Artykuł metodologiczny

Sekwencjonowanie insercji transpozonów jako narzędzie do wyjaśnienia czynników kolonizacji bakteryjnej u mieczyków Burkholderia gladioli z chrząszczami Lagria villosa

5.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62843

⸱

12 sierpnia 2021

 ,  , 
1Department of Evolutionary Ecology, Institute of Organismic and Molecular Evolution, Johannes Gutenberg University, 2Department of Insect Symbiosis, Max Planck Institute for Chemical Ecology, 3Department of Plant and Environmental Sciences, Section for Organismal Biology, University of Copenhagen

W tym artykule

Podsumowanie

To jest dostosowana metoda identyfikacji potencjalnych czynników kolonizacji owadów w korzystnym symbiontie Burkholderia. Gospodarz chrząszcza jest zainfekowany losową zmutowaną biblioteką wygenerowaną przez mutagenezę transpozonów, a złożoność biblioteki po kolonizacji jest porównywana z kontrolą wyhodowaną in vitro.

Streszczenie

Wnioskowanie o funkcji genów poprzez manipulowanie ich aktywnością jest niezbędnym narzędziem do zrozumienia genetycznych podstaw większości procesów biologicznych. Postępy w mikrobiologii molekularnej doprowadziły do pojawienia się różnych technik mutagenezy do manipulacji genami. Wśród nich sekwencjonowanie transpozonowo-insercyjne (Tn-seq) jest cennym narzędziem do jednoczesnej oceny funkcjonalności wielu genów kandydujących w sposób nieukierunkowany. Technika ta odegrała kluczową rolę w zidentyfikowaniu mechanizmów molekularnych kolonizacji gospodarzy eukariotycznych w kilku drobnoustrojach chorobotwórczych i kilku pożytecznych symbiontach.

Tutaj Tn-seq jest ustanawiany jako metoda identyfikacji czynników kolonizacyjnych u mutualistycznego symbionta Burkholderia gladioli chrząszcza Lagria villosa. Przez koniugację, insercja transpozonu Tn5 kasety opornej na antybiotyki jest przeprowadzana w losowych lokalizacjach genomu u B. gladioli. Aby zidentyfikować wpływ zakłóceń genów na zdolność bakterii do kolonizacji gospodarza chrząszcza, wygenerowaną bibliotekę transpozonów B. gladioli zaszczepia się jaja chrząszczy, podczas gdy kontrolę hoduje się in vitro w płynnej pożywce hodowlanej. Po zapewnieniu wystarczającej ilości czasu na kolonizację, DNA jest ekstrahowane z bibliotek hodowanych in vivo i in vitro. Zgodnie z protokołem przygotowania biblioteki DNA, próbki DNA są przygotowywane do sekwencjonowania transpozonowo-insercyjnego. Fragmenty DNA, które zawierają krawędź wstawki transpozonu i flankujące DNA bakteryjne, są wybierane, a miejsca mutacji są określane przez sekwencjonowanie z dala od krawędzi wstawki transpozonu. Wreszcie, analizując i porównując częstości występowania każdego mutanta w bibliotekach in vivo i in vitro, można przewidzieć znaczenie określonych genów symbiontów podczas kolonizacji chrząszczy.

Wprowadzenie

Mieczyki Burkholderia mogą angażować się w symbiozę z chrząszczami Lagria villosa, odgrywając ważną rolę w obronie przed mikrobiologicznymi antagonistami owada gospodarza4,5,6. Samice chrząszczy zawierają kilka szczepów B. gladioli w wyspecjalizowanych gruczołach pomocniczych do układu rozrodczego. Po złożeniu jaj samice rozmazują komórki B. gladioli na powierzchni jaja, gdzie związki przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez B. gladioli hamują infekcje grzybami entomopatogenicznymi4,6. W późnym rozwoju embrionalnym lub wcześnie po wykluciu się larw bakterie kolonizują wgłębienia kutykularne na grzbietowej powierzchni larw. Pomimo tej wyspecjalizowanej lokalizacji i pionowej drogi transmisji symbiontów, L. villosa może przypuszczalnie również pozyskiwać B. gladioli poziomo ze środowiska4. Ponadto znaleziono co najmniej trzy szczepy B. gladioli w związku z L. villosa4,6. Wśród nich B. gladioli Lv-StA jest jedynym, który nadaje się do uprawy in vitro.

B. gladioli Lv-StA ma rozmiar genomu 8,56 Mb6 i zawiera 7 468 genów. Które z tych genów są ważne dla bakterii B. gladioli do kolonizacji gospodarza chrząszcza? Aby odpowiedzieć na to pytanie, użyliśmy sekwencjonowania transpozonowo-inserekcyjnego (Tn-seq), metody eksploracyjnej do identyfikacji warunkowo niezbędnych genów drobnoustrojów1,2,3. Zmutowana biblioteka B. gladioli Lv-StA została stworzona przy użyciu transpozonu Tn5. Poprzez koniugację komórek dawcy Escherichia coli z B. gladioli Lv-StA, przeniesiono plazmid pRL27 przenoszący transpozon Tn5 i kasetę oporności na antybiotyki otoczoną odwróconymi powtórzeniami (Figura 1). W ten sposób wygenerowano zestaw mutantów, które indywidualnie przenoszą zakłócenia 3 736 genów symbiont (Rysunek 2).

Pula mutantów została zainfekowana na jajach chrząszczy w celu zidentyfikowania czynników kolonizacji i, jako kontrola, była również hodowana in vitro na pożywce King's B (KB). Po zapewnieniu wystarczającej ilości czasu na kolonizację, wyklute larwy zebrano i zebrano w celu ekstrakcji DNA. Fragmenty DNA zawierające wstawkę transpozonu i flankujący region genomowy B. gladioli Lv-StA wybrano przy użyciu zmodyfikowanego protokołu przygotowania biblioteki DNA do sekwencjonowania. Przetwarzanie jakości odczytu, a następnie analizę za pomocą DESeq2 przeprowadzono w celu zidentyfikowania określonych genów kluczowych dla B. gladioli Lv-StA do kolonizacji larw L. villosa po przeniesieniu przez powierzchnię jaja.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek i buforów

  1. Przygotować pożywki KB i LB oraz płytki agarowe zgodnie z Tabelą 1, a następnie wysterylizować w autoklawie przy 121 °C, 15 psi przez 20 min.
    1. Do wysterylizowanej pożywki LB przed hodowlą E.coli WM3064 + pRL27 dodać 50 µg/mL sterylizowanej przez filtr kanamycyny oraz 300 µM sterylizowanego przez filtr kwasu 2,6-diaminopimeliowego (DAP).
    2. Do wysterylizowanego agaru KB dodać 50 µg/mL sterylizowanej przez filtr kanamycyny, aby przygotować płytki niezbędne do selekcji udanych transkonjugantów B. gladioli Lv-StA.
  2. Przygotować 1x roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), mieszając następujące składniki: NaCl 8 g/L, KCl 0.201 g/L, Na2HPO4 1.42 g/L oraz KH2PO4 0.272 g/L. Rozpuścić sole w wodzie destylowanej i wysterylizować mieszaninę w autoklawie przy 121 °C, 15 psi przez 20 min przed użyciem. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotować 2x bufor do wiązania i przemywania (Bind-and-wash buffer), rozpuszczając następujące składniki w wodzie destylowanej: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM kwasu etylenodiaminooctowego (EDTA) oraz 2 M NaCl. Mieszaninę sterylizować przez filtr przed użyciem. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  4. Przygotować 1x Low-TE, rozpuszczając 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) i 0.1 mM EDTA w wodzie dwukrotnie destylowanej. Sterylizować w autoklawie przy 121 °C, 15 psi przez 20 min. Przechowywać w temperaturze pokojowej.

2. Koniugacja w celu wygenerowania biblioteki mutantów transpozonalnych

Schemat koniugacji bakteryjnej; łączenie biblioteki mutantów; proces selekcji transkonjugantów z użyciem E. coli.
Rysunek 1Kroki protokołu koniugacji. Biorca konjugacji Burkholderia gladioli Lv-StA (czerwony) i donator Escherichia coli zawierające plazmid pRL27 (różowy) są hodowane odpowiednio na agarze KB i w pożywce LB, z dodatkiem kanamycyny i DAP. Po transferze koniugacyjnym plazmidu przez 12–18 h w 30 °C, transkonjugant B. gladioli komórki są selekcjonowane na podłożu KB z dodatkiem kanamycyny, a następnie łączone. Skróty: DAP = kwas 2,6-diaminopimeliowy; Kan = kanamycyna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Pod sterylnym dygestorium zaszczep świeżą kulturę dawcy Escherichia coli WM3064 + pRL27 w 10 mL pożywki LB uzupełnionej o kanamycynę i DAP. Zaszczep komórki biorcy Burkholderia gladioli Lv-StA w 5 mL pożywki KB. Inkubuj kultury w temperaturze 30 °C przez noc na wytrząsarce przy 250 rpm.
  2. Po nocnym wzrostu odwiruj 4 mL każdej z kultur przy 9 600 × g przez 6 min, abyt utworzyć osad komórkowy. Odlej nadsącz.
  3. Pod sterylnym dygestorium przemyj osady komórkowe w pożywce KB zawierającej DAP, a następnie zawieś kultury oddzielnie w 4 mL pożywki KB + DAP.
  4. W nowej probówce 15 mL zmieszaj 250 µL przemytych komórek dawcy E. coli z 1 mL przemytych komórek biorcy B. gladioli Lv-StA.
  5. Nanieś 10 µL tej mieszaniny komórek koniugacyjnych na płytki z agarem KB zawierającym DAP. Pozostaw płytkę w spokoju w sterylnym dygestorium w temperaturze pokojowej przez 1 h. Następnie inkubuj płytki z punktami koniugacji w temperaturze 30 °C przez 12-18 h.
    UWAGA: Czas koniugacji można dostosować do gatunku docelowego. Jednak długi okres koniugacji zwiększa ryzyko podwójnych insercji lub integracji plazmidu z genomem. W przypadku bakterii wolno rosnących należy przewidzieć dłuższy czas koniugacji.
  6. Po inkubacji dodaj pod sterylnym dygestorium 2-4 mL 1x PBS na płytki i za pomocą skrobaka do komórek odseparuj wyrosłe punkty koniugacji bakteryjnej od agaru. Przenieś pipetą mieszaninę skoniugowanych komórek do probówek do mikrowirówki 2 mL.
  7. Osadź komórki przez wirowanie przy 9 600 × g przez 2 min. Odlej nadsącz i przemyj osad dwukrotnie w 1 mL 1x PBS, pipetując w górę i w dół. Zawieś końcowy osad w 1200 µL 1x PBS. Przed wysianiem na płytki wykonaj rozcieńczenia, jeśli liczba komórek w mieszaninie przekracza 1 × 104.
  8. Dobrze wymieszaj i rozprowadź 200 µL mieszaniny komórek na dużych płytkach z agarem KB (6 lub więcej, jeśli wymagane), uzupełnionych o kanamycynę, i inkubuj przez noc w 30 °C.
    UWAGA: Kolonie mutantów docelowych pojawiają się w ciągu 30 h na selektywnych płytkach z agarem. Dzięki markerowi oporności na antybiotyk na selektywnej płytce z agarem pojawiają się tylko kolonie zmutowane. W związku z tym oczekuje się, że wszystkie kolonie będą udanymi transkonjugantami.
  9. Policz całkowitą liczbę kolonii transkonjugantów na trzech płytkach i dokonaj ekstrapolacji, aby obliczyć przybliżoną liczbę mutantów uzyskanych na wszystkich płytkach. Aby zwiększyć szanse na uzyskanie reprezentatywnej biblioteki, upewnij się, że całkowita liczba kolonii jest kilkukrotnie wyższa niż całkowita liczba genów w genomie. Aby potwierdzić sukces koniugacji, przeprowadź PCR nakierowany na kasetę insercyjną, wykorzystując 10-20 wybranych kolonii, zgodnie z opisem w sekcji 3.
    UWAGA: Celem jest zapewnienie, aby liczba kolonii była co najmniej 10-krotnie większa od liczby genów w całym genomie, w tym przypadku >75 000 mutantów. Jednak zazwyczaj trudno jest dokładnie oszacować liczbę kolonii, która odpowiadałaby w pełni reprezentatywnej bibliotece. Liczba zmutowanych unikalnych genów nie jest na tym etapie znana, ponieważ nie uwzględnia się zaburzeń w genach niezbędnych, często występują wiele różnych miejsc mutacji dla tego samego genu, a mutacje generowane za pomocą transpozonów Tn5 nie są całkowicie losowe.
  10. Pod sterylnym dygestorium zeskrob kolonie z płytek, dodając 1-2 mL 1x PBS na agar. Połącz mieszaniny komórkowe zeskrobane z płytek w probówkach 50 mL. Wymieszaj bibliotekę w wirówce typu Vortex, a następnie podziel 4 mL połączonej biblioteki mutantów do kilku probówek kriogenicznych. Dodaj do probówek 1 mL 70% glicerolu i przechowuj w temperaturze -80 °C.

3. PCR i elektroforeza żelowa w celu potwierdzenia udanych insercji w B. gladioli Lv-StA

  1. Aby potwierdzić obecność insercji, należy pobrać poszczególne kolonie mutantów z płytek selekcyjnych z kroku 2.9 i przeprowadzić reakcję PCR nakierowaną na kasetę insercyjną, używając starterów wymienionych w Tabeli 2. Przygotować mieszaninę PCR (master mix) zgodnie z Tabelą 3 i ustawić parametry w termocyklerze zgodnie z opisem w Tabeli 4.
  2. Produkty PCR należy poddać elektroforezie w 1,6% żelu agarozowym (250 V, 40 min), aby sprawdzić, czy amplifikowane fragmenty DNA mają oczekiwaną długość 1580 bp.

4. Zakażanie jaj chrząszcza pulą mutantów

  1. Etapy płukania biblioteki
    1. Rozmrozić na lodzie aliquot przygotowanej biblioteki mutantów. Odwirować przy 2,683 × g przez 10 min i usunąć nadosad. W sterylnej komorze przepłukać komórki 4 mL 1x PBS, aby usunąć z komórek pozostałości pożywki. Resuspendować komórki w 4 mL 1x PBS.
    2. Policzyć liczbę komórek w aliquocie biblioteki, używając komory do liczenia komórek. Rozcieńczyć część biblioteki do stężenia 2 × 106 komórek/µL w 1x PBS.
    3. Dokładnie wymieszać aliquot biblioteki w wortexie, aby uzyskać jednorodną zawiesinę przed pobraniem wymaganej objętości.
  2. Sterylizacja sprzęgier jaj i zakażenie in vivo
    1. Wybrać sprzęgier jaj L. villosa. Policzyć liczbę jaj i kontynuować, jeśli sprzęgier zawiera więcej niż 100 jaj.
    2. Zsterylizować cały sprzęgier jaj.
      1. Dodać 200 µL 70% etanolu i delikatnie płukać jaja przez 5 min. Usunąć etanol i dwukrotnie przepłukać jaja wodą autoklawowaną.
      2. Dodać 200 µL 12% wybielacza (NaOCl) i delikatnie płukać jaja przez 30 s. Natychmiast usunąć wybielacz i ponownie trzykrotnie przepłukać jaja 200 µL wody autoklawowanej.
    3. Zakazić zsterylizowany sprzęgier jaj biblioteką mutantów po płukaniu w stężeniu 2 × 106 komórek/µL (2,5 µL na jajo).
    4. Dwa dni po wykluciu się zakażonych larw chrząszcza zebrać po 100 larw drugiego stadium rozwojowego (2nd instar) do probówek mikrocentryfużowych 1,5 mL i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Kontrola biblioteki mutantów in vitro
    1. W sterylnej komorze zaszczepić 250 µL biblioteki mutantów po płukaniu o stężeniu 2 × 106 komórek/µL do 10 mL pożywki KB z dodatkiem kanamycyny.
    2. Inkubować kulturę mutantów in vitro w temperaturze 30 °C przez 20 h.
      UWAGA: Obliczyć czas inkubacji tak, aby odpowiadał przybliżonej liczbie pokoleń WT B. gladioli Lv-StA in vivo podczas kolonizacji.
    3. Po 20-godzinnej inkubacji dodać do kultury mutantów in vitro taką samą objętość 70% glicerolu i przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Ekstrakcja DNA z zainfekowanych chrząszczy i biblioteki mutantów in vitro

UWAGA: Ekstrakcje DNA przeprowadzono przy użyciu zestawu do oczyszczania DNA i RNA zgodnie z protokołem producenta, który krótko opisano poniżej.

  1. Zhomogenizować połączone larwy (maksymalnie 4 mg na probówkę do wirówki) poprzez dodanie 1-2 mL ciekłego azotu i rozcieranie tłuczkiem.
  2. rozmrozić na lodzie hodowle mutantów hodowane in vitro z zapasów glicerolowych. Przed lizą komórek osadzić komórki poprzez wirowanie przy 9 600 × g przez 10 min.
  3. Do próbek in vitro i in vivo dodać 300 µL roztworu do lizy tkanek i komórek. Dodać 5 µL Proteinazy K o stężeniu 10 mg/mL, inkubować mieszaninę w temperaturze 60 °C przez 15 min, a następnie umieścić na lodzie na 3-5 min.
  4. Do lizatów dodać 150 µL odczynnika do wytrącania białek i dokładnie wymieszać w wortexie. Osad resztki białkowe poprzez wirowanie przy 9 600 × g przez 10 min.
  5. Przenieść nadfiltr do probówki do wirówki o pojemności 1,5 mL. Do nadfiltru dodać 500 µL izopropanolu i delikatnie odwrócić probówki co najmniej 40 razy przed inkubacją w temperaturze -20 °C przez 1 h lub przez noc.
  6. Osadzić wytrącone DNA poprzez wirowanie przy 9 600 × g przez 10 min. Odrzucić nadfiltr i dodać lodowaty 70% etanol do osadu DNA.
  7. Wirować przy ≥10 000 × g przez 5 min. Odrzucić nadfiltr i pozostawić próbki do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 1 h.
  8. Resuspendować DNA z próbek in vitro i in vivo w 100 µL buforu Low-TE.
  9. Próbki przechowywać w temperaturze -20 °C.

6. Przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania

UWAGA: Protokół i odczynniki do przygotowania biblioteki DNA zostały zaadaptowane i zmodyfikowane na podstawie instrukcji dostarczonych przez producenta zestawu do przygotowania biblioteki DNA.

Schemat procesu sekwencjonowania: od fragmentacji DNA do końcowego przygotowania biblioteki, z wykorzystaniem PCR i kulek streptawidynowych.
Rysunek 2: Schemat etapów przygotowania biblioteki DNA. Po fragmentacji i ligacji adapterów, zmodyfikowany protokół obejmuje etap selekcji za pomocą kulek streptawidynowych w celu wzbogacenia fragmentów DNA zawierających kasetę insercyjną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Rozcieńczyć próbki do stężenia 20 ng/µL i objętości 100 µL, a następnie przechowywać je w lodzie.
  2. Poddać DNA z próbek in vivo oraz in vitro fragmentacji za pomocą ultrasonikatora. Ustawić ultrasonikator na 70% mocy. Próbki krótko wymieszać na wortexie i poddać fragmentacji przez 1 min 30 s.
    UWAGA: Ustawienia ultrasonikatora będą się różnić w zależności od urządzenia. W tym przypadku wielkość fragmentów wynosiła 200-400 bp, co jest odpowiednie dla tej metody sekwencjonowania 150 bp, paired-end (patrz krok 9.1). Parametry fragmentacji można dostosować do wymagań eksperymentatora.
  3. Sprawdzić, czy DNA zostało sfragmentowane do pożądanego zakresu wielkości (w tym przypadku 200-400 bp). Nałożyć 5 µL nief ragmentowanego i sfragmentowanego DNA, po wymieszaniu z barwnikiem do elektroforezy w stosunku 1:1, na żel agarozowy 1,6% i prowadzić elektroforezę przy 250 V przez 40 min (Rysunek 3A,B).
  4. Przygotowanie końców fragmentów wymagane do ligacji adapterów
    1. Do 50 µL sfragmentowanego DNA dodać odczynniki do przygotowania końców dołączone do zestawu do przygotowania biblioteki: 3 µL mieszaniny enzymatycznej oraz 7 µL buforu reakcyjnego i dobrze wymieszać pipetując. Ustawić termocykler z podgrzewaną pokrywą na ≥ 75 °C i inkubować próbki przez 30 min w 20 °C oraz 30 min w 65 °C. Przechowywać w 4 °C.
  5. Ligacja adapterów
    1. W celu ligacji adapterów dodać do produktów etapu przygotowania końców następujące odczynniki: 30 µL Ligation Master Mix, 1 µL Ligation Enhancer oraz 2,5 µL rozcieńczonego adaptera. Dokładnie wymieszać pipetując i inkubować próbkę przez 15 min w 20 °C w termocyklerze z wyłączonym podgrzewaniem pokrywy.
    2. Po 15 min dodać 3 µL enzymu (uracylu DNA glikozylazy + DNA glikozylazy-lyazy Endonukleazy VIII) (patrz Tabela Materiałów). Dobrze wymieszać pipetując i inkubować próbkę przez 15 min w 37 °C w termocyklerze z pokrywą podgrzaną do ≥ 47 °C.
      UWAGA: Protokół można przerwać na tym etapie, a próbki można przechowywać w -20 °C.
  6. Selekcja wielkości sfragmentowanego DNA z ligowanymi adapterami w celu uzyskania fragmentów 250 bp
    1. Wymieszać na wortexie roztwór kulek magnetycznych (patrz Tabela Materiałów) i pozostawić w temperaturze pokojowej na 30 min przed użyciem.
    2. Dodać 0,3x kulek do 96,5 µL mieszaniny ligowanego DNA i dokładnie wymieszać pipetując. Inkubować mieszaninę z kulkami przez 5 min.
      UWAGA: Obecność soli i glikolu polietylenowego w mieszaninie kulek ułatwia precypitację fragmentów DNA na kulkach. Niski stosunek kulek do cząsteczek DNA prowadzi do wiązania na kulkach tylko większych fragmentów DNA. W tym przypadku na kulkach wiążą się fragmenty DNA o długości powyżej 250 bp.
    3. Umieścić probówki na statywie magnetycznym, aby przyciągnąć kulki i usunąć fragmenty DNA o niepożądanej wielkości. Pozostawić kulki na 5 min, a następnie przenieść klarowny nadfiltr do nowej probówki do mikrocentryfugi (zachować nadfiltr).
    4. Dodać 0,15x świeżych kulek do nadfiltru i dobrze wymieszać pipetując. Inkubować mieszaninę z kulkami przez 5 min, a następnie umieścić probówki na statywie magnetycznym, aby przyciągnąć kulki związane z docelowym DNA. Odczekać 5 min, a następnie odlać nadfiltr (zachować kulki).
      UWAGA: Taki stosunek kulek do DNA prowadzi do wiązania fragmentów o pożądanej wielkości 250 bp.
    5. Przy kulkach znajdujących się na statywie magnetycznym dodać 200 µL 80% etanolu (świeżo przygotowanego) i odczekać 30 s. Ostrożnie odpipetować i usunąć przemycie etanolowe, nie poruszając kulek na statywie magnetycznym. Powtórzyć ten krok.
    6. Po ostatnim przemyciu usunąć resztki etanolu z kulek, a następnie suszyć kulki na powietrzu przez 2 min, aż staną się błyszczące, ale nie całkowicie wyschnięte. Nie przesuszać kulek.
    7. Zdjąć probówki ze statywu magnetycznego i dodać 17 µL 10 mM Tris-HCl lub 0,1x TE (Low-TE). Wymieszać pipetując około 10 razy i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 2 min.
    8. Ponownie umieścić probówki na statywie magnetycznym i odczekać 5 min. Po opadnięciu kulek przenieść nadfiltr z DNA do nowej probówki.
  7. PCR I w celu dodania znacznika biotyny do fragmentów DNA zawierających kasetę insercyjną
    1. Dodać biotynilowany znacznik starterowy do fragmentów DNA zawierających kasetę insercyjną Tn5, używając specyficznego dla transpozonu biotynilowanego startera (Tabela 5) oraz startera indeksowego. Przygotować master mix PCR zgodnie z Tabela 6 i zastosować warunki PCR dla termocyklera wymienione w Tabela 7.
  8. Oczyszczanie PCR I bez selekcji wielkości
    1. Wymieszać na wortexie 0,9x kulek i pozostawić w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 min przed oczyszczaniem.
    2. Dodać 0,9x kulek do produktów PCR i dokładnie wymieszać.
    3. Umieścić kulki na statywie magnetycznym, aby je przyciągnąć.
    4. Usunąć klarowny nadfiltr i dwukrotnie przemyć związane z kulkami DNA 200 µL świeżo przygotowanego 80% etanolu.
    5. Usunąć etanol po etapach przemywania i suszyć kulki na powietrzu, aż staną się błyszczące, ale nie zbyt suche.
    6. Dodać 32 µL 10 mM Tris-HCl lub 0,1X TE (Low-TE) i inkubować kulki przez 5 min. Ponownie umieścić mieszaninę na statywie magnetycznym i przenieść nadfiltr do nowej probówki do mikrocentryfugi.
  9. Wiązanie biotynilowanych fragmentów DNA do kulek z streptawidyną
    1. Resuspendować 32 µL kulek z streptawidyną w buforze 1x Bind-and-wash. Przemyć kulki buforem trzykrotnie, trzymając je na statywie magnetycznym.
    2. Dodać 32 µL buforu 2x Bind-and-wash i resuspendować kulki. Do tego dodać 32 µL oczyszczonych produktów PCR 1. Dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    3. Umieścić mieszaninę kulek i DNA na statywie magnetycznym przez 2 min. Odpipetować nadfiltr, ponieważ DNA z znacznikiem biotyny zawierające krawędź insercji wiąże się ze streptawidyną na kulkach.
    4. Przemyć kulki 500 µL buforu 1x Bind-and-wash, a następnie 200 µL Low-TE. Resuspendować kulki z wiążącym się DNA w 17 µL Low-TE.
  10. PCR II w celu dodania adapterów do fragmentów zawierających krawędź kasety insercyjnej
    1. Przygotować master mix, jak pokazano w Tabela 8, używając starterów indeksowych i zmodyfikowanych uniwersalnych starterów PCR wymienionych w Tabela 5. Dodać 15 µL kulek ze streptawidyną z wiążącym się DNA z poprzedniego kroku do mieszaniny PCR. Warunki dla termocyklera znajdują się w Tabela 7.
  11. Oczyścić produkty PCR bez selekcji wielkości zgodnie z krokiem 6.8 niniejszego protokołu. Eluować końcowe produkty DNA w 30 µL wody klasy molekularnej.
  12. Przechowywać próbki w -20 °C i wykorzystać do sekwencjonowania.

7. Sekwencjonowanie i analiza

  1. Przeprowadź sekwencjonowanie biblioteki przy użyciu technologii sekwencjonowania wysokoprzepływowego. Dostosuj głębokość sekwencjonowania w zależności od wielkości biblioteki transpozonowej, zgodnie z poniższymi uwagami. Oceń jakość odczytów za pomocą FastQC7. Wybierz odczyty zawierające krawędź insercji Tn5 na końcu 5' odczytu i usuń sekwencję krawędzi insercji przy użyciu Cutadapt8 i/lub Trimmomatic9.
    UWAGA: W tym przypadku zastosowano podejście sekwencjonowania par końcowych (paired-end), aby uzyskać 150 bp na odczyt i łącznie 8 Mio odczytów. Aby uzyskać reprezentatywny zestaw danych, należy upewnić się, że całkowita liczba zsekwencjonowanych odczytów przekracza maksymalną możliwą liczbę mutantów w bibliotece, tj. całkowitą szacowaną liczbę kolonii z kroku 2.9. Jako punkt odniesienia, w tym protokole dążono do uzyskania 40-krotności maksymalnej możliwej wielkości biblioteki. Inne udane badania wykorzystujące Tn-seq w podobnym celu sekwencjonowały całkowitą liczbę odczytów bliską 25-krotności rzeczywistej liczby unikalnych insercji w odpowiedniej bibliotece mutantów22,23.
  2. Biorąc pod uwagę, że mutacje na końcach genów nie są funkcjonalnie zaburzające, przytnij 5% z obu końców adnotacji genów w pliku GFF genomu referencyjnego. Zmapuj przycięte odczyty do genomu referencyjnego za pomocą Bowtie210.
  3. Oblicz liczbę insercji na podstawie liczby unikalnych pozycji 5' w pliku dopasowania BAM.
  4. Za pomocą FeatureCounts11 określ liczbę genów trafionych dla każdej próbki powtórzonej.
  5. Używając pakietu DESeq212 w RStudio, oblicz różnicę w obfitości mutantów pomiędzy różnymi warunkami.

Wyniki

Bakterie związane z gospodarzem mogą wykorzystywać szereg czynników w celu ustanowienia asocjacji, w tym te pośredniczące w adhezji, motylości, chemotaksji, odpowiedziach stresowych lub specyficzne transportery. Choć w przypadku wielu bakterii13,14,15,16,17,18, w tym przedstawicieli rodzaju Burkholderia19,20, opisano czynniki istotne dla oddziaływań patogen-gospodarz, znacznie mniej badań poświęcono molekularnym mechanizmom wykorzystywanym przez korzystne symbionty do kolonizacji21,22,23. Wykorzystując sekwencjonowanie insercji transpozonowych, postawiono sobie za cel zidentyfikowanie czynników molekularnych, które umożliwiają B. gladioli kolonizację chrząszczy L. villosa.

Mutagenezę za pośrednictwem transpozonu przeprowadzono przy użyciu plazmidu pRL27, który niesie transpozon Tn5 oraz kasetę oporności na kanamycynę flankowaną miejscami powtórzeń odwróconych. Plazmid wprowadzono do docelowych komórek B. gladioli Lv-StA poprzez koniugację ze szczepem donora plazmidu E. coli WM3064 (jak pokazano na Rysunku 1). Po koniugacji mieszaninę koniugacyjną zawierającą komórki biorcy B. gladioli oraz donora E. coli wysiano na selektywne płytki agarowe z dodatkiem kanamycyny. Brak DAP na płytkach wyeliminował komórki donora E. coli , a obecność kanamycyny pozwoliła na wyselekcjonowanie udanych transkonjugantów B. gladioli Lv-StA. Połączona biblioteka mutantów B. gladioli Lv-StA, otrzymana z zebrania 100 000 kolonii transkonjugantów, została przygotowana do sekwencjonowania przy użyciu zmodyfikowanego zestawu do przygotowania biblioteki DNA i specjalnie zaprojektowanych starterów. Rysunek 2 przedstawia etapy przygotowania biblioteki DNA. Sekwencjonowanie dostarczyło 4 Mio odczytów sparowanych; zakłócono działanie 3 736 genów z 7 468 genów w B. gladioli Lv-StA.

Aby zidentyfikować mutanty z defektem kolonizacji gospodarza, B. gladioli Bibliotekę mutantów Lv-StA zainfekowano w jajach chrząszcza i poddano hodowli. in vitro w podłożu KB jako kontrolę. in vivo przed eksperymentem obliczono wielkość wąskiego gardła kolonizacji. Znana liczba B. gladioli Komórki Lv-StA zainfekowano w jajach chrząszcza, a liczbę kolonizujących komórek w nowo wyklutych larwach pierwszego stadium uzyskano poprzez wysiewanie zawiesiny z każdej larwy i liczenie jednostek tworzących kolonie na osobnika. Obliczenia te przeprowadzono w celu upewnienia się, że liczba kolonizujących komórek jest wystarczająca do oceny zdolności do kolonizacji gospodarza dla wszystkich lub wysokiego odsetka mutantów w bibliotece. Dodatkowo, czas wzrostu pomiędzy in vitro i in vivo warunki znormalizowano w oparciu o liczbę generacji bakterii, aby uczynić te próbki porównywalnymi.

Po wykluciu się jaj zebrano 1296 larw, które podzielono na 13 pul. Odpowiadające im in vitro hodowle mutantów namnożono i przechowywano jako zapasy w glicerolu. DNA z tych in vivo i in vitro wyhodowane biblioteki mutantów wyekstrahowano i pofragmentowano w sonikatorze ultradźwiękowym. Rycina 3 przedstawia rozkład wielkości fragmentów ścinanego DNA, w którym większość fragmentów mieści się w przedziale od 100 do 400 bp, zgodnie z oczekiwaniami. Następnie zastosowano zmodyfikowany protokół przygotowania biblioteki DNA do sekwencjonowania. Na każdym etapie protokołu sprawdzano stężenie pozostałego DNA, aby upewnić się, że poszczególne kroki zostały wykonane prawidłowo oraz aby monitorować straty DNA. Kontrola jakości (patrz: w Tabela materiałów) przed sekwencjonowaniem wykazało, że biblioteki DNA zawierały niespodziewanie duże (>fragmenty DNA (800 bp), co było bardziej wyraźne w in vivo biblioteki. Ze względu na trudności w optymalizacji klastrowania fragmentów w kanałach sekwencjonowania, konieczne było zwiększenie głębokości sekwencjonowania do 10 mln odczytów sparowanych w in vivo biblioteki w celu uzyskania pożądanej liczby odczytów. Analiza wyników sekwencjonowania wykazała, że średnio 4 mln odczytów w in vivo biblioteki oraz 3,1 mln odczytów w in vitro biblioteki zawierały krawędź transpozonu na końcu 5' Read-1 (Tabela 9), co było satysfakcjonujące w tym eksperymencie. Rozkład 24 224 unikalnych insercji w obrębie B. gladioli genom w oryginalnej bibliotece pokazano w Rycina 4Analiza przeprowadzona przy użyciu oprogramowania DESeq2 wykazała, że liczebność 271 mutantów różniła się istotnie pomiędzy in vivo i in vitro warunki

Wyniki elektroforezy żelowej; rozdział prążków DNA; drabinka, 100-1000 bp; analiza molekularna.
Rysunek 3Żele agarozowe mutanta i bibliotek DNA. (A) Żel agarozowy z niefragmentowanym DNA mutanta w ścieżce x oraz drabiną 1 kbp dla skali. (B) Żel z biblioteką fragmentowanego DNA. Wielkości prążków drabinki w pierwszej ścieżce są wskazane po lewej stronie. Pierwsze trzy ścieżki a, b i c zawierają fragmenty fragmentowanego DNA o in vivo biblioteki. Ścieżki d, e, f i g zawierają fragmenty pociętego DNA z in vitro biblioteki Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Wykres pokrycia sekwencjonowania genomowego; analiza sekwencji, dane porównawcze dla chromosomów.
Rysunek 4: Lokalizacja unikalnych miejsc insercji w oryginalnej bibliotece w obrębie czterech replikonów w genomie Burkholderia gladioli Lv-StA. Każdy słupek wzdłuż osi x znajduje się w miejscu insercji. Wysokość słupka wzdłuż osi y odpowiada liczbie odczytów przypisanych do tego miejsca. Należy zauważyć, że dwa chromosomy i dwa plazmidy są przedstawione w pełnej długości, a zatem mają różne skale na osi x. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

podłoże/agar King’s B
Pepton (sojowy)20 g/L
K2HPO41,5 g/L
MgSO₄4.7H2O1,5 g/L
Agar15 g/L
Rozpuszczone w wodzie destylowanej
podłoże/agar LB
Tryptona10 g/L
Ekstrakt drożdżowy5 g/L
NaCl10 g/L
Rozpuszczone w wodzie destylowanej

Tabela 1: Składniki pożywek.

Nie.StarterySekwencjaTemperatura przyłączania starterów w PCR (°C)
1tpnRL17–1RC5’-CGTTACATCCCTGGCTTGTT-3’58.2
2tpnRL13–2RC5’-TCGTGAAGAAGGTGTTGCTG-3’

Tabela 2: Primery do potwierdzenia sukcesu konjugacji.

KomponentObjętość (μL)
woda oczyszczona do HPLC4.92
Bufor S 10x (wysoka specyficzność)1
MgCl2 (25 mM)0.2
dNTP (2 mM)1.2
Starter 1 (10 pmol/µL)0.8
Starter 2 (10 pmol/µL)0.8
Taq (5 J/µL)0.08
Całkowita objętość mastermixu9
Szablon1

Tabela 3: Mieszanina PCR (master mix) do potwierdzenia sukcesu koniugacji. Skróty: HPLC = wysokosprawna chromatografia cieczowa; dNTPs = odwrotny nukleozydotrifosforan.

KrokiTemperatura °CCzasCykle
Denaturacja początkowa953 min1
Denaturacja9540 s
Wyżarzanie58.240 s30 do 35
Rozszerzenie721-2 min
Ostateczne przedłużenie724 min1
Przytrzymać4∞

Tabela 4: Warunki PCR w celu potwierdzenia sukcesu konjugacji.

StarterySekwencjaTm °CZastosowanieProszę o podanie tekstu źródłowego do tłumaczenia.
Biotynilowany starter specyficzny dla transpozonu5’-Biotyna-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG
-3’		63.56.7.1. PCR INiestandardowy
Zmodyfikowana uniwersalna starter PCR5’- AATGATACGGCGACCACCGAGATC
TACACTCTTTCCCTACACGACGCTC
TTCCGATCTGAATTCATCGATGAT
GGTTGAGATGTGT – 3’		626.10.1. PCR IINiestandardowy
Starter indeksowyNależy zapoznać się z instrukcją producenta6.7.1. PCR I & 6.10.1. PCR IINEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Zestaw starterów indeksujących 1)
AdapterNależy zapoznać się z instrukcją producenta6.5. Ligacja adapterówZestaw do przygotowania bibliotek DNA NEBNext Ultra II dla systemu Illumina

Tabela 5: Primery i adapter dla PCR I i II podczas przygotowania biblioteki DNA.

mieszanina PCR(µL)
Fragmenty DNA z przyligowanymi adapterami15
mieszanka master mix NEBNext Ultra II Q525
Starter indeksujący (10 pmol/ µL)5
Specyficzna biotynilowana starter do transpozonu (10 pmol/ µL)5
Objętość całkowita50

Tabela 6: Przygotowanie biblioteki DNA-mieszanina PCR I master mix.

EtapyTemperaturaCzasCykle
Denaturacja wstępna98 °C30 s1
Denaturacja98 °C10 s6 do 12
Przyłączanie (annealing)65 °C30 s
Elongacja72 °C30 s
Elongacja końcowa72 °C2 min1
Przechowywanie16 °C∞

Tabela 7: Przygotowanie biblioteki DNA-warunki PCR I i II.

mieszanina PCR(µL)
DNA wyselekcjonowane za pomocą kulek15
NEBNext Ultra II Q5 master mix25
Starter indeksujący5
Modyfikowany uniwersalny starter PCR5
Objętość całkowita50

Tabela 8: Przygotowanie biblioteki DNA-mieszanina PCR II master mix.

BibliotekiIn vivo-1In vivo-2Invivo-3In vitro-1In vitro-2In vitro-3Biblioteka oryginalna
Liczba odczytów (PE)56,57,71039,19,05130,65,84935,73,49428,83,44036,61,95646,09,410
Liczba odczytów zawierających krawędź Tn na końcu 5’ Read-154,15,88037,31,16929,36,24733,00,49927,35,70533,50,40241,53,270
Ogólny wskaźnik dopasowania Bowtie2 (%) (tylko Read-1)95.53%83.71%89.87%80.79%78.00%73.06%74.92%
Liczba unikalnych insercji8,5394,1347,18318,93018,42120,43824,224
Liczba trafionych genów157599314502793259730373736

Tabela 9: Podsumowanie wyników sekwencjonowania i częstotliwości insercji transpozonów dla każdej biblioteki. Skrót: PE = paired-end.

Dyskusja

Stworzono bibliotekę mutantów transpozonów B. gladioli w celu zidentyfikowania ważnych czynników kolonizacji gospodarza w symbiotycznej interakcji między chrząszczami L. villosa a bakteriami B. gladioli . Głównymi etapami protokołu były koniugacja, infekcja gospodarza, przygotowanie biblioteki DNA i sekwencjonowanie.

Ponieważ wiele szczepów Burkholderia jest podatnych na modyfikację genetyczną przez koniugację24,25, plazmid przenoszący transpozon i kasetę inseryjną antybiotyku został pomyślnie sprzężony z docelowym szczepem B. gladioli Lv-StA z E. coli. Poprzednie próby transformacji za pomocą elektroporacji przyniosły bardzo niskie lub prawie żadne transformatory B. gladioli. Wskazane jest zoptymalizowanie techniki transformacji dla organizmu docelowego, aby skutecznie uzyskać dużą liczbę transformantów.

Jedna runda koniugacji i 40 plam koniugacji zakłóciła 3736 genów u B. gladioli Lv-StA. Patrząc z perspektywy czasu, konieczne byłoby przeprowadzenie wielu rund koniugacji, aby zakłócić działanie większości z 7468 genów i uzyskać nasyconą bibliotekę. Warto zauważyć, że czas inkubacji podczas koniugacji nie mógł przekroczyć 12-18 godzin, co jest końcem fazy wykładniczego wzrostu B. gladioli. Dopuszczenie koniugacji poza fazę wykładniczego wzrostu komórek bakteryjnych zmniejsza szanse na powodzenie otrzymania transkoniugantów26. Dlatego okres koniugacji należy dostosować do wzrostu gatunków bakterii.

Aby skutecznie przeprowadzić eksperyment polegający na zakażeniu zmutowanych bibliotek w gospodarzu, ważne jest oszacowanie wielkości wąskiego gardła populacji bakterii podczas kolonizacji oraz różnorodności mutantów w bibliotece przed infekcją 1,2,27. Przygotowując się do eksperymentu, oszacowaliśmy minimalną liczbę chrząszczy, które muszą zostać zainfekowane, aby mieć dużą szansę na pobranie próbki od każdego mutanta w bibliotece i pozwolenie na kolonizację. Obliczono również przybliżony czas generacji bakterii in vivo oraz liczbę pokoleń w czasie trwania eksperymentu. Kultura in vitro została następnie wyhodowana do porównywalnej liczby pokoleń poprzez dostosowanie czasu inkubacji. W przypadku podobnego eksperymentu z infekcją u innych gospodarzy niebędących modelami pożądana jest zdolność do utrzymania kultury laboratoryjnej i stałego źródła organizmów gospodarza.

Po rozroscie biblioteki mutantów in vivo i in vitro oraz pobraniu próbek, przeprowadzono zmodyfikowany protokół przygotowania biblioteki DNA do sekwencjonowania insercji transpozonów. Modyfikacja protokołu polegała na zaprojektowaniu niestandardowych starterów PCR i dodaniu etapów PCR w celu wybrania fragmentów DNA zawierających kasetę insercji. Ponieważ protokół został dostosowany, dodatkowe cykle PCR w protokole zwiększały ryzyko nadmiernego wzmocnienia i uzyskania hybrydyzowanych fragmentów adapter-adapter w bibliotekach końcowych. W związku z tym zalecany jest końcowy etap czyszczenia (bez wyboru rozmiaru) po dwóch PCR, ponieważ pomaga to w usunięciu tych fragmentów. Rozkład wielkości bibliotek DNA był nadal szerszy niż oczekiwano. Jednak zwiększenie głębokości sekwencjonowania zapewniło wystarczającą ilość danych, które zostały przefiltrowane podczas analizy bioinformatycznej, uzyskując zadowalające wyniki.

Ponieważ mutageneza za pośrednictwem transpozonów generuje tysiące losowych insercji w jednym eksperymencie, możliwe jest wygenerowanie nasyconej biblioteki mutantów, która zawiera wszystkie z wyjątkiem tych mutantów, w których geny niezbędne do wzrostu bakterii zostały zakłócone. Najprawdopodobniej nie pracowaliśmy z nasyconą biblioteką mutantów, biorąc pod uwagę szacunki dotyczące niezbędnych genów w innych badaniach nad Burkholderia sp.Rozdział 28,29. Nienasycona biblioteka pomaga jednak w odkrywaniu różnych genów kandydujących do dalszych badań z wykorzystaniem ukierunkowanej mutagenezy. Przed eksperymentami należy również pamiętać, że niektóre transpozony mają specyficzne miejsca docelowe insercji, które zwiększają liczebność mutantów w określonych loci w genomie30. Wiadomo, że transpozony Marinera celują w miejsca INSERCJI31, a transpozony Tn5 mają odchylenie GC32,33. Uwzględnienie kroków podczas analizy bioinformatycznej w celu rozpoznania gorących punktów dla insercji transpozonów pomoże w ocenie wszelkich odchyleń rozkładu.

Chociaż podatny na niepowodzenia, dobrze zaprojektowany eksperyment sekwencjonowania insercji transpozonów może być potężnym narzędziem do identyfikacji wielu warunkowo ważnych genów u bakterii w jednym eksperymencie. Na przykład tuzin genów u Burkholderia seminalis ważnych dla tłumienia nekrozy liści storczyków zidentyfikowano poprzez połączenie mutagenezy transpozonów i genomiki34. Poza Burkholderia, kilka genów adhezji i ruchliwości oraz transporterów zostało zidentyfikowanych jako ważne czynniki kolonizacji w symbiontach Snodgrassella alvi Apis mellifera (pszczoła miodna)22 oraz w symbiontach Vibrio fischerii Euprymna scolopes (kałamarnica hawajska)23 przy użyciu podejścia mutagenezy transpozonowo-insercyjnej.

Alternatywnym podejściem jest mutageneza transpozonów, po której można przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku poszczególnych mutantów przy użyciu pożywek selektywnych zamiast sekwencjonowania. Możliwe są fenotypowe badania przesiewowe lub testy biologiczne w celu zidentyfikowania niedoborów, takich jak ruchliwość, produkcja bioaktywnych metabolitów wtórnych lub specyficzne auksotrofie. Na przykład, badania przesiewowe biblioteki transpozonów Burkholderia insecticola (przypisanej do rodzaju Caballeronia35) były kluczowe w ustaleniu, że symbionty wykorzystują geny ruchliwości do kolonizacji Riptortus pedestris, ich owadziego żywiciela36. Ponadto, korzystając z mutagenezy transpozonów i fenotypowych badań przesiewowych, zidentyfikowano klaster genów biosyntetycznych dla bioaktywnego metabolitu wtórnego karioynyny w Burkholderia caryophylli37. Auksotroficzny mutant Burkholderia pseudomallei został zidentyfikowany po mutagenezie transpozonów i badaniach przesiewowych i jest możliwym atenuowanym kandydatem na szczepionkę przeciwko melioidozie, niebezpiecznej chorobie u ludzi i zwierząt38. W związku z tym mutageneza i sekwencjonowanie transpozonów jest cennym podejściem do badania cech molekularnych bakterii, które są ważne dla interakcji z odpowiednimi gospodarzami w asocjacjach patogennych lub mutualistycznych.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów w związku z badaniem.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Junbeom Lee za dostarczenie szczepu E. coli WM3064+pRL27 do koniugacji i wskazówek w procedurze, Kathrin Hüffmeier za pomoc w rozwiązywaniu problemów podczas tworzenia biblioteki mutantów oraz Prof. André Rodriguesowi za wsparcie w zbieraniu owadów i uzyskiwaniu pozwoleń. Dziękujemy również Rebecce Janke i Dagmar Klebsch za wsparcie w zbieraniu i hodowli owadów. Wyrażamy uznanie dla władz brazylijskich za udzielenie następujących zezwoleń na dostęp, zbieranie i eksport okazów owadów: autoryzacja SISBIO nr 45742-1, 45742-7 i 45742-10, proces CNPq nr 01300.004320/2014-21 i 01300.0013848/2017-33, IBAMA nr 14BR016151DF i 20BR035212/DF). Badania te zostały sfinansowane z grantów badawczych Niemieckiej Fundacji Naukowej (DFG) FL1051/1-1 i KA2846/6-1.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2,6- Kwas diaminopimelicznyAlfa AesarB22391Dla E.coli WM3064+ pRL27
Agar - AgarRoth5210
AgarozaBiozym840004
Koraliki AMPure XP (kulki makrantowe + glikol polietylenowy + sole)Beckman CoulterA63880Wybór rozmiaru w kroku 6.6
Wybielacz (NaOCl) 12%Roth9062
Bowtie2 v.2.4.2Bioinfromatyczne narzędzie do mapowania odczytu. Odnośnik 10 w głównym rękopisie.
Buffer-SPeqlabPEQL01-1020Do PCR
Skrobak do komórekSarstedt83.1830
Cutadapt v.2.10Narzędzie bioinformatyczne do usuwania określonych sekwencji adapterów z odczytów. Odnośnik 8 w głównym rękopisie.
Pakiet DESeq2RStudio do oceny zróżnicowanej liczebności mutantów. Zwykle używany do analizy RNAseq. Odnośnik 12 w głównym rękopisie.
Drabinka DNA 100 pzRothT834.1
dNTPsLife TechnologyR0182PCR do potwierdzenia sukcesu koniugacji
EDTA, sól di-sodowaRoth8043
Epicentre MasterPure Kompletny zestaw do oczyszczania DNA i RNALucigenMC85200
Bromek etydynyRoth2218.1
FastQC v.0.11.8Narzędzie bioinformatyczne do oceny jakości danych sekwencjonowania. Odnośnik 7 w głównym rękopisie.
FeatureCounts v.2.0.1Narzędzie bioinformatyczne do uzyskiwania liczby odczytów na cechę genomową. Odnośnik 11 w głównym rękopisie.
GlycerolRoth7530
K2HPO4RothP749
Siarczan kanamycynyServa26899
KClMerck4936
KH2PO4Roth3904
MgSO4.7H2ORothPO27
Na2HPO4RothP030
NaClMerck6404
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (zestaw starterów indeksu 1)New England BiolabsE7335S
NEBNext Ultra II zestaw do przygotowania biblioteki DNA dla IlluminaNew England BiolabsE7645S
Pepton (soja)Roth2365Dla Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium
peqGOLD 'Hot' Taq- DNA Polimeraza DNAVWRPEQL01-1020do potwierdzania powodzenia koniugacji
Płytki Petriego - 145 x 20 mmRothXH90.1Do selekcji transkoniugantów
Płytki Petriego - 90 x 16 mmRothN221.2
Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Niemcy)Kontrolajakości po przygotowaniu biblioteki DNA
Koraliki streptawidynyRothHP57.1
Polimeraza DNA TaqVWR01-1020
Trimmomatic v.0.36Bioinformatyczne narzędzie do przycinania odczytów o niskiej jakości, a także sekwencji adapterów. Odnośnik 9 w głównym rękopisie.
Tris -HClRoth9090.1
TryptonRoth2366Dla Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium
UltrasonografBandelinGM 70 HDDo ścinania
enzymu USER (glikozylaza DNA uracylu + glikozylaza DNA - liaza Endonukleaza VIII)New England BiolabsE7645SEtap ligacji 6.5.2
EkstraktdrożdżowyRoth2363
powiedział:

Bibliografia

  1. Cain, A. K., et al. A decade of advances in transposon-insertion sequencing. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 526-540 (2020).
  2. Chao, M. C., Abel, S., Davis, B. M., Waldor, M. K. The design and analysis of transposon insertion sequencing experiments. Nature Reviews Microbiology. 14 (2), 119-128 (2016).
  3. Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing. RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).
  4. Flórez, L. V., et al. Antibiotic-producing symbionts dynamically transition between plant pathogenicity and insect-defensive mutualism. Nature Communications. 8 (1), 15172(2017).
  5. Flórez, L. V., Kaltenpoth, M. Symbiont dynamics and strain diversity in the defensive mutualism between Lagria beetles and Burkholderia. Environmental Microbiology. 19 (9), 3674-3688 (2017).
  6. Flórez, L. V., et al. An antifungal polyketide associated with horizontally acquired genes supports symbiont-mediated defense in Lagria villosa beetles. Nature Communications. 9 (1), 2478(2018).
  7. Andrews, S. FastQC A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2012).
  8. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  9. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  10. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  11. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. FeatureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  12. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550(2014).
  13. Gaytán, M. O., Martínez-Santos, V. I., Soto, E., González-Pedrajo, B. Type three secretion system in attaching and effacing pathogens. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 129(2016).
  14. Hachani, A., Wood, T. E., Filloux, A. Type VI secretion and anti-host effectors. Current Opinion in Microbiology. 29, 81-93 (2016).
  15. Deep, A., Chaudhary, U., Gupta, V. Quorum sensing and bacterial pathogenicity: From molecules to disease. Journal of Laboratory Physicians. 3 (1), 4-11 (2011).
  16. Silva, A. J., Benitez, J. A. Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), 0004330(2016).
  17. Navarro-Garcia, F., Ruiz-Perez, F., Cataldi, Á, Larzábal, M. Type VI secretion system in pathogenic Escherichia coli: structure, role in virulence, and acquisition. Frontiers in Microbiology. 10, 1965(2019).
  18. Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
  19. Schwarz, S., et al. Burkholderia Type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), 1001068(2010).
  20. Jones, C., et al. Kill and cure: genomic phylogeny and bioactivity of Burkholderia gladioli bacteria capable of pathogenic and beneficial lifestyles. Microbial Genomics. 7 (1), 000515(2021).
  21. Takeshita, K., Kikuchi, Y. Riptortuspedestris and Burkholderia symbiont: an ideal model system for insect-microbe symbiotic associations. Research in Microbiology. 168 (3), 175-187 (2017).
  22. Powell, J. E., et al. Genome-wide screen identifies host colonization determinants in a bacterial gut symbiont. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13887-13892 (2016).
  23. Brooks, J. F., et al. Global discovery of colonization determinants in the squid symbiont Vibrio fischeri. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17284-17289 (2014).
  24. Somprasong, N., McMillan, I., Karkhoff-Schweizer, R. R., Mongkolsuk, S., Schweizer, H. P. Methods for genetic manipulation of Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans. BMC Research Notes. 3 (308), (2010).
  25. Garcia, E. C. Burkholderia thailandensis: Genetic manipulation. Current Protocols in Microbiology. 45, 1-15 (2017).
  26. Headd, B., Bradford, S. A. The conjugation window in an Escherichia coli K-12 strain with an IncFII plasmid. Applied and Environmental Microbiology. 86 (17), 00948(2020).
  27. Van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: A new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 435-442 (2013).
  28. Gallagher, L. A., Ramage, E., Patrapuvich, R., Weiss, E., Brittnacher, M., Manoil, C. Sequence-defined transposon mutant library of Burkholderia thailandensis. mBio. 4 (6), 00604-00613 (2013).
  29. Wong, Y. -C., et al. Candidate essential genes in Burkholderia cenocepacia J2315 identified by genome-wide TraDIS. Frontiers in Microbiology. 7, 1288(2016).
  30. Moule, M. G., et al. Genome-wide saturation mutagenesis of Burkholderia pseudomallei K96243 predicts essential genes and novel targets for antimicrobial development. mBio. 5 (1), 00926(2014).
  31. Ding, Q., Tan, K. S. Himar1 transposon for efficient random mutagenesis in Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Frontiers in Microbiology. 8, 1842(2017).
  32. Green, B., Bouchier, C., Fairhead, C., Craig, N. L., Cormack, B. P. Insertion site preference of Mu, Tn5, and Tn7 transposons. Mobile DNA. 3, 3(2012).
  33. Lodge, J. K., Weston-Hafer, K., Berg, D. E. Transposon Tn5 target specificity: Preference for insertion at G/C pairs. Genetics. 120 (3), 645-650 (1988).
  34. Ará Ujo, W. L., et al. Genome sequencing and transposon mutagenesis of Burkholderia seminalis TC3.4.2R3 identify genes contributing to suppression of orchid necrosis caused by B. gladioli. Molecular Plant-microbe Interactions: MPMI. 29 (6), 435-446 (2016).
  35. Dobritsa, A. P., Samadpour, M. Reclassification of Burkholderiainsecticola as Caballeroniainsecticola comb. nov. and reliability of conserved signature indels as molecular synapomorphies. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 69 (7), 2057-2063 (2019).
  36. Ohbayashi, T., et al. Insect's intestinal organ for symbiont sorting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 5179-5188 (2015).
  37. Ross, C., Scherlach, K., Kloss, F., Hertweck, C. The molecular basis of conjugated polyyne biosynthesis in phytopathogenic bacteria. Angewandte Chemie International Edition. 53 (30), 7794-7798 (2014).
  38. Atkins, T., et al. A mutant of Burkholderia pseudomallei, auxotrophic in the branched chain amino acid biosynthetic pathway, is attenuated and protective in a murine model of melioidosis. Infection and Immunity. 70 (9), 5290-5294 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tn Seqbakterie symbiotycznebiblioteka mutant wprzerwanie genukolonizacja gospodarzakaseta oporno ci na antybiotyki
Sekwencjonowanie insercji transpozonów jako narzędzie do wyjaśnienia czynników kolonizacji bakteryjnej u mieczyków Burkholderia gladioli z chrząszczami Lagria villosa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.