Method Article

Przyjazne dla użytkownika, wysokowydajne i w pełni zautomatyzowane oprogramowanie do akwizycji danych do mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

DOI:

10.3791/62832

⸱

July 29th, 2021

 ,  ,  , 
1Molecular Biophysics Unit, Indian Institute of Science, 2Gatan Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek wymaga odpowiedniego pakietu oprogramowania i przyjaznego dla użytkownika potoku do wysokowydajnej automatycznej akwizycji danych. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie w pełni zautomatyzowanego pakietu oprogramowania do akwizycji obrazu, Latitude-S, oraz praktycznego potoku do gromadzenia danych o zeszklonych biomolekułach w warunkach niskich dawek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilku lat, postęp technologiczny i metodologiczny w mikroskopii krioelektronowej pojedynczej cząstki (cryo-EM) utorował nową drogę do wysokorozdzielczego określania struktury makrocząsteczek biologicznych. Pomimo niezwykłych postępów w dziedzinie cryo-EM, nadal istnieje możliwość poprawy w różnych aspektach procesu analizy pojedynczych cząstek. Analiza pojedynczych cząstek wymaga odpowiedniego pakietu oprogramowania do automatycznej akwizycji danych o wysokiej przepustowości. W ciągu ostatnich ośmiu lat opracowano kilka pakietów oprogramowania do automatycznej akwizycji danych do automatycznego obrazowania krio-EM pojedynczych cząstek. W artykule przedstawiono zastosowanie w pełni zautomatyzowanego procesu akwizycji obrazów dla zeszklonych biomolekuł w warunkach niskich dawek.

Pokazuje pakiet oprogramowania, który może zbierać dane krio-EM w pełni, automatycznie i precyzyjnie. Dodatkowo, różne parametry mikroskopowe są łatwo kontrolowane przez ten pakiet oprogramowania. Protokół ten demonstruje potencjał tego pakietu oprogramowania w automatycznym obrazowaniu białka kolca zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej koronawirusa 2 (SARS-CoV-2) za pomocą mikroskopu krioelektronowego o napięciu 200 keV wyposażonego w bezpośredni detektor elektronów (DED). W ciągu jednej sesji (48 godzin) zebrano około 3000 obrazów filmów krio-EM, uzyskując strukturę o rozdzielczości atomowej białka kolca SARS-CoV-2. Co więcej, to badanie strukturalne wskazuje, że białko kolca przyjmuje dwie główne konformacje, 1-RBD (domena wiążąca receptor) w górę otwartą i wszystkie RBD w dół zamknięte konformacje.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednocząsteczkowy cryo-EM stał się głównym nurtem techniki biologii strukturalnej do wysokorozdzielczego określania struktury makromolekuł biologicznych1. Rekonstrukcja pojedynczej cząstki polega na uzyskaniu ogromnej liczby mikrofotografii zeszklonych próbek w celu wyodrębnienia dwuwymiarowych (2D) obrazów cząstek, które są następnie wykorzystywane do rekonstrukcji trójwymiarowej (3D) struktury biologicznej makrocząsteczki biologicznej2,3. Przed opracowaniem DEDów rozdzielczość osiągana z rekonstrukcji pojedynczej cząstki wahała się od 4 do 30 Å4,5. Ostatnio osiągalna rozdzielczość z pojedynczej cząstki cryo-EM osiągnęła ponad 1,8 Å6. DED i oprogramowanie do automatycznego gromadzenia danych w głównych rolach przyczyniły się do tej rewolucji w rozwiązywaniu problemów7, gdzie interwencja człowieka przy zbieraniu danych jest minimalna. Ogólnie rzecz biorąc, obrazowanie krio-EM wykonuje się przy niskich dawkach elektronów (20-100 e/A 2) w celu zminimalizowania uszkodzeń próbek biologicznych spowodowanych promieniowaniem wiązką elektronów, co przyczynia się do niskiego stosunku sygnału do szumu (SNR) na obrazie. Tak niski stosunek sygnału do szumu (SNR) utrudnia charakteryzację struktur makrocząsteczek biologicznych o wysokiej rozdzielczości przy użyciu analizy pojedynczych cząstek.

Detektory elektronów nowej generacji to detektory oparte na CMOS (komplementarny metal-tlenek-półprzewodnik), które mogą pokonać te niskie przeszkody związane z SNR. Te kamery CMOS z bezpośrednią detekcją umożliwiają szybki odczyt sygnału, dzięki czemu kamera przyczynia się do lepszej funkcji rozpraszania punktów, odpowiedniego SNR i doskonałej wykrywalnej wydajności kwantowej (DQE) dla makrocząsteczek biologicznych. Kamery z detekcją bezpośrednią oferują wysoki SNR8 i niski poziom szumów w rejestrowanych obrazach, co skutkuje ilościowym wzrostem wykrywającej wydajności kwantowej (DQE) - miary tego, ile szumu detektor dodaje do obrazu. Kamery te nagrywają również filmy z prędkością setek klatek na sekundę, co umożliwia szybkie pobieranie danych9,10. Wszystkie te cechy sprawiają, że szybkie kamery z detekcją bezpośrednią nadają się do zastosowań niskodawkowych.

Obrazy stosu z korekcją ruchu są używane do przetwarzania danych w celu obliczenia klasyfikacji 2D i zrekonstruowania mapy gęstości 3D makrocząsteczek przy użyciu różnych pakietów oprogramowania, takich jak RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 i EMAN215. Jednak do analizy pojedynczych cząstek wymagany jest ogromny zestaw danych, aby uzyskać strukturę o wysokiej rozdzielczości. W związku z tym opłaty za automatyczne gromadzenie danych są bardzo istotne dla gromadzenia danych. Do rejestrowania dużych zbiorów danych kriogenicznych w ciągu ostatniej dekady wykorzystano kilka pakietów oprogramowania. Dedykowane pakiety oprogramowania, takie jak AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS i EPU, zostały opracowane z myślą o automatycznym pozyskiwaniu danych.

Te pakiety oprogramowania wykorzystują rutynowe zadania do automatycznego znajdowania pozycji otworów poprzez korelację obrazów o małym powiększeniu z obrazami o dużym powiększeniu, co pomaga w identyfikacji otworów z szklistym lodem o odpowiedniej grubości lodu do akwizycji obrazu w warunkach niskiej dawki. Te pakiety oprogramowania zmniejszyły liczbę powtarzalnych zadań i zwiększyły przepustowość zbierania danych krio-EM poprzez pozyskiwanie ogromnej ilości danych dobrej jakości przez kilka dni w sposób ciągły, bez żadnych przerw i fizycznej obecności operatora. Latitude-S to podobny pakiet oprogramowania, który służy do automatycznego pozyskiwania danych do analizy pojedynczych cząstek. Jednak ten pakiet oprogramowania jest odpowiedni tylko dla K2/K3 DED i jest dostarczany z tymi detektorami.

Ten protokół demonstruje potencjał Latitude-S w automatycznej akwizycji obrazu białka kolca SARS-CoV-2 za pomocą bezpośredniego detektora elektronów wyposażonego w krio-EM o natężeniu 200 keV (zobacz Tabelę materiałów). Za pomocą tego narzędzia do zbierania danych automatycznie pozyskiwanych jest 3 000 plików filmowych białka kolca SARS-CoV-2 i przeprowadzane jest dalsze przetwarzanie danych w celu uzyskania struktury białka kolca o rozdzielczości 3,9-4,4 A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Do zbierania danych cryo-EM wymagane są trzy ważne kroki: 1. przygotowanie siatki cryo-EM, 2. kalibracja i wyrównanie mikroskopu, 3. automatyczne zbieranie danych (Rysunek 1). Ponadto zautomatyzowane gromadzenie danych dzieli się na: a. odpowiedni wybór obszaru, b. optymalizację Latitude-S, c. rozpoczęcie automatycznego wyboru otworów i d. rozpoczęcie automatycznego gromadzenia danych (Rysunek 1).

1. Przygotowanie siatki Cryo-EM i ładowanie próbek do automatycznego pozyskiwania danych

  1. Oczyść kratki za pomocą wyładowarki żarzenia i zmieniaj parametry wyładowania jarzeniowego w zależności od wymagań eksperymentalnych (tutaj 60 s przy 20 mA).
  2. Dodać świeżo przygotowaną próbkę białka (3 μl) do siatki jarzeniowej i inkubować przez 10 sekund.
  3. Osusz kratki przez 3-5 sekund przy 100% wilgotności i szybko zanurz je w ciekłym etanie za pomocą kriotłoka.
  4. Zaciśnij kratki ręcznie w pierścieniu zaciskowym, aby uformować wkład za pomocą elastycznego pierścienia zaciskowego C.
  5. Załaduj zamrożone siatki zamontowane na kartridżu do kasety automatycznego podajnika i przenieś kasetę za pomocą nano nasadki do wstępnie schłodzonego automatycznego podajnika mikroskopu w celu zebrania danych.

2. Strojenie mikroskopu i podstawowe ustawienie przed automatycznym akwizycją danych

  1. Przesunięcie wiązki
    1. Kliknij Przesunięcie belki na karcie Bezpośrednie wyrównanie.
    2. Zmniejsz powiększenie i wyśrodkuj wiązkę do osi optycznej za pomocą wielofunkcyjnego pokrętła X i Y.
  2. Wyrównanie punktu obrotu
    1. Kliknij opcję Pochylenie belki w Bezpośrednie wyrównanie pp X na karcie Bezpośrednie wyrównanie.
    2. Skondensuj wiązkę do punktu i zminimalizuj ruch za pomocą wielofunkcyjnego pokrętła X i Y.
  3. Centrowanie przysłony C2
    1. Wybierz otwór kondensora z zakładki Wyrównanie.
    2. Skondensuj wiązkę do miejsca, wyśrodkuj wiązkę do osi optycznej, a następnie rozszerz wiązkę, aby równomiernie pokryć okrąg.
    3. Powtarzaj te kroki, aż przysłona kondensatora 2 zostanie wyregulowana.
  4. Wyrównanie bez komy
    1. Kliknij Coma-free Alignment X (Wyrównanie bez komek) na karcie Direct Alignment (Wyrównanie bezpośrednie), aby wyrównać wiązkę do osi optycznej.
    2. Użyj pokrętła wielofunkcyjnego, aby zminimalizować kształt i ruch FFT (upewnij się, że jest stabilny).
    3. Powtórz tę samą procedurę dla wyrównania Y bez komy -
      4. .
  5. Ustaw równoległe oświetlenie przed zebraniem danych w cryo-EM dzięki podwójnej soczewce C.
    1. Włóż aperturę obiektywu (70 μm) w trybie dyfrakcji.
    2. Ustaw ostrość przysłony obiektywu na przedniej płaszczyźnie ogniskowej soczewki dyfrakcyjnej, kontrolując pokrętło intensywności rozmycia (prąd soczewki obiektywu i soczewki C2).
    3. Upewnij się, że wyraźna krawędź przysłony obiektywu jest widoczna po prawidłowym rozmyciu.
    4. Włóż ogranicznik wiązki i rozprowadź intensywność, aż pierścienie dyfrakcyjne ze złotego proszku zostaną zminimalizowane.
      UWAGA: Jeśli wiązka jest rozprowadzona prawidłowo, na ekranie widoczny jest wyraźny pierścień dyfrakcyjny złotego proszku, co wskazuje, że wiązka jest równoległa.
    5. Po ustawieniu równoległego oświetlenia wycofaj ogranicznik wiązki i zmień tryb mikroskopu na Nano probe.
      UWAGA: Sprawdź strojenie mikroskopu przed rozpoczęciem zbierania danych, aby zapewnić optymalną wydajność mikroskopu. Wszystkie te ustawienia zostaną wykonane w zakładce GUI Bezpośrednie wyrównanie mikroskopu. Całe strojenie mikroskopu odbywa się przy użyciu siatki testowej przed zebraniem danych.

3. Akwizycja danych za pomocą Latitude-S

  1. Uruchom oprogramowanie do automatycznego gromadzenia danych Latitude-S.
    UWAGA: Instalacja notebooka Latitude-S wymaga również kalibracji mikroskopu, która zostanie przeprowadzona przed zebraniem danych, a ustawienia zostaną zapisane na stałe. Pięć różnych stanów zbierania danych jest kalibrowanych z czterema różnymi powiększeniami (Rysunek 1 i Rysunek 2). Stan atlasu i stan siatki są w dwóch różnych powiększeniach w trybie LM (zakresy małego powiększenia). Stan otworu jest w trybie SA (zakresy dużego powiększenia), ale z umiarkowanym powiększeniem. Fokus i stan danych korzystają z trybu skojarzenia o dużym powiększeniu.
    1. Kliknij DigitalMicrograph w menu Start lub kliknij dwukrotnie ikonę DigitalMicrograph na pulpicie.
    2. Wybierz ikonę Menedżer technik z DigitalMicrograph.
      UWAGA: Ten system pokaże ikony TEM i Latitude-S (Rysunek 2 i Rysunek uzupełniający S1).
    3. Wybierz ikonę Latitude-S do automatycznego zbierania danych dotyczących pojedynczych cząstek.
      UWAGA: Kamera K2 działa w trzech trybach: liniowym/zintegrowanym, zliczonym i superrozdzielczościowym. Użytkownik mógł wybrać dowolny tryb w interfejsie DigitalMicrograph. Obrazy danych mogą być zapisywane jako stosy obrazów frakcjonowanych dawką lub jako obrazy zsumowane w plikach MRC, TIF lub .dm4 o różnych głębiach bitowych. Co więcej, dane mogą być zapisywane jako obrazy z korekcją ruchu dla kamery K3. W kamerze K2 nieprzetworzony stos obrazów można zapisać jako 4-bitowe pliki MRC, 8-bitowe TIF lub 8-bitowe .dm4.
  2. Utwórz nową sesję na podstawie ustawień z poprzedniej sesji.
    1. Zaznacz pole wyboru Na podstawie poprzedniej sesji w palecie.
    2. Wybierz przycisk Nowy.
    3. Wybierz folder zawierający sesję, na której są oparte ustawienia nowej sesji. Przejdź do katalogu poprzedniej sesji, aby utworzyć nową sesję. Wybierz folder, w którym chcesz zapisać nową sesję i skojarzone z nią dane.
    4. Wybierz i wybierz folder, w którym zostanie zapisana nowa sesja i powiązane z nią dane.
      UWAGA: Każdy stan i jego podstawowe ustawienia (powiększenie, warunki oświetlenia, obraz lub projektor) oraz przesunięcie wiązki i parametry kamery (całkowita ekspozycja, ekspozycja pojedynczej klatki i binning) zostaną wyeksportowane z istniejącej sesji do nowej sesji. Ścieżka folderu jest wyświetlana jako ciąg tekstowy u dołu palety. Każda ze stanów i palet konfiguracji ma gwiazdkę (*) dołączoną do tytułu, co oznacza, że została już skonfigurowana i jest gotowa do użycia.
  3. Kontynuuj istniejącą sesję.
    1. Naciśnij przycisk Kontynuuj na palecie, aby kontynuować istniejącą sesję.
      UWAGA: Montażu atlasu nie można modyfikować.
    2. Wybierz folder zawierający sesję, która ma być kontynuowana, i przejdź do niego.
  4. Rozpocznij zupełnie nową sesję.
    1. Kliknij zakładkę Nowy w palecie. Wybierz folder zawierający sesję, która ma być kontynuowana. Wybierz folder, w którym chcesz zapisać dane.
      UWAGA: Domyślna nazwa folderu jest tworzona przy użyciu daty i godziny.
    2. Kliknij ikonę Ustawienia. W wyświetlonym oknie Zarządzaj eksploracją stanu dodaj stan, ustaw warunek TEM, warunek kamery i obraz/stos, a następnie nadaj państwu nazwę.
      UWAGA: Przepływ pracy automatycznego pozyskiwania danych wykorzystuje 5 różnych stanów do automatycznego zbierania danych. Te stany są konfigurowane i przechowywane w odpowiednich paletach stanów. Podsumowanie stanu znajduje się w tabeli 1.
  5. Skonfiguruj stan atlasu.
    1. Kliknij paletę stanów Atlasu.
    2. Skonfiguruj stan atlasu z następującymi parametrami: powiększenie 115x tryb LM w sondzie nano, warunki oświetlenia-rozmiar plamki 8 i jasność 934400, binning: 1 i czas ekspozycji kamery: 1,0 s dla obrazowania przy małym powiększeniu. Zapoznaj się z podsumowaniem stanu podanym w tabeli 1.
    3. Kliknij Dalej, aby przejść do następnego stanu.
      UWAGA: Stan atlasu to najniższy stan powiększenia, który zapewnia przegląd całej siatki (rysunek uzupełniający S2). Ogólnie rzecz biorąc, ten stan pomaga nam wizualizować całe siatki w małym powiększeniu i oceniać grubość lodu, płaskość i połamane kwadraty siatek. Zaleca się wygenerowanie atlasu w różnych obszarach siatki, aby zaobserwować optymalną grubość lodu i nieoptymalną grubość lodu siatek (rysunek uzupełniający S3). Wymienione parametry można zmieniać w zależności od potrzeb użytkownika.
  6. Skonfiguruj stan siatki.
    1. Kliknij paletę Stan siatki.
    2. Skonfiguruj stan siatki z następującymi optykami obrazowania mikroskopu (powiększenie 380x LM w trybie Nano), warunkami oświetlenia (rozmiar plamki: 8 i jasność 626 200), biningiem: 1 i czasem ekspozycji kamery: 1,0 s.
    3. Zobacz podsumowanie stanu współrzędnych Latitude-S zamieszczone w tabeli 1.
    4. Kliknij Dalej, aby przejść do następnego stanu.
      UWAGA: Stan siatki jest ustawiony na powiększenie większe niż stan atlasu, tak że pole widzenia wynosi jeden kwadrat siatki (Rysunek 2). W tym konkretnym powiększeniu obserwuje się jeden kwadrat siatki. W związku z tym otwory są obserwowane prawidłowo w tym powiększeniu, co pomaga sprawdzić grubość lodu w otworach (rysunek uzupełniający S4). Prosty filtr pasmowoprzepustowy jest używany w stanie siatki do lokalizowania otworów w siatce patentowej. Wymienione parametry można zmieniać w zależności od potrzeb użytkownika.
  7. Skonfiguruj stan otworu.
    1. Kliknij paletę otworów.
    2. Skonfiguruj stan otworu z następującymi ustawieniami mikroskopu: optyka obrazowa (powiększenie 4500x w trybie SM w sondzie Nano), warunki oświetlenia (rozmiar plamki: 7 i średnica wiązki 8,81 μm), binning: 1 i czas ekspozycji kamery: 1,0 s.
    3. W razie potrzeby zmień parametry w zależności od typu siatki. Zobacz podsumowanie stanu znajdujące się w tabeli 1.
    4. Kliknij Dalej, aby przejść do następnego stanu.
      UWAGA: Tryb SA wskazuje duży zakres powiększenia w mikroskopie elektronowym. Stan otworu mieści się w zakresie powiększenia SA z polem widzenia kilku mikrometrów (10-20 μm) (Rysunek 2 i Rysunek uzupełniający S4). Ten zakres powiększenia jest większy niż stan Atlasu lub siatki, ale znacznie mniejszy niż stan ostrości/danych. W tym powiększeniu będą widoczne poszczególne otwory. Rozmiar otworu jest odpowiedni do obserwacji wysokiego stopnia zanieczyszczenia, pustych otworów i odpowiedniej grubości lodu w otworach. Otwory do obrazowania są wybierane na podstawie tych założeń. W stanie otworu używane są dwa filtry: jeden do korelacji krzyżowej obrazu referencyjnego otworu z nowym obrazem otworu, a drugi do dostosowywania wysokości stołu montażowego do wysokości eucentrycznej.
  8. Skonfiguruj stan koncentracji uwagi.
    1. Kliknij paletę Ostrość.
    2. Skonfiguruj stan ostrości za pomocą następujących ustawień mikroskopu: optyka obrazowa (powiększenie 45 000x SA w trybie nanosondy), warunki oświetlenia (rozmiar plamki: 8 i jasność 934400), binning: 1 i czas ekspozycji aparatu: 1,0 s.
    3. Skoncentruj się na obszarze węgla amorficznego w pobliżu otworu. Zapoznaj się z podsumowaniem stanu notebooków Latitude-S zamieszczonym w tabeli 1.
    4. Kliknij Dalej, aby przejść do następnego stanu.
      UWAGA: Tryb SA wskazuje duży zakres powiększenia w mikroskopie elektronowym. Stan ostrości to powiększenie o wyższym zakresie SA. W trybie ostrości wiązka jest przesuwana na pobliski obszar węglowy otworu docelowego i automatycznie ustawia ostrość w celu zebrania danych w stanie danych. Filtr pasmowoprzepustowy w połączeniu z filtrem hanningowym lub miękkim prostokątnym jest używany w stanie ostrości do pomiaru przesunięcia między dwoma obrazami stanu ostrości tego samego obszaru (Rysunek 2). Wymienione parametry można zmieniać w zależności od potrzeb użytkownika.
  9. Skonfiguruj stan danych.
    1. Kliknij paletę danych.
    2. Skonfiguruj stan danych z następującymi ustawieniami mikroskopu: optyka obrazowa (np. powiększenie 28 000x, 45 000x, 54 000x w trybie SA w sondzie nano), warunki oświetlenia (rozmiar plamki: 8 i jasność 934400), binowanie: 1 i czas ekspozycji aparatu: 1,0 s.
    3. Zapoznaj się z podsumowaniem stanu szerokości geograficznej S podanym w tabeli 1.
    4. Kliknij Dalej, aby przejść do następnego stanu.
      UWAGA: Stan danych to najwyższe powiększenie wybrane na podstawie wymagań dotyczących rozmiaru piksela i rozdzielczości docelowej (Rysunek 2). Ogólnie rzecz biorąc, po ustawieniu ostrości wiązka jest automatycznie przesuwana do obszaru docelowego w celu zebrania danych. Powyższe parametry mogą ulec zmianie w zależności od wymagań użytkownika.

4. Konfiguracja ostrości

  1. Kliknij paletę konfiguracji Focus. Określ zakres wartości rozmycia i rozmiar kroku na danej karcie.
  2. Naciśnij przycisk Dalej, aby przejść do następnego kroku.
    UWAGA: Niższe wartości rozmycia mogą być używane do pozyskiwania danych o wysokiej rozdzielczości. Ogólnie rzecz biorąc, do akwizycji obrazu używane są wartości rozmycia od -0,5 do -3,0 μm z rozmiarem kroku rozmycia 0,25 lub 0,5. Użytkownicy mogą pominąć etap konfiguracji ostrości, jeśli chcą tylko wyświetlić próbkę. Wystarczy nacisnąć przycisk Dalej na palecie, aby pominąć krok konfiguracji ostrości.

5. Precyzyjne wyrównanie

  1. Skoncentruj się na niektórych cechach siatki (np. zanieczyszczenie lodem sześciokątnym lodem); patrz Rysunek 3.
    UWAGA: Obiekty nie powinny być ani za duże, ani za małe. Powinny być widoczne zarówno przy powiększeniu stanu Atlas 115x (tryb LA), jak i przy powiększeniu danych.
  2. Kliknij przycisk Przechwyć. Umieść czerwony krzyżyk na tym samym obiekcie na każdym obrazie różnych stanów.
  3. Zacznij od fokusu, danych i stanów otworów, ponieważ ich pole widzenia jest znacznie większe niż stany atlasu i siatki. Powiększ stany atlasu i siatki, aby umieścić czerwony krzyżyk na tym samym elemencie w stanach atlasu i siatki.
  4. Kliknij przycisk Oblicz, aby obliczyć pozycje pięciu różnych stanów, które obliczą przesunięcia między każdym ze stanów i odzwierciedlą je w oknie wyjściowym.
    UWAGA: Wartości przesunięcia są zintegrowane ze stanami do dalszego wykorzystania (Rysunek 3). Dokładne wyrównanie jest wykonywane w celu zapewnienia wysokiej dokładności położenia każdego stanu (Rysunek 3). To precyzyjne wyrównanie pomaga określić dokładną pozycję we wszystkich pięciu stanach. Precyzyjne wyrównanie ma kluczowe znaczenie dla pozyskiwania danych dotyczących pojedynczych cząstek. Dlatego zdecydowanie zaleca się wykonanie precyzyjnego wyrównania przed obrazowaniem.

6. Procedura pozyskiwania danych za pomocą Latitude-S

  1. Kliknij paletę przechwytywania.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, dane atlasu są zbierane w małym powiększeniu (115x) w celu wizualizacji większości kwadratów siatki.
  2. Wybierz rozmiar atlasu, który ma pokryć całą siatkę lub część siatki w zależności od wymagań (np. 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8 lub 8 x 12).
    UWAGA: Rozmiar atlasu 16 na 16 obejmuje całą siatkę.
  3. Kliknij przycisk Przechwyć, aby przechwycić atlas.
    UWAGA: Zostanie otwarte główne okno nawigacji w systemie Latitude-S, które wypełni dostępne miejsce w programie DigitalMicrograph (rysunek uzupełniający S5). Trzy panele obrazów w głównym oknie nawigacji pokazują obrazy stanów systemu w trzech różnych powiększeniach. Cały atlas jest obecnie wyświetlany w bieżącym stanie pozyskania w okienku po lewej stronie. Kafelki w atlasie będą się zapełniać po każdym przechwyceniu.
  4. Wybierz kwadrat siatki na podstawie grubości lodu, nawigując po atlasie (rysunek uzupełniający S5). Po wybraniu żądanych kwadratów siatki kliknij przycisk Zaplanuj i obserwuj, jak kafelki w kwadracie siatki wypełniają się, gdy każdy kwadrat siatki jest przechwytywany.
  5. Kliknij przycisk Harmonogram po wybraniu kwadratów siatki.
  6. Wybierz reprezentatywny otwór w kwadracie siatki, dodając jego położenie. Po uzyskaniu obrazu otworu zdefiniuj dane i pozycje ostrości, a następnie zapisz układ jako szablon (rysunek uzupełniający S6).
  7. Kliknij Automatyczne wyszukiwanie, podaj rozmiar otworu (np. R1.2/1.3) i kliknij przycisk Znajdź w programie, co spowoduje, że program Znajdź automatycznie znajdzie otwory na podstawie średnicy otworu. Następnie kliknij przycisk Oznacz, aby dodać szablon (Rysunek 4) i dodaj czerwone oznaczenia kółek we wszystkich otworach w jednej siatce lub częściowym kwadracie siatki.
  8. Ustaw intensywność, aby usunąć otwory z kwadratu siatki i zanieczyszczenia lodem (Rysunek 4).
    UWAGA: Na koniec wybrane otwory zostaną oznaczone kolorem żółtym w celu zaplanowania zbierania danych.
  9. Kliknij przycisk Zaplanuj w zadaniach Współrzędnych po dodaniu otworów za pomocą opcji Automatyczne wyszukiwanie.
    UWAGA: Przed zaplanowaniem automatycznego zbierania danych upewnij się, że poziom ciekłego azotu w zbiorniku jest wystarczający, pompa turbo automatycznej ładowarki jest wyłączona, a miejsce na dysku RAID jest wolne. Menedżer zadań Latitude-S pokazuje liczbę stanów atlasu, kwadratu siatki, otworu i danych zaplanowanych do zbierania danych (Rysunek 5). W graficznym interfejsie użytkownika notebooka Latitude-S będą widoczne różne schematy kolorów i zostanie wyświetlone znaczenie różnych schematów kolorów: 1. Żółty oznacza niezaplanowany; 2. Zielony oznacza zaplanowane; 3. Niebieski oznacza Nabyty; 4. Kolor czerwony oznacza niepowodzenie.

7. Przetwarzanie danych Cryo-EM

UWAGA: Przetwarzanie obrazu Cryo-EM białka kolca jest szczegółowo opisane w najnowszej literaturze25.

  1. Przeprowadź przetwarzanie obrazu białka kolca SARS-CoV2 za pomocą RELION 3.011.
  2. Obrazy filmów zebrane za pomocą notebooka Latitude-S można wyświetlić ręcznie i wykonać korekcję ruchu poszczególnych filmów za pomocą wiązki za pomocą oprogramowania MotionCor29. Wstępną selekcję mikrofotografii z korekcją ruchu należy przeprowadzić ręcznie za pomocą pakietu oprogramowania cisTEM14.
    UWAGA: Prawie 85% automatycznie pozyskanych mikrofotografii było dobrej jakości, a dane miały sygnał w zakresie 3,7-5,2 A, który jest obliczany za pomocą oprogramowania cisTEM14 (Rysunek uzupełniający S7A,B).
  3. Przetwarzaj dane za pomocą pakietu oprogramowania RELION 3.011.
    1. Ręcznie wybierz cząstki kolców i poddaj je klasyfikacji klasy 2D (rysunek uzupełniający S7C). Użyj najlepszej klasy 2D jako odniesienia do automatycznego wybierania 3 99 842 cząstek o pojedynczym kolcu z mikrofotografii za pomocą narzędzia RELION autopick11.
      UWAGA: Przeprowadzono trzy rundy klasyfikacji 2D przed poddaniem cząstek klasyfikacji 3D (Rysunek Uzupełniający S8). Do klasyfikacji 3D wybrano około 2 55 982 pojedyncze cząstki, a zestaw danych sklasyfikowano w sześciu klasach. Ostateczne automatyczne udoskonalanie 3D zostało wykonane z najlepszą klasą; Z klasyfikacji 3D uzyskano 85 227 cząstek kolców.
    2. Po automatycznym udoskonaleniu wykonaj korektę rozmycia dla każdej cząstki z odpowiednimi parametrami nachylenia wiązki w celu poprawy rozdzielczości. Następnie poddaj cząstki polerowaniu bayesowskiemu za pomocą pakietu oprogramowania RELION 3.011. Na koniec użyj zestawu polerowanych cząstek, aby przeprowadzić kolejną rundę automatycznego udoskonalania 3D za pomocą RELION 3.011.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W obecnej sytuacji pandemicznej, cryo-EM odgrywa kluczową rolę w charakterystyce struktur różnych białek z SARS-CoV-226,27,28,29, co może pomóc w opracowaniu szczepionek i leków przeciwko wirusowi. Istnieje pilna potrzeba podjęcia szybkich działań badawczych przy ograniczonych zasobach ludzkich w celu zwalczania choroby koronawirusowej z 2019 r. Akwizycja danych w krio-elektromagnetycznym pojed...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Latitude-S to intuicyjny interfejs użytkownika, który zapewnia środowisko do automatycznego konfigurowania i gromadzenia tysięcy mikrofotografii lub plików filmowych w wysokiej rozdzielczości w ciągu dwóch dni. Zapewnia łatwą nawigację po siatkach i utrzymuje pozycję stolika mikroskopu podczas przechodzenia od małego powiększenia do dużego powiększenia. Każdy etap pozyskiwania danych za pomocą notebooka Latitude-S jest szybki dzięki takim funkcjom, jak prosty interfejs użytkownika, szybkie przesyłanie strumieniowe danych...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych konkurencyjnych lub finansowych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Departamentowi Biotechnologii, Departamentowi Nauki i Technologii (DST) oraz Ministerstwu Rozwoju Zasobów Ludzkich (MHRD), Indie, za finansowanie i instalację cryo-EM w IISc-Bangalore. Potwierdzamy program DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) i DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) dla krajowego zakładu Cryo-EM w IISc, Bangalore. Dziękujemy za wsparcie finansowe ze strony Rady ds. Badań Naukowych i Inżynieryjnych (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 i SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Dziękujemy Pani Ishika Pramanick za przygotowanie siatek krio-EM, zebranie danych krio-EM oraz przygotowanie Tabeli Materiałów. Dziękujemy również Panu Sumanowi Mishrze za przetwarzanie obrazu cryo-EM i za pomoc w przygotowaniu figur. Dziękujemy prof. Raghavanowi Varadarajanowi za pomoc w uzyskaniu oczyszczonej próbki białka kolca do tego badania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BibułaTed Pella, INC.47000-100Element przygotowania próbek EM
KapsułkaThermo Fisher Scientific9432 909 97591Jednostka do przygotowywania próbek EM
KasetaThermo Fisher Scientific1020863Jednostka do przygotowywania próbek EM
C-ClipThermo Fisher Scientific1036171przygotowania próbek EM
Narzędzie do wkładania C-ClipThermo Fisher Scientific9432 909 97571Narzędzie do przygotowywania próbek EM
Pierścień C-ClipThermo Fisher Scientific1036173Element przygotowania próbek
EM siatka EM (Quantifoil)Mikroskopia elektronowa NaukiQ3100AR1,3R 1,2 / 1,3 300 Mesh, złota
maszyna do wyładowywania jarzeniQuorumN/AMaszyna do wyładowywania jarzeniowego Quorum GlowQube
K2 DEDGatan Inc.Nie dotyczyUrządzenie do zbierania danych Cryo-EM (kamera)
Oprogramowanie Latitude SGatan Inc.Oprogramowanie do obrazowania
Stacja załadowczaThermo Fisher Scientific1130698Jednostka przygotowania próbek EM
Talos 200 kV ArcticaThermo Scientific™Mikroskop krioelektronowyN/A
Vitrobot Mark IVThermo FisherScientific N/AJednostka przygotowania próbek EM
Element

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
  2. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  3. Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
  4. Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
  5. Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
  6. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  7. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  8. McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
  9. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  10. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980(2015).
  11. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  12. Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  13. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  14. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383(2018).
  15. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  16. Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
  17. Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
  18. Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  20. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  21. Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
  22. Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
  23. Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, Pt 3 384-389 (2007).
  24. Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
  25. Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
  26. Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
  27. Hillen, H. S., et al. Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).
  28. Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
  29. Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
  30. Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Particle Cryo EMAutomated Data AcquisitionCryo EM SoftwareHigh Throughput ImagingSpike Protein StructureElectron MicroscopyData Collection AutomationDirect Electron DetectorStructural Characterization3D Classification

Related Articles