Artykuł metodologiczny

Bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w trzech wymiarach

DOI:

10.3791/62845

⸱

26 sierpnia 2021

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (dSTORM) służy do ominięcia typowego limitu dyfrakcji mikroskopii świetlnej i do oglądania egzosomów w skali nanometrów. Może być stosowany zarówno w dwóch, jak i trzech wymiarach do charakteryzowania egzosomów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) są uwalniane przez wszystkie typy komórek i odgrywają ważną rolę w sygnalizacji komórkowej i homeostazie. Wizualizacja EV często wymaga metod pośrednich ze względu na ich małą średnicę (40-250 nm), która jest poniżej limitu dyfrakcji typowej mikroskopii świetlnej. Opracowaliśmy wizualizację EV opartą na mikroskopii superrozdzielczości, aby ominąć limit dyfrakcji zarówno w dwóch, jak i trzech wymiarach. Korzystając z tego podejścia, możemy określić trójwymiarowy kształt EV z rozdzielczością +/- 20 nm na osi XY i rozdzielczością +/- 50 nm wzdłuż osi Z. Podsumowując, proponujemy, aby mikroskopia superrozdzielcza była rozważana jako metoda charakterystyki EV, w tym egzosomów, a także wirusów otoczkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to pęcherzyki związane z błoną, uwalniane przez wszystkie typy komórek. Zawierają lipidy, białka, metabolity i kwasy nukleinowe i przenoszą te materiały lokalnie między komórkami i dystalnie między tkankami i narządami. Istnieją trzy podstawowe podtypy EV: ciała apoptotyczne, mikropęcherzyki i egzosomy1,2. Tutaj skupiamy się na naszej dyskusji na egzosomach i związanych z nimi białkach.

Egzosomy to wydzielane pęcherzyki pochodzące z wewnętrznego pączkowania wczesnych endosomów do ciała wielopęcherzykowego (MVB). MVB następnie łączy się z błoną plazmatyczną, uwalniając egzosomy do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, aby przemieszczać się do innych komórek3,4. Egzosomy występują w spektrum rozmiarów od 40 do 150 nm i są wzbogacone w endosomalne białka transbłonowe znane jako tetrasantyny (CD9, CD63, CD81), endosomalny kompleks sortujący związany z błoną wymagany do transportu (ESCRT) oraz białka związane z tratwą lipidową1,2, 5,6,7.

Charakteryzowanie składu biochemicznego egzosomów stało się popularną dziedziną dla badaczy, aby lepiej zrozumieć ich funkcjonalną naturę. Istnieje wiele metod wizualizacji i charakterystyki egzosomów, w tym cytometria przepływowa w nanoskali, analiza śledzenia nanocząstek (NTA), skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), powierzchniowy rezonans plazmonów, rezystancyjne wykrywanie impulsów i tradycyjna mikroskopia świetlna, z których każda zawiera wewnętrzne zalety i wady8,9. TEM i cryo-EM mogą osiągać rozdzielczość nanometryczną, ale często wymagają etapów odwadniania i zamrażania i pękania, co powoduje kurczenie się lub lizę EVs10,11. NTA opiera się na rozpraszaniu światła, co pozwala na scharakteryzowanie setek EV jednocześnie, ale jest pośrednim pomiarem wielkości cząstek i nie może łatwo odróżnić EV, wirusów i agregatów białkowych12,13,14,15,16. Cytometria przepływowa w nanoskali wykorzystuje rozpraszanie światła ze ścieżki wzbudzenia, które można następnie przełożyć na pomiary wielkości, ale jest to nowa technologia i nie ma zgody co do tego, jakie rozmiary cząstek mieszczą się w liniowym zakresie wykrywania dla różnych instrumentów12,17,18.

Tradycyjna mikroskopia świetlna z użyciem białek fluorescencyjnych lub barwników była jedną z najczęściej stosowanych technik wizualizacji subkomórkowych kompartmentów, kompleksów białkowych i maszynerii sygnalizacyjnej w komórce. Chociaż technika ta okazuje się przydatna w wizualizacji lokalizacji kompleksów, granica dyfrakcyjna tradycyjnej mikroskopii świetlnej (około 250-400 nm) uniemożliwia wyraźną rozdzielczość białek lub struktur w typowym zakresie wielkości egzosomu (40-150 nm)12,19,20.

Mikroskopia superrozdzielcza, a konkretnie bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (dSTORM), odróżnia się od konwencjonalnej mikroskopii świetlnej tym, że wykorzystuje właściwości fotoprzełączalne określonych fluoroforów i wykrywa te mrugające zdarzenia do rekonstrukcji obrazów z dokładnością do nanometrów21. Zdarzenia fotoprzełączania są zbierane za pomocą kamery wykrywającej o dużej liczbie klatek na sekundę w ciągu dziesiątek tysięcy indywidualnych ekspozycji, a funkcja rozproszenia punktowego służy do mapowania z dużą pewnością dokładnej lokalizacji fotoprzełączania fluoroforu19,20,22. Dzięki temu dSTORM może ominąć limit dyfrakcji mikroskopii świetlnej. Kilka grup zgłosiło użycie technik super-rozdzielczości do wizualizacji i śledzenia egzosomów i związanych z nimi białek22,23,24,25. Ostateczna rozdzielczość zależy od właściwości biofizycznych fluoroforu, ale często waha się od +/- 10-100 nm wzdłuż osi XY, co pozwala na rozdzielczość pojedynczej cząsteczki.

Zdolność do rozpoznawania pojedynczych fluoroforów w tej skali na osi XY zrewolucjonizowała mikroskopię. Jednak niewiele jest danych na temat trójwymiarowego (3D) dSTORM egzosomu. W związku z tym staraliśmy się ustalić standardową procedurę operacyjną (SOP) do wizualizacji i charakterystyki oczyszczonych EV opartych na dSTORM, w tym egzosomów z nanometrową precyzją w 3D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 Rozmnażanie i utrzymanie linii komórkowych

  1. Pozyskaj ludzkie komórki kostniakomięsaka (U2OS) i umieść je w pożywce wzrostowej uzupełnionej 10% wolną od egzosomów płodową surowicą bydlęcą i 1x roztworem penicyliny/streptomycyny.
    UWAGA: Wolna od egzosomów płodowa surowica bydlęca została wygenerowana zgodnie z protokołem przedstawionym w McNamara i in. al.26.
  2. Utrzymuj komórki U2OS w inkubatorze pokrytym miedzią w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i komórkach pasażowych w kolbach T17526,27. Komórki muszą być utrzymywane w środkowej logarytmicznej fazie wzrostu, aby zapobiec powstawaniu subpopulacji lub gromadzeniu się resztek apoptotycznych w fazie stacjonarnej.

2 Izolacja i oczyszczanie egzosomów

  1. Wyhoduj linie komórkowe U2OS do pełnej konfluencji w 10 oddzielnych kolbach T175 z 50 ml pożywki na kolbę. Usunąć supernatant komórek i kolejno przepuścić go przez aparat filtracji próżniowej 0,45 μm i 0,22 μm.
  2. Poddaj supernatant filtracji z przepływem krzyżowym (znanej również jako filtracja o przepływie stycznym) w systemie filtracji wyposażonym we wkład z pustych włókien o mocy 750 kDa w celu usunięcia mniejszych białek lub metabolitów28.
    1. Przepuścić supernatant przez operatora filtracji o przepływie stycznym przy stałym ciśnieniu 30 psi, utrzymując ciśnienie retencji <20 psi, aby wytworzyć ciśnienie Δ 10 lub więcej psi. Umieść mieszadło magnetyczne w zbiorniku retentatu i ustaw na 150 obr./min26.
    2. Utrzymuj szybkość podawania na poziomie 40 ml/min lub wyższym. Zebrać permeat w zbiorniku i wyrzucić go.
  3. Stężyć supernatant do 30 ml, a następnie zrównoważyć z czterema objętościami 1x PBS. Zebrać przefiltrowany i zrównoważony roztwór o przepływie krzyżowym w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  4. Wytrącić EV w temperaturze 4 °C przez noc w końcowym stężeniu 40 mg/ml glikolu polietylenowego o masie cząsteczkowej 8 000 Da. Odwirować EV przy 1 200 x g w 4 °C przez 1 godzinę i ponownie zawiesić w 500 μl 1x PBS.
  5. Inkubować EVs z 50 μg/ml fotoprzełączalnego barwnika interkalacyjnego z czerwoną membraną i 50 μg/ml RNazy A w 1x PBS w 4 °C przez 1 godzinę.
  6. Usunąć nadmiar barwnika przez kolumnę w systemie oczyszczania białek podłączonym do kolektora frakcji. Zidentyfikuj frakcje EV za pomocą absorbancji UV i połącz je w probówce do mikrowirówki26.
  7. Affinity-select total 200 μL EV za pomocą kulek magnetycznych anty-CD81 zrównoważonych w 1x PBS.
    1. Rozcieńczyć 100 μl kulek magnetycznych anty-CD81 w 1x PBS do całkowitej objętości 1 ml i pozostawić do związania w temperaturze 4 °C przez 2 godziny w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml z ciągłym kołysaniem.
  8. Umyj koraliki anty-CD81 i EV trzy razy za pomocą 1x PBS. Elutę CD81+ EV z roztworu za pomocą 100 mM glicyny o pH 2,0 przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  9. Odpipetować oczyszczony CD81+ EV do równej objętości 100 mM Tris-HCl o pH 7,5 w 1x PBS.
    UWAGA: Podwielokrotność oczyszczonego roztworu CD81+ EV może być zarezerwowana do analizy śledzenia nanocząstek lub mikroskopii elektronowej w celu potwierdzenia czystości roztworu i obecności EVs26.

3 Utrwalenie i przygotowanie

  1. Umieścić oczyszczone pod względem powinowactwa EV na 8-dołkowych płytkach ze szklanym dnem μ o łącznej objętości 200 μl (można rozcieńczyć próbkę EV w 100 mM Tris-HCl przy pH 7,5 w 1x PBS) i pozostawić do przylegania do powierzchni przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Nie usuwając istniejącego roztworu z płytki 8-dołkowej, przymocuj EV do płytek, dodając 200 μl 4% paraformaldehydu w 1x PBS do roztworu zawierającego EV w każdym dołku i pozostaw do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej21.
  3. Ostrożnie usuń paraformaldehyd i nadmiar roztworu za pomocą mikropipety, aby nie przeszkadzać EVs. Umyj EV 1x PBS, aby usunąć nadmiar paraformaldehydu. Wykonaj procedurę prania trzy razy. Usuń nadmiar 1x PBS.
  4. Przygotować 250 μl sześciennego roztworu buforowego dSTORM B na próbkę, tworząc roztwór 5 mM dioksygenazy protokatechunowej (część A) rozcieńczonej w buforze obrazowania (część B) zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Stężenie enzymu w buforze może zostać podwojone do 10 mM, jeśli wystąpi fotowybielanie.
    1. Dodaj 250 μl przygotowanego buforu do każdej studzienki zgodnie z protokołem producenta przez 20 minut w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem w celu usunięcia cząsteczek utleniających.
      UWAGA: EV można następnie natychmiast wyświetlić lub przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia. Zamień bufor po przechowywaniu przed każdą wizualizacją.

4 Bezpośrednia kalibracja mikroskopii rekonstrukcji optycznej

  1. Przygotować kulki wymagane do kalibracji mikroskopu o wysokiej rozdzielczości, rozcieńczając mikrosfery o długości fali 100 nm do stężenia 0,5% w wodzie klasy biologii molekularnej i pipetując 200 μl do każdej studzienki 8-dołkowej płytki ze szklanym dnem μ.
    1. Pozwól koralikom osiąść w studzienkach przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  2. Nie usuwając istniejącego roztworu, dodać 200 μl 4% paraformaldehydu w PBS do każdego dołka do roztworu kulki kalibracyjnej i pozostawić do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Ostrożnie usuń paraformaldehyd za pomocą mikropipety, aby nie naruszyć kulek i umyj koraliki trzykrotnie 1x PBS. Przygotuj bufor zgodnie z krokiem 3.4.
  4. Usunąć 1x PBS i dodać 250 μl przygotowanego buforu do każdej studzienki. Pozostaw bufor na 20 minut przed wizualizacją.
  5. Przed umieszczeniem czegokolwiek na scenie podłącz do mikroskopu 3D za pomocą przycisku Podłącz mikroskop. Dodaj 100x oleju do celu i umieść środek studni na wierzchu obiektywu. W ustawieniach Acquire włącz lasery wzbudzające 473 i 640 nm i kliknij View.
    1. Bez włączonej soczewki 3D view koraliki pod ustawieniem nasycenia fotonów, klikając opcję Photon Counts (Liczba fotonów) w opcjach wyświetlania obrazu. Ustaw początkową moc lasera na 8,4 mW dla lasera 473 nm i na 11,6 mW dla lasera 640 nm.
    2. Zmniejsz ostrość lasera do około -300 nm lub płaszczyzny ogniskowej kulek kalibracyjnych, aby uzyskać wyraźną rozdzielczość poszczególnych kulek. Po ustawieniu ostrości na płaszczyźnie Z dostosuj poziomy mocy lasera, aby uwzględnić zmiany w każdym polu widzenia.
  6. W ramach funkcji przyrządu zakończ kalibrację mapowania 3D i kalibrację mapowania kanałów, aby uzyskać błędy na osiach X, Y i Z. Ustaw maksymalną liczbę pól widzenia na 20, docelową liczbę punktów na 4 000, maksymalną odległość między kanałami na 5,0 pikseli, a promień wykluczenia między kanałami na 10,0 pikseli podczas kalibracji mapowania kanałów.
  7. Upewnij się, że kalibracja zapewnia pokrycie punktowe na poziomie >90% i dobrą jakość mapowania. Zapisz podane dane kalibracyjne do przyszłych akwizycji obrazów.

5 Wizualizacja EV w trzech wymiarach

  1. Dodaj 100x olej na obiektyw i umieść przygotowane EV w mikroskopie. Bez aktywowanej soczewki 3D włącz laser wzbudzający 640 nm i początkowo podnieś go do wartości od 1,2 mW do 12,5 mW, w zależności od intensywności sygnału i pola widzenia, aby wzbudzić czerwoną membranę interkalacyjną barwione barwnikiem EV.
    1. W opcjach wyświetlania obrazu przełącz metodę wyświetlania z nasycenia fotonów na percentyle, aby lepiej zobrazować EV. Dostosuj moc lasera, aby zminimalizować szumy, jednocześnie maksymalizując sygnał. Zachowaj wszystkie inne parametry.
    2. Dostosuj ostrość płaszczyzny Z, klikając ikonę w górę lub w dół na osi Z.
      UWAGA: Płaszczyzna Z powinna być zogniskowana w zakresie od -200 do -350 nm, ale będzie się różnić w zależności od pola view.
  2. Ustaw czas ekspozycji na 20 ms, przechwytywanie klatki na 10 000 klatek, a początkową moc lasera na zakres od 1,2 mW do 12,5 mW lub moc lasera określoną w kroku 5.1, w zależności od intensywności sygnału i pola view.
    1. Aktywuj soczewkę 3D za pomocą ikony i rozpocznij akwizycję, klikając przycisk Pobierz.
  3. Podczas akwizycji obrazu zwiększaj moc lasera o 3 przyrosty po 10 co 1000 klatek lub wystarczająco, aby utrzymać wysoki stosunek sygnału do szumu. Nie reguluj płaszczyzny Z podczas akwizycji.
    UWAGA: Moc lasera można zwiększyć do maksymalnie 90 mW.

6 Modyfikacja po przejęciu i śledzenie EV

  1. Po pobraniu obrazu przełącz się do okna Analizuj viewing. Wykonaj korekcję dryfu na niefiltrowanym obrazie, a następnie aktywuj filtry. Dostosuj liczbę fotonów, precyzję lokalizacji, sigma i indeks ramki zgodnie z Tabelą 1.
  2. Nałóż narzędzie widoku płaszczyzny XYZ wzdłuż osi X poszczególnych EV z pola widzenia i wyeksportuj . Pliki CSV ze zdarzeniami fotoprzełączania.
  3. Przetnij poszczególne EV na osi XY w polu widzenia X na Y za pomocą narzędzia do histogramu liniowego, które dzieli zdarzenia fotoprzełączania na określone grupy odległości.
  4. Rób zdjęcia pojedynczych pojazdów elektrycznych i zapisuj je jako pliki .tiff.
  5. Twórz filmy 3D poszczególnych pojazdów elektrycznych za pomocą narzędzia do wizualizacji 3D i koloruj zgodnie z położeniem wzdłuż osi Z.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego badania było oszacowanie skuteczności mikroskopii super-rozdzielczej w wizualizacji pojedynczych EV z rozdzielczością nanometrową w trzech wymiarach (3-D). Aby przeanalizować kształt i rozmiar poszczególnych EV, użyliśmy fotoprzełączalnego barwnika i inkubowaliśmy EV z dalekoczerwonym, membranowym barwnikiem interkalacyjnym i usunęliśmy nadmiar barwnika za pomocą chromatografii29. Wychwycone powinowactwem anty-CD81 i zabarwione na czerwono EV były następnie oglądane w mikroskopie o wyso...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EV stały się popularnym obszarem badań ze względu na ich ważną rolę w wielu procesach wewnątrzkomórkowych i sygnalizacji międzykomórkowej 1,30. Ich wizualizacja okazuje się jednak trudna, ponieważ ich niewielkie rozmiary mieszczą się poniżej granicy dyfrakcji mikroskopii świetlnej. Bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (dSTORM) jest bezpośrednią metodą wizualizacji, która omija granicę dyfrakcji poprzez uchwycenie zdarzeń fotoprzełączania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.G.C. nie ma żadnych konfliktów interesów, o których mógłby się oświadczyć. R.P.M i D.P.D. otrzymują wsparcie materialne od Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. i Cytiva Inc. (dawniej GE Healthcare). R.P.M. i D.P.D. deklarują konkurencyjne interesy w zakresie ewentualnej komercjalizacji niektórych z prezentowanych informacji. Są one zarządzane przez Uniwersytet Północnej Karoliny. Źródła finansowania nie były zaangażowane w interpretację ani pisanie tego manuskryptu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Oxford Nanoimaging za konstruktywne opinie i wskazówki. Prace te zostały sfinansowane przez 5UM1CA121947-10 do R.P.M. i 1R01DA040394 do D.P.D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
15 &mikro;-Slide 8-dołkowe płytkiIbidi80827
1X PBSGibco14190-144
1X Penicylina Roztwór streptomycynyGibco15140-122
50 ml rurka stożkowaThermo Fisher339652
500 ml 0,22 µ m Aparatura do filtracji próżniowejGenesee25-227
750 kDa wkład odcinający z kanalikowym włóknemCytiva29-0142-95
AKTA Flux SCytiva29-0384-37
AKTA StartCytiva29022094-ECOMINSSW
Koraliki magnetyczne Anti-CD81Thermo Fisher10616D
B-sześcienny buforONI 
CellMask RedThermo FisherC10046
Dubelco's Modified Eagle MediumThermo Fisher10566016
Płodowa surowica bydlęcaVWR97068-085
Frac 30 Kolektorfrakcji Cytiva29022094-ECOMINSSW
Glicyna pH=2,0Thermo FisherBP381-5
HiTrap CaptoCore 700 KolumnaCytiva17548151
Biologia molekularna Klasa WodaCorning9820003
NanoimagerOxford NanoimagingNiestandardowa
paraformaldehhydeMikroskopia elektronowa Sciences15710
Glikol polietylenowyThermo FisherBP233-1
RNaza APromegaA797C
T175 KolbyGenesee25-211
Mikrosfery TetraspekInvitrogenT7279
Tris- HCl pH=7,5Thermo FisherBP153-1
Unicorn VCytiva29022094-ECOMINSSW
BCA0017

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  3. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  4. Cocozza, F., Grisard, E., Martin-Jaular, L., Mathieu, M., Théry, C. SnapShot: Extracellular vesicles. Cell. 182 (1), 262(2020).
  5. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  6. McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Extracellular vesicles in virus infection and pathogenesis. Current Opinion in Virology. 44, 129-138 (2020).
  7. Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
  8. Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLoS One. 11 (2), 0149866(2016).
  9. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  10. Emelyanov, A., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid. PLoS One. 15 (1), 0227949(2020).
  11. Noble, J. M., et al. Direct comparison of optical and electron microscopy methods for structural characterization of extracellular vesicles. Journal of Structural Biology. 210 (1), 107474(2020).
  12. Panagopoulou, M. S., Wark, A. W., Birch, D. J. S., Gregory, C. D. Phenotypic analysis of extracellular vesicles: a review on the applications of fluorescence. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1710020(2020).
  13. Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
  14. Carnell-Morris, P., Tannetta, D., Siupa, A., Hole, P., Dragovic, R. Analysis of extracellular vesicles using fluorescence nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. 1660, 153-173 (2017).
  15. Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
  16. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016(2019).
  17. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (8), 807-818 (2010).
  18. Lannigan, J., Erdbruegger, U. Imaging flow cytometry for the characterization of extracellular vesicles. Methods. 112, 55-67 (2017).
  19. Magenau, A., Gaus, K. 3D super-resolution imaging by localization microscopy. Methods in Molecular Biology. 1232, 123-136 (2015).
  20. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  21. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  22. Chen, C., et al. Imaging and intracellular tracking of cancer-derived exosomes using single-molecule localization-based super-resolution microscope. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (39), 25825-25833 (2016).
  23. Grant, M. J., Loftus, M. S., Stoja, A. P., Kedes, D. H., Smith, M. M. Superresolution microscopy reveals structural mechanisms driving the nanoarchitecture of a viral chromatin tether. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4992-4997 (2018).
  24. Nizamudeen, Z., et al. Rapid and accurate analysis of stem cell-derived extracellular vesicles with super resolution microscopy and live imaging. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865 (12), 1891-1900 (2018).
  25. Shen, X., et al. 3D dSTORM imaging reveals novel detail of ryanodine receptor localization in rat cardiac myocytes. The Journal of Physiology. 597 (2), 399-418 (2019).
  26. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396(2018).
  27. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
  28. Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Science Reports. 7 (1), 11561(2017).
  29. Mönkemöller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 16 (24), 12576-12581 (2014).
  30. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  31. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  32. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  33. Jayasinghe, I., et al. True molecular scale visualization of variable clustering properties of ryanodine receptors. Cell Reports. 22 (2), 557-567 (2018).
  34. Eggert, D., Rösch, K., Reimer, R., Herker, E. Visualization and analysis of hepatitis C virus structural proteins at lipid droplets by super-resolution microscopy. PLoS One. 9 (7), 102511(2014).
  35. Mazloom-Farsibaf, H., et al. Comparing lifeact and phalloidin for super-resolution imaging of actin in fixed cells. PLoS One. 16 (1), 02246138(2021).
  36. Huang, B., Jones, S. A., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5 (12), 1047-1052 (2008).
  37. McNamara, R. P., et al. Nef secretion into extracellular vesicles or exosomes is conserved across human and simian immunodeficiency viruses. mBio. 9 (1), 02344(2018).
  38. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  39. Kalies, S., Kuetemeyer, K., Heisterkamp, A. Mechanisms of high-order photobleaching and its relationship to intracellular ablation. Biomedical Optics Express. 2 (4), 805-816 (2011).
  40. Mönkemöller, V., Øie, C., Hübner, W., Huser, T., McCourt, P. Multimodal super-resolution optical microscopy visualizes the close connection between membrane and the cytoskeleton in liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. Scientific Reports. 5, 16279(2015).
  41. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81, 1-27 (2017).
  42. Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution microscopy approaches for live cell imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
  43. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Optics Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  44. Hurwitz, S. N., et al. CD63 regulates Epstein-Barr Virus LMP1 exosomal packaging, enhancement of vesicle production, and noncanonical NF-κB signaling. Journal of Virology. 91 (5), 02251(2017).
  45. Hurwitz, S. N., Cheerathodi, M. R., Nkosi, D., York, S. B., Meckes, D. G. Tetraspanin CD63 bridges autophagic and endosomal processes to regulate exosomal secretion and intracellular signaling of Epstein-Barr Virus LMP1. Journal of Virology. 92 (5), 01969(2018).
  46. Bukong, T. N., Momen-Heravi, F., Kodys, K., Bala, S., Szabo, G. Exosomes from hepatitis C infected patients transmit HCV infection and contain replication competent viral RNA in complex with Ago2-miR122-HSP90. PLoS Pathogens. 10 (10), 1004424(2014).
  47. Khan, M. B., et al. Nef exosomes isolated from the plasma of individuals with HIV-associated dementia (HAD) can induce Aβ(1-42) secretion in SH-SY5Y neural cells. J Neurovirology. 22 (2), 179-190 (2016).
  48. Lee, J. H., et al. HIV-Nef and ADAM17-containing plasma extracellular vesicles induce and correlate with immune pathogenesis in chronic HIV infection. EBioMedicine. 6, 103-113 (2016).
  49. Meckes, D. G., et al. Modulation of B-cell exosome proteins by gamma herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2925-2933 (2013).
  50. Raymond, A. D., et al. Microglia-derived HIV Nef+ exosome impairment of the blood-brain barrier is treatable by nanomedicine-based delivery of Nef peptides. Journal of Neurovirology. 22 (2), 129-139 (2016).
  51. Raab-Traub, N., Dittmer, D. P. Viral effects on the content and function of extracellular vesicles. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 559-572 (2017).
  52. Feng, Z., et al. A pathogenic picornavirus acquires an envelope by hijacking cellular membranes. Nature. 496 (7445), 367-371 (2013).
  53. Bandopadhyay, M., Bharadwaj, M. Exosomal miRNAs in hepatitis B virus related liver disease: a new hope for biomarker. Gut Pathogens. 12, 23(2020).
  54. Hurwitz, S. N., et al. Proteomic profiling of NCI-60 extracellular vesicles uncovers common protein cargo and cancer type-specific biomarkers. Oncotarget. 7 (52), 86999-87015 (2016).
  55. Rodrigues, M., Fan, J., Lyon, C., Wan, M., Hu, Y. Role of extracellular vesicles in viral and bacterial infections: Pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. Theranostics. 8 (10), 2709-2721 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Extracellular VesiclesSuper Resolution MicroscopyDirect Stochastic Optical ReconstructionThree Dimensional ImagingdSTORM MicroscopyExosome VisualizationVirus Particle ImagingPhotoswitching EventsSize Distribution AnalysisCalibration Beads

Powiązane artykuły