Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowany system hodowli do stosowania w badaniach przedklinicznych terapii gruźlicy ukierunkowanych na gospodarza

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62838

⸱

16 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine, Trinity Translational Medicine Institute, St. James's Hospital, Trinity College Dublin, The University of Dublin, 2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 3SFI Advanced Materials and Bioengineering Research (AMBER) Centre, RCSI & TCD, 4SFI Centre for Research in Medical Devices (CURAM), RCSI, Dublin and National University of Ireland

W tym artykule

Podsumowanie

Szybkie i skuteczne oznaczanie wzrostu wewnątrzkomórkowego M. tuberculosis jest kluczowe dla poszukiwania lepszych terapii przeciwko gruźlicy (TB). Protokół ten opisuje test detekcji kolorymetrycznej na bazie bulionu przy użyciu zautomatyzowanego systemu hodowli płynów do ilościowego określenia wzrostu Mtb w makrofagach traktowanych potencjalnymi terapiami kierowanymi przez gospodarza.

Streszczenie

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), czynnik wywołujący gruźlicę (TB), był najważniejszym zabójcą chorób zakaźnych na świecie aż do nadejścia COVID-19. Mtb ewoluował, aby przetrwać w środowisku wewnątrzkomórkowym, unikać obrony gospodarza i rozwinąć oporność na wiele leków przeciwgruźliczych. Jednym z podejść do rozwiązania problemu oporności jest identyfikacja istniejących zatwierdzonych leków, które wzmocnią odpowiedź immunologiczną gospodarza na Mtb. Leki te mogą być następnie ponownie wykorzystane jako wspomagające terapie ukierunkowane na gospodarza (HDT) w celu skrócenia czasu leczenia i przezwyciężenia oporności na antybiotyki.

Kwantyfikacja wewnątrzkomórkowego wzrostu Mtb w makrofagach jest kluczowym aspektem oceny potencjału HDT. Złotym standardem pomiaru wzrostu Mtb jest liczenie jednostek tworzących kolonie (CFU) na płytkach agarowych. Jest to powolny, pracochłonny test, który nie nadaje się do szybkich badań przesiewowych leków. W tym protokole zautomatyzowany system hodowli oparty na bulionie, który jest częściej stosowany do wykrywania Mtb w próbkach klinicznych, został przystosowany do przedklinicznych badań przesiewowych terapii ukierunkowanych na gospodarza. Oceniono zdolność systemu do oznaczania płynnych kultur do badania wewnątrzkomórkowego wzrostu Mtb w makrofagach poddanych działaniu HDT. HDT testowane pod kątem ich zdolności do hamowania wzrostu Mtb to kwas all-trans retinowy (AtRA), zarówno w roztworze, jak i w kapsułkach w mikrocząstkach poli(kwasu mlekowo-koglikolowego) (PLGA) oraz kombinacja interferonu-gamma i linezolidu. Zalety tej zautomatyzowanej techniki opartej na hodowli płynnej w porównaniu z metodą CFU obejmują prostotę konfiguracji, mniej pracochłonne przygotowanie i szybszy czas oczekiwania na wyniki (5-12 dni w porównaniu do 21 dni lub więcej w przypadku płytek agarowych).

Wprowadzenie

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), czynnik wywołujący gruźlicę, był najważniejszym zabójcą chorób zakaźnych na świecie w 2019 roku1. Aby uniknąć obrony gospodarza, Mtb osłabia aktywność prątkowobójczą wrodzonych komórek odpornościowych, takich jak makrofagi i komórki dendrytyczne (DC), umożliwiając mu przetrwanie wewnątrzkomórkowe i replikację2. Brak skutecznej szczepionki zapobiegającej gruźlicy płuc u dorosłych oraz coraz częstsze pojawianie się szczepów lekoopornych wskazują na pilną potrzebę opracowania nowych terapii.

Wspomagające terapie ukierunkowane na gospodarza (HDT) mogłyby skrócić czas leczenia i pomóc przezwyciężyć oporność3. Przedkliniczna ocena kandydatów na HDT in vitro w celu określenia aktywności prątkowobójczej w makrofagach często opiera się na ilościowym określeniu wzrostu Mtb za pomocą jednostek tworzących kolonie (CFU) na stałych płytkach agarowych. Jest to powolny, pracochłonny test, który nie nadaje się do szybkich badań przesiewowych leków. Dostępne na rynku zautomatyzowane systemy wykrywania drobnoustrojów na bazie bulionu są częściej stosowane w klinicznych laboratoriach mikrobiologicznych do wykrywania i testowania wrażliwości na leki Mtb i innych gatunków prątków w próbkach klinicznych4. Przyrządy te mierzą wzrost pośrednio w oparciu o aktywność metaboliczną bakterii prowadzącą do zmian fizycznych w pożywkach hodowlanych (zmiana poziomów CO2 lub O2 lub ciśnienia) monitorowanych w czasie5. Odczyt to czas do dodatniego wyniku (TPP), który wcześniej wykazano, że koreluje z Mtb CFU w próbkach plwociny pacjentów z gruźlicą w odpowiedzi na leczenie6,7 oraz w lizatach zakażonych płuc i śledziony myszy 8. Ponadto systemy wykrywania płynnych kultur zostały wykorzystane do pomiaru wpływu konwencjonalnych terapii ukierunkowanych na patogeny na wzrost prątków w kulturach aksenicznych i hodowanych makrofagach9,10. Instrument został również wykorzystany do zbadania wrodzonej zdolności komórek dendrytycznych i makrofagów pęcherzykowych do kontrolowania wzrostu wewnątrzkomórkowego Mtb11,12. Ten protokół eksperymentalny pokazuje, że system diagnostyczny płynnych hodowli może być przystosowany do przeprowadzania przedklinicznych badań przesiewowych HDT w kierunku gruźlicy w hodowanych makrofagach. W porównaniu z liczeniem CFU, główną zaletą tej techniki jest to, że znacznie zmniejsza ona pracochłonność eksperymentalną i czas wymagany do ilościowego określenia wzrostu/przeżycia prątków wewnątrzkomórkowych. Technika ta opiera się na dostępie do zautomatyzowanego instrumentu hodowlanego, który można wykorzystać do oceny przeżycia wewnątrzkomórkowych prątków w komórkach odpornościowych traktowanych szeroką gamą odczynników farmakologicznych ukierunkowanych na funkcje komórkowe w celu wzmocnienia odporności gospodarza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Doświadczenia opisane w niniejszym protokole przeprowadzono z wykorzystaniem atenuowanego szczepu H37Ra Mtb, który może być hodowany w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (Containment Level 2). Wszystkie manipulacje z żywymi prątkami wykonywano w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) klasy II. Procedury eksperymentalne zostały zaprojektowane w celu zminimalizowania powstawania aerozoli. Hodowla komórek eukariotycznych (komórek THP-1) była również prowadzona w komorze BSC klasy II. Laboratorium przeprowadziło ocenę ryzyka i zapewniło, że wszystkie procedury były realizowane zgodnie z instytucjonalnymi i krajowymi przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego. Do przeprowadzenia opisanej metody (krok 1) wykorzystano ludzką linię komórkową monocytów THP-1. Przed zakażeniem prątkami komórki są różnicowane w makrofagi poprzez stymulację forbolem 12-mirystynianem 13-octanu (PMA).

1. Hodowla komórek

  1. Namnożyć materiał siewny H37Ra do fazy logarytmicznej w pożywce Middlebrook 7H9 (MB) z dodatkiem wzbogacenia albuminowo-dekstrozowo-katallazowego (ADC) (10%) oraz 0,05% polisorbatu 80. Przechowywać zapas H37Ra w alikwotach po 1 ml w temperaturze -80 °C zamrażarka do 1 roku.
  2. Odmrozić fiolkę o pojemności 1 ml zawierającą szczep Mtb-H37Ra i przenieść ją do kolby T25 z nakrętką z filtrem zawierającej 9 ml pożywki MB z dodatkami mniej więcej tydzień przed planowanym eksperymentem. Inkubować w 37 °C przez 5–7 dni w inkubatorze statycznym.
  3. Hodować komórki THP-1 w medium RPMI-1640 uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej nieinaktywowanej cieplnie (pełne (c)RPMI) w kolbie T75 w inkubatorze z CO22 inkubator z nawilżaniem i 5% CO₂2/37 °C i przeprowadzać pasaż dwa razy w tygodniu, aby utrzymać gęstość poniżej 1 x 106 komórek/ml
  4. Zróżnicuj komórki THP-1 w makrofagi na 3 dni przed infekcją, delikatnie pipetując komórki kilkukrotnie za pomocą pipety serologicznej w kolbach T75 w celu rozbicia skupisk, a następnie przenieś je do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
  5. Odwiruj komórki przy 30 x g g przez 10 min w temperaturze pokojowej, odlej nadosad, a osad delikatnie resuspenduj w 2 ml pożywki RPMI. Wykonaj obliczenie liczby komórek, aby oszacować stężenie komórek/ml.
  6. Wysiać 2 ml makrofagów THP-1 w 12-dołkowych płytkach do hodowli tkanek z gęstością 100 0 komórek/ml w cRPMI z dodatkiem 10 ng/ml PMA na 72 h. Usunąć z komórek pożywkę zawierającą PMA i uzupełnić ją świeżym cRPMI przed infekcją Mtb.
  7. Przygotuj oddzielne płytki dla każdego wymaganego punktu czasowego.
  8. Wysiać komórki z tą samą gęstością (100 0 komórek/ml) na szkiełkach przedmiotowych z dwiema komorami w celu określenia wielokrotności infekcji (MOI).
  9. Umieścić w 5% CO22 inkubator z nawilżaczem przez 3 dni w temperaturze 37°C °C.

2. Ilościowe oznaczenie poboru Mtb

  1. Wyznaczanie pochłaniania Mtb przez makrofagi (MOI)
    1. W dniu infekcji przygotuj komorę bezpieczeństwa biologicznego (BSC) klasy II i pracuj na dwóch warstwach ręczników papierowych, aby wyłapać ewentualne wycieki. Przygotuj pojemniki na odpady zgodnie z lokalnymi przepisami.
    2. Pobierz 6-8 mL kultury prątków z kolby T25 i przenieś ją do probówki z polipropylenu o pojemności 15 mL.
      UWAGA: Do mniejszych doświadczeń można użyć probówek o mniejszej objętości.
    3. Wirowaj probówkę w wirówce naktowej w temperaturze pokojowej przez 10 min przy 2890 x g.
    4. Ostrożnie wyjmij probówkę z wirówki i przenieś ją do komory bezpieczeństwa biologicznego. Odczekaj 1 min, aby bakterie osiadły.
      1. Odlej supernatant do pojemnika z środkiem dezynfekcyjnym, zakręć probówkę i resuspenduj bakterie w pozostałym medium, opukując ściankę probówki. Odczekaj 1 min, aby bakterie osiadły.
    5. Dodaj 2 mL uprzednio ogrzanego cRPMI, delikatnie wymieszaj i przenieś do probówki stożkowej o pojemności 50 mL.
    6. Bardzo ostrożnie resuspenduj prątki za pomocą igły 25 G i strzykawki 5 mL. Aby resuspendować, wciągnij zawiesinę prątków do strzykawki i bardzo delikatnie wypuść ją po ściance probówki, aby zminimalizować powstawanie aerozolu. Powtórz 6-8 razy.
      UWAGA: Zachowaj najwyższą ostrożność, ponieważ jest to kultura prątków o wysokiej gęstości. Aby uniknąć ryzyka zakłucia igłą, w miarę możliwości stosuj igły stępione oraz strzykawki z zamkiem Luer lock.
    7. Zutylizuj igłę i strzykawkę w pojemniku na odpady ostre w BSC.
    8. Przenieś zawiesinę do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL (z nakrętką) i wiruj w temperaturze pokojowej przez 3 min przy 10 x g, aby odwirować pozostałe grudki. Przenieś probówkę z powrotem do komory bezpieczeństwa i odczekaj 1 min, aż bakterie osiadną.
    9. Przenieś górne 1-1,5 mL supernatantu do nowej probówki. Oryginalną probówkę wyrzuć do pojemnika z odpadami zawierającego środek dezynfekcyjny. Wymieszaj dokładnie i dodaj różne ilości zawiesiny prątków (np. 5, 25, 50, 150 µL) na szkiełka z dwudzielną komorą szklaną i inkubuj przez 3 h w inkubatorze CO2 w 37 °C.
  2. Barwienie bakterii kwasoopornych (AFB)
    UWAGA: Po 3 h inkubacji makrofagi są płukane i utrwalane paraformaldehydem w celu inaktywacji prątków. Następnie preparaty barwi się przy użyciu zestawu Modified Auramine O (patrz Tabela Materiałów), aby oszacować liczbę fagocytowanych prątków na komórkę. Ze względu na woskową ścianę komórkową, prątki zatrzymują barwnik Auramine po płukaniu kwasem i alkoholem. Jądra makrofagów są następnie barwione kontrastowo barwnikiem Hoechst. Metoda ta pozwala na policzenie liczby fagocytowanych bakterii na komórkę i jest wykorzystywana do wyznaczenia wielokrotności infekcji (MOI) makrofagów.
    1. Usuń medium ze szkiełka z komorą szklaną, uprzednio pipetując zawartość w górę i w dół trzy razy, aby oderwać bakterie, które nie zostały sfagocytowane.
    2. Przepłucz raz 2 mL PBS w temperaturze pokojowej.
    3. Zasoby 4% paraformaldehydu rozpuszczonego w PBS przechowuj w alikwotach w temperaturze -20 °C do 6 miesięcy. Alikwot 4% paraformaldehydu odmroź bezpośrednio przed użyciem. Rozcieńcz do 2% paraformaldehydu za pomocą PBS i dodaj 2 mL na każdą studienkę.
    4. Inkubuj przez 10 min w temperaturze pokojowej. Na tym etapie szkiełko z komorą szklaną można wyjąć z komory bezpieczeństwa w celu barwienia.
    5. Przepłucz szkiełko pod delikatnym strumieniem wody z kranu.
    6. Nanieś na szkiełko za pomocą plastikowej pipety transferowej tyle Auraminy, aby pokryć komórki, i inkubuj przez 1 min w temperaturze pokojowej w ciemności (przykryj folią aluminiową).
    7. Usuń nadmiar barwnika ze szkiełka wodą z kranu i dodaj odbarwiacz/gaszacz na 1 min w ciemności.
    8. Usuń nadmiar wodą z kranu i inkubuj przez 15 min w temperaturze pokojowej z Hoechst 342 (10 µg/mL w PBS) w ciemności.
    9. Usuń barwnik Hoechst wodą z kranu, zdejmij komory, odlej nadmiar wody ze szkiełka, dodaj kroplę środka przeciwblaknącego i nałóż szkiełko cover-slip, a następnie wysusz na powietrzu.
    10. Obejrzyj preparat pod mikroskopem fluorescencyjnym, używając obiektywu olejowego 10x. Prątki będą fluorescować na zielono pod filtrem FITC. Jądra fluorescują na niebiesko pod filtrem DAPI (Rysunek 1C).
    11. Wyznacz MOI, licząc liczbę sfagocytowanych prątków na komórkę oraz procent zainfekowanych komórek.
    12. Oblicz objętość zawiesiny prątków potrzebną do osiągnięcia wymaganego MOI na podstawie powierzchni studienki na płytce; na przykład powierzchnia szkiełek z komorą szklaną użytych w tym doświadczeniu wynosi 4 cm2. Niskie MOI (około 1-2 prątki/komórka) jest pożądane w eksperymentach prowadzonych przez kilka dni (np. 5 dni).
  3. Infekcja makrofagów
    1. Dobrze wymieszaj zawiesinę prątków i dodaj wymaganą ilość do komórek na płytkach 12-studienkowych, gdy zostanie już określona objętość niezbędna do osiągnięcia pożądanego MOI.
    2. Inkubuj w 37 °C przez 3 h, aby umożliwić fagocytozę prątków.
    3. Usuń bakterie pozakomórkowe, płucząc studzienki kilka razy ciepłym RPMI lub HBSS.
    4. Zlizuj makrofagi w jednej studience (próbka 3 h), aby wyznaczyć procentowy czas do uzyskania wyniku pozytywnego (TTP) początkowego inokulum (próbka 3 h), zgodnie z opisem w kroku 3 poniżej.
    5. Do pozostałych studienek dodaj świeże cRPMI oraz wymagane dawki leku lub kontrolę nośnika; inkubuj płytki w inkubatorze CO2 w 37 °C przez niezbędny czas (zależnie od planu eksperymentalnego, zazwyczaj w kilku odstępach czasu od 1 do 8 dni).

3. Pobieranie próbek do systemu detekcji w hodowli płynnej

UWAGA: W dniu zakażenia mycobakterie zewnątrzkomórkowe są usuwane poprzez przemywanie, a mycobakterie wewnątrzkomórkowe są pozyskiwane poprzez lizę makrofagów z jednej studni (próbka po 3 h), aby określić początkową ilość fagocytowanych bakterii jako kontrolę bazową dla zakażenia. W kolejnych punktach czasowych medium, lizat komórkowy i popłuczyny są łączone w celu pomiaru całkowitego wzrostu mycobakterii. Jeśli jest to wymagane, wzrost zewnątrzkomórkowy i wewnątrzkomórkowy może być również oceniany oddzielnie.

  1. Zbiór próbki po 3 h w celu oznaczenia TTP
    1. Wypłucz prątki z przestrzeni zewnątrzkomórkowej ze wszystkich studzienek po początkowych 3 h infekcji, zgodnie z opisem w punkcie 2.3.3. Do studzienki kontrolnej (3 h) dodaj 1 mL świeżej pożywki, aby wyrównać objętość lizatu z objętościami uzyskanymi w późniejszych punktach czasowych.
      ​UWAGA: Patrz punkt 3.2.7, jeśli prątki zewnątrzkomórkowe mają zostać wykluczone z analizy.
  2. Zbieranie próbek
    1. Podgrzej bulion MB i butelki inkubacyjne urządzenia, aby osiągnęły temperaturę pokojową.
    2. Przenieś pożywkę z płytki 12-dołkowej do odpowiednio opisanych probówek stożkowych.
    3. Do każdej studzienki dodaj 50 µL sterylnego buforu do lizy (0,1% Triton x-10 w PBS przefiltrowany przez sterylny filtr 0,2 µm) i pozostaw na 10 min.
    4. Ostrożnie zeskrob komórki ze studzienki sterylnym skrobakiem i połącz je z pożywką w odpowiedniej probówce stożkowej.
    5. Wypłucz studzienkę 0,5 mL sterylnego PBS i przenieś płuczkę do odpowiedniej probówki.
    6. Każdą próbkę delikatnie przepuść 6–8 razy przez igłę i strzykawkę (25 G), aby rozbić aglomeraty. Rozcieńcz próbki 1:10 w bulionie MB; 10 µL próbki + 90 µL pożywki MB.
    7. W wymaganych odstępach czasu/dniach (zazwyczaj od 1 do 8 dni) pobierz pozostałe próbki, postępując zgodnie z krokami 3.2.1–3.2.6 opisanymi powyżej.
      ​UWAGA: Badacze mogą preferować wykluczenie prątków zewnątrzkomórkowych z analizy; w takim przypadku w kroku 3.2.2 powyżej pożywkę z każdej studzienki należy odrzucić, a makrofagi przemyć kilka razy przed dodaniem buforu do lizy.
  3. Inokulacja i ładowanie butelek inkubacyjnych urządzenia
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat urządzenia do hodowli w cieczy oraz związanych z nim materiałów eksploatacyjnych znajdują się w Tabeli materiałów.
    1. Zdezynfekuj gumowy korek butelki inkubacyjnej przy użyciu ręcznika papierowego nasączonego 70% alkoholem i pozostaw do wyschnięcia.
      UWAGA: Ten krok należy przeprowadzić w BSC.
    2. Przygotuj butelki, przenosząc odpowiednią ilość suplementów odżywczych dla wszystkich próbek do probówki stożkowej (0,5 mL/butelka). Używając igły i strzykawki, wstrzyknij 0,5 mL suplementu odżywczego do butelki inkubacyjnej.
    3. Pipetą przenieś 50 µL rozcieńczonej próbki (1:10) do probówki z dnem w kształcie litery V o pojemności 1 mL.
    4. Używając igły i strzykawki, wstrzyknij 500 µL próbki do przypisanej butelki inkubacyjnej.
    5. Zdezynfekuj gumowy korek butelki inkubacyjnej ręcznikiem papierowym nasączonym 70% alkoholem i pozostaw do wyschnięcia. Przed wyjęciem z BSC przetrzyj butelki ręcznikiem papierowym nasączonym 70% alkoholem.
    6. Ostrożnie przenieś butelki z komory bezpiecznej biologicznie do urządzenia w celu ich załadowania.
    7. Naciśnij przycisk ładowania w zautomatyzowanym systemie detekcji drobnoustrojów.
    8. Zeskanuj kody kreskowe na butelkach inkubacyjnych i umieść butelki w inkubatorze systemu detekcji w temperaturze 37 °C na maksymalnie 42 dni. Odczytaj i zapisz czas potrzebny do uzyskania wyniku dodatniego z ekranu urządzenia.
      UWAGA: Kod kreskowy umożliwia urządzeniu identyfikację butelki i powiązanie odczytów odbiciowości z konkretną butelką.
    9. Oblicz procentowy czas do uzyskania wyniku dodatniego (TTP), porównując TTP początkowego inokulum wewnątrzkomórkowego (Dzień 0) z TTP makrofagów hodowanych przez wskazany czas. Pozytywna zmiana procentowego TTP oznacza wzrost prątków13.
      Na przykład dla dnia 3:
      Procentowa zmiana czasu do uzyskania wyniku dodatniego = figure-protocol-1

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zautomatyzowany przyrząd do hodowli w cieczy użyty w tej badaniu monitoruje poziom CO2 co 10 min. Zmiana barwy sensora znajdującego się na dnie butelki przyrządu jest mierzona kolorymetrycznie i wyrażana w jednostkach odbicia. Następnie oprogramowanie urządzenia stosuje algorytmy detekcji w celu obliczenia czasu do uzyskania wyniku dodatniego (TTP), czyli liczby dni od inokulacji do momentu oznaczenia hodowli jako dodatniej (Rycina 1A). Zależność odwrotna między TTP a log10

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Autorzy wykorzystali metodę hodowli płynnej opisaną w tym protokole do monitorowania wzrostu Mtb w makrofagach pochodzących z monocytów i makrofagach pęcherzykowych oraz komórkach THP-1 zróżnicowanych za pomocą PMA 11,16,17. Technika ta może być również zmodyfikowana do stosowania z komórkami nieprzylegającymi12. Niedawno instrument został również wykorzystany w badaniach przedklinicznych do oceny wziewne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Science Foundation Ireland (SFI 08/RFP/BMT1689), Health Research Board w Irlandii [HRA-POR/2012/4 i HRA-POR-2015-1145] oraz Royal City of Dublin Hospital Trust.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop fluorescencyjny IX51Olympus, JaponiaWykrywanie i obrazowanie AFBbez dotyczy
Mikroprobówka 2 ml, płaskie dno, nakrętka, sterylneSarstedt, Karolina Północna, USA72.694.006Zakażenie Mtb strzykawką makropahges
5 mL, Luer lockBD Biosciences, San Jose, CA, USASZR-150-031KZakażenie Mtb makropahges/CFU
50 mL probówka, sterylneSarstedt, północ Carolina, Stany Zjednoczone62.547.254Zakażenie Mtb
kwasem all-trans-retinowym makropahges (ATRA) ≥ 98% (HPLC)Sigma Aldrich, Missouri, USAR2625Kandydat na terapię kierowaną przez gospodarza
System wykrywania drobnoustrojów BacT/ALERT 3DBiomerieux (Hampshire, Wielka Brytania)247001System detekcji kolorometrycznej na bazie bulionu
BACT/ALERT MP  BACT/ALERT MP Suplement odżywczyBiomerieux (Hampshire, Wielka Brytania)414997detekcji kolormetrycznej na bazie bulionu
Butelki hodowlane BACT/ALERT MPBiomerieux (Hampshire, Wielka Brytania)419744Test detekcji kolorometrycznej na bazie bulionu
BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mlBD Biosciences, San Jose, CA, USAM0553Płynna kultura prątków
BD BBL Middlebrook Wzbogacenie OADC, 20mLBD Biosciences, San Jose, CA, USAM0678Jednostki formujące kolonie
Skrobak komórkowy, 25 cmSarstedt, Karolina Północna, USA83.1830Zbiór lizatów lmakrofagów
Filtr strzykawkowy Corning, 0,2 i mikro; mCorning Incorporated, Niemcy431219Sterylizacja buforu do lizy
Szkło nakrywkowe (borokrzemian), 24 x 50 mm, grubość #1,5VWR International Limited631 - 0147
Cykloheksymidek, z mikrobiologicznegoSigma Aldrich, Missouri, USAC7698Jednostki tworzące kolonie
Dako Fluorescencyjne mediumAgilent Technologies Ireland LimitedS3023Antifade nośnik montażowy
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma Aldrich, Missouri, USAD8537Zakażenie Mtb makropahges
Płodowa surowica bydlęca, GibcoThermo Fisher, Massachusetts, USA10270106Hodowla komórek makrofagów
Glicerol, DifcoBD Biosciences, San Jose, CA, USA228220Jednostki tworzące kolonie
Hoescht 33342 (trichlorowodorek bisBenzimide H 33342)Sigma Aldrich, Missouri, USAB2261Barwienie jądrowe
IFNγ, rekombinowany ludzkiR& D Systems Inc, Minnesota, Stany Zjednoczone285-IFKandydat na terapię kierowaną przez gospodarza
Labtek 2-dołkowe szkiełko komorowe, sterylne, NuncThermo Fisher, Massachusetts, USATKT-210-150RZakażenie Mtb makropahgami
L-asparagina, bezwodnaSigma Aldrich, Missouri, USAA4159Jednostki tworzące kolonie
LinezolidSigma Aldrich, Missouri, USAPZ0014Antybiotyk
Igła podskórna Microlance 25 GBD Biosciences, San Jose, CA, USA300400Zakażenie Mtb makropahges/CFU
Middlebrook 7H10 Agar BaseBD Biosciences, San Jose, CA, USAM0303Jednostki do tworzenia kolonii
Middlebrook 7H9 Bulion BaseBD Biosciences, San Jose, CA, USAM0178Płynna kultura Mycobacterium
Zmodyfikowana Auramina O Barwnik i odbarwiaczLaboratorium Urządzeń Naukowych, IL, USA345-250AFB barwienie
ParaformaldehydSigma Aldrich, Missouri, USA158127Zakażenie Mtb makropahges
szalkami Petriego, 92 x 16mm (20/worek)Sarstedt, Karolina Północna, USA82.1473.001Jednostki tworzące kolonie
12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA)Sigma Aldrich, Missouri, Stany ZjednoczoneP8139Hodowla komórek makrofagów
Polisorbat 80, DifcoBD Biosciences, San Jose, Kalifornia, Stany Zjednoczone231181Płynna kultura prątków
RPMI-1640, GibcoThermo Fisher, Massachusetts, Stany Zjednoczone52400025Hodowla komórek makrofagów
Sterylny rozsiewacz komórek,, Thermo Fisher, MA, USARB-44103Jednostki formujące kolonie
Kolba T25 TC, kątowa szyjka, nasadka filtra, sterylna, NuncThermo Fisher, Massachusetts, Stany Zjednoczone156367Płynna hodowla prątków Mycobacterium
Linia komórkowa THP-1ATCC, Wirginia, USAATCC TIB-202Hodowla komórek makrofagów
Test montażowe marka rybna w kształcie litery L

Bibliografia

  1. WHO. Global Tuberculosis Report. World Health Organization. , Geneva. (2020).
  2. Russell, D. G. Mycobacterium tuberculosis and the intimate discourse of a chronic infection. Immunological Reviews. 240 (1), 252-268 (2011).
  3. Young, C., Walzl, G., Du Plessis, N. Therapeutic host-directed strategies to improve outcome in tuberculosis. Mucosal Immunology. 13 (2), 190-204 (2020).
  4. Angeby, K. A., et al. Evaluation of the BacT/ALERT 3D system for recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Clinical Microbiology and Infection. 9 (11), 1148-1152 (2003).
  5. Asmar, S., Drancourt, M. Rapid culture-based diagnosis of pulmonary tuberculosis in developed and developing countries. Frontiers in Microbiology. 6, 1184(2015).
  6. Diacon, A. H., et al. Time to liquid culture positivity can substitute for colony counting on agar plates in early bactericidal activity studies of antituberculosis agents. Clinical Microbiology and Infection. 18 (7), 711-717 (2012).
  7. Diacon, A. H., et al. Time to positivity in liquid culture predicts colony forming unit counts of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens. Tuberculosis. 94 (2), Edinburgh. 148-151 (2014).
  8. O'Sullivan, D. M., et al. Evaluation of liquid culture for quantitation of Mycobacterium tuberculosis in murine models. Vaccine. 25 (49), 8203-8205 (2007).
  9. Heinrichs, M., et al. Mycobacterium tuberculosis Strains H37ra and H37rv have equivalent minimum inhibitory concentrations to most antituberculosis drugs. International Journal of Mycobacteriology. 7 (2), 156-161 (2018).
  10. Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (1), 640-645 (2016).
  11. O'Leary, S. M., et al. Cigarette smoking impairs human pulmonary immunity to Mycobacterium tuberculosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (12), 1430-1436 (2014).
  12. Ryan, R. C., O'Sullivan, M. P., Keane, J. Mycobacterium tuberculosis infection induces non-apoptotic cell death of human dendritic cells. BMC Microbiology. 11, 237(2011).
  13. Keane, J., Remold, H. G., Kornfeld, H. Virulent mycobacterium tuberculosis strains evade apoptosis of infected alveolar macrophages. The Journal of Immunology. 164 (4), 2016-2020 (2000).
  14. Gao, X. F., Yang, Z. W., Li, J. Adjunctive therapy with interferon-gamma for the treatment of pulmonary tuberculosis: a systematic review. International Journal of Infectious Diseases. 15 (9), 594-600 (2011).
  15. Thorpe, T. C., et al. BacT/Alert: an automated colorimetric microbial detection system. Journal of Clinical Microbiology. 28 (7), 1608-1612 (1990).
  16. Gleeson, L. E., et al. Cutting edge: Mycobacterium tuberculosis induces aerobic glycolysis in human alveolar macrophages that is required for control of intracellular bacillary replication. The Journal of Immunology. 196 (6), 2444-2449 (2016).
  17. O'Connor, G., et al. Inhalable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles encapsulating all-trans-Retinoic acid (ATRA) as a host-directed, adjunctive treatment for Mycobacterium tuberculosis infection. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 134, 153-165 (2019).
  18. O'Connor, G., et al. Sharpening nature's tools for efficient tuberculosis control: A review of the potential role and development of host-directed therapies and strategies for targeted respiratory delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 102, 33-54 (2016).
  19. Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588(2018).
  20. Ortalo-Magne, A., et al. Molecular composition of the outermost capsular material of the tubercle bacillus. Microbiology. 141, Reading. Pt 7 1609-1620 (1995).
  21. Stokes, R. W., et al. The glycan-rich outer layer of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis acts as an antiphagocytic capsule limiting the association of the bacterium with macrophages. Infection and Immunity. 72 (10), 5676-5686 (2004).
  22. O'Sullivan, M. P., O'Leary, S., Kelly, D. M., Keane, J. A caspase-independent pathway mediates macrophage cell death in response to Mycobacterium tuberculosis infection. Infection and Immunity. 75 (4), 1984-1993 (2007).
  23. Cheon, S. H., et al. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 901-907 (2002).
  24. Nathan, C., Barry, C. E. TB drug development: immunology at the table. Immunological Reviews. 264 (1), 308-318 (2015).
  25. Bowness, R., et al. The relationship between Mycobacterium tuberculosis MGIT time to positivity and cfu in sputum samples demonstrates changing bacterial phenotypes potentially reflecting the impact of chemotherapy on critical sub-populations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (2), 448-455 (2015).
  26. Basu Roy, R., et al. An auto-luminescent fluorescent BCG whole blood assay to enable evaluation of paediatric mycobacterial responses using minimal blood volumes. Frontiers in Pediatrics. 7, 151(2019).
  27. Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000645(2009).
  28. Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 92 (6), Edinburgh. 453-488 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mycobacterium tuberculosiswewn trzkom rkowy wzrost Mtbzaka anie makrofag wtest hodowli w o rodku p ynnymjednostki tworz ce kolonierepurposing lek w w gru licymikrocz steczki PLGAmikroskopia fluorescencyjna

Powiązane artykuły