Przyjazne dla użytkownika, wysokowydajne i w pełni zautomatyzowane oprogramowanie do akwizycji danych do mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Summary

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek wymaga odpowiedniego pakietu oprogramowania i przyjaznego dla użytkownika potoku do wysokowydajnej automatycznej akwizycji danych. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie w pełni zautomatyzowanego pakietu oprogramowania do akwizycji obrazu, Latitude-S, oraz praktycznego potoku do gromadzenia danych o zeszklonych biomolekułach w warunkach niskich dawek.

Abstract

W ciągu ostatnich kilku lat, postęp technologiczny i metodologiczny w mikroskopii krioelektronowej pojedynczej cząstki (cryo-EM) utorował nową drogę do wysokorozdzielczego określania struktury makrocząsteczek biologicznych. Pomimo niezwykłych postępów w dziedzinie cryo-EM, nadal istnieje możliwość poprawy w różnych aspektach procesu analizy pojedynczych cząstek. Analiza pojedynczych cząstek wymaga odpowiedniego pakietu oprogramowania do automatycznej akwizycji danych o wysokiej przepustowości. W ciągu ostatnich ośmiu lat opracowano kilka pakietów oprogramowania do automatycznej akwizycji danych do automatycznego obrazowania krio-EM pojedynczych cząstek. W artykule przedstawiono zastosowanie w pełni zautomatyzowanego procesu akwizycji obrazów dla zeszklonych biomolekuł w warunkach niskich dawek.

Pokazuje pakiet oprogramowania, który może zbierać dane krio-EM w pełni, automatycznie i precyzyjnie. Dodatkowo, różne parametry mikroskopowe są łatwo kontrolowane przez ten pakiet oprogramowania. Protokół ten demonstruje potencjał tego pakietu oprogramowania w automatycznym obrazowaniu białka kolca zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej koronawirusa 2 (SARS-CoV-2) za pomocą mikroskopu krioelektronowego o napięciu 200 keV wyposażonego w bezpośredni detektor elektronów (DED). W ciągu jednej sesji (48 godzin) zebrano około 3000 obrazów filmów krio-EM, uzyskując strukturę o rozdzielczości atomowej białka kolca SARS-CoV-2. Co więcej, to badanie strukturalne wskazuje, że białko kolca przyjmuje dwie główne konformacje, 1-RBD (domena wiążąca receptor) w górę otwartą i wszystkie RBD w dół zamknięte konformacje.

Introduction

Jednocząsteczkowy cryo-EM stał się głównym nurtem techniki biologii strukturalnej do wysokorozdzielczego określania struktury makromolekuł biologicznych¹. Rekonstrukcja pojedynczej cząstki polega na uzyskaniu ogromnej liczby mikrofotografii zeszklonych próbek w celu wyodrębnienia dwuwymiarowych (2D) obrazów cząstek, które są następnie wykorzystywane do rekonstrukcji trójwymiarowej (3D) struktury biologicznej makrocząsteczki biologicznej^2,3. Przed opracowaniem DEDów rozdzielczość osiągana z rekonstrukcji pojedynczej cząstki wahała się od 4 do 30 Å^4,

Protocol

UWAGA: Do zbierania danych cryo-EM wymagane są trzy ważne kroki: 1. przygotowanie siatki cryo-EM, 2. kalibracja i wyrównanie mikroskopu, 3. automatyczne zbieranie danych (Rysunek 1). Ponadto zautomatyzowane gromadzenie danych dzieli się na: a. odpowiedni wybór obszaru, b. optymalizację Latitude-S, c. rozpoczęcie automatycznego wyboru otworów i d. rozpoczęcie automatycznego gromadzenia danych (Rysunek 1).

1. Przygotowanie siatki Cryo-EM i ładowanie próbek do automatycznego pozyskiwania danych

1. Oczyść kratki za pomocą wyładowarki żarzenia i zmieniaj parametry wyładowania ja....

Results

W obecnej sytuacji pandemicznej, cryo-EM odgrywa kluczową rolę w charakterystyce struktur różnych białek z SARS-CoV-2^26,27,28,29, co może pomóc w opracowaniu szczepionek i leków przeciwko wirusowi. Istnieje pilna potrzeba podjęcia szybkich działań badawczych przy ograniczonych zasobach ludzkich w celu zwalczania choroby koronawirusowej z 2019 r. Akwizycja danych w krio-elektromagnetycznym pojed.......

Discussion

Latitude-S to intuicyjny interfejs użytkownika, który zapewnia środowisko do automatycznego konfigurowania i gromadzenia tysięcy mikrofotografii lub plików filmowych w wysokiej rozdzielczości w ciągu dwóch dni. Zapewnia łatwą nawigację po siatkach i utrzymuje pozycję stolika mikroskopu podczas przechodzenia od małego powiększenia do dużego powiększenia. Każdy etap pozyskiwania danych za pomocą notebooka Latitude-S jest szybki dzięki takim funkcjom, jak prosty interfejs użytkownika, szybkie przesyłanie strumieniowe danych.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bibuła	Ted Pella, INC.	47000-100	Element przygotowania próbek EM
Kapsułka	Thermo Fisher Scientific	9432 909 97591	Jednostka do przygotowywania próbek EM
Kaseta	Thermo Fisher Scientific	1020863	Jednostka do przygotowywania próbek EM
C-Clip	Thermo Fisher Scientific	1036171	przygotowania próbek EM
Narzędzie do wkładania C-Clip	Thermo Fisher Scientific	9432 909 97571	Narzędzie do przygotowywania próbek EM
Pierścień C-Clip	Thermo Fisher Scientific	1036173	Element przygotowania próbek
EM siatka EM (Quantifoil)	Mikroskopia elektronowa Nauki	Q3100AR1,3	R 1,2 / 1,3 300 Mesh, złota
maszyna do wyładowywania jarzeni	Quorum	N/A	Maszyna do wyładowywania jarzeniowego Quorum GlowQube
K2 DED	Gatan Inc.	Nie dotyczy	Urządzenie do zbierania danych Cryo-EM (kamera)
Oprogramowanie Latitude S	Gatan Inc.		Oprogramowanie do obrazowania
Stacja załadowcza	Thermo Fisher Scientific	1130698	Jednostka przygotowania próbek EM
Talos 200 kV Arctica	Thermo Scientific™	Mikroskop krioelektronowy	N/A
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher	Scientific N/A	Jednostka przygotowania próbek EM