dalszego użycia.
  3. Mieszanie agarozy i białka
    1. Wymieszać 21 µL agarozy 3% z 7 µL fragmentów błony 5-HT1AR. Powoli pipetować roztwór w górę i w dół wielokrotnie, aby zapewnić odpowiednie wymieszanie. Następnie inkubować w 45 °C przez 1 min.
  4. Osadzanie hydrożelu i lipidów
    1. Dla GUV bez białek: Na świeżo oczyszczonych plazmowo szkiełkach zakrywkowych stworzyć cienką warstwę, używając 20 µL agarozy 2%. Szybko nałożyć drugie szkiełko zakrywkowe na kroplę agarozy i delikatnie rozsunąć szkiełka, aby utworzyć cienką warstwę na obu szkiełkach.
      UWAGA: Ten krok jest wymagający, ponieważ rozsuwanie kropli musi nastąpić, gdy agaroza jest nadal w formie stopionej.
    2. Dla GUV z wbudowanymi białkami: Pipetować mieszaninę białko/agaroza w górę i w dół jeszcze raz, a następnie nanieść 20 µL agarozy 2% na oczyszczone plazmowo szkiełko zakrywkowe. Postępować zgodnie z instrukcjami odlewania (slip-casting) opisanymi powyżej.
    3. Pozostawić agarozę do żelowania w ciemności przez 30 min w temperaturze pokojowej.
    4. Nanieść lipidy kroplami na wierzch warstwy agarozy. Użyć łącznie 10 µL roztworu 2 mg/mL 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) z 0,4 Mol% 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) znakowanego ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (lub innej interesującej mieszaniny lipidowej) w chloroformie na warstwę agarozy. Nanieść krople za pomocą igły do chromatografii gazowej i rozprowadzać jedną kroplę naraz za pomocą delikatnego strumienia powietrza.
      UWAGA: W tym kroku należy zachować ostrożność, aby utworzyć stosunkowo jednorodną warstwę lipidów na wierzchu hydrożelu. Ponadto chloroform jest toksyczny i należy z nim pracować w odpowiednim dygestorium chemicznym.
    5. Złożyć komory Sykesa-Moore'a (S-M), umieszczając oring na wierzchu szkiełka zakrywkowego, a następnie nakładając górny element komory na oring. Użyć klucza dostarczonego przez producenta, aby złożyć komorę poprzez skręcenie elementów, co uszczelni komorę i zapobiegnie jakimkolwiek wyciekom.
      UWAGA: Górna część komory powinna być dociśnięta do oringu, ale należy zachować ostrożność, aby szkiełko zakrywkowe pozostało nienaruszone, gdyż może ono pęknąć, jeśli oring nie przylega prawidłowo w komorze. Należy również upewnić się, że komora jest uszczelniona wystarczająco mocno, aby nie przeciekała po dodaniu roztworu pęczniejącego. Niedostateczne dokręcenie komory doprowadzi do wycieków i utraty próbki.
  5. Pęcznienie i zbieranie pęcherzyków
    1. Nawodnić cały układ, delikatnie pipetując 450 µL 200 mM sacharozy w 1x PBS i delikatnie opukując komory, aby zapewnić odpowiednie pokrycie warstw hydrożel-lipid buforem.
      UWAGA: Roztwór sacharozy można zastąpić buforem rehydratacyjnym zawierającym interesujące sondy biologiczne.
    2. Umieścić komory w 45 °C i przykryć górną część komory szkiełkiem zakrywkowym, aby zapobiec parowaniu. Pozostawić próbkę do spęcznienia, chroniąc ją przed zanieczyszczeniami i światłem przez 1 h.
    3. Dodać 100 µL 1 mg/mL BSA w wodzie ultrapure do każdej studni płytki 96-dołkowej przeznaczonej do użycia. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h.
    4. Przemyć trzy razy wodą ultrapure i raz roztworem 200 mM sacharozy w 1x PBS.
    5. Na koniec dodać 200 mM glukozy w 1x PBS przed dodaniem roztworu próbek GUV.
      UWAGA: BSA została użyta do blokowania adsorpcji GUV.
    6. Po dopuszczeniu do spęcznienia hydrożelu, delikatnie wstrząsnąć i opukać komorę, aby odłączyć wszelkie GUV, które mogą pozostać przytwierdzone do powierzchni hydrożelu. Następnie ostrożnie pobrać pipetą roztwór GUV-sacharoza.
      UWAGA: Jako opcjonalny krok w celu zapewnienia odłączenia wszystkich pęcherzyków od powierzchni, można delikatnie nanieść część zawiesiny sacharozowej z powrotem na powierzchnię hydrożelu.
    7. Przenieść zawiesinę do wcześniej przygotowanej probówki do mikrocentryfugi zawierającej 700 µL 200 mM glukozy w 1x PBS.
      UWAGA: Gradient gęstości doprowadzi do osadzania się pęcherzyków na dnie probówki do centryfugi.
    8. Pozostawić pęcherzyki do osadzenia przez kolejną godzinę, aby upewnić się, że pęcherzyki opadną na dno probówki do mikrocentryfugi, co pozwoli na optymalne zebranie.
    9. Po osadzeniu GUV w glukozie, przenieść 300 µL z dna probówki do centryfugi (osadzone pęcherzyki) do wcześniej przygotowanej i potraktowanej BSA płytki 96-dołkowej, aby zbadać pęcherzyki pod mikroskopem konfokalnym.
      UWAGA: Należy unikać pobierania cieczy z samego dna probówki do mikrocentryfugi, aby zminimalizować ilość zanieczyszczeń zebranych w końcowej próbce.
  6. Sprawdzić próbki pod mikroskopem.
    1. Oświetlić próbkę laserem 488 nm (co pozwala na wizualizację błony, ponieważ dwuwarstwa została znakowana ATTO-488-DPPE).
    2. Oświetlić próbkę laserem 561 nm (co pozwala na wizualizację białka, ponieważ zostało ono znakowane NHS-Rodaminą).
      ​UWAGA: Podczas obrazowania próbki należy zachować ostrożność, ponieważ fotoutlenianie może zdestabilizować pęcherzyki. Pęcherzyki obserwowano w tym samym dniu.

Proces pęcznienia filmu białkowo-lipidowego; schemat przedstawia wyniki wzbudzenia GUVs przy 491nm/561nm.
Rycina 1: Ilustracja szczegółowych kroków protokołu. Utworzono w BioRender.com Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zmierzono stężenie białka, a stopień znakowania obliczono jako stosunek molowy barwnika do białka wynoszący 1:1. Analizując GUV za pomocą mikroskopii konfokalnej, potwierdzono prawidłowe formowanie się pęcherzyków oraz integrację białek. Lipidy znakowano 0,4 mol% ATTO 488-DPPE, a białko znakowano kowalencyjnie poprzez modyfikację amin pierwszorzędowych za pomocą estru NHS rodaminy. Rysunek 2a i Rysunek 2b przedstawiają pęcherzyk z wbudowanym białkiem odpowiednio...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zidentyfikowaliśmy dwa etapy, które mają kluczowe znaczenie dla powodzenia całego protokołu: obróbka plazmowa i osadzanie lipidów. Czyszczenie plazmowe szkiełek nakrywkowych jest niezbędne do zapewnienia odpowiedniego pokrycia i przyczepności hydrożelu agarozowego do szklanego szkiełka nakrywkowego. Czyszczenie plazmowe osiąga dwie rzeczy: po pierwsze, usuwa ślady materii organicznej z powierzchni szkła; Po drugie, aktywuje powierzchnię szkiełka nakrywkowego, co pozwala na zwiększenie zwilżalności wraz ze wzrostem hydrof...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Matthew Blosserowi za cenne dyskusje i rady. Prace te były wspierane przez Biuro Badań Marynarki Wojennej (N00014-16-1-2382) i Narodową Fundację Nauki (PHY-1915017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DOPC)Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL850375C-25mg
  Mikroskop odwrócony TI-EclipseNikon, Melville, NYEclipse Ti
1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfatydylocholina (DPPC)Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ O-ringi silikonowe ODSterling Seal & Zasilanie, Neptun, IN5-003-8770
16-bitowa kaskada II 512 ze sprzężonym ładunkiem elektronowym kamerafotometryczna, Huntington Beach, CA  Cascade II 512
1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholina (POPC)Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL850457C-25mg
50 mW lasery na ciele stałym przy 488 nm i filtr emisyjny wyśrodkowany na 525 nm i 561 nm z filtrem emisyjnym wyśrodkowanym na 595 nmKoherentny, Santa Clara, CA488/561-50-LS Fragmenty membrany
5-HT1ARPerkin Elmer, Waltham, MARBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina (DPPE)ATTO-TEC, Siegen, NiemcyAD 488-155
Stacjonarny środek do czyszczenia plazmowegoHarrick Plasma, Ithaca, NYPDC-32G
albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma Aldrich, St. Louis, MOA9418
chloroform (CHCl3)Millipore Sigma, Burlington, MACX1055
Cholesterol (Chol)Sigma Aldrich, St. Louis, MOC8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom Corning, Corning, NY3904
Elmasonic E-Series E15H UltrasonicElma, Singen, Niemcy[już niesprzedawane na głównej stronie internetowej]
glukozaSigma Aldrich, St. Louis, MOG7528
metanol (MeOH)Millipore Sigma, Burlington, MAMX0485
NanoDrop ND-1000Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAND-1000
NHS-RhodamineThermo Fisher Scientific, Waltham, MA46406
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (10x PBS)Corning, Corning, NY21-040
tarcza spinning-disc Głowica konfokalna CSUXYokogawa, Tokio, JaponiaCSU-X1
standardowe szkiełka nakrywkowe szklane 25 mm nr 1ChemGlass, Vineland, NJCLS-1760
sacharozaSigma Aldrich, St. Louis, MOS7903
Komory Sykesa-Moore'aBellco, Vineland, NJ1943-11111
Agaroza o bardzo niskiej temperaturze topnieniaSigma Aldrich, St. Louis, MOA5030
Analogowy blok grzewczy VWRVWR International, Radnor, PA[już niesprzedawane na głównej stronie internetowej]
VWR Tube RotatorVWR International, Radnor, PA10136-084
Kolumny odsalające Zeba Spin, 7K MWCO, 0.5 mLThermo Fisher Scientific, Waltham, MA89882

Bibliografia

  1. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
  2. Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane questions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), 004622(2011).
  3. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  4. Li, S., Hu, P., Malmstadt, N. Confocal imaging to quantify passive transport across biomimetic lipid membranes. Analytical Chemistry. 82 (18), 7766-7771 (2010).
  5. Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2010).
  6. Elbaradei, A., Brown, S. L., Miller, J. B., May, S., Hobbie, E. K. Interaction of polymer-coated silicon nanocrystals with lipid bilayers and surfactant interfaces. Physical Review E. 94 (4), 042804(2016).
  7. Veatch, S. L., Keller, S. L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Physical Review Letters. 89 (26), 268101(2002).
  8. Plasencia, I., Norlén, L., Bagatolli, L. A. Direct visualization of lipid domains in human skin stratum corneum's lipid membranes: Effect of pH and temperature. Biophysical Journal. 93 (9), 3142-3155 (2007).
  9. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophysical Journal. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  10. Deans, J. P., Li, H., Polyak, M. J. CD20-mediated apoptosis: signalling through lipid rafts. Immunology. 107 (2), 176-182 (2002).
  11. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 32, 257-283 (2003).
  12. Pike, L. J. Lipid rafts: bringing order to chaos. Journal of Lipid Research. 44 (4), 655-667 (2003).
  13. Tsui-Pierchala, B. A., Encinas, M., Milbrandt, J., Johnson, E. M. Lipid rafts in neuronal signaling and function. Trends in Neurosciences. 25 (8), 412-417 (2002).
  14. Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
  15. Scheve, C. S., Gonzales, P. A., Momin, N., Stachowiak, J. C. Steric pressure between membrane-bound proteins opposes lipid phase separation. Journal of the American Chemical Society. 135 (4), 1185-1188 (2013).
  16. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  17. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of agarose enable rapid formation of giant liposomes in solutions of physiologic ionic strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  18. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81 (0), 303-311 (1986).
  19. Teh, S. -Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), (2011).
  20. Hu, P. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic fabrication of asymmetric giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (5), 1434-1440 (2011).
  21. Lu, L., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Continuous microfluidic fabrication of synthetic asymmetric vesicles. Lab on a Chip. 15 (17), 3591-3599 (2015).
  22. Maktabi, S., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Dewetting-induced formation and mechanical properties of synthetic bacterial outer membrane models (GUVs) with controlled inner-leaflet lipid composition. Soft Matter. 15 (19), 3938-3948 (2019).
  23. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  24. Kim, S., Martin, G. M. Preparation of cell-size unilamellar liposomes with high captured volume and defined size distribution. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 646 (1), 1-9 (1981).
  25. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  26. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. le Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  29. Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in Enzymology. 372, 65-86 (2003).
  30. Renthal, R. An unfolding story of helical transmembrane proteins. Biochemistry. 45 (49), 14559-14566 (2006).
  31. Jørgensen, I. L., Kemmer, G. C., Pomorski, T. G. Membrane protein reconstitution into giant unilamellar vesicles: a review on current techniques. European Biophysics Journal. 46 (2), 103-119 (2017).
  32. Hansen, J. S., et al. Formation of giant protein vesicles by a lipid cosolvent method. ChemBioChem. 12 (18), 2856-2862 (2011).
  33. Kahya, N., Pécheur, E. -I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
  34. Kahya, N., Merkle, D., Schwille, P. Pushing the complexity of model bilayers: Novel prospects for membrane biophysics. Fluorescence of Supermolecules, Polymers, and Nanosystems. , 339-359 (2008).
  35. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Lévy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  36. Shaklee, P. M., et al. Protein incorporation in giant lipid vesicles under physiological conditions. ChemBioChem. 11 (2), 175-179 (2010).
  37. Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1712 (2), 152-160 (2005).
  38. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 87 (1), 419-429 (2004).
  39. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  40. Levental, I., et al. Cholesterol-dependent phase separation in cell-derived giant plasma-membrane vesicles. The Biochemical Journal. 424 (2), 163-167 (2009).
  41. López-Montero, I., Rodríguez-García, R., Monroy, F. Artificial spectrin shells reconstituted on giant vesicles. The Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (12), 1583-1588 (2012).
  42. Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. Journal of the American Chemical Society. 135 (46), 17294-17297 (2013).
  43. Gutierrez, M. G., Malmstadt, N. Human serotonin receptor 5-HT 1A preferentially segregates to the liquid disordered phase in synthetic lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13530-13533 (2014).
  44. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  45. Gutierrez, M. G., Mansfield, K. S., Malmstadt, N. The functional activity of the human serotonin 5-HT 1A receptor is controlled by lipid bilayer composition. Biophysical Journal. 110, 2486-2495 (2016).
  46. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
  47. Nichols, D. E., Nichols, C. D. Serotonin receptors. Chemical Reviews. 108 (5), 1614-1641 (2008).
  48. Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using surface plasmon resonance to quantitatively assess lipid-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1376, Clifton, N.J. 141-153 (2016).
  49. Place, J. F., Sutherland, R. M., Dähne, C. Opto-electronic immunosensors: a review of optical immunoassay at continuous surfaces. Biosensors. 1 (4), 321-353 (1985).
  50. Brown, M. F., Miljanich, G. P., Franklin, L. K., Dratz, E. A. H-NMR studies of protein-lipid interactions in retinal rod outer segment disc membranes. FEBS letters. 70 (1), 56-60 (1976).
  51. Sun, F., et al. Structural basis for interactions of the Phytophthora sojae RxLR effector Avh5 with phosphatidylinositol 3-phosphate and for host cell entry. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (3), 330-344 (2013).
  52. Kavran, J. M., et al. Specificity and promiscuity in phosphoinositide binding by pleckstrin homology domains. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30497-30508 (1998).
  53. Stevenson, J. M., Perera, I. Y., Boss, W. F. A phosphatidylinositol 4-Kinase pleckstrin homology domain that binds phosphatidylinositol 4-Monophosphate. Journal of Biological Chemistry. 273 (35), 22761-22767 (1998).
  54. Han, X., Yang, Y., Zhao, F., Zhang, T., Yu, X. An improved protein lipid overlay assay for studying lipid-protein interactions. Plant Methods. 16 (1), 33(2020).
  55. Yen, H. -Y., et al. PtdIns(4,5)P 2 stabilizes active states of GPCRs and enhances selectivity of G-protein coupling. Nature. 559 (7714), 423-427 (2018).
  56. Myers, M., Mayorga, O. L., Emtage, J., Freire, E. Thermodynamic characterization of interactions between ornithine transcarbamylase leader peptide and phospholipid bilayer membranes. Biochemistry. 26 (14), 4309-4315 (1987).
  57. Swamy, M. J., Sankhala, R. S. Probing the thermodynamics of protein-lipid interactions by isothermal titration calorimetry. Lipid-Protein Interactions: Methods and Protocols. , 37-53 (2013).
  58. Han, X., Shi, Y., Liu, G., Guo, Y., Yang, Y. Activation of ROP6 GTPase by phosphatidylglycerol in arabidopsis. Frontiers in Plant Science. 0, (2018).
  59. Surolia, A., Bachhawat, B. K. The effect of lipid composition on liposome-lectin interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 83 (3), 779-785 (1978).
  60. Sarkis, J., Vié, V. Biomimetic models to investigate membrane biophysics affecting lipid-protein interaction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 270(2020).
  61. McMahon, H. T., Boucrot, E. Membrane curvature at a glance. Journal of Cell Science. 128 (6), 1065-1070 (2015).
  62. Banerjee, K. K., Kumar, S., Bremmell, K. E., Griesser, H. J. Molecular-level removal of proteinaceous contamination from model surfaces and biomedical device materials by air plasma treatment. Journal of Hospital Infection. 76 (3), 234-242 (2010).
  63. Raiber, K., Terfort, A., Benndorf, C., Krings, N., Strehblow, H. -H. Removal of self-assembled monolayers of alkanethiolates on gold by plasma cleaning. Surface Science. 595 (1), 56-63 (2005).
  64. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A 2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  65. Garten, M., Levy, D., Bassereau, P. The giant vesicle book. The giant vesicle book. , 38-51 (2021).
  66. Gutierrez, M. G., et al. G Protein-coupled receptors incorporated into rehydrated diblock copolymer vesicles retain functionality. Small. 12 (38), Weinheim an der Bergstrasse, Germany. 5256-5260 (2016).
  67. Peruzzi, J., Gutierrez, M. G., Mansfield, K., Malmstadt, N. Dynamics of hydrogel-assisted giant unilamellar vesicle formation from unsaturated lipid systems. Langmuir. 32 (48), 12702-12709 (2016).
  68. Shchelokovskyy, P., Tristram-Nagle, S., Dimova, R. Effect of the HIV-1 fusion peptide on the mechanical properties and leaflet coupling of lipid bilayers. New Journal of Physics. 13, 025004(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Gigantyczne pęcherzyki jednowarstwoweintegralne białka błonoweoddziaływania białko-błonapęcznienie hydrożeluwbudowywanie białek błonowychreceptor 5-HT1Abłony biomimetycznelokalizacja białek
Budowa modelowych błon lipidowych zawierających receptory sprzężone z białkiem G (GPCR)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.