Artykuł metodologiczny

Sekwencjonowanie insercji transpozonów jako narzędzie do wyjaśnienia czynników kolonizacji bakteryjnej u mieczyków Burkholderia gladioli z chrząszczami Lagria villosa

DOI:

10.3791/62843

⸱

12 sierpnia 2021

 ,  , 
1Department of Evolutionary Ecology, Institute of Organismic and Molecular Evolution, Johannes Gutenberg University, 2Department of Insect Symbiosis, Max Planck Institute for Chemical Ecology, 3Department of Plant and Environmental Sciences, Section for Organismal Biology, University of Copenhagen

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To jest dostosowana metoda identyfikacji potencjalnych czynników kolonizacji owadów w korzystnym symbiontie Burkholderia. Gospodarz chrząszcza jest zainfekowany losową zmutowaną biblioteką wygenerowaną przez mutagenezę transpozonów, a złożoność biblioteki po kolonizacji jest porównywana z kontrolą wyhodowaną in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wnioskowanie o funkcji genów poprzez manipulowanie ich aktywnością jest niezbędnym narzędziem do zrozumienia genetycznych podstaw większości procesów biologicznych. Postępy w mikrobiologii molekularnej doprowadziły do pojawienia się różnych technik mutagenezy do manipulacji genami. Wśród nich sekwencjonowanie transpozonowo-insercyjne (Tn-seq) jest cennym narzędziem do jednoczesnej oceny funkcjonalności wielu genów kandydujących w sposób nieukierunkowany. Technika ta odegrała kluczową rolę w zidentyfikowaniu mechanizmów molekularnych kolonizacji gospodarzy eukariotycznych w kilku drobnoustrojach chorobotwórczych i kilku pożytecznych symbiontach.

Tutaj Tn-seq jest ustanawiany jako metoda identyfikacji czynników kolonizacyjnych u mutualistycznego symbionta Burkholderia gladioli chrząszcza Lagria villosa. Przez koniugację, insercja transpozonu Tn5 kasety opornej na antybiotyki jest przeprowadzana w losowych lokalizacjach genomu u B. gladioli. Aby zidentyfikować wpływ zakłóceń genów na zdolność bakterii do kolonizacji gospodarza chrząszcza, wygenerowaną bibliotekę transpozonów B. gladioli zaszczepia się jaja chrząszczy, podczas gdy kontrolę hoduje się in vitro w płynnej pożywce hodowlanej. Po zapewnieniu wystarczającej ilości czasu na kolonizację, DNA jest ekstrahowane z bibliotek hodowanych in vivo i in vitro. Zgodnie z protokołem przygotowania biblioteki DNA, próbki DNA są przygotowywane do sekwencjonowania transpozonowo-insercyjnego. Fragmenty DNA, które zawierają krawędź wstawki transpozonu i flankujące DNA bakteryjne, są wybierane, a miejsca mutacji są określane przez sekwencjonowanie z dala od krawędzi wstawki transpozonu. Wreszcie, analizując i porównując częstości występowania każdego mutanta w bibliotekach in vivo i in vitro, można przewidzieć znaczenie określonych genów symbiontów podczas kolonizacji chrząszczy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mieczyki Burkholderia mogą angażować się w symbiozę z chrząszczami Lagria villosa, odgrywając ważną rolę w obronie przed mikrobiologicznymi antagonistami owada gospodarza4,5,6. Samice chrząszczy zawierają kilka szczepów B. gladioli w wyspecjalizowanych gruczołach pomocniczych do układu rozrodczego. Po złożeniu jaj samice rozmazują komórki B. gladioli na powierzchni jaja, gdzie związki przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez B. gladioli hamują infekcje grzybami entomopatogenicznymi4,6. W późnym rozwoju embrionalnym lub wcześnie po wykluciu się larw bakterie kolonizują wgłębienia kutykularne na grzbietowej powierzchni larw. Pomimo tej wyspecjalizowanej lokalizacji i pionowej drogi transmisji symbiontów, L. villosa może przypuszczalnie również pozyskiwać B. gladioli poziomo ze środowiska4. Ponadto znaleziono co najmniej trzy szczepy B. gladioli w związku z L. villosa4,6. Wśród nich B. gladioli Lv-StA jest jedynym, który nadaje się do uprawy in vitro.

B. gladioli Lv-StA ma rozmiar genomu 8,56 Mb6 i zawiera 7 468 genów. Które z tych genów są ważne dla bakterii B. gladioli do kolonizacji gospodarza chrząszcza? Aby odpowiedzieć na to pytanie, użyliśmy sekwencjonowania transpozonowo-inserekcyjnego (Tn-seq), metody eksploracyjnej do identyfikacji warunkowo niezbędnych genów drobnoustrojów1,2,3. Zmutowana biblioteka B. gladioli Lv-StA została stworzona przy użyciu transpozonu Tn5. Poprzez koniugację komórek dawcy Escherichia coli z B. gladioli Lv-StA, przeniesiono plazmid pRL27 przenoszący transpozon Tn5 i kasetę oporności na antybiotyki otoczoną odwróconymi powtórzeniami (Figura 1). W ten sposób wygenerowano zestaw mutantów, które indywidualnie przenoszą zakłócenia 3 736 genów symbiont (Rysunek 2).

Pula mutantów została zainfekowana na jajach chrząszczy w celu zidentyfikowania czynników kolonizacji i, jako kontrola, była również hodowana in vitro na pożywce King's B (KB). Po zapewnieniu wystarczającej ilości czasu na kolonizację, wyklute larwy zebrano i zebrano w celu ekstrakcji DNA. Fragmenty DNA zawierające wstawkę transpozonu i flankujący region genomowy B. gladioli Lv-StA wybrano przy użyciu zmodyfikowanego protokołu przygotowania biblioteki DNA do sekwencjonowania. Przetwarzanie jakości odczytu, a następnie analizę za pomocą DESeq2 przeprowadzono w celu zidentyfikowania określonych genów kluczowych dla B. gladioli Lv-StA do kolonizacji larw L. villosa po przeniesieniu przez powierzchnię jaja.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie podłoża i buforu

  1. Przygotować pożywki KB i LB oraz płytki agarowe zgodnie z tabelą 1 i przelać do autoklawu w temperaturze 121 °C, 15 psi, 20 min.
    1. Dodać 50 μg/ml sterylizowanej filtrem kanamycyny i 300 μM sterylizowanego filtrem kwasu 2,6-diaminopimelowego (DAP) do autoklawowanej pożywki LB przed hodowlą E. coli WM3064 + pRL27.
    2. Dodaj 50 μg/ml sterylizowanej filtrem kanamycyny do autoklawowanego agaru KB, aby wlać płytki potrzebne do wybrania udanych transkoniugantów B. gladioli Lv-StA.
  2. Przygotować 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) mieszając następujące składniki: NaCl 8 g/L, KCl 0,201 g/L, Na2HPO4 1,42 g/L i KH2PO4 0,272 g/L. Rozpuść sole w wodzie destylowanej i autoklawuj mieszaninę w temperaturze 121 °C, 15 psi, 20 minut przed użyciem. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotuj 2x bufor do wiązania i płukania, rozpuszczając następujące składniki: 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) i 2 M NaCl w wodzie destylowanej. Przefiltruj i wysterylizuj mieszaninę przed użyciem. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  4. Przygotuj 1x Low-TE, rozpuszczając 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) i 0,1 mM EDTA w podwójnie destylowanej wodzie. Sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psi, 20 min. Przechowywać w temperaturze pokojowej.

2. Koniugacja w celu wygenerowania biblioteki mutantów transpozonów

figure-protocol-1
Rysunek 1: Kroki protokołu koniugacji. Biorca koniugacji Burkholderia gladioli Lv-StA (czerwony) i dawca Escherichia coli zawierający plazmid pRL27 (różowy) są hodowane odpowiednio w agarze KB i LB, uzupełnione kanamycyną i DAP. Po sprzęgającym transferze plazmidu przez 12-18 godzin w temperaturze 30 °C, transkoniugowane komórki B. gladioli są wybierane na KB zawierającej kanamycynę i łączone razem. Skróty: DAP = kwas 2,6-diaminomelilowy; Kan = kanamycyna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Pod sterylnym kapturem zaszczepić świeżą kulturę dawcy Escherichia coli WM3064 + pRL27 w 10 ml pożywki LB uzupełnionej kanamycyną i DAP. Zaszczepić komórki biorcze Lv-StA Burkholderia gladioli w 5 ml pożywki KB. Inkubować kultury w temperaturze 30 °C przez noc na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min.
  2. Po nocnym wzroście odwirować 4 ml każdej z kultur w temperaturze 9 600 × g przez 6 minut, aby osadzać komórki. Odrzucić supernatant.
  3. Pod sterylnym kapturem umyć granulowane kultury komórkowe w pożywce KB zawierającej DAP, a na koniec ponownie zawiesić kultury oddzielnie w 4 ml pożywki KB + DAP.
  4. W świeżej probówce o pojemności 15 ml wymieszaj 250 μl umytych komórek dawcy E. coli z 1 ml umytych komórek biorczych B. gladioli Lv-StA.
  5. Umieścić 10 μl tej mieszaniny komórek koniugacyjnych na płytkach agarowych KB zawierających DAP. Pozostawić płytkę w spokoju w sterylnym kapturze w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie inkubować płytki z plamkami koniugacji w temperaturze 30 °C przez 12-18 h.
    UWAGA: Okres koniugacji można dostosować w zależności od gatunku docelowego. Jednak długi okres koniugacji zwiększa ryzyko podwójnej insercji lub integracji plazmidu z genomem. W przypadku wolno rosnących bakterii należy pozwolić na dłuższe okresy koniugacji.
  6. Po inkubacji dodaj 2-4 ml 1x PBS do płytek pod sterylnym kapturem i użyj skrobaka do komórek, aby uwolnić wyhodowane plamy koniugacji bakterii z agaru. Odpipetować mieszaninę komórek sprzężonych do probówek do mikrofuge o pojemności 2 ml.
  7. Osadzać komórki przez odwirowanie w stężeniu 9 600 × g przez 2 min. Wyrzucić supernatant i przemyć osad dwukrotnie w 1 ml 1x PBS, pipetując w górę i w dół. Zawiesić końcowy granulat w 1200 μL 1x PBS. Rozcieńczyć przed posiewem, jeśli liczba komórek w mieszaninie przekracza 1 × 104.
  8. Dobrze wymieszać i rozprowadzić 200 μl mieszaniny komórek na dużych płytkach agarowych KB (6 lub więcej, jeśli jest to wymagane) uzupełnionych kanamycyną i inkubować w temperaturze 30 °C przez noc.
    UWAGA: Docelowe kolonie zmutowanych mutacji pojawiają się w ciągu 30 godzin na selektywnych płytkach agarowych. Ze względu na marker oporności na antybiotyki na selektywnej płytce agarowej pojawiają się tylko zmutowane kolonie. Dlatego oczekuje się, że wszystkie kolonie będą udanymi transkoniugantami.
  9. Policz całkowitą liczbę kolonii transkoniugantów na trzech płytkach i ekstrapoluj, aby obliczyć przybliżoną liczbę mutantów uzyskanych na wszystkich płytkach. Aby zwiększyć szanse na uzyskanie reprezentatywnej biblioteki, upewnij się, że całkowita liczba kolonii jest kilkakrotnie wyższa niż całkowita liczba genów w genomie. Aby potwierdzić powodzenie koniugacji, należy przeprowadzić PCR ukierunkowany na kasetę inseryjną przy użyciu 10-20 kolonii próbek, jak opisano w sekcji 3.
    UWAGA: Celem jest zapewnienie, że liczba kolonii jest co najmniej 10-krotnie większa niż liczba genów w całym genomie, w tym przypadku >75 000 mutantów. Jednak na ogół trudno jest dokładnie oszacować liczbę kolonii, która odpowiadałaby w pełni reprezentatywnej bibliotece. Liczba zmutowanych unikalnych genów nie jest w tym momencie oczywista, biorąc pod uwagę, że zakłócenia w podstawowych genach nie są wychwytywane, często istnieje wiele różnych miejsc mutacji dla tego samego genu, a mutacje generowane za pomocą transpozonów Tn5 nie są całkowicie losowe.
  10. Pod sterylnym kapturem zeskrob kolonie z płytek, dodając 1-2 ml 1x PBS na agare. Zebrać mieszaninę komórek zeskrobaną z płytek do probówek o pojemności 50 ml. Wiruj bibliotekę, aby dokładnie wymieszać, a następnie podziel 4 ml połączonej biblioteki mutantów na kilka krioprobówek. Dodać 1 ml 70% glicerolu do probówek i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. PCR i elektroforeza żelowa w celu potwierdzenia udanych insercji w B. gladioli Lv-StA

  1. Aby potwierdzić obecność insercji, należy pobrać poszczególne kolonie mutantów z płytek selekcyjnych w kroku 2.9 i przeprowadzić PCR ukierunkowany na kasetę inseryjną przy użyciu starterów wymienionych w tabeli 2. Przygotować główną mieszankę PCR zgodnie z tabelą 3 i ustawić warunki w termocyklerze zgodnie z opisem w tabeli 4.
  2. Uruchom produkty PCR na 1,6% żelu agarozowym za pomocą elektroforezy (250 V, 40 min), aby sprawdzić, czy amplifikowane fragmenty DNA mają oczekiwaną długość 1580 pz.

4. Infekcja puli mutantów na jajach chrząszczy

  1. Kroki mycia biblioteki
    1. Rozmrozić podwielokrotność przygotowanej biblioteki mutantów na lodzie. Odwirować przy 2,683 × g przez 10 minut i usunąć supernatant. Pod sterylnym kapturem umyj komórki 4 ml 1x PBS, aby usunąć resztki pożywki z komórek. Ponownie zawiesić komórki w 4 ml 1x PBS.
    2. Policz liczbę komórek w podwielokrotności biblioteki za pomocą komory zliczającej komórki. Rozcieńczyć część biblioteki do 2 × 106 komórek/μl w 1x PBS.
    3. Dokładnie wymieszaj porcję biblioteczną, aby jednorodnie wymieszać całą bibliotekę przed pobraniem wymaganej objętości.
  2. Sterylizacja lęgu jaja kurzego i zakażenie in vivo
    1. Wybierz sprzęgło do jaj L. villosa. Policz liczbę jaj i kontynuuj, jeśli lęg zawiera więcej niż 100 jaj.
    2. Wysterylizuj całe sprzęgło jajeczne.
      1. Dodaj 200 μl 70% etanolu i delikatnie myj jajka przez 5 minut. Usuń etanol i umyj jajka dwukrotnie wodą z autoklawy.
      2. Dodaj 200 μl 12% wybielacza (NaOCl) i delikatnie myj jajka przez 30 s. Natychmiast usuń wybielacz i ponownie umyj jajka trzy razy 200 μl autoklawizowanej wody.
    3. Zainfekuj 2 × 106 komórek/μl umytej biblioteki mutantów na wysterylizowanym lęgu jaj (2,5 μl na jajo).
    4. Dwa dni po wykluciu się zarażonych larw chrząszczy należy zebrać 100 larw w drugim stadium rozwojowym w probówce o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Kontrola biblioteki mutantów in vitro
    1. Pod sterylnym kapturem zaszczepić 250 μl 2 × 106 komórek/μl umytej biblioteki mutantów w 10 ml pożywki KB zawierającej kanamycynę.
    2. Inkubować zmutowaną kulturę in vitro w temperaturze 30 °C przez 20 h.
      UWAGA: Oblicz czas inkubacji, aby dopasować go do przybliżonej liczby pokoleń LV-StA WT B. gladioli in vivo podczas kolonizacji.
    3. Po 20 godzinach inkubacji dodać równą objętość 70% glicerolu do zmutowanej kultury in vitro i przechowywać ją w temperaturze -80 °C.

5. Ekstrakcja DNA z biblioteki zakażonych chrząszczy i mutacji in vitro

UWAGA: Ekstrakcje DNA zostały przeprowadzone przy użyciu zestawu do oczyszczania DNA i RNA zgodnie z protokołem producenta opisanym poniżej.

  1. Homogenizować zebrane larwy (maksymalnie 4 mg na probówkę do mikrofuge), dodając 1-2 ml ciekłego azotu i miażdżąc tłuczkiem.
  2. Rozmrozić wyhodowane in vitro zmutowane kultury z zapasów glicerolu na lodzie. Granulować komórki przez odwirowanie w ilości 9 600 × g przez 10 minut przed lizą komórek.
  3. Dodać 300 μl roztworu do lizy tkanek i komórek do próbek in vitro i in vivo. Dodać 5 μl 10 mg/ml proteinazy K, inkubować mieszaninę w temperaturze 60 °C przez 15 minut, a następnie umieścić na lodzie na 3-5 minut.
  4. Do lizatów dodać 150 μl odczynnika do wytrącania białek i dokładnie przemieszać. Osadzanie resztek białkowych przez odwirowanie w ilości 9 600 × g przez 10 minut.
  5. Przenieść supernatant do probówki do mikrofiltrów o pojemności 1,5 ml. Dodać 500 μl izopropanolu do supernatantu i delikatnie odwrócić probówki co najmniej 40 razy przed inkubacją w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę lub przez noc.
  6. Wytrącone DNA należy osadzać przez odwirowanie w stężeniu 9 600 × g przez 10 minut. Odrzucić supernatant i dodać lodowaty 70% etanol do osadu DNA.
  7. Wirować przy ≥10 000 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i pozostawić próbki do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 1 godzinę.
  8. Zawiesić DNA z próbek in vitro i in vivo w 100 μl buforu o niskiej zawartości TE.
  9. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

6. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania

UWAGA: Protokół i odczynniki do przygotowania biblioteki DNA są dostosowane i zmodyfikowane na podstawie instrukcji dostarczonych przez producenta zestawu do przygotowania biblioteki DNA.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Schemat etapów przygotowania biblioteki DNA. Po ścinaniu i podwiązaniu adapterem, zmodyfikowany protokół obejmuje etap selekcji kulek streptawidyny w celu wzbogacenia fragmentów DNA zawierających kasetę inseryjną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Rozcieńczyć próbki do stężenia 20 ng/μl i objętości 100 μl i przechowywać je na lodzie.
  2. Ścinanie próbki DNA in vivo i in vitro za pomocą ultrasonografu. Ustaw ultradźwięki na 70% mocy. Krótko zwirować próbki i ścinać przez 1 min 30 s.
    UWAGA: Ustawienia ultrasonografu będą się różnić w zależności od przyrządu. W tym przypadku rozmiar fragmentu wynosił 200-400 pz, co jest odpowiednie dla tego podejścia sekwencjonowania 150 pz, sparowany koniec (patrz krok 9.1). Parametry ścinania można dostosować do wymagań eksperymentatora.
  3. Sprawdź, czy DNA zostało ścięte do pożądanego zakresu rozmiarów (w tym przypadku 200-400 pz). Załaduj 5 μl nieściętego i ściętego DNA po zmieszaniu z barwnikiem ładującym żel w stosunku 1:1 na 1,6% żelu agarozowym przebiegu pod napięciem 250 V przez 40 minut (Rysunek 3A,B).
  4. Przygotowanie końcówek fragmentów wymaganych do podwiązania adaptera
    1. Do 50 μl ściętego DNA dodać odczynniki do przygotowania końcowego podane w zestawie do przygotowywania biblioteki: 3 μl mieszaniny enzymów i 7 μl buforu reakcyjnego i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Ustawić termocykler z podgrzewaną pokrywką na temperaturę ≥ 75 °C i inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze 20 °C i 30 minut w temperaturze 65 °C. Utrzymywać w temperaturze 4 °C.
  5. Podwiązanie adaptera
    1. W przypadku podwiązania adapterowego dodaj następujące odczynniki do produktów na końcowym etapie przygotowania: 30 μl Ligation Master Mix, 1 μl Ligation Enhancer i 2,5 μl rozcieńczonego Adaptera. Dokładnie wymieszać pipetując i inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze 20 °C w termocyklerze bez podgrzewanej pokrywy.
    2. Po 15 minutach dodać 3 μl enzymu (glikozylaza DNA uracylu + glikozylaza DNA z liazą DNA Endonukleaza VIII) (patrz tabela materiałów). Dobrze wymieszać przez pipetowanie i inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze 37 °C w termocyklerze z pokrywką podgrzaną do temperatury ≥47 °C.
      UWAGA: Na tym etapie protokół może zostać wstrzymany, a próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.
  6. Dobór wielkości DNA podwiązanego adapterem ukierunkowanego na fragmenty 250 pz
    1. Roztworze kulki magnetycznej należy przetrząsnąć (patrz Tabela materiałów) i umieścić w temperaturze pokojowej na 30 minut przed użyciem.
    2. Dodać 0,3x kulki do 96,5 μl mieszaniny ligowanego DNA i wymieszać dokładnie pipetując. Inkubować mieszaninę kulek przez 5 min.
      UWAGA: Obecność soli i glikolu polietylenowego w mieszaninie kulek ułatwia wytrącanie się fragmentów DNA na kulkach. Niski stosunek kulek do cząsteczek DNA prowadzi do wiązania się z kulkami tylko większych fragmentów DNA. W tym przypadku fragmenty DNA o długości powyżej 250 pz są związane z koralikami.
    3. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, aby ściągnąć koraliki i usunąć fragmenty DNA o niepożądanych rozmiarach. Pozwól kulkom osiąść na 5 minut, a następnie przenieś przezroczysty supernatant do nowej probówki do mikronatynku (zachowaj supernatant).
    4. Dodać 0,15x świeżych kulek do supernatantu i wymieszać dobrze pipetując. Inkubuj mieszaninę kulek przez 5 minut, a następnie umieść probówki na stojaku magnetycznym, aby ściągnąć w dół kulki związane z docelowym DNA. Odczekać 5 minut, a następnie wyrzucić supernatant (zachować kulki).
      UWAGA: Ten stosunek koralików do DNA prowadzi do wiązania fragmentów o pożądanym rozmiarze 250 pz.
    5. Z kulkami na stojaku magnetycznym dodaj 200 μl 80% etanolu (świeżo przygotowanego) i odczekaj 30 sekund. Odpipetuj i ostrożnie wyrzuć myty etanol, nie naruszając kulek na stojaku magnetycznym. Powtórz ten krok.
    6. Po ostatnim praniu usuń ślady etanolu z kulek, a następnie susz je na powietrzu przez 2 minuty, aż staną się błyszczące, ale nie całkowicie wysuszone. Nie susz koralików zbyt mocno.
    7. Wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego i dodaj 17 μl 10 mM Tris-HCl lub 0,1x TE (Low-TE). Wymieszać pipetując ~10 razy i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
    8. Umieść probówki z powrotem na stojaku magnetycznym i odczekaj 5 minut. Gdy kulki się uspokoją, przenieś supernatant DNA do nowej probówki.
  7. PCR I w celu dodania znacznika biotyny do fragmentów DNA zawierających kasetę inseryjną
    1. Dodać biotynylowany znacznik startera do fragmentów DNA zawierających kasetę insercji Tn5 za pomocą specyficznego dla transpozonu biotynylowanego startera (Tabela 5) i startera indeksowego. Przygotować główną mieszaninę PCR zgodnie z tabelą 6 i postępować zgodnie z warunkami PCR dla termocyklera wymienionymi w tabeli 7.
  8. Czyszczenie PCR I bez wyboru rozmiaru
    1. Zwiruj koraliki 0,9x i umieść je w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut przed czyszczeniem.
    2. Dodaj 0,9x koraliki do produktów PCR i dokładnie wymieszaj.
    3. Umieść koraliki na stojaku magnetycznym, aby pociągnąć koraliki w dół.
    4. Usunąć klarowny sklarowany supernatant i dwukrotnie przemyć DNA związane z kulkami 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu.
    5. Usuń etanol po etapach mycia i wysusz kulki na powietrzu, aż będą błyszczące, ale niezbyt suche.
    6. Dodać 32 μl 10 mM Tris-HCl lub 0,1X TE (Low-TE) i inkubować kulki przez 5 minut. Umieść mieszaninę z powrotem na stojaku magnetycznym i przenieś supernatant do świeżej probówki do mikrofuge.
  9. Wiązanie biotynylowanych fragmentów DNA z kulkami streptawidyny
    1. Ponownie zawiesić 32 μl kulek streptawidyny w 1x buforze Bind-and-wash. Umyj koraliki buforem trzy razy, gdy są umieszczone na stojaku magnetycznym.
    2. Dodać 32 μl 2x buforu Bind-and-wash i ponownie zawiesić kulki. Do tego należy dodać 32 μl oczyszczonych produktów PCR 1. Dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    3. Umieść mieszaninę kulek i DNA na stojaku magnetycznym na 2 minuty. Odpipetuj supernatant, gdy DNA znakowane biotyną zawierające krawędź insercji wiąże się ze streptawidyną na kulkach.
    4. Umyj kulki 500 μl 1x buforu Bind-and-wash, a następnie umyj kulki 200 μl Low-TE. Ponownie zawiesić kulki związane z DNA w 17 μl Low-TE.
  10. PCR II w celu dodania adapterów do fragmentów zawierających krawędź kasety wprowadzającej
    1. Przygotować mieszankę wzorcową, jak pokazano w tabeli 8, używając starterów indeksowych i zmodyfikowanych uniwersalnych starterów PCR wymienionych w tabeli 5. Dodać 15 μl kulek streptawidyny związanych z DNA z poprzedniego kroku do mieszaniny PCR. Patrz Tabela 7, aby zapoznać się z warunkami termocyklera.
  11. Oczyść produkty PCR bez wyboru rozmiaru, jak podano w kroku 6.8 niniejszego protokołu. Eluować końcowe produkty DNA w 30 μl wody molekularnej.
  12. Przechowywać próbki w temperaturze -20 °C i używać ich do sekwencjonowania.

7. Sekwencjonowanie i analiza

  1. Sekwencjonowanie biblioteki przy użyciu technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Dostosuj głębokość sekwencjonowania w zależności od rozmiaru biblioteki transpozonów, jak pokazano poniżej. Oceń jakość odczytu za pomocą FastQC7. Wybierz odczyty zawierające krawędź wstawiania Tn5 na końcu 5' odczytu i usuń sekwencję krawędzi wstawiania za pomocą Cutadapt8 i/lub Trimmomatic9.
    UWAGA: W tym przypadku zastosowano podejście sekwencjonowania sparowanych końców, aby osiągnąć 150 pz na odczyt i łącznie 8 mln odczytów. Aby uzyskać reprezentatywny zestaw danych, upewnij się, że łączna liczba sekwencjonowanych odczytów przekracza maksymalną możliwą liczbę mutantów w bibliotece, tj. całkowitą szacowaną liczbę kolonii z kroku 2.9. Jako odniesienie, protokół ten miał na celu 40-krotne zwiększenie maksymalnego możliwego rozmiaru biblioteki. Inne udane badania wykorzystujące Tn-seq do podobnego celu zsekwencjonowały całkowitą liczbę odczytów blisko 25-krotność rzeczywistej liczby unikalnych wstawienia w odpowiedniej bibliotece mutantów22,23.
  2. Biorąc pod uwagę, że mutacje na końcach genów nie są funkcjonalnie destrukcyjne, należy przyciąć o 5% oba końce adnotacji genów w pliku GFF genomu referencyjnego. Mapuj przycięte odczyty do genomu referencyjnego za pomocą Bowtie210.
  3. Oblicz liczbę wstawienia na podstawie liczby unikalnych pozycji 5' w pliku BAM linii trasowania.
  4. Korzystając z FeatureCounts11, uzyskaj liczbę trafionych genów dla każdej próbki repliki.
  5. Korzystając z pakietu DESeq212 w programie RStudio, oblicz różnicę w liczebności mutantów między różnymi warunkami.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie związane z gospodarzem mogą wykorzystywać kilka czynników do ustalenia związku, w tym te pośredniczące w adhezji, ruchliwości, chemotaksji, reakcjach na stres lub specyficzne transportery. Podczas gdy czynniki ważne dla interakcji patogen-gospodarz zostały zgłoszone dla kilku bakterii13,14,15,16,17,18, w tym członkowie rodzaju Burkholderia19,20, mniej badań dotyczyło mechanizmów molekularnych wykorzystywanych przez pożyteczne symbionty do kolonizacji21,22,23. Wykorzystując sekwencjonowanie insercji transpozonów, celem było zidentyfikowanie czynników molekularnych, które umożliwiają B. gladioli kolonizację chrząszczy L. villosa.

Mutageneza za pośrednictwem transpozonu została przeprowadzona przy użyciu plazmidu pRL27, który przenosi transpozon Tn5 i kasetę oporności na kanamycynę otoczoną miejscami powtórzeń odwróconych. Plazmid został wprowadzony do docelowych komórek B. gladioli Lv-StA przez koniugację ze szczepem WM3064 dawcy plazmidu E. coli (jak pokazano na Rysunek 1). Po koniugacji mieszaninę koniugacyjną zawierającą biorcę B. gladioli i komórki dawcy E. coli rozsiano na selektywnych płytkach agarowych zawierających kanamycynę. Brak DAP na płytkach wyeliminował komórki E. coli dawcy, a obecność kanamycyny wyselekcjonowanej do udanych transkoniugantów B. gladioli Lv-StA. Zbiorcza biblioteka mutantów B. gladioli Lv-StA uzyskana z zebrania 100 000 kolonii transkoniugantów została przygotowana do sekwencjonowania przy użyciu zmodyfikowanego zestawu do przygotowania biblioteki DNA i niestandardowych starterów. Rysunek 2 przedstawia etapy przygotowania biblioteki DNA. Sekwencjonowanie dało 4 mln sparowanych odczytów; 3736 z 7468 genów u B. gladioli Lv-StA zostało zakłóconych.

Aby zidentyfikować mutanty, które były wadliwe pod względem kolonizacji u gospodarza, biblioteka mutantów B. gladioli Lv-StA została zainfekowana na jajach chrząszczy i wyhodowana in vitro na pożywce KB jako kontrola. Wielkość wąskiego gardła kolonizacji in vivo została obliczona przed eksperymentem. Znana liczba komórek Lv-StA B. gladioli została zakażona na jajach chrząszczy, a liczbę komórek kolonizujących w świeżo wyklutych larwach pierwszego stadium rozwojowego uzyskano poprzez posiew zawiesiny z każdej larwy i zliczenie jednostek tworzących kolonie na osobnika. Obliczenia te zostały wykonane, aby upewnić się, że liczba komórek kolonizujących jest wystarczająca do oceny wszystkich lub wysokiego odsetka mutantów w bibliotece pod kątem ich zdolności do kolonizacji gospodarza. Ponadto czas wzrostu między warunkami in vitro i in vivo został znormalizowany w oparciu o liczbę pokoleń bakterii, aby umożliwić porównanie tych próbek.

Po wykluciu się jaj, 1,296 larw zostało zebranych w 13 basenach. Odpowiednie zmutowane kultury in vitro hodowano i przechowywano jako zapasy glicerolu. DNA z bibliotek mutantów hodowanych in vivo i in vitro zostało wyekstrahowane i rozdrobnione w ultrasonografie. Rysunek 3 pokazuje rozkład wielkości ściętego DNA, gdzie większość fragmentów rozciąga się między 100 a 400 pz, zgodnie z oczekiwaniami. Po tym etapie opracowano zmodyfikowany protokół przygotowania biblioteki DNA do sekwencjonowania. Na każdym etapie protokołu sprawdzano stężenie pozostałego DNA, aby upewnić się, że kroki zostały wykonane prawidłowo i śledzić straty DNA. Kontrola jakości (patrz Tabela Materiałów) przed sekwencjonowaniem wykazała, że biblioteki DNA zawierały nieoczekiwanie duże (>800 pz) fragmenty DNA, które były bardziej widoczne w bibliotekach in vivo. Biorąc pod uwagę trudności w optymalizacji grupowania fragmentów na torach sekwencjonowania, konieczne było zwiększenie głębokości sekwencjonowania do 10 mln sparowanych odczytów w bibliotekach in vivo, aby osiągnąć pożądaną liczbę odczytów. Analiza wyników sekwencjonowania wykazała, że średnio 4 Mio odczyty w bibliotekach in vivo i 3,1 Mio odczyty w bibliotekach in vitro zawierały krawędź Transpozonu na końcu 5' Read-1 (Tabela 9), co było zadowalające dla tego eksperymentu. Rozkład 24 224 unikalnych insercji w genomie B. gladioli w oryginalnej bibliotece pokazano w Rysunek 4. Analiza przeprowadzona przy użyciu DESeq2 wykazała, że liczebność 271 mutantów różniła się znacząco między warunkami in vivo i in vitro.

figure-results-1
Rysunek 3: Żele agarozowe mutanta i biblioteki DNA. (A) Żel agarozowy z nieściętym DNA mutanta na pasie x i drabinką 1 kbp dla skali. (B) Żel ze ściętą biblioteką DNA. Rozmiary taśm drabiny na pierwszym pasie są wskazane po lewej stronie. Pierwsze trzy pasy a, b i c zawierają ścięte fragmenty DNA z bibliotek in vivo. Pasy d, e, f i g zawierają ścięte fragmenty DNA z bibliotek in vitro. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 4: Lokalizacja unikalnych miejsc insercji w oryginalnej bibliotece w czterech replikonach w genomie Lv-StA mieczyków Burkholderia. Każdy pręt wzdłuż osi x znajduje się w miejscu wstawienia. Wysokość słupka wzdłuż osi y odpowiada liczbie odczytów skojarzonych z tym miejscem. Zauważ, że dwa chromosomy i dwa plazmidy są pokazane na całej długości, a zatem mają różne skale na osi x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podłoże King's B/ agar
Pepton (soja)20 g/l
K2HPO41,5 g/l
MgSO 4,7H2 O1,5 g/l
agar15 g/L
Rozpuszczony w wodzie destylowanej
LB średnie/agar
Trypton10 g/L
Ekstrakt drożdżowy5 g/l
Zawartość NaCl10 g/L
Rozpuszczony w wodzie destylowanej

Tabela 1: Komponenty multimedialne.

Nie.PodkładySekwencjaTemp. wyżarzania PCR (°C)
1tpnRL17–1RC5'-CGTTACATCCCTGGCTTGTT-3'58.2
cyfra arabskatpnRL13–2RC5'-TCGTGAAGAAGGTTGCTG-3'

Tabela 2: Startery potwierdzające sukces koniugacji.

pkt. pkt. pkt.
składnikObjętość (μL)
Woda oczyszczona metodą HPLCNorma 4,92
10x Bufor S (wysoka specyficzność)1
MgCl2 (25 mM)0,2
Zasilacze dNTP (2 mM)Rozdział 1.2
Podkład 1 (10 pmol/μL)0,8
Podkład 2 (10 pmol/μL)0,8
Taq (5 U/μL)0,08
Mastermix ogółem9
szablon1

Tabela 3: Główna mieszanka PCR potwierdzająca sukces koniugacji. Skróty: HPLC = wysokosprawna chromatografia cieczowa; dNTPs = trifosforan deoksynukleozydu.

pkt.
KrokiTemperatura °CGodzinaCykli
Początkowa denaturacja95 Rozdział 95Czas trwania: 3 min1
denaturacja95 Rozdział 9540 sekund
Wyżarzanie58,240 sekundod 30 do 35
rozszerzenie72 Rozdział 721-2 min
Końcowe przedłużenie72 Rozdział 72Czas trwania: 4 min1
trzymać4∞

Tabela 4: Warunki PCR potwierdzające powodzenie koniugacji.

pkt. TGLI
PodkładySekwencjaTm °Cużywaćźródło
Biotynylowany podkład specyficzny dla Transpozonu5'-Biotyna-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG
-3'		63,56.7.1. Szczepionka PCR Izwyczaj
Zmodyfikowany uniwersalny starter do PCR5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATC
TACACTCTTTCCCTACACGACGCTC
TTCCGATCTGAATTCATCGATGAT
GGTTGAGATGTGT – 3'		626.10.1. Szczepionka PCR IIzwyczaj
Elementarz indeksuZapoznaj się z instrukcją producenta6.7.1. PCR I i 6.10.1. Metoda PCR IINEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Zestaw starterów indeksu 1)
adapterZapoznaj się z instrukcją producenta6.5. Podwiązanie adapteraZestaw do przygotowania biblioteki DNA NEBNext Ultra II dla Illumina

Tabela 5: Startery i adapter do PCR I i II podczas przygotowywania biblioteki DNA.

Rozdział
Mieszanka PCR(μl)
Fragmenty DNA podwiązane adapterem15
Główny miks NEBNext Ultra II Q525
Starter indeksowy (10 pmol/ μL)5
Specyficzny dla transpozonu biotynylowany starter (10 pmol/ μL)5
Całkowita objętość50

Tabela 6: Przygotowanie biblioteki DNA-PCR I master mix.

KrokitemperaturaGodzinaCykli
Początkowa denaturacja98 °C30 sekund1
denaturacja98 °C10 sekund6 do 12
Wyżarzanie65 °C30 sekund
rozszerzenie72 °C30 sekund
Końcowe przedłużenie72 °CCzas trwania: 2 min1
trzymać16 °C∞

Tabela 7: Przygotowanie biblioteki DNA - warunki PCR I i II.

Rozdział
Mieszanka PCR(μl)
DNA wyselekcjonowane przez koraliki15
Główny miks NEBNext Ultra II Q525
Elementarz indeksu5
Zmodyfikowany uniwersalny starter do PCR5
Całkowita objętość50

Tabela 8: Przygotowanie biblioteki DNA-mieszanka wzorcowa PCR II.

powiedział: powiedział: ) ) ) osób osób osób osób osób osób osób osób osób osób jedn. osób osób jedynki jedynki osób osób osób TGL szt. szt. TGL SZT. TGL
BibliotekiInvivo-1Invivo-2Invivo-3Invitro-1 (Invitro-1Invitro-2 (Invitro-2Invitro-3 (Invitro-3Oryginalna biblioteka
Liczba odczytów (PE)56 57 71039 19 05130 65 84935 73 49428 83 44036 61 95646 09 410
Liczba odczytów zawierających Tn – krawędź na końcu 5' Read-154 15 88037,31,16929 36 24733 00 49927 35 70533 50 40241 53 270
Ogólny współczynnik wyrównania muszki2 (%) (tylko Odczyt-1)95,53%83,71%89,87%80,79%78,00%73,06%74,92%
Liczba unikalnych wstawek8 5394 1347 18318 93018 42120 43824 224
Liczba trafionych genówRok 1575993145027932597Numer katalogowy: 30373736

Tabela 9: Podsumowanie wyników sekwencjonowania i częstotliwości wstawiania transpozonów dla każdej biblioteki. Skrót: PE = paired-end.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stworzono bibliotekę mutantów transpozonów B. gladioli w celu zidentyfikowania ważnych czynników kolonizacji gospodarza w symbiotycznej interakcji między chrząszczami L. villosa a bakteriami B. gladioli . Głównymi etapami protokołu były koniugacja, infekcja gospodarza, przygotowanie biblioteki DNA i sekwencjonowanie.

Ponieważ wiele szczepów Burkholderia jest podatnych na modyfikację genetyczną przez koniugację24,25, plazmid przenoszący transpozon i kasetę inseryjną antybiotyku został pomyślnie sprzężony z docelowym szczepem B. gladioli Lv-StA z E. coli. Poprzednie próby transformacji za pomocą elektroporacji przyniosły bardzo niskie lub prawie żadne transformatory B. gladioli. Wskazane jest zoptymalizowanie techniki transformacji dla organizmu docelowego, aby skutecznie uzyskać dużą liczbę transformantów.

Jedna runda koniugacji i 40 plam koniugacji zakłóciła 3736 genów u B. gladioli Lv-StA. Patrząc z perspektywy czasu, konieczne byłoby przeprowadzenie wielu rund koniugacji, aby zakłócić działanie większości z 7468 genów i uzyskać nasyconą bibliotekę. Warto zauważyć, że czas inkubacji podczas koniugacji nie mógł przekroczyć 12-18 godzin, co jest końcem fazy wykładniczego wzrostu B. gladioli. Dopuszczenie koniugacji poza fazę wykładniczego wzrostu komórek bakteryjnych zmniejsza szanse na powodzenie otrzymania transkoniugantów26. Dlatego okres koniugacji należy dostosować do wzrostu gatunków bakterii.

Aby skutecznie przeprowadzić eksperyment polegający na zakażeniu zmutowanych bibliotek w gospodarzu, ważne jest oszacowanie wielkości wąskiego gardła populacji bakterii podczas kolonizacji oraz różnorodności mutantów w bibliotece przed infekcją 1,2,27. Przygotowując się do eksperymentu, oszacowaliśmy minimalną liczbę chrząszczy, które muszą zostać zainfekowane, aby mieć dużą szansę na pobranie próbki od każdego mutanta w bibliotece i pozwolenie na kolonizację. Obliczono również przybliżony czas generacji bakterii in vivo oraz liczbę pokoleń w czasie trwania eksperymentu. Kultura in vitro została następnie wyhodowana do porównywalnej liczby pokoleń poprzez dostosowanie czasu inkubacji. W przypadku podobnego eksperymentu z infekcją u innych gospodarzy niebędących modelami pożądana jest zdolność do utrzymania kultury laboratoryjnej i stałego źródła organizmów gospodarza.

Po rozroscie biblioteki mutantów in vivo i in vitro oraz pobraniu próbek, przeprowadzono zmodyfikowany protokół przygotowania biblioteki DNA do sekwencjonowania insercji transpozonów. Modyfikacja protokołu polegała na zaprojektowaniu niestandardowych starterów PCR i dodaniu etapów PCR w celu wybrania fragmentów DNA zawierających kasetę insercji. Ponieważ protokół został dostosowany, dodatkowe cykle PCR w protokole zwiększały ryzyko nadmiernego wzmocnienia i uzyskania hybrydyzowanych fragmentów adapter-adapter w bibliotekach końcowych. W związku z tym zalecany jest końcowy etap czyszczenia (bez wyboru rozmiaru) po dwóch PCR, ponieważ pomaga to w usunięciu tych fragmentów. Rozkład wielkości bibliotek DNA był nadal szerszy niż oczekiwano. Jednak zwiększenie głębokości sekwencjonowania zapewniło wystarczającą ilość danych, które zostały przefiltrowane podczas analizy bioinformatycznej, uzyskując zadowalające wyniki.

Ponieważ mutageneza za pośrednictwem transpozonów generuje tysiące losowych insercji w jednym eksperymencie, możliwe jest wygenerowanie nasyconej biblioteki mutantów, która zawiera wszystkie z wyjątkiem tych mutantów, w których geny niezbędne do wzrostu bakterii zostały zakłócone. Najprawdopodobniej nie pracowaliśmy z nasyconą biblioteką mutantów, biorąc pod uwagę szacunki dotyczące niezbędnych genów w innych badaniach nad Burkholderia sp.Rozdział 28,29. Nienasycona biblioteka pomaga jednak w odkrywaniu różnych genów kandydujących do dalszych badań z wykorzystaniem ukierunkowanej mutagenezy. Przed eksperymentami należy również pamiętać, że niektóre transpozony mają specyficzne miejsca docelowe insercji, które zwiększają liczebność mutantów w określonych loci w genomie30. Wiadomo, że transpozony Marinera celują w miejsca INSERCJI31, a transpozony Tn5 mają odchylenie GC32,33. Uwzględnienie kroków podczas analizy bioinformatycznej w celu rozpoznania gorących punktów dla insercji transpozonów pomoże w ocenie wszelkich odchyleń rozkładu.

Chociaż podatny na niepowodzenia, dobrze zaprojektowany eksperyment sekwencjonowania insercji transpozonów może być potężnym narzędziem do identyfikacji wielu warunkowo ważnych genów u bakterii w jednym eksperymencie. Na przykład tuzin genów u Burkholderia seminalis ważnych dla tłumienia nekrozy liści storczyków zidentyfikowano poprzez połączenie mutagenezy transpozonów i genomiki34. Poza Burkholderia, kilka genów adhezji i ruchliwości oraz transporterów zostało zidentyfikowanych jako ważne czynniki kolonizacji w symbiontach Snodgrassella alvi Apis mellifera (pszczoła miodna)22 oraz w symbiontach Vibrio fischerii Euprymna scolopes (kałamarnica hawajska)23 przy użyciu podejścia mutagenezy transpozonowo-insercyjnej.

Alternatywnym podejściem jest mutageneza transpozonów, po której można przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku poszczególnych mutantów przy użyciu pożywek selektywnych zamiast sekwencjonowania. Możliwe są fenotypowe badania przesiewowe lub testy biologiczne w celu zidentyfikowania niedoborów, takich jak ruchliwość, produkcja bioaktywnych metabolitów wtórnych lub specyficzne auksotrofie. Na przykład, badania przesiewowe biblioteki transpozonów Burkholderia insecticola (przypisanej do rodzaju Caballeronia35) były kluczowe w ustaleniu, że symbionty wykorzystują geny ruchliwości do kolonizacji Riptortus pedestris, ich owadziego żywiciela36. Ponadto, korzystając z mutagenezy transpozonów i fenotypowych badań przesiewowych, zidentyfikowano klaster genów biosyntetycznych dla bioaktywnego metabolitu wtórnego karioynyny w Burkholderia caryophylli37. Auksotroficzny mutant Burkholderia pseudomallei został zidentyfikowany po mutagenezie transpozonów i badaniach przesiewowych i jest możliwym atenuowanym kandydatem na szczepionkę przeciwko melioidozie, niebezpiecznej chorobie u ludzi i zwierząt38. W związku z tym mutageneza i sekwencjonowanie transpozonów jest cennym podejściem do badania cech molekularnych bakterii, które są ważne dla interakcji z odpowiednimi gospodarzami w asocjacjach patogennych lub mutualistycznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów w związku z badaniem.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Junbeom Lee za dostarczenie szczepu E. coli WM3064+pRL27 do koniugacji i wskazówek w procedurze, Kathrin Hüffmeier za pomoc w rozwiązywaniu problemów podczas tworzenia biblioteki mutantów oraz Prof. André Rodriguesowi za wsparcie w zbieraniu owadów i uzyskiwaniu pozwoleń. Dziękujemy również Rebecce Janke i Dagmar Klebsch za wsparcie w zbieraniu i hodowli owadów. Wyrażamy uznanie dla władz brazylijskich za udzielenie następujących zezwoleń na dostęp, zbieranie i eksport okazów owadów: autoryzacja SISBIO nr 45742-1, 45742-7 i 45742-10, proces CNPq nr 01300.004320/2014-21 i 01300.0013848/2017-33, IBAMA nr 14BR016151DF i 20BR035212/DF). Badania te zostały sfinansowane z grantów badawczych Niemieckiej Fundacji Naukowej (DFG) FL1051/1-1 i KA2846/6-1.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2,6- Kwas diaminopimelicznyAlfa AesarB22391Dla E.coli WM3064+ pRL27
Agar - AgarRoth5210
AgarozaBiozym840004
Koraliki AMPure XP (kulki makrantowe + glikol polietylenowy + sole)Beckman CoulterA63880Wybór rozmiaru w kroku 6.6
Wybielacz (NaOCl) 12%Roth9062
Bowtie2 v.2.4.2Bioinfromatyczne narzędzie do mapowania odczytu. Odnośnik 10 w głównym rękopisie.
Buffer-SPeqlabPEQL01-1020Do PCR
Skrobak do komórekSarstedt83.1830
Cutadapt v.2.10Narzędzie bioinformatyczne do usuwania określonych sekwencji adapterów z odczytów. Odnośnik 8 w głównym rękopisie.
Pakiet DESeq2RStudio do oceny zróżnicowanej liczebności mutantów. Zwykle używany do analizy RNAseq. Odnośnik 12 w głównym rękopisie.
Drabinka DNA 100 pzRothT834.1
dNTPsLife TechnologyR0182PCR do potwierdzenia sukcesu koniugacji
EDTA, sól di-sodowaRoth8043
Epicentre MasterPure Kompletny zestaw do oczyszczania DNA i RNALucigenMC85200
Bromek etydynyRoth2218.1
FastQC v.0.11.8Narzędzie bioinformatyczne do oceny jakości danych sekwencjonowania. Odnośnik 7 w głównym rękopisie.
FeatureCounts v.2.0.1Narzędzie bioinformatyczne do uzyskiwania liczby odczytów na cechę genomową. Odnośnik 11 w głównym rękopisie.
GlycerolRoth7530
K2HPO4RothP749
Siarczan kanamycynyServa26899
KClMerck4936
KH2PO4Roth3904
MgSO4.7H2ORothPO27
Na2HPO4RothP030
NaClMerck6404
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (zestaw starterów indeksu 1)New England BiolabsE7335S
NEBNext Ultra II zestaw do przygotowania biblioteki DNA dla IlluminaNew England BiolabsE7645S
Pepton (soja)Roth2365Dla Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium
peqGOLD 'Hot' Taq- DNA Polimeraza DNAVWRPEQL01-1020do potwierdzania powodzenia koniugacji
Płytki Petriego - 145 x 20 mmRothXH90.1Do selekcji transkoniugantów
Płytki Petriego - 90 x 16 mmRothN221.2
Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Niemcy)Kontrolajakości po przygotowaniu biblioteki DNA
Koraliki streptawidynyRothHP57.1
Polimeraza DNA TaqVWR01-1020
Trimmomatic v.0.36Bioinformatyczne narzędzie do przycinania odczytów o niskiej jakości, a także sekwencji adapterów. Odnośnik 9 w głównym rękopisie.
Tris -HClRoth9090.1
TryptonRoth2366Dla Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium
UltrasonografBandelinGM 70 HDDo ścinania
enzymu USER (glikozylaza DNA uracylu + glikozylaza DNA - liaza Endonukleaza VIII)New England BiolabsE7645SEtap ligacji 6.5.2
EkstraktdrożdżowyRoth2363
powiedział:

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cain, A. K., et al. A decade of advances in transposon-insertion sequencing. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 526-540 (2020).
  2. Chao, M. C., Abel, S., Davis, B. M., Waldor, M. K. The design and analysis of transposon insertion sequencing experiments. Nature Reviews Microbiology. 14 (2), 119-128 (2016).
  3. Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing. RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).
  4. Flórez, L. V., et al. Antibiotic-producing symbionts dynamically transition between plant pathogenicity and insect-defensive mutualism. Nature Communications. 8 (1), 15172(2017).
  5. Flórez, L. V., Kaltenpoth, M. Symbiont dynamics and strain diversity in the defensive mutualism between Lagria beetles and Burkholderia. Environmental Microbiology. 19 (9), 3674-3688 (2017).
  6. Flórez, L. V., et al. An antifungal polyketide associated with horizontally acquired genes supports symbiont-mediated defense in Lagria villosa beetles. Nature Communications. 9 (1), 2478(2018).
  7. Andrews, S. FastQC A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2012).
  8. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  9. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  10. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  11. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. FeatureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  12. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550(2014).
  13. Gaytán, M. O., Martínez-Santos, V. I., Soto, E., González-Pedrajo, B. Type three secretion system in attaching and effacing pathogens. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 129(2016).
  14. Hachani, A., Wood, T. E., Filloux, A. Type VI secretion and anti-host effectors. Current Opinion in Microbiology. 29, 81-93 (2016).
  15. Deep, A., Chaudhary, U., Gupta, V. Quorum sensing and bacterial pathogenicity: From molecules to disease. Journal of Laboratory Physicians. 3 (1), 4-11 (2011).
  16. Silva, A. J., Benitez, J. A. Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), 0004330(2016).
  17. Navarro-Garcia, F., Ruiz-Perez, F., Cataldi, Á, Larzábal, M. Type VI secretion system in pathogenic Escherichia coli: structure, role in virulence, and acquisition. Frontiers in Microbiology. 10, 1965(2019).
  18. Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
  19. Schwarz, S., et al. Burkholderia Type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), 1001068(2010).
  20. Jones, C., et al. Kill and cure: genomic phylogeny and bioactivity of Burkholderia gladioli bacteria capable of pathogenic and beneficial lifestyles. Microbial Genomics. 7 (1), 000515(2021).
  21. Takeshita, K., Kikuchi, Y. Riptortuspedestris and Burkholderia symbiont: an ideal model system for insect-microbe symbiotic associations. Research in Microbiology. 168 (3), 175-187 (2017).
  22. Powell, J. E., et al. Genome-wide screen identifies host colonization determinants in a bacterial gut symbiont. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13887-13892 (2016).
  23. Brooks, J. F., et al. Global discovery of colonization determinants in the squid symbiont Vibrio fischeri. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17284-17289 (2014).
  24. Somprasong, N., McMillan, I., Karkhoff-Schweizer, R. R., Mongkolsuk, S., Schweizer, H. P. Methods for genetic manipulation of Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans. BMC Research Notes. 3 (308), (2010).
  25. Garcia, E. C. Burkholderia thailandensis: Genetic manipulation. Current Protocols in Microbiology. 45, 1-15 (2017).
  26. Headd, B., Bradford, S. A. The conjugation window in an Escherichia coli K-12 strain with an IncFII plasmid. Applied and Environmental Microbiology. 86 (17), 00948(2020).
  27. Van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: A new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 435-442 (2013).
  28. Gallagher, L. A., Ramage, E., Patrapuvich, R., Weiss, E., Brittnacher, M., Manoil, C. Sequence-defined transposon mutant library of Burkholderia thailandensis. mBio. 4 (6), 00604-00613 (2013).
  29. Wong, Y. -C., et al. Candidate essential genes in Burkholderia cenocepacia J2315 identified by genome-wide TraDIS. Frontiers in Microbiology. 7, 1288(2016).
  30. Moule, M. G., et al. Genome-wide saturation mutagenesis of Burkholderia pseudomallei K96243 predicts essential genes and novel targets for antimicrobial development. mBio. 5 (1), 00926(2014).
  31. Ding, Q., Tan, K. S. Himar1 transposon for efficient random mutagenesis in Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Frontiers in Microbiology. 8, 1842(2017).
  32. Green, B., Bouchier, C., Fairhead, C., Craig, N. L., Cormack, B. P. Insertion site preference of Mu, Tn5, and Tn7 transposons. Mobile DNA. 3, 3(2012).
  33. Lodge, J. K., Weston-Hafer, K., Berg, D. E. Transposon Tn5 target specificity: Preference for insertion at G/C pairs. Genetics. 120 (3), 645-650 (1988).
  34. Ará Ujo, W. L., et al. Genome sequencing and transposon mutagenesis of Burkholderia seminalis TC3.4.2R3 identify genes contributing to suppression of orchid necrosis caused by B. gladioli. Molecular Plant-microbe Interactions: MPMI. 29 (6), 435-446 (2016).
  35. Dobritsa, A. P., Samadpour, M. Reclassification of Burkholderiainsecticola as Caballeroniainsecticola comb. nov. and reliability of conserved signature indels as molecular synapomorphies. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 69 (7), 2057-2063 (2019).
  36. Ohbayashi, T., et al. Insect's intestinal organ for symbiont sorting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 5179-5188 (2015).
  37. Ross, C., Scherlach, K., Kloss, F., Hertweck, C. The molecular basis of conjugated polyyne biosynthesis in phytopathogenic bacteria. Angewandte Chemie International Edition. 53 (30), 7794-7798 (2014).
  38. Atkins, T., et al. A mutant of Burkholderia pseudomallei, auxotrophic in the branched chain amino acid biosynthetic pathway, is attenuated and protective in a murine model of melioidosis. Infection and Immunity. 70 (9), 5290-5294 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tn Seqbakterie symbiotycznebiblioteka mutant wprzerwanie genukolonizacja gospodarzakaseta oporno ci na antybiotyki

Powiązane artykuły