Artykuł metodologiczny

Behawioralne badanie przesiewowe napadów wywołanych ciepłem w mysich modelach padaczki

DOI:

10.3791/62846

⸱

12 lipca 2021

 ,  , 
1Department of Developmental and Cell Biology, University of California, 2Department of Anatomy and Neurobiology, University of California

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem metody jest badanie przesiewowe pod kątem hipertermii lub napadów wywołanych ciepłem w modelach mysich. Protokół opisuje użycie specjalnie zbudowanej komory z ciągłym monitorowaniem temperatury ciała w celu określenia, czy podwyższona temperatura ciała prowadzi do napadów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transgeniczne modele myszy okazały się potężnymi narzędziami w badaniu różnych aspektów ludzkich zaburzeń neurologicznych, w tym epilepsji. Padaczki genetyczne związane z SCN1A obejmują szerokie spektrum zaburzeń napadowych z niepełną penetracją i zmiennością kliniczną. Mutacje SCN1A mogą powodować dużą różnorodność fenotypu napadów, począwszy od prostych, samoograniczających się napadów gorączkowych związanych z gorączką (FS), padaczki genetycznej o umiarkowanym poziomie z drgawkami gorączkowymi plus (GEFS+) do cięższego zespołu Dravet (DS). Chociaż FS są często obserwowane u dzieci w wieku poniżej 6-7 lat, które nie mają padaczki genetycznej, FS u pacjentów z GEFS+ nadal występuje w wieku dorosłym. Tradycyjnie, eksperymentalne FS były indukowane u myszy poprzez wystawienie zwierzęcia na działanie strumienia suchego powietrza lub lamp grzewczych, a tempo zmian temperatury ciała często nie jest dobrze kontrolowane. Tutaj opisujemy zbudowaną na zamówienie komorę grzewczą z frontem z pleksi, która jest wyposażona w cyfrowy regulator temperatury i wentylator elektryczny wyposażony w grzałkę, który może wysyłać ogrzane wymuszone powietrze do areny testowej w sposób kontrolowany temperaturą. Temperatura ciała myszy umieszczonej w komorze, monitorowana za pomocą sondy doodbytniczej, może być podniesiona do 40-42 °C w powtarzalny sposób poprzez zwiększenie temperatury wewnątrz komory. Ciągły monitoring wzrokowy zwierząt w okresie grzewczym wykazuje indukcję napadów wywołanych ciepłem u myszy noszących mutację FS w temperaturze ciała, która nie wywołuje napadów behawioralnych u dzikich rodaków z miotu. Zwierzęta można łatwo wyjąć z komory i umieścić na podkładce chłodzącej, aby szybko przywrócić normalną temperaturę ciała. Metoda ta zapewnia prosty, szybki i powtarzalny protokół badań przesiewowych w kierunku występowania napadów wywołanych ciepłem w mysich modelach padaczki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Padaczka, czwarta najczęstsza rodzina zaburzeń neurologicznych w Stanach Zjednoczonych1, charakteryzują się brakiem równowagi między napędem pobudzającym i hamującym w OUN, co prowadzi do nawracających napadów. Drgawki gorączkowe (FS) lub drgawki związane z gorączką mogą wystąpić w populacji ogólnej, najczęściej u dzieci już w wieku od 3 miesięcy do 6-7 lat. Jednak u niektórych osób z mutacjami genetycznymi, najczęściej w genie kanału sodowego, FS może utrzymywać się po 7 roku życia w wieku dorosłym. Ten stan jest określany jako drgawki gorączkowe plus lub FS+. Szybki postęp w sekwencjonowaniu genomu pozwolił zidentyfikować ponad 1300 mutacji w ludzkim genie kanału jonowym SCN1A, co czyni go gorącym punktem mutacji padaczki. Mutacje SCN1A zostały powiązane z szerokim spektrum zaburzeń napadowych, w tym drgawkami gorączkowymi (FS), padaczką genetyczną z drgawkami gorączkowymi plus (GEFS+) i zespołem Dravet (DS)2,3,4,5,6. Około 20% mutacji typu missense SCN1A prowadzi do GEFS+5,7,8. Historia złożona lub przedłużająca się FS w dzieciństwie może następnie przekształcić się w bardziej wyniszczające formy padaczki, takie jak padaczka skroniowa (TLE)9,10,11. Zespół Dravet powstaje z powodu mutacji skróconych lub mutacji utraty funkcji w SCN1A i jest ciężką postacią nieuleczalnej padaczki, z początkiem w dzieciństwie napadów gorączkowych, które przekształcają się w napady oporne na leczenie i często wiąże się z zaburzeniami poznawczymi, rozwojowymi i motorycznymi2,5,12. Ponieważ wiele osób z GEFS+ i/lub DS wykazuje drgawki gorączkowe, konieczne staje się opracowanie nowych terapii, aby lepiej zwalczać te zaburzenia napadowe.

Modele zwierzęce padaczki związanej z SCN1A okazały się nieocenione w charakterystyce różnych typów napadów (gorączkowych i uogólnionych) oraz w analizowaniu neuronalnego mechanizmu powstawania napadów13,14,15,16,17,18. Podczas gdy badanie spontanicznych napadów za pomocą zapisów EEG/EMG w mózgach gryzoni jest dobrze ugruntowane i jest bardzo użytecznym narzędziem, tylko kilka badań próbowało naśladować drgawki gorączkowe w modelach mysich14,16,19,20,21,22,23. W poprzednich badaniach używano strumienia ogrzanego, suchego powietrza lub butli z metakrylanem wyposażonej w system termiczny, lub lamp grzewczych z regulatorem temperatury w zamkniętych arenach testowych9,16,21,22,23,24 w celu wywołania napadów padaczkowych za pomocą hipertermii. W celu podniesienia temperatury ciała w bardziej kontrolowanym środowisku, opisany tutaj protokół wykorzystuje specjalnie zbudowaną komorę z systemem ogrzewania o kontrolowanej temperaturze, który umożliwiał powtarzalne tempo wzrostu temperatury ciała myszy wewnątrz komory. Komora grzewcza została zbudowana z drewna (długość 40 cm x szerokość 34 cm x wysokość 31 cm) i została wyposażona w cyfrowy regulator temperatury z termoparą K. Mały wentylator osiowy wyposażony w grzałkę na tylnym panelu komory kieruje ogrzane powietrze do komory regulowane przez cyfrowy regulator temperatury. Ten system ogrzewania z wymuszonym obiegiem powietrza umożliwia kontrolowanie tempa wzrostu temperatury w komorze. (Rysunek 1A,B). Termopara K umieszczona wewnątrz drewnianej komory grzewczej wysyła informację zwrotną do cyfrowego regulatora temperatury, aby utrzymać stałą temperaturę wewnątrz pudełka podczas testu. Ustawienie temperatury na cyfrowym regulatorze temperatury, umożliwia wentylatorowi elektrycznemu przesyłanie ogrzanego wymuszonego powietrza przez otwory wentylacyjne w celu równomiernego ogrzewania komory (Rysunek 1A). Przedni panel komory grzewczej to przezroczysta folia z pleksi, która umożliwia łatwe nagrywanie wideo z prób.

Dorosłe myszy (P30-P40), heterozygotyczne pod względem mutacji missense w SCN1A, która powoduje GEFS+, oraz taka sama liczba dzikich rodaków z miotu, które mają służyć jako grupa kontrolna, zostały wybrane do każdego eksperymentu. Zwierzęta, zarówno samce, jak i samice, użyte w tych badaniach ważyły co najmniej 15 g, ponieważ myszy typu dzikiego ważące mniej były bardziej wrażliwe na napady wywołane upałem niż cięższe zwierzęta w tym samym wieku. W badaniu pilotażowym zaobserwowano, że zarówno myszy ze mutami, jak i dzikimi typami szukały chłodniejszych zakątków komory z tyłu i pozostawały tam przez dłuższy czas. Aby obejść ten problem, efektywny rozmiar podłogi wewnątrz areny testowej komory grzewczej został zmniejszony do długości 16,5 cm x szerokości 21,5 cm x wysokości 27,5 cm poprzez umieszczenie drewnianego klocka B (wymiary 20 cm x 8 cm x 7,2 cm) po prawej stronie komory (Rysunek 1A). Komora grzewcza została zbudowana ze sklejki o grubości 1,9 cm (długość 40 cm x szerokość 34 cm x wysokość 31 cm) pokrytej białym laminatem i wyposażona w cyfrowy regulator temperatury z termoparą K. Laminowana powierzchnia ścian komory jest nieprzepuszczalna i można ją łatwo zdezynfekować między próbami, przecierając 70% etanolem. Temperatura komory grzewczej została początkowo ustalona na 50 °C i wstępnie podgrzewana przez co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu, aby zapewnić równomierne ogrzewanie wewnątrz komory. Każda mysz została wyposażona w termometr doodbytniczy do ciągłego monitorowania temperatury ciała przez cały czas trwania eksperymentu. Pojedyncza mysz była umieszczana w komorze na raz, a temperatura była utrzymywana na poziomie 50 °C między 1a 10minutą. Następnie temperaturę podnoszono do 55 °C na 11-20minuty, a na koniec podnoszono do 60 °C na 21-30minuty. Spowodowało to powtarzalne tempo wzrostu temperatury ciała myszy (Rysunek 2A). Każde badanie było nagrywane na wideo, a analiza behawioralna była przeprowadzana offline.

Protokół ogrzewania można łatwo zmodyfikować, aby zmienić początkową temperaturę komory grzewczej i szybkość nagrzewania komory, co z kolei zmienia szybkość podnoszenia temperatury ciała myszy podczas testu. W związku z tym metoda ta zapewnia większą elastyczność w porównaniu z tradycyjnymi metodami w ustawianiu behawioralnych badań przesiewowych obejmujących napady wywołane upałem. Protokół napadów wywołanych ciepłem może być również wykorzystany do badań przesiewowych w kierunku leków przeciwpadaczkowych, które sprawiają, że zmutowane myszy są bardziej odporne na napady wywołane ciepłem lub zwiększają temperaturę progową, przy której obserwuje się napady. Podobnie, korzystny wpływ restrykcyjnych reżimów dietetycznych, takich jak dieta ketonowa, na napady wywołane upałem można zbadać u normalnych myszy karmionych karmą i keto.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Opis komory grzewczej myszy zbudowanej na zamówienie. (A) Na przednim panelu drewnianej komory grzewczej myszy znajduje się boczny panel sterowania, w którym znajduje się przełącznik Power ON/OFF, który włącza cyfrowy regulator temperatury, termoparę K, włącznik/wyłącznik nagrzewnicy i wskaźnik ciepła. Wymiary zewnętrzne pudełka i wewnętrznej areny testowej są podane w cm. Pokazany jest również drewniany klocek B służący do skutecznego zmniejszania powierzchni areny testowej. Dno areny testowej pokryte jest ściółką z kolb, aby zapobiec bezpośredniemu kontaktowi myszy z rozgrzanymi drewnianymi powierzchniami. (B) Tylny panel komory grzewczej pokazuje wentylator zamontowany na górnym otworze wentylacyjnym oraz przewód zasilający do dostarczania energii elektrycznej do komory. Ten rysunek jest zmodyfikowany na podstawie rysunku 3 w Das et al., 2021, eNeuro14. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine.

1. Przygotowanie do testu napadów padaczkowych wywołanych wysoką temperaturą

  1. Włącz przycisk Power On na komorze grzewczej, a następnie przycisk Heat On.
  2. Ustaw temperaturę komory grzewczej na 50 °C za pomocą klawiatury na cyfrowym regulatorze temperatury.
  3. Odczekaj co najmniej 1 godzinę, aby podgrzać komorę do temperatury 50 °C przed wprowadzeniem pierwszej myszy do komory. Podgrzewanie zapewnia równomierne nagrzewanie wewnątrz komory.
  4. Wyłóż podłogę komory grzewczej myszy ściółką z kolb.
  5. Zamontuj kamerę rejestrującą wideo przed komorą cieplną, aby rejestrować każdą próbę testu napadów padaczkowych wywołanych ciepłem.
  6. Wyłóż szalkę Petriego o średnicy 140 mm grubymi warstwami bibuły i umieść ją na lodzie, aby służyła jako podkładka chłodząca.
    UWAGA: Pod koniec testu poszczególne myszy zostaną przeniesione na wstępnie schłodzoną podkładkę chłodzącą, aby obniżyć ich podwyższoną temperaturę ciała.

2. Przygotowanie myszy do testu napadowego wywołanego wysoką temperaturą

  1. Wybierz 10 dorosłych myszy (P30-P40), 5 będących nosicielami mutacji powodującej padaczkę i 5 rodzeństwa z miotu typu dzikiego do testu przesiewowego napadów padaczkowych wywołanych upałem.
    UWAGA: Myszy typu dzikiego, nie będące nosicielami mutacji powodującej padaczkę, nie wykazują napadów wywołanych ciepłem w temperaturach poniżej 44 °C i służą jako grupa kontrolna.
  2. Zważyć każdą mysz, która ma być wykorzystana do testu przesiewowego, i zapisać jej masę ciała. Do testu należy używać wyłącznie myszy o masie ciała 15 g lub większej.
  3. Wyświetlaj jedną mysz na raz w komorze grzewczej myszy.
  4. Krótko znieczulaj mysz przez 10-15 sekund, używając kilku kropli izofluranu na dnie słoika.
  5. Wyjmij zwierzę ze słoika i połóż je na ręczniku papierowym.
  6. Upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona, sprawdzając, czy mysz nie reaguje na szkodliwe szczypanie palca.
  7. Pokryj metalową końcówkę sondy temperatury doodbytniczej smarem (takim jak wazelina) i delikatnie włóż go do myszy na głębokość mniejszą lub równą 2 cm.
  8. Przymocuj sondę doodbytniczą do ogona myszy za pomocą taśmy, aby sonda nie wysunęła się podczas testu.
    UWAGA: Alternatywnie umieść zwierzę w stożku przytrzymującym mysz i włóż sondę temperatury doodbytniczą. Przymocuj go taśmą do ogona.
  9. Upewnij się, że sonda doodbytnicza jest podłączona do multimetru, który wyświetla wewnętrzną temperaturę ciała myszy.
  10. Umieść zwierzę w nowej klatce wyłożonej ściółką z kolb, tj. klatce rekonwalescencyjnej.
  11. Uruchom minutnik i odczekaj 5 minut. Obserwuj mysz, aż całkowicie wyzdrowieje ze znieczulenia, a mysz będzie aktywna i pielęgnowana.
    1. Jednocześnie monitoruj temperaturę ciała myszy, aż ustabilizuje się na poziomie 35-36 °C.
  12. Pod koniec 5 minut zanotuj temperaturę ciała myszy. Jest to początkowa temperatura ciała w czasie "0" min.
    UWAGA: Jeśli temperatura ciała myszy jest niższa niż 35 °C, poczekaj na dodatkowy czas, aż zwierzę dojdzie do siebie po hipotermii wywołanej znieczuleniem.
  13. Szybko przenieś pojedynczą mysz do podgrzanej komory myszy. To oznacza POCZĄTEK próby eksperymentalnej. W danym momencie wyświetlana jest tylko jedna mysz.

3. Test napadu padaczkowego wywołanego wysoką temperaturą

  1. Po delikatnym umieszczeniu myszy na podłodze wstępnie podgrzanej komory grzewczej myszy, zamknij drzwiczki z pleksi i uruchom kamerę, aby nagrać eksperyment na wideo.
  2. Uruchom stoper. Rejestruj temperaturę ciała myszy z termometru doodbytniczego w odstępach 1-minutowych przez cały czas trwania eksperymentu.
  3. W regularnych odstępach czasu zwiększaj temperaturę komory grzewczej myszy tak, aby temperatura ciała myszy rosła w tempie 0,25-0,5 °C /min.
    UWAGA: Gwałtowny wzrost temperatury ciała może prowadzić do udaru cieplnego lub śmierci i należy tego unikać.
  4. Postępując zgodnie z tym protokołem, zwiększaj temperaturę komory grzewczej myszy o 5 °C co 10 minut, jak pokazano na Rysunek 2A.
  5. Po 9.5 min ustaw temperaturę komory grzewczej na 55 °C, aby ustabilizować temperaturę komory grzewczej do 55 °C przez 10minut, jak pokazano na cyfrowym wyświetlaczu temperatury.
  6. Podobnie zwiększ temperaturę do 60 °C po 19,5 min, aby ustabilizować temperaturę komory grzewczej do 60 °C po 20minutach. Każda próba przesiewowa w kierunku napadów trwa 30 minut.
  7. Jeśli mysz ma napad padaczkowy (wokalizuje, pokazuje głową, klonus kończyn przednich, wyprost kończyn tylnych, upada na bok lub doświadcza uogólnionych drgawek tonicznych/klonicznych), zapisz następujące informacje.
    1. Zapisz temperaturę ciała myszy podczas napadu (temperatura progu drgawkowego) z termometru do pomiaru temperatury w odbycie.
    2. Rejestruj cechy zachowania napadowego, takie jak głową, klonus kończyn przednich, wyprost kończyn tylnych, upadek na bok i/lub uogólnione napady toniczne/kloniczne (GTCS) wyświetlane przez mysz.
  8. Szybko, ale delikatnie wyjmij mysz z komory i umieść ją na podkładce chłodzącej przygotowanej w kroku 1.6.
    UWAGA: Jeśli mysz doświadcza napadów w skali 5 skali Racine'a i wykazuje niekontrolowane skakanie, może być trudno podnieść zwierzę z komory grzewczej i przenieść je na zewnątrz na podkładkę chłodzącą. Jednak typowy napad wywołany ciepłem trwa od 30 s do 60 s. Dlatego mysz powinna zostać wyjęta z komory grzewczej i umieszczona na podkładce chłodzącej w ciągu 60 s od rozpoczęcia epizodu napadu wywołanego ciepłem.
  9. Poczekaj, aż temperatura ciała myszy spadnie do 36-37 °C, zanim przeniesiesz ją do klatki odzyskiwania. Tylko jedna mysz jest umieszczana w klatce odzyskiwania na raz.
    UWAGA: Nie należy mieszać myszy, które nie zostały jeszcze użyte do badań przesiewowych wywołanych ciepłem, z myszą, która już przeszła próbę eksperymentalną z napadami wywołanymi ciepłem.
  10. Delikatnie i ostrożnie przetnij taśmę między ogonem myszy a drutem sondy doodbytniczej nożyczkami, aby usunąć sondę doodbytniczą z myszy.
  11. Wytrzyj metalową końcówkę sondy doodbytniczej 70% alkoholem i chusteczkami do tkanek miękkich, aby była gotowa do następnej próby.
  12. Kontynuuj obserwację myszy w klatce odzyskiwania, dopóki nie wznowi normalnej aktywności (chodzenie, pielęgnacja itp.), zanim wróci do klatki domowej. To oznacza KONIEC próby eksperymentalnej dla tej myszy.
  13. Rejestruje się status zwierzęcia po wykonaniu testu – żywego i odzyskanego z sesji badawczej lub martwego. Napady o dużej intensywności polegające na niekontrolowanym skakaniu i uogólnionych napadach tonicznych/klonicznych mogą czasami prowadzić do śmierci myszy.
  14. Jeśli mysz nie doświadczy napadów wywołanych ciepłem w ciągu 30-minutowego okresu obserwacji lub temperatura ciała myszy osiągnie 44 °C, wyjmij mysz z komory grzewczej i umieść ją na podkładce chłodzącej, aż temperatura ciała myszy powróci do 36-37 °C.
  15. Zresetuj temperaturę komory grzewczej myszy do 50 °C i pozwól jej się zrównoważyć, aż temperatura na wyświetlaczu cyfrowego regulatora temperatury pokaże 50 °C.
  16. Zmieniaj ściółkę kolb między poszczególnymi próbami na myszach.
  17. Przygotuj następną mysz do badania przesiewowego zgodnie z opisem w punkcie 2 i powtórz czynności opisane w punkcie 3.

4. Eutanazja zwierząt

  1. Chociaż większość zwierząt wraca do zdrowia po napadach wywołanych upałem, z naszego doświadczenia wynika, że kilka myszy przechodzi SUDEP (nagła niewyjaśniona śmierć w EPilepsy) w swojej domowej klatce w ciągu 24-48 godzin od napadów wywołanych upałem. Po zakończeniu badań przesiewowych na wszystkich myszach indywidualnie pod kątem napadów padaczkowych wywołanych upałem po 30-minutowym badaniu, należy poddać eutanazji wszystkie myszy zgodnie z wytycznymi IACUC instytucji.

5. Analiza danych dotyczących napadów padaczkowych wywołanych upałem

  1. Po zakończeniu badań przesiewowych kohorty zwierząt należy obliczyć odsetek myszy w danym genotypie wykazujących napady padaczkowe, korzystając z następującego wzoru:
    figure-protocol-1
  2. Oszacuj średnią temperaturę progu drgawkowego myszy w obrębie danego genotypu, uśredniając temperaturę progu drgawkowego wszystkich myszy (zanotowanych w kroku 3.7) w tym genotypie, które wykazują napady wywołane ciepłem.
  3. Pozostając nadal ślepym na tożsamość i genotyp, odtwórz ponownie nagrania wideo każdej z myszy podczas badania przesiewowego napadów wywołanych ciepłem na ekranie komputera, aby ocenić nasilenie napadów.
  4. Przyznaj punkty poszczególnym myszom wykazującym napady padaczkowe wywołane ciepłem, używając zmodyfikowanej skali Racine'a13, zgodnie z opisem w poprzednich badaniach13,14. Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 1.
  5. Jeśli mysz, doświadczając napadów wywołanych upałem, pokazuje tylko głową, przyznaj jej wynik 2. Jeśli mysz rozpoczyna epizod napadu od głową, ale wykazuje również klonus kończyn przednich, przewracanie się i/lub skakanie, przyznaj jej wynik 5.
  6. Zapisz maksymalny wynik dla każdej myszy za pomocą zmodyfikowanej skali Racine'a13, jak opisano powyżej.
  7. Wykreśl wykres punktowy maksymalnych wyników Racine'a wykazywanych przez wszystkie myszy w danym genotypie.
  8. Statystycznie porównaj maksymalne wyniki Racine'a w różnych grupach myszy jako metodę określania nasilenia napadów behawioralnych, takich jak napady wywołane upałem.
    UWAGA: Wyniki Racine'a są pomocne w porównywaniu charakterystyki napadów między różnymi zmutowanymi grupami myszy lub genotypami. Oczekuje się, że myszy typu dzikiego nie będą przechodzić napadów wywołanych upałem i nie będą musiały być brane pod uwagę przy porównaniach wyników Racine'a.
  9. Na podstawie projektu eksperymentalnego przeprowadź odpowiednią analizę statystyczną w celu określenia, czy odsetek myszy wykazujących napady padaczkowe między myszami typu dzikiego i zmutowanymi oraz ich średnie wartości temperatury progu drgawkowego znacznie się od siebie różnią.
Punktacja Racine'aCharakterystyka napadu
0Brak napadów
1Ruchy ust i twarzy
cyfra arabskagłową
3Klonus kończyn przednich, zwykle jedna kończyna
4Klonus kończyn przednich z odchodem
5Uogólniony napad toniczno-kloniczny, podnoszenie, skakanie, przewracanie się

Tabela 1: Wyniki Racine'a.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczekuje się, że modele zwierzęce z mutacjami napadów gorączkowych będą doświadczać napadów wywołanych ciepłem przy podwyższonej temperaturze ciała, które nie wywołują napadów u dzikich rodaków z miotu. Mutacje SCN1A zostały powiązane z drgawkami gorączkowymi, w tym u pacjentów z K1270T GEFS+, którzy wykazują zarówno drgawki uogólnione z gorączką, jak i z gorączką7. Przebadaliśmy wygenerowane przez CRISPR myszy z mutacją SCN1A K1270T GEFS + niedawno opisane w badaniu14 pod kątem występowania napadów cieplnych w dwóch tłach genetycznych - odpornych na napady 129X1 / SvJ (129X1) i podatnych na napady C57BL / NJ (B6N). Jako grupę kontrolną posłużyły dopasowane wiekowo rodzeństwo z miotu typu dzikiego w komorze cieplnej myszy, które nie są nosicielami żadnych mutacji GEFS +, a zatem nie oczekuje się, że będą wykazywać napady wywołane upałem. Szybkość zmian temperatury ciała w czasie oceniano, wykreślając średnią temperaturę ciała myszy rejestrowaną co minutę podczas testu. Nie stwierdzono różnicy w szybkości zmian temperatury ciała między heterozygotycznymi zmutowanymi myszami a rodzeństwem z miotu typu dzikiego testowanym w odpowiednich tłach genetycznych 129X1 i B6N (Rysunek 2B, C). Sugeruje to, że termoregulacja nie ulega zmianie u heterozygotycznych zmutowanych myszy K1270T GEFS +.

Wszystkie heterozygotyczne zmutowane myszy z genetycznego tła 129X1 (n = 15) lub B6N (n = 9) wykazywały napady wywołane ciepłem (Rysunek 2D). Żadna z myszy typu dzikiego w wzbogaconym tle 129X1 (n = 13) nie wykazywała napadów wywołanych ciepłem (Ryc. 2D). W przeciwieństwie do tego, jedna trzecia badanych myszy (n = 3 z 9 myszy) w tle wrażliwym na napady B6N wykazywała napady wywołane ciepłem. Porównanie statystyczne pokazuje, że odsetek heterozygotycznych zmutowanych myszy wykazujących napady wywołane ciepłem był znacznie wyższy niż ich odpowiednich odpowiedników typu dzikiego zarówno w tle genetycznym 129X1, jak i B6N (Rysunek 2D, dokładny test Fishera, 129X1 p < 0,0001; B6NJ p = 0,009). Średnia temperatura progu drgawkowego między heterozygotycznymi zmutowanymi myszami w tle genetycznym 129X1 i B6N była podobna. Myszy z mutacją 129X1 mają średnią temperaturę progu drgawkowego wynoszącą 42,6 ± 0,20 °C, która nie różniła się znacząco od średniej temperatury progu drgawkowego wynoszącej 42,7 ± 0,06 °C obserwowanej u myszy B6N (Rysunek 2E; dwustronny niesparowany test t-Studenta, p = 0,782). Należy zauważyć, że średnia temperatura progu drgawkowego trzech myszy typu dzikiego B6N, które wykazywały napady wywołane ciepłem, wynosiła 43,7 ± 0,08 °C i była znacznie wyższa niż średni próg drgawkowy wynoszący 42,7 ± 0,06 °C wykazywany przez heterozygotyczne zmutowane myszy B6N (Rysunek 2E, dwustronny niesparowany test t-Studenta, p < 0,0001).

Przód komory z pleksiglasu umożliwia wykonywanie ciągłych nagrań wideo podczas testu, które mogą być później wykorzystane do oceny nasilenia napadu u każdej myszy na zmodyfikowanej skali Racine'a, jak opisano wcześniej14,20. Podczas typowego testu heterozygotyczne zmutowane myszy wykazywałyby napady wywołane ciepłem z wokalizacją i / lub głową (wynik Racine'a 2) i szybko przechodziły do klonusa kończyn przednich, upadając na bok, skacząc, prostując kończyny tylne i / lub uogólnione napady toniczne / kloniczne (punkty Racine'a 3-5), gdy temperatura ciała osiągnęła około 42 °C. Maksymalny wynik Racine'a reprezentuje najcięższe zachowanie napadowe wywołane upałem wśród zmutowanych myszy. Maksymalny wynik Racine'a heterozygotycznych zmutowanych myszy na wzbogaconym tle 129X1 (n = 15) nie różni się od heterozygotycznych zmutowanych myszy w tle genetycznym B6N (n = 9) (Rysunek 2F; Test Manna-Whitneya, s. > 0,9999). Sugeruje to, że charakterystyka zachowania napadowego wywołanego ciepłem u myszy z mutacją K1270T GEFS + jest niezależna od tła szczepu.

Podsumowując, dane pokazują, że wszystkie zmutowane myszy wykazują napady wywołane ciepłem z podobną częstotliwością, temperaturą progu drgawkowego i nasileniem napadów behawioralnych w sposób niezależny od szczepu. Większość dzikich rodzeństwa z miotu nie wykazuje takich napadów w temperaturze 44 °C lub niższej. Około jedna trzecia myszy kontrolnych typu dzikiego w tle wrażliwym na napady B6N wykazywała napady wywołane ciepłem (prawdopodobnie z powodu genetycznych efektów tła), ale temperatura progu drgawkowego była znacznie wyższa w porównaniu ze zmutowanymi myszami na tym samym tle. Wyniki te sugerują, że zmutowane myszy w tle genetycznym B6N są podatne na napady wywołane ciepłem przy niższych progach temperatury z powodu mutacji SCN1A GEFS+, której są nosicielami. Tak więc, korzystając z tego protokołu, można ocenić napady wywołane ciepłem u myszy z mutacją padaczki i odróżnić je od myszy z dzikiego miotu, które albo nie przechodzą napadów wywołanych upałem, albo wykazują napady cieplne w znacznie wyższych temperaturach.

figure-results-1
Rysunek 2: Zmutowane myszy wykazują napady wywołane upałem. (A) Protokół ogrzewania do behawioralnych badań przesiewowych napadów wywołanych upałem u myszy. (B-C) Średnia temperatura ciała myszy w czasie u myszy typu dzikiego (Scn1a+/+ - czarne trójkąty) i heterozygotycznych mutantów (Scn1aKT/+ - pomarańczowe kółka) myszy w dwóch tłach genetycznych odpowiednio 129X1 i B6N. (D) Odsetek myszy wykazujących napady padaczkowe wywołane ciepłem w obu tłach genetycznych. Myszy typu dzikiego (Scn1a+/+) i heterozygotycznego (Scn1aKT/+) są reprezentowane odpowiednio przez czarne i pomarańczowe paski. Heterozygotyczne mutanty w tłach 129X1 i B6N są pokazane odpowiednio w pomarańczowych jednolitych paskach i pomarańczowych paskach z czarnymi paskami. (E) Próg temperatury drgawek dla napadów wywołanych ciepłem u myszy typu dzikiego (Scn1a+/+) i heterozygotycznego mutanta (Scn1aKT/+) w obu szczepach. (F) Rozkład rozproszony maksymalnych wyników Racine'a napadów wywołanych ciepłem wykazywanych przez myszy heterozygotyczne (Scn1aKT / +) w obu tłach genetycznych. Każda kropka reprezentuje maksymalny wynik Racine'a w jednej myszy. Liczba zwierząt w każdym genotypie jest podana w nawiasach. Dane przedstawione w panelach B-F są średnimi ± S.E.M. Ten rysunek jest zmodyfikowany na podstawie rysunku 3 w Das et al., 2021, eNeuro14. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy prosty i skuteczny protokół badań przesiewowych pod kątem występowania napadów wywołanych ciepłem u myszy, behawioralnego odpowiednika napadów gorączkowych u ludzi. Test ocenia kilka parametrów - w tym odsetek myszy wykazujących drgawki, próg drgawkowy, nasilenie napadów w skali Racine'a, w celu porównania wrażliwości grup kontrolnych i testowych myszy na wzrost temperatury ciała.

Krytycznym krokiem w tym protokole jest zwiększenie ciepła w komorze przy jednoczesnym ciągłym monitorowaniu temperatury ciała myszy. Konieczne jest, aby maksymalna temperatura ciała, jakiej doświadczą myszy w tych testach, wynosiła 44 °C, ponieważ zwierzęta typu dzikiego mogą doświadczać napadów wywołanych ciepłem w temperaturze ciała >44 °C. Wstępne leczenie znieczuleniem ogólnym lub środkami przeciwbólowymi może obniżyć temperaturę ciała zwierząt lub zakłócić termoregulację, co z kolei zakłóciłoby gromadzenie danych o temperaturze progu drgawkowego. W związku z tym myszy objęte tym protokołem przesiewowym nie mogły być zaopatrzone w te środki podczas 30-minutowego okna próbnego. Wszystkie procedury muszą zostać zatwierdzone przez komitet IACUC danej instytucji. Aby zapewnić ciągłe monitorowanie temperatury wewnętrznej ciała myszy podczas testu, bezpiecznie przyklej sondę temperatury doodbytnicy do ogona myszy. Jeśli podczas testu okaże się, że temperatura ciała myszy pozostaje niezmieniona przez dłuższy czas, nawet po zwiększeniu temperatury komory myszy, upewnij się, że sonda temperatury w odbycie nie wyszła z myszy lub jest luźno przymocowana do ogona.

Tło genetyczne modeli mysich może wpływać na wrażliwość na mutację SCN1A i napady farmakologicznie wywołane 18,25,26,27. Jak omówiono w powyższych wynikach, tło genetyczne myszy może wpływać na ich podatność na napady wywołane upałem. SCN1a powiedział: Myszy z mutacją K1270T GEFS + testowano w dwóch tłach genetycznych - 129X1 i B6NJ, a niewielki odsetek myszy typu dzikiego (33%) w tle wrażliwym na napady B6NJ również zaobserwowano, że przechodzą napady wywołane ciepłem. Jednak w porównaniu z heterozygotycznymi zmutowanymi myszami Scn1a KT/+, myszy typu dzikiego B6NJ doświadczyły napadów padaczkowych wywołanych ciepłem przy znacznie wyższym progu temperatury. Potwierdza to, że mutacja genetyczna (Scn1a K1270T), która została wprowadzona przez CRISPR knock-in, sprawia, że zmutowane myszy są bardziej podatne na napady wywołane hipertermią.

Istnieje kilka zalet przyjęcia tego protokołu, które podsumowano poniżej. Po pierwsze, w przeciwieństwie do użycia strumienia suchego powietrza lub podgrzewanych lamp, wymuszone powietrze o kontrolowanej temperaturze ustawione w zamkniętej przestrzeni zapewnia eksperymentatorowi większą kontrolę nad nagrzewaniem się areny testowej w pożądanym tempie. Kroki w protokole ogrzewania można łatwo zmodyfikować, aby zwiększyć/zmniejszyć temperaturę początkową, czas trwania każdego kroku itp., Aby przebadać starsze myszy, które są cięższymi lub większymi gryzoniami, takimi jak szczury. Po drugie, ciągłe monitorowanie temperatury ciała myszy za pomocą dołączonej sondy doodbytniczej dostarcza cennych informacji na temat tempa zmian temperatury ciała u poszczególnych myszy podczas całego testu. Pozwala to eksperymentatorowi na dokładną obserwację, że szybkość zmian temperatury u myszy nie przekracza 0,25-0,5 °C/min (co może być stresujące dla zwierząt), podczas adaptacji tego protokołu do innych aren testowych. Co ważne, tempo zmian temperatury ciała w czasie w różnych grupach myszy może rzucić światło na ich zdolność do termoregulacji i może być pomocne w zrozumieniu, czy drgawki gorączkowe powodujące mutacje zmieniają również termoregulację u myszy. Po trzecie, ciągłe monitorowanie temperatury ciała zapewnia, że pomiary temperatury progu drgawkowego przy użyciu tego protokołu są dokładne, ponieważ są rejestrowane jednocześnie z pierwszym atakiem drgawkowym, którego doświadczyła mysz. Jeśli temperatura ciała zwierzęcia nie jest stale monitorowana lub temperatura progu drgawkowego nie jest mierzona po wyjęciu zwierzęcia z areny testowej, wartości progu drgawkowego mogą się różnić ze względu na czas potrzebny na postępowanie z myszami po napadach. Wreszcie, metoda ta omija potrzebę stosowania inwazyjnych metod wywoływania gorączki (poprzez wstrzykiwanie patogenów) u myszy w celu naśladowania drgawek gorączkowych u ludzi.

Jednym z ograniczeń tego protokołu jest to, że trudno jest przebadać młode myszy (w wieku poniżej P30) pod kątem napadów wywołanych upałem. Protokół został opracowany w celu badania przesiewowego wrażliwości dorosłych myszy (P30-P40 i powyżej) na napady wywołane ciepłem lub hipertermią. Z naszego doświadczenia wynika, że młodsze myszy typu dzikiego, zwłaszcza te ważące poniżej 15 g, są bardziej narażone na napady wywołane ciepłem, które mogą być spowodowane słabo rozwiniętymi mechanizmami termoregulacji, fizjologicznym stresem termicznym lub kombinacją obu. W związku z tym nie jest idealnym rozwiązaniem wykonywanie badania przesiewowego napadów wywołanych ciepłem u młodych myszy przy użyciu tego protokołu.

Przyszłe badania, które łączą monitorowanie EEG podczas poddawania myszy napadom wywołanym ciepłem, mogą rzucić światło na wzorce napadów EEG wywołanych upałem, podobnie jak w poprzednim badaniu19. Aktywność neuronalną w określonych obszarach mózgu myszy można śledzić, łącząc podejścia optogenetyczne i badania immunohistochemiczne po pobraniu tkanki mózgowej. Ponadto wpływ restrykcyjnych diet, takich jak dieta ketonowa, na zmniejszenie drgawek gorączkowych można ocenić, poddając myszy karmione keto i normalne myszy karmione karmą protokołowi napadów wywołanych upałem. Podobnie, paradygmaty badań przesiewowych leków na padaczkę mogą zostać opracowane w celu przetestowania i zidentyfikowania potencjalnych leków przeciwpadaczkowych, które łagodzą lub tłumią napady wywołane ciepłem u myszy karmionych lub leczonych lekiem w porównaniu z myszami karmionymi nośnikiem lub kontrolnymi.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Connorowi J. Smithowi za pomoc w budowie dostosowanej do potrzeb myszy komory grzewczej. Dziękujemy za pomoc członkom laboratorium O'Dowd, Lisha Zeng i Andrew Salgado, w standaryzacji protokołu ogrzewania na wczesnych etapach rozwoju testu. Dziękujemy również Danny'emu Benavidesowi i Kumarowi Perinbamowi za nagranie wideo części eksperymentalnej procedury do rękopisu. Praca ta została wsparta grantem NIH (NS083009) przyznanym D.O.D.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wentylator osiowyFarnamAF20-200-120-xx10-3.1Produkty niestandardowe Farnam -Osiowa nagrzewnica z wentylatorem
Cyfrowy regulator temperaturyInkbirdITC-100RHCyfrowy regulator temperatury PID Inkbird ITC-100RH z termoparą K
Mysza sonda temperatury doodbytnicyThermoWorks, Braintree Scientific, IncRET-3Mysza sonda temperatury doodbytnicy z termometrem

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hirtz, D., et al. How common are the 'common' neurologic disorders. Neurology. 68, 326-337 (2007).
  2. Catterall, W. A. Sodium Channel Mutations and Epilepsy. Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies. , Center for Biotechnology Information. US. Internet (2012).
  3. Mantegazza, M., Broccoli, V. SCN 1A /Na V 1.1 channelopathies: Mechanisms in expression systems, animal models, and human iPSC models. Epilepsia. 60, (2019).
  4. Stafstrom, C. E. Persistent Sodium Current and Its Role in Epilepsy. Epilepsy Currents. 7, 15-22 (2007).
  5. Schutte, S. S., Schutte, R. J., Barragan, E. V., O'Dowd, D. K. Model systems for studying cellular mechanisms of SCN1A-related epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115, 1755-1766 (2016).
  6. Wei, F., et al. Ion Channel Genes and Epilepsy: Functional Alteration, Pathogenic Potential, and Mechanism of Epilepsy. Neuroscience Bulletin. 33, 455-477 (2017).
  7. Abou-Khalil, B., et al. Partial and generalized epilepsy with febrile seizures plus and a novel SCN1A mutation. Neurology. 57, 2265-2272 (2001).
  8. Zhang, Y. -H., et al. Genetic epilepsy with febrile seizures plus: Refining the spectrum. Neurology. 89, 1210-1219 (2017).
  9. Patterson, K. P., et al. Enduring memory impairments provoked by developmental febrile seizures are mediated by functional and structural effects of neuronal restrictive silencing factor. Journal of Neuroscience. 37, 3799-3812 (2017).
  10. Rossi, M. A. SCN1A and febrile seizures in mesial temporal epilepsy: An early signal to guide prognosis and treatment. Epilepsy Currents. 14, 189-190 (2014).
  11. Zhang, Y., et al. Altered gut microbiome composition in children with refractory epilepsy after ketogenic diet. Epilepsy Research. 145, 163-168 (2018).
  12. Meng, H., et al. The SCN1A mutation database: Updating information and analysis of the relationships among genotype, functional alteration, and phenotype. Human Mutation. 36, 573-580 (2015).
  13. Cheah, C. S., et al. Specific deletion of NaV1.1 sodium channels in inhibitory interneurons causes seizures and premature death in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 109, 14646-14651 (2012).
  14. Das, A., et al. Interneuron dysfunction in a new mouse model of SCN1A GEFS. eNeuro. , (2021).
  15. Kalume, F., et al. Sudden unexpected death in a mouse model of Dravet syndrome. Journal of Clinical Investigations. 123, 1798-1808 (2013).
  16. Martin, M. S., et al. Altered function of the SCN1A voltage-gated sodium channel leads to gamma-aminobutyric acid-ergic (GABAergic) interneuron abnormalities. Journal of Biological Chemistry. 285, 9823-9834 (2010).
  17. Rubinstein, M., et al. Dissecting the phenotypes of Dravet syndrome by gene deletion. Brain. 138, 2219-2233 (2015).
  18. Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nature Neuroscience. 9, 1142-1149 (2006).
  19. Dutton, S. B. B., et al. Early-life febrile seizures worsen adult phenotypes in Scn1a mutants. Experimental Neurology. 293, 159-171 (2017).
  20. Cheah, C. S., et al. Specific deletion of NaV1.1 sodium channels in inhibitory interneurons causes seizures and premature death in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 109, 14646-14651 (2012).
  21. Oakley, J. C., Cho, A. R., Cheah, C. S., Scheuer, T., Catterall, W. A. Synergistic GABA-enhancing therapy against seizures in a mouse model of Dravet Syndrome. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 345, 215-224 (2013).
  22. Ricobaraza, A., et al. Epilepsy and neuropsychiatric comorbidities in mice carrying a recurrent Dravet syndrome SCN1A missense mutation. Scientific Reports. 9, (2019).
  23. Warner, T. A., Liu, Z., Macdonald, R. L., Kang, J. -Q. Heat induced temperature dysregulation and seizures in Dravet Syndrome/GEFS+ Gabrg2+/Q390X mice. Epilepsy Research. 134, 1-8 (2017).
  24. Eun, B. -L., Abraham, J., Mlsna, L., Kim, M. J., Koh, S. Lipopolysaccharide potentiates hyperthermia-induced seizures. Brain and Behavior. 5, 00348(2015).
  25. Miller, A. R., Hawkins, N. A., McCollom, C. E., Kearney, J. A. Mapping genetic modifiers of survival in a mouse model of Dravet syndrome. Genes Brain and Behavior. 13, 163-172 (2013).
  26. Mistry, A. M., et al. Strain- and age-dependent hippocampal neuron sodium currents correlate with epilepsy severity in Dravet syndrome mice. Neurobiology of Disease. 65, 1-11 (2014).
  27. Ogiwara, I., et al. Nav1.1 localizes to axons of parvalbumin-positive inhibitory interneurons: a circuit basis for epileptic seizures in mice carrying an Scn1a gene mutation. Journal of Neuroscience. 27, 5903-5914 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Modele epilepsji u myszydrgawki gor czkowemutacje SCN1Atemperatura progu drgawkowegokomora grzewczacyfrowy regulator temperaturyskala Racine atest przesiewowy drgawekmonitorowanie temperatury cia a

Powiązane artykuły