Behawioralne badanie przesiewowe napadów wywołanych ciepłem w mysich modelach padaczki

Antara Das; Martin A. Smith; Diane K. O'Dowd

doi:10.3791/62846

Artykuł metodologiczny

Behawioralne badanie przesiewowe napadów wywołanych ciepłem w mysich modelach padaczki

7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62846

⸱

12 lipca 2021

Antara Das¹ , Martin A. Smith² , Diane K. O'Dowd¹

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, ²Department of Anatomy and Neurobiology, University of California

W tym artykule

Podsumowanie

Celem metody jest badanie przesiewowe pod kątem hipertermii lub napadów wywołanych ciepłem w modelach mysich. Protokół opisuje użycie specjalnie zbudowanej komory z ciągłym monitorowaniem temperatury ciała w celu określenia, czy podwyższona temperatura ciała prowadzi do napadów.

Streszczenie

Transgeniczne modele myszy okazały się potężnymi narzędziami w badaniu różnych aspektów ludzkich zaburzeń neurologicznych, w tym epilepsji. Padaczki genetyczne związane z SCN1A obejmują szerokie spektrum zaburzeń napadowych z niepełną penetracją i zmiennością kliniczną. Mutacje SCN1A mogą powodować dużą różnorodność fenotypu napadów, począwszy od prostych, samoograniczających się napadów gorączkowych związanych z gorączką (FS), padaczki genetycznej o umiarkowanym poziomie z drgawkami gorączkowymi plus (GEFS+) do cięższego zespołu Dravet (DS). Chociaż FS są często obserwowane u dzieci w wieku poniżej 6-7 lat, które nie mają padaczki genetycznej, FS u pacjentów z GEFS+ nadal występuje w wieku dorosłym. Tradycyjnie, eksperymentalne FS były indukowane u myszy poprzez wystawienie zwierzęcia na działanie strumienia suchego powietrza lub lamp grzewczych, a tempo zmian temperatury ciała często nie jest dobrze kontrolowane. Tutaj opisujemy zbudowaną na zamówienie komorę grzewczą z frontem z pleksi, która jest wyposażona w cyfrowy regulator temperatury i wentylator elektryczny wyposażony w grzałkę, który może wysyłać ogrzane wymuszone powietrze do areny testowej w sposób kontrolowany temperaturą. Temperatura ciała myszy umieszczonej w komorze, monitorowana za pomocą sondy doodbytniczej, może być podniesiona do 40-42 °C w powtarzalny sposób poprzez zwiększenie temperatury wewnątrz komory. Ciągły monitoring wzrokowy zwierząt w okresie grzewczym wykazuje indukcję napadów wywołanych ciepłem u myszy noszących mutację FS w temperaturze ciała, która nie wywołuje napadów behawioralnych u dzikich rodaków z miotu. Zwierzęta można łatwo wyjąć z komory i umieścić na podkładce chłodzącej, aby szybko przywrócić normalną temperaturę ciała. Metoda ta zapewnia prosty, szybki i powtarzalny protokół badań przesiewowych w kierunku występowania napadów wywołanych ciepłem w mysich modelach padaczki.

Wprowadzenie

Epilepsja, będąca czwartą pod względem częstotliwości występowania grupą zaburzeń neurologicznych w Stanach Zjednoczonych¹, charakteryzuje się brakiem równowagi między pobudzeniem a hamowaniem w OUN, co prowadzi do nawracających napadów. Napady gorączkowe (FS) lub napady związane z gorączką mogą występować w populacji ogólnej, najczęściej u dzieci od 3. miesiąca życia do 6–7 roku życia. Jednak u niektórych osób z mutacjami genetycznymi, najczęściej w genie kanału sodowego, FS mogą utrzymywać się powyżej 7. roku życia, aż do dorosłości. Stan ten określa się jako zespół napadów gorączkowych plus lub FS+. Szybki postęp w sekwencjonowaniu genomu pozwolił na zidentyfikowanie ponad 1300 mutacji w ludzkim genie kanału jonowego sodu SCN1A, co czyni go głównym obszarem mutacji odpowiedzialnych za epilepsję. Mutacje SCN1A zostały powiązane z szerokim spektrum zaburzeń napadowych, w tym z napadami gorączkowymi (FS), genetyczną epilepsją z napadami gorączkowymi plus (GEFS+) oraz zespołem Dravet (DS)²^,³^,⁴^,⁵^,⁶. Około 20% mutacji missense w genie SCN1A prowadzi do GEFS+⁵^,⁷^,⁸. Pediatryczny wywiad w kierunku złożonych lub przedłużających się napadów FS w dzieciństwie może w дальнейшем rozwinąć się w bardziej wyniszczające formy epilepsji, takie jak epilepsja płata skroniowego (TLE)⁹^,¹⁰^,¹¹. Zespół Dravet wynika z mutacji trunkujących lub mutacji powodujących utratę funkcji w genie SCN1A i jest ciężką postacią epilepsji lekoopornej, z dziecięcym początkiem w postaci napadów gorączkowych, które przekształcają się w napady refrakteryjne, często współwystępując z zaburzeniami poznawczymi, rozwojowymi i motorycznymi²^,⁵^,¹². Ponieważ wiele osób z GEFS+ i/lub DS wykazuje napady gorączkowe, opracowanie nowych terapii w celu lepszego zwalczania tych zaburzeń napadowych staje się kwestią kluczową.

Modele zwierzęce epilepsji związanej z SCN1A okazały się nieocenione w charakteryzacji różnych typów napadów (gorączkowych w porównaniu z uogólnionymi) oraz w analizie neuronalnych mechanizmów powstawania napadów¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Choć badanie napadów spontanicznych za pomocą rejestracji EEG/EMG z mózgów gryzoni jest dobrze ugruntowane i stanowi bardzo użyteczne narzędzie, tylko nieliczne badania podjęły próbę odwzorowania napadów gorączkowych w modelach mysich¹⁴^,¹⁶^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³. W poprzednich badaniach, w celu wywołania napadów poprzez hipertermię, stosowano strumień podgrzanego suchego powietrza, cylinder z metakrylanu wyposażony w system termiczny lub lampy grzewcze z kontrolerem temperatury w zamkniętych arenach testowych⁹^,¹⁶^,²¹^,²²^,²³^,²⁴. Aby zwiększyć temperaturę ciała w bardziej kontrolowanym środowisku, w opisanym tutaj protokole zastosowano specjalnie zbudowaną komorę z systemem grzewczym z regulacją temperatury, co pozwoliło na uzyskanie powtarzalnych prędkości wzrostu temperatury ciała myszy znajdującej się wewnątrz komory. Komora grzewcza została wykonana z drewna (długość 40 cm x szerokość 34 cm x wysokość 31 cm) i wyposażona w cyfrowy kontroler temperatury z termoparą typu K. Mały wentylator osiowy z grzałką, zamontowany na tylnym panelu komory, kieruje do jej wnętrza podgrzane powietrze, którego przepływ jest regulowany przez cyfrowy kontroler temperatury. Ten wymuszony system grzania powietrzem umożliwia kontrolowanie tempa wzrostu temperatury w komorze (Rysunek 1A,B). Termopara typu K znajdująca się wewnątrz drewnianej komory grzewczej przesyła sygnał zwrotny do cyfrowego kontrolera temperatury, aby utrzymać stałą temperaturę wewnątrz skrzynki podczas testu. Ustawienie temperatury na cyfrowym kontrolerze temperatury umożliwia wentylatorowi elektrycznemu tłoczenie podgrzanego powietrza przez otwory wentylacyjne, co zapewnia równomierne ogrzanie komory (Rysunek 1A). Przedni panel komory grzewczej stanowi przezroczysta płyta z pleksiglasu, co umożliwia łatwe nagrywanie wideo przeprowadzanych prób.

Do każdego eksperymentu wybrano dorosłe myszy (P30-P40), heterozygotyczne pod kątem mutacji missense w genie SCN1A wywołującej GEFS+, oraz równą liczbę myszy typu dzikiego z tego samego miotu, które służyły jako grupa kontrolna. Zwierzęta obu płci wykorzystane w tych badaniach ważyły co najmniej 15 g, ponieważ myszy typu dzikiego o mniejszej masie były bardziej podatne na drgawki indukowane ciepłem niż cięższe zwierzęta w tym samym wieku. W badaniu pilotażowym zaobserwowano, że zarówno myszy mutanty, jak i typu dzikiego poszukiwały chłodniejszych narożników komory z tyłu i pozostawały w nich przez dłuższy czas. Aby temu zapobiec, efektywna powierzchnia podłogi wewnątrz areny testowej komory grzewczej została zredukowana do wymiarów 16,5 cm długości x 21,5 cm szerokości x 27,5 cm wysokości poprzez umieszczenie drewnianego bloku B (wymiary 20 cm x 8 cm x 7,2 cm) po prawej stronie komory (Rycina 1A). Komora grzewcza została wykonana z przekładki sklejki o grubości 1,9 cm (długość 40 cm x szerokość 34 cm x wysokość 31 cm) pokrytej białym laminatem i wyposażona w cyfrowy kontroler temperatury z termoparą typu K. Laminowana powierzchnia ścian komory jest nieprzepuszczalna i może być łatwo dezynfekowana pomiędzy próbami poprzez przecieranie 70% etanolem. Temperaturę w komorze grzewczej początkowo ustawiono na 50 °C i podgrzewano przez co najmniej 1 h przed rozpoczęciem eksperymentu, aby zapewnić równomierne nagrzanie wnętrza komory. Każda mysz została wyposażona w termometr rektalny do ciągłego monitorowania temperatury ciała podczas całego eksperymentu. Do komory wprowadzano pojedynczo jedną mysz, a temperaturę utrzymywano na poziomie 50 °C od 1^st do 10^th minuty. Następnie temperaturę podniesiono do 55 °C w 11^th-20^th minucie, a na koniec do 60 °C w 21^st-30^th minucie. Przyniosło to powtarzalne tempo wzrostu temperatury ciała myszy (Rycina 2A). Każda próba została zarejestrowana wideo, a analiza behawioralna była przeprowadzana w trybie offline.

Protokół ogrzewania można łatwo zmodyfikować, aby zmienić temperaturę początkową komory grzewczej oraz tempo jej nagrzewania, co z kolei wpływa na szybkość wzrostu temperatury ciała myszy podczas badania. Dzięki temu metoda ta zapewnia większą elastyczność w porównaniu z tradycyjnymi metodami przy opracowywaniu testów behawioralnych obejmujących drgawki indukowane ciepłem. Protokół drgawek indukowanych ciepłem może być również wykorzystany do przesiewania leków przeciwpadaczkowych, które zwiększają odporność myszy mutantów na drgawki indukowane ciepłem lub podnoszą temperaturę progową, przy której obserwuje się drgawki. Podobnie można badać korzystny wpływ ograniczających reżimów dietetycznych, takich jak dieta ketogeniczna, na drgawki indukowane ciepłem, porównując myszy karmione standardową karmą z myszami na diecie ketogenicznej.

Układ komory kontroli termicznej z regulatorem temperatury; schemat przedstawia kierunki przepływu powietrza i ścieżki okablowania.
Rycina 1: Opis zbudowanej na zamówienie komory grzewczej dla myszy. (A) Przedni panel drewnianej komory grzewczej dla myszy przedstawia boczny panel sterowania zawierający przełącznik zasilania (Power ON/OFF), który włącza cyfrowy regulator temperatury, termoparę typu K, przełącznik włącznik/wyłącznik grzejnika z wentylatorem oraz wskaźnik grzania. Wymiary zewnętrzne skrzyni oraz wewnętrznej areny testowej podano w cm. Przedstawiono również drewniany blok B, służący do efektywnej redukcji powierzchni areny testowej. Dno areny testowej wyłożone jest ściółką z kukurydzy, aby zapobiec bezpośredniemu kontaktowi myszy z podgrzanymi drewnianymi powierzchniami. (B) Tylny panel komory grzewczej przedstawia wentylator zamontowany w górnym otworze wentylacyjnym oraz przewód zasilający dostarczający energię elektryczną do komory. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie Ryciny 3 z pracy Das et al., 2021, eNeuro¹⁴. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na University of California, Irvine.

1. Przygotowanie do testu drgawek indukowanych ciepłem

Naciśnij przycisk Power On w komorze grzewczej, a następnie przycisk Heat On.
Ustaw temperaturę komory grzewczej na 50 °C, korzystając z klawiatury cyfrowego sterownika temperatury.
Odczekaj co najmniej 1 h, aby wstępnie podgrzać komorę do 50 °C przed wprowadzeniem do niej pierwszej myszy. Wstępne podgrzanie zapewnia równomierne ogrzewanie wnętrza komory.
Wykłady dno komory grzewczej dla myszy ściółką z kukurydzy.
Zamontuj kamerę wideo przed komorą grzewczą w celu rejestracji każdej próby testu drgawek wywołanych ciepłem.
Wykładaj szalkę Petriego o średnicy 140 mm grubymi warstwami ręczników papierowych i umieść ją na lodzie, aby służyła jako podkładka chłodząca.
UWAGA: Po zakończeniu testu każda mysz zostanie przeniesiona na schłodzoną podkładkę chłodzącą, aby pomóc w obniżeniu podwyższonej temperatury ciała.

2. Przygotowanie myszy do badania drgawek indukowanych ciepłem

Wybierz 10 dorosłych myszy (P30-P40), w tym 5 myszy posiadających mutację wywołującą epilepsję oraz 5 myszy typu dzikiego z tego samego miotu, do testu przesiewowego drgawek indukowanych ciepłem.
UWAGA: Myszy typu dzikiego, które nie posiadają mutacji wywołującej epilepsję, nie wykazują drgawek indukowanych ciepłem w temperaturach poniżej 44 °C i służą jako grupa kontrolna.
Zważ każdą mysz przeznaczoną do testu przesiewowego i zapisz jej masę ciała. Do testu należy używać wyłącznie myszy o masie 15 g lub więcej.
Badaj jedną mysz na raz w komorze cieplnej dla myszy.
Krótko znieczul mysz przez 10-15 s, stosując kilka kropli izofluranu na dnie klosza.
Wyjmij zwierzę z klosza i połóż je na ręczniku papierowym.
Upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona, sprawdzając, czy nie reaguje na bolesne uszczypnięcie palca u stopy.
Pokryj metalową końcówkę sondy do pomiaru temperatury rektalnej środkiem nawilżającym (np. wazeliną) i delikatnie wprowadź ją do odbytu myszy na głębokość mniejszą lub równą 2 cm.
Przymocuj sondę rektalną do ogona myszy za pomocą taśmy, aby sonda nie wypadła podczas testu.
UWAGA: Alternatywnie można umieścić zwierzę w stożku stabilizującym dla myszy i wprowadzić sondę do pomiaru temperatury rektalnej, a następnie przymocować ją taśmą do ogona.
Upewnij się, że sonda rektalna jest podłączona do multimetru, który wyświetla wewnętrzną temperaturę ciała myszy.
Umieść zwierzę w czystej klatce wyłożonej ściółką z kukurydzy, tzw. klatce rekonwalescencyjnej.
Uruchom stoper i odczekaj 5 min. Obserwuj mysz, aż całkowicie wybudzi się z narkozy, stanie się aktywna i zacznie się pielęgnować.
1. Jednocześnie monitoruj temperaturę rdzeniową ciała myszy, aż ustabilizuje się ona na poziomie 35-36 °C.
Po upływie 5 min zanotuj temperaturę ciała myszy. Jest to początkowa temperatura ciała w czasie „0” min.
UWAGA: Jeśli temperatura rdzeniowa ciała myszy jest niższa niż 35 °C, odczekaj dodatkowy czas, aż zwierzę wyjdzie z hipotermii wywołanej znieczuleniem.
Szybko przenieś pojedynczą mysz do wstępnie podgrzanej komory dla myszy. Oznacza to POCZĄTEK próby eksperymentalnej. W danym czasie badana jest tylko jedna mysz.

3. Test drgawek indukowanych ciepłem

Po delikatnym umieszczeniu myszy na dnie wstępnie podgrzanej komory grzewczej dla myszy, należy zamknąć pleksiglasowe drzwiczki i uruchomić kamerę w celu rejestracji wideo eksperymentu.
Uruchom stoper. Rejestruj temperaturę ciała myszy za pomocą termometru rektalnego w odstępach 1-minutowych przez cały czas trwania eksperymentu.
W regularnych odstępach czasu zwiększaj temperaturę w komorze grzewczej dla myszy w taki sposób, aby temperatura ciała myszy wzrastała w tempie 0,25-0.5 °C /min.
UWAGA: Gwałtowne wzrosty temperatury ciała mogą prowadzić do udaru cieplnego lub śmierci i należy ich unikać.
Postępując zgodnie z tym protokołem, należy zwiększyć temperaturę w komorze grzewczej dla myszy o 5 °C co 10 min, jak pokazano w Rycina 2A.
W 9,5 min ustaw temperaturę komory grzewczej na 55 °C, aby ustabilizować temperaturę w komorze grzewczej do 55 °C do 10.^th min, zgodnie z odczytem na cyfrowym wyświetlaczu temperatury.
W podobny sposób zwiększyć temperaturę do 60 °C w 19,5 min, aby ustabilizować temperaturę komory grzewczej do 60 °C do 20. dnia^th min. Każda próba przesiewowa w kierunku napadów trwa 30 min.
Jeśli u myszy wystąpi napad (wokalizacja, kiwanie głową, klonus przednich kończyn, wyprost tylnych kończyn, upadek na bok lub uogólnione drgawki toniczno-kloniczne), należy zapisać następujące informacje.
1. Zapisz temperaturę ciała myszy podczas napadu (temperaturę progu napadowego), odczytaną z termometru rektalnego.
2. Należy zarejestrować charakterystykę zachowań drgawkowych myszy, takich jak kiwanie głową, klonus kończyn przednich, wyprost kończyn tylnych, upadek na bok i/lub uogólnione napady toniczno-kloniczne (GTCS).
Szybko, lecz delikatnie wyjmij mysz z komory i umieść ją na podkładce chłodzącej przygotowanej w kroku 1.6.
UWAGA: W przypadku wystąpienia u myszy drgawek stopnia 5 w skali Racine'a objawiających się niekontrolowanymi skokami, wyjęcie zwierzęcia z komory grzewczej i przeniesienie go na podkładkę chłodzącą na zewnątrz może być utrudnione. Typowy napad drgawek wywołany ciepłem trwa jednak od 30 do 60 s. W związku z tym mysz należy wyjąć z komory grzewczej i umieścić na podkładce chłodzącej w ciągu 60 s od rozpoczęcia epizodu drgawek wywołanych ciepłem.
Należy odczekać, aż temperatura ciała myszy spadnie do 36-37 °Cprzed przeniesieniem go do klatki regeneracyjnej. W klatce regeneracyjnej umieszcza się tylko jedną mysz jednocześnie.
UWAGA: Nie należy mieszać myszy, które nie zostały jeszcze poddane przesiewowej indukcji cieplnej, z myszą, u której przeprowadzono już próbę eksperymentu z drgawkami indukowanymi cieplnie.
Ostrożnie i delikatnie przetnij nożyczkami taśmę znajdującą się między ogonem myszy a przewodem sondy rektalnej, aby usunąć sondę z organizmu myszy.
Przetrzyj metalową końcówkę sondy rektalnej 70% alkoholem i miękkimi chusteczkami, aby przygotować ją do kolejnej próby.
Należy kontynuować obserwację myszy w klatce rekonwalescencyjnej do momentu powrotu do normalnej aktywności (chodzenie, pielęgnacja futra itp.), a następnie przenieść zwierzę z powrotem do klatki macierzystej. Oznacza to ZAKOŃCZENIE próby eksperymentalnej dla tej myszy.
Odnotuj stan zwierzęcia po przeprowadzeniu testu – czy przeżyło i doszło do regeneracji po sesji badawczej, czy też padło. Silne napady drgawek objawiające się niekontrolowanym skakaniem oraz uogólnione napady toniczno-kloniczne mogą czasami prowadzić do śmierci myszy.
Jeśli u myszy nie wystąpią napady indukowane ciepłem w ciągu 30-minutowego okresu obserwacji lub temperatura ciała myszy osiągnie 44 °Cwyjmij mysz z komory grzewczej i umieść ją na podkładce chłodzącej, aż temperatura ciała myszy powróci do 36-37 °C.
Zresetuj temperaturę komory grzewczej dla myszy do 50 °C i pozostawić do wyrównania temperatury, aż na wyświetlaczu cyfrowego regulatora temperatury pojawi się wartość 50 °C.
Wymieniaj ściółkę z kukurydzy pomiędzy poszczególnymi próbami z udziałem myszy.
Przygotować kolejną mysz do badania przesiewowego zgodnie z opisem w sekcji 2 i powtórzyć kroki z sekcji 3.

4. Eutanazja zwierząt

Choć większość zwierząt dochodzi do siebie po napadach wywołanych ciepłem, w naszym doświadczeniu u kilku myszy dochodzi do SUDEP (nagłej nieoczekiwanej śmierci w epilepsji) w klatce domowej w ciągu 24-48 h od wystąpienia napadów wywołanych ciepłem. Po zakończeniu indywidualnego screeningu wszystkich myszy pod kątem napadów wywołanych ciepłem po 30 min próbie, należy uśmiercić wszystkie myszy zgodnie z wytycznymi IACUC danej instytucji.

5. Analiza danych dotyczących napadów wywołanych ciepłem

Po zakończeniu przesiewu kohorty zwierząt, oblicz procent myszy o danym genotypie wykazujących drgawki, korzystając z następującego wzoru:
Oszacuj średnią temperaturę progu drgawek dla myszy o danym genotypie, wyciągając średnią z temperatur progu drgawek wszystkich myszy (odnotowanych w kroku 3.7) w tym genotypie, które wykazują drgawki indukowane ciepłem.
Zachowując ślepą próbę w odniesieniu do tożsamości i genotypu, odtwórz nagrania wideo każdej myszy z przesiewowego testu drgawek indukowanych ciepłem na ekranie komputera, aby ocenić nasilenie napadów drgawek.
Przypisz oceny poszczególnym myszom wykazującym zachowania drgawkowe indukowane ciepłem, korzystając z zmodyfikowanej skali Racine¹³, zgodnie z opisem w poprzednich badaniach¹³^,¹⁴. Szczegóły znajdują się w Tabeli 1.
Jeśli mysz podczas drgawek indukowanych ciepłem wykazuje jedynie potakiwanie głową, przypisz jej ocenę 2. Jeśli mysz rozpoczyna epizod drgawek od potakiwania głową, ale wykazuje również klonus kończyn przednich, upadki i/lub skakanie, przypisz jej ocenę 5.
Zanotuj maksymalną ocenę dla każdej myszy według zmodyfikowanej skali Racine¹³, zgodnie z powyższym opisem.
Wykreśl wykres rozrzutu maksymalnych ocen Racine uzyskanych przez wszystkie myszy o danym genotypie.
Statystycznie porównaj maksymalne oceny Racine pomiędzy różnymi grupami myszy jako metodę określenia nasilenia drgawek behawioralnych, takich jak drgawki indukowane ciepłem.
UWAGA: Oceny Racine są pomocne w porównywaniu charakterystyki drgawek między różnymi grupami myszy mutantów lub genotypami. Przewiduje się, że myszy typu dzikiego nie będą miały drgawek indukowanych ciepłem i nie będą musiały być uwzględniane w porównaniach ocen Racine.
W zależności od projektu eksperymentalnego przeprowadź odpowiednią analizę statystyczną, aby określić, czy procent myszy wykazujących drgawki pomiędzy myszami typu dzikiego a mutantami oraz ich średnie wartości temperatury progu drgawek różnią się od siebie w sposób istotny statystycznie.

Skala Racine'a	Charakterystyka napadów drgawkowych
0	Brak napadów
1	Ruchy ust i twarzy
2	Potakiwanie głową
3	Klonus kończyny przedniej, zazwyczaj jednej kończyny
4	Klonus kończyn przednich z unoszeniem ciała
5	Uogólniony napad drgawkowy w formie toniczno-klonicznej, wstawanie na tylnych łapach, skakanie, upadanie

Tabela 1: Skale Racine'a.

Wyniki

Oczekuje się, że modele zwierzęce z mutacjami predysponującymi do drgawek gorączkowych będą przechodzić napady indukowane ciepłem przy podwyższonej temperaturze ciała, która nie wywołuje drgawek u współrodzeństwa typu dzikiego. Mutacje SCN1A zostały powiązane z drgawkami gorączkowymi, w tym u pacjentów z GEFS+ K1270T, u których występują zarówno gorączkowe, jak i bezgorączkowe napady uogólnione⁷. Przesiewowo badaliśmy myszy z mutacją SCN1A K1270T GEFS+ wygenerowaną metodą CRISPR, opisaną niedawno w badaniu¹⁴, pod kątem występowania drgawek indukowanych ciepłem w dwóch backgroundach genetycznych – opornym na drgawki 129X1/SvJ (129X1) oraz podatnym na drgawki C57BL/NJ (B6N). Grupę kontrolną stanowiły współrodzeństwa typu dzikiego w tym samym wieku, umieszczone w komorze grzewczej dla myszy, które nie posiadają mutacji GEFS+ i w związku z tym nie powinny wykazywać drgawek indukowanych ciepłem. Tempo zmiany temperatury ciała w czasie oceniano poprzez wykreślenie średniej temperatury ciała myszy rejestrowanej w każdej minucie podczas testu. Nie stwierdzono różnic w tempie zmiany temperatury ciała pomiędzy heterozygotycznymi myszami mutantami a współrodzeństwem typu dzikiego w odpowiednich backgroundach genetycznych 129X1 i B6N (Ryc. 2B,C). Sugeruje to, że termoregulacja nie jest zaburzona u heterozygotycznych myszy mutantów K1270T GEFS+.

Wszystkie heterozygotyczne myszy mutanty o tłach genetycznych 129X1 (n = 15) lub B6N (n = 9) wykazywały napady wywołane ciepłem (Rysunek 2D). Żadna z myszy typu dzikiego w wzbogaconym tle 129X1 (n = 13) nie wykazała napadów wywołanych ciepłem (Rysunek 2D). W przeciwieństwie do nich, jedna trzecia badanych myszy (n = 3 z 9 myszy) w wrażliwym na napady tle B6N wykazywała napady wywołane ciepłem. Porównanie statystyczne wykazuje, że odsetek heterozygotycznych myszy mutantów wykazujących napady wywołane ciepłem był znacznie wyższy niż u odpowiadających im myszy typu dzikiego w obu tłach genetycznych 129X1 i B6N (Rysunek 2D, dokładny test Fishera, 129X1 p < 0.0001; B6NJ p = 0.009). Średnia temperatura progu napadowego była podobna u heterozygotycznych myszy mutantów w tłach genetycznych 129X1 i B6N. Myszy mutanty 129X1 mają średnią temperaturę progu napadowego 42.6 ± 0.20 °C, co nie różniło się istotnie od średniej temperatury progu napadowego 42.7 ± 0.06 °C zaobserwowanej u myszy B6N (Rysunek 2E; dwustronny nieparzysty test t Studenta, p = 0.782). Należy zauważyć, że średnia temperatura progu napadowego trzech myszy B6N typu dzikiego, które wykazywały napady wywołane ciepłem, wynosiła 43.7 ± 0.08 °C i była istotnie wyższa od średniego progu napadowego 42.7 ± 0.06 °C wykazanego przez heterozygotyczne myszy mutanty B6N (Rysunek 2E, dwustronny nieparzysty test t Studenta, p < 0.0001).

Pleksiglasowy przód komory umożliwia ciągłe nagrywanie wideo podczas testu, które może zostać wykorzystane później do oceny nasilenia napadów u każdej myszy w zmodyfikowanej skali Racine, zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁴^,²⁰. Podczas typowego testu myszy mutanty heterozygotyczne wykazują wywołane ciepłem napady z wokalizacją i/lub potakiwaniem głową (wynik w skali Racine 2), a następnie szybko przechodzą w klonus kończyn przednich, upadanie na bok, skakanie, wyprost kończyn tylnych i/lub uogólnione napady toniczno-kloniczne (wyniki w skali Racine 3-5), gdy temperatura ciała osiągnie około 42 °C. Maksymalny wynik w skali Racine reprezentuje najcięższe zachowania napadowe wywołane ciepłem wśród myszy mutantów. Maksymalny wynik w skali Racine u myszy mutantów heterozygotycznych w wzbogaconym tle 129X1 (n = 15) nie różni się od wyniku u myszy mutantów heterozygotycznych w tle genetycznym B6N (n = 9) (Rycina 2F; test Manna-Whitneya, p > 0,9999). Sugeruje to, że charakterystyka zachowań napadowych wywołanych ciepłem u myszy mutantów K1270T GEFS+ jest niezależna od tła szczepu.

Wzięte razem, dane te wykazują, że wszystkie myszy mutanty przejawiają napady indukowane ciepłem o podobnej częstotliwości, temperaturze progu napadowego i behawioralnym nasileniu napadów, niezależnie od szczepu. Większość braci i sióstr z grupy typu dzikiego nie wykazuje takich napadów w temperaturze 44 °C lub niższej. Około jedna trzecia myszy kontrolnych typu dzikiego na wrażliwym na napady tle genetycznym B6N przejawiała napady indukowane ciepłem (prawdopodobnie z powodu efektów tła genetycznego), jednak temperatura progu napadowego była znacznie wyższa w porównaniu z myszami mutantami na tym samym tle. Wyniki te sugerują, że myszy mutanty na tle genetycznym B6N są podatne na napady indukowane ciepłem przy niższych progach temperaturowych ze względu na posiadaną mutację SCN1A GEFS+. Zatem, stosując ten protokół, można ocenić napady indukowane ciepłem u mutantów myszy z epilepsją i odróżnić je od myszy typu dzikiego, które albo nie ulegają napadom indukowanym ciepłem, albo wykazują napady cieplne w znacznie wyższych temperaturach.

Równowaga statyczna w eksperymencie dotyczącym napadów wywołanych temperaturą; wykresy, diagram protokołu.
Rysunek 2: Myszy mutanty wykazują napady wywołane ciepłem. (A) Protokół ogrzewania do przesiewowych badań behawioralnych w kierunku napadów wywołanych ciepłem u myszy. (B-C) Średnia temperatura ciała myszy w czasie u myszy typu dzikiego (Scn1a^+/+- czarne trójkąty) i mutantów heterozygotycznych (Scn1a^KT/+- pomarańczowe koła) w dwóch tłach genetycznych, odpowiednio 129X1 i B6N. (D) Procent myszy wykazujących napady wywołane ciepłem w obu tłach genetycznych. Myszy typu dzikiego (Scn1a^+/+) i heterozygotyczne (Scn1a^KT/+) są reprezentowane odpowiednio przez czarne i pomarańczowe słupki. Mutanty heterozygotyczne w tłach 129X1 i B6N przedstawiono odpowiednio jako pomarańczowe słupki jednolite i pomarańczowe słupki z czarnymi paskami. (E) Próg temperatury wywołania napadów u myszy typu dzikiego (Scn1a^+/+) i mutantów heterozygotycznych (Scn1a^KT/+) w obu szczepach. (F) Rozkład punktowy maksymalnych wyników w skali Racine dla napadów wywołanych ciepłem u myszy heterozygotycznych (Scn1a^KT/+) w obu tłach genetycznych. Każda kropka reprezentuje maksymalny wynik Racine u pojedynczej myszy. Liczba zwierząt w każdym genotypie podana jest w nawiasach. Dane przedstawione na panelach B-F to średnia ± S.E.M. Rysunek zmodyfikowano na podstawie Rysunku 3 z pracy Das et al., 2021, eNeuro¹⁴. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Opisujemy prosty i skuteczny protokół badań przesiewowych pod kątem występowania napadów wywołanych ciepłem u myszy, behawioralnego odpowiednika napadów gorączkowych u ludzi. Test ocenia kilka parametrów - w tym odsetek myszy wykazujących drgawki, próg drgawkowy, nasilenie napadów w skali Racine'a, w celu porównania wrażliwości grup kontrolnych i testowych myszy na wzrost temperatury ciała.

Krytycznym krokiem w tym protokole jest zwiększenie ciepła w komorze przy jednoczesnym ciągłym monitorowaniu temperatury ciała myszy. Konieczne jest, aby maksymalna temperatura ciała, jakiej doświadczą myszy w tych testach, wynosiła 44 °C, ponieważ zwierzęta typu dzikiego mogą doświadczać napadów wywołanych ciepłem w temperaturze ciała >44 °C. Wstępne leczenie znieczuleniem ogólnym lub środkami przeciwbólowymi może obniżyć temperaturę ciała zwierząt lub zakłócić termoregulację, co z kolei zakłóciłoby gromadzenie danych o temperaturze progu drgawkowego. W związku z tym myszy objęte tym protokołem przesiewowym nie mogły być zaopatrzone w te środki podczas 30-minutowego okna próbnego. Wszystkie procedury muszą zostać zatwierdzone przez komitet IACUC danej instytucji. Aby zapewnić ciągłe monitorowanie temperatury wewnętrznej ciała myszy podczas testu, bezpiecznie przyklej sondę temperatury doodbytnicy do ogona myszy. Jeśli podczas testu okaże się, że temperatura ciała myszy pozostaje niezmieniona przez dłuższy czas, nawet po zwiększeniu temperatury komory myszy, upewnij się, że sonda temperatury w odbycie nie wyszła z myszy lub jest luźno przymocowana do ogona.

Tło genetyczne modeli mysich może wpływać na wrażliwość na mutację SCN1A i napady farmakologicznie wywołane 18,25,26,27. Jak omówiono w powyższych wynikach, tło genetyczne myszy może wpływać na ich podatność na napady wywołane upałem. SCN1a powiedział: Myszy z mutacją K1270T GEFS + testowano w dwóch tłach genetycznych - 129X1 i B6NJ, a niewielki odsetek myszy typu dzikiego (33%) w tle wrażliwym na napady B6NJ również zaobserwowano, że przechodzą napady wywołane ciepłem. Jednak w porównaniu z heterozygotycznymi zmutowanymi myszami ^{Scn1a KT/+}, myszy typu dzikiego B6NJ doświadczyły napadów padaczkowych wywołanych ciepłem przy znacznie wyższym progu temperatury. Potwierdza to, że mutacja genetyczna (Scn1a K1270T), która została wprowadzona przez CRISPR knock-in, sprawia, że zmutowane myszy są bardziej podatne na napady wywołane hipertermią.

Istnieje kilka zalet przyjęcia tego protokołu, które podsumowano poniżej. Po pierwsze, w przeciwieństwie do użycia strumienia suchego powietrza lub podgrzewanych lamp, wymuszone powietrze o kontrolowanej temperaturze ustawione w zamkniętej przestrzeni zapewnia eksperymentatorowi większą kontrolę nad nagrzewaniem się areny testowej w pożądanym tempie. Kroki w protokole ogrzewania można łatwo zmodyfikować, aby zwiększyć/zmniejszyć temperaturę początkową, czas trwania każdego kroku itp., Aby przebadać starsze myszy, które są cięższymi lub większymi gryzoniami, takimi jak szczury. Po drugie, ciągłe monitorowanie temperatury ciała myszy za pomocą dołączonej sondy doodbytniczej dostarcza cennych informacji na temat tempa zmian temperatury ciała u poszczególnych myszy podczas całego testu. Pozwala to eksperymentatorowi na dokładną obserwację, że szybkość zmian temperatury u myszy nie przekracza 0,25-0,5 °C/min (co może być stresujące dla zwierząt), podczas adaptacji tego protokołu do innych aren testowych. Co ważne, tempo zmian temperatury ciała w czasie w różnych grupach myszy może rzucić światło na ich zdolność do termoregulacji i może być pomocne w zrozumieniu, czy drgawki gorączkowe powodujące mutacje zmieniają również termoregulację u myszy. Po trzecie, ciągłe monitorowanie temperatury ciała zapewnia, że pomiary temperatury progu drgawkowego przy użyciu tego protokołu są dokładne, ponieważ są rejestrowane jednocześnie z pierwszym atakiem drgawkowym, którego doświadczyła mysz. Jeśli temperatura ciała zwierzęcia nie jest stale monitorowana lub temperatura progu drgawkowego nie jest mierzona po wyjęciu zwierzęcia z areny testowej, wartości progu drgawkowego mogą się różnić ze względu na czas potrzebny na postępowanie z myszami po napadach. Wreszcie, metoda ta omija potrzebę stosowania inwazyjnych metod wywoływania gorączki (poprzez wstrzykiwanie patogenów) u myszy w celu naśladowania drgawek gorączkowych u ludzi.

Jednym z ograniczeń tego protokołu jest to, że trudno jest przebadać młode myszy (w wieku poniżej P30) pod kątem napadów wywołanych upałem. Protokół został opracowany w celu badania przesiewowego wrażliwości dorosłych myszy (P30-P40 i powyżej) na napady wywołane ciepłem lub hipertermią. Z naszego doświadczenia wynika, że młodsze myszy typu dzikiego, zwłaszcza te ważące poniżej 15 g, są bardziej narażone na napady wywołane ciepłem, które mogą być spowodowane słabo rozwiniętymi mechanizmami termoregulacji, fizjologicznym stresem termicznym lub kombinacją obu. W związku z tym nie jest idealnym rozwiązaniem wykonywanie badania przesiewowego napadów wywołanych ciepłem u młodych myszy przy użyciu tego protokołu.

Przyszłe badania, które łączą monitorowanie EEG podczas poddawania myszy napadom wywołanym ciepłem, mogą rzucić światło na wzorce napadów EEG wywołanych upałem, podobnie jak w poprzednim badaniu¹⁹. Aktywność neuronalną w określonych obszarach mózgu myszy można śledzić, łącząc podejścia optogenetyczne i badania immunohistochemiczne po pobraniu tkanki mózgowej. Ponadto wpływ restrykcyjnych diet, takich jak dieta ketonowa, na zmniejszenie drgawek gorączkowych można ocenić, poddając myszy karmione keto i normalne myszy karmione karmą protokołowi napadów wywołanych upałem. Podobnie, paradygmaty badań przesiewowych leków na padaczkę mogą zostać opracowane w celu przetestowania i zidentyfikowania potencjalnych leków przeciwpadaczkowych, które łagodzą lub tłumią napady wywołane ciepłem u myszy karmionych lub leczonych lekiem w porównaniu z myszami karmionymi nośnikiem lub kontrolnymi.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Connorowi J. Smithowi za pomoc w budowie dostosowanej do potrzeb myszy komory grzewczej. Dziękujemy za pomoc członkom laboratorium O'Dowd, Lisha Zeng i Andrew Salgado, w standaryzacji protokołu ogrzewania na wczesnych etapach rozwoju testu. Dziękujemy również Danny'emu Benavidesowi i Kumarowi Perinbamowi za nagranie wideo części eksperymentalnej procedury do rękopisu. Praca ta została wsparta grantem NIH (NS083009) przyznanym D.O.D.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wentylator osiowy	Farnam	AF20-200-120-xx10-3.1	Produkty niestandardowe Farnam -Osiowa nagrzewnica z wentylatorem
Cyfrowy regulator temperatury	Inkbird	ITC-100RH	Cyfrowy regulator temperatury PID Inkbird ITC-100RH z termoparą K
Mysza sonda temperatury doodbytnicy	ThermoWorks, Braintree Scientific, Inc	RET-3	Mysza sonda temperatury doodbytnicy z termometrem

Bibliografia

Hirtz, D., et al. How common are the 'common' neurologic disorders. Neurology. 68, 326-337 (2007).
Catterall, W. A. Sodium Channel Mutations and Epilepsy. Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies. , Center for Biotechnology Information. US. Internet (2012).
Mantegazza, M., Broccoli, V. SCN 1A /Na V 1.1 channelopathies: Mechanisms in expression systems, animal models, and human iPSC models. Epilepsia. 60, (2019).
Stafstrom, C. E. Persistent Sodium Current and Its Role in Epilepsy. Epilepsy Currents. 7, 15-22 (2007).
Schutte, S. S., Schutte, R. J., Barragan, E. V., O'Dowd, D. K. Model systems for studying cellular mechanisms of SCN1A-related epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115, 1755-1766 (2016).
Wei, F., et al. Ion Channel Genes and Epilepsy: Functional Alteration, Pathogenic Potential, and Mechanism of Epilepsy. Neuroscience Bulletin. 33, 455-477 (2017).
Abou-Khalil, B., et al. Partial and generalized epilepsy with febrile seizures plus and a novel SCN1A mutation. Neurology. 57, 2265-2272 (2001).
Zhang, Y. -H., et al. Genetic epilepsy with febrile seizures plus: Refining the spectrum. Neurology. 89, 1210-1219 (2017).
Patterson, K. P., et al. Enduring memory impairments provoked by developmental febrile seizures are mediated by functional and structural effects of neuronal restrictive silencing factor. Journal of Neuroscience. 37, 3799-3812 (2017).
Rossi, M. A. SCN1A and febrile seizures in mesial temporal epilepsy: An early signal to guide prognosis and treatment. Epilepsy Currents. 14, 189-190 (2014).
Zhang, Y., et al. Altered gut microbiome composition in children with refractory epilepsy after ketogenic diet. Epilepsy Research. 145, 163-168 (2018).
Meng, H., et al. The SCN1A mutation database: Updating information and analysis of the relationships among genotype, functional alteration, and phenotype. Human Mutation. 36, 573-580 (2015).
Cheah, C. S., et al. Specific deletion of NaV1.1 sodium channels in inhibitory interneurons causes seizures and premature death in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 109, 14646-14651 (2012).
Das, A., et al. Interneuron dysfunction in a new mouse model of SCN1A GEFS. eNeuro. , (2021).
Kalume, F., et al. Sudden unexpected death in a mouse model of Dravet syndrome. Journal of Clinical Investigations. 123, 1798-1808 (2013).
Martin, M. S., et al. Altered function of the SCN1A voltage-gated sodium channel leads to gamma-aminobutyric acid-ergic (GABAergic) interneuron abnormalities. Journal of Biological Chemistry. 285, 9823-9834 (2010).
Rubinstein, M., et al. Dissecting the phenotypes of Dravet syndrome by gene deletion. Brain. 138, 2219-2233 (2015).
Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nature Neuroscience. 9, 1142-1149 (2006).
Dutton, S. B. B., et al. Early-life febrile seizures worsen adult phenotypes in Scn1a mutants. Experimental Neurology. 293, 159-171 (2017).
Cheah, C. S., et al. Specific deletion of NaV1.1 sodium channels in inhibitory interneurons causes seizures and premature death in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 109, 14646-14651 (2012).
Oakley, J. C., Cho, A. R., Cheah, C. S., Scheuer, T., Catterall, W. A. Synergistic GABA-enhancing therapy against seizures in a mouse model of Dravet Syndrome. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 345, 215-224 (2013).
Ricobaraza, A., et al. Epilepsy and neuropsychiatric comorbidities in mice carrying a recurrent Dravet syndrome SCN1A missense mutation. Scientific Reports. 9, (2019).
Warner, T. A., Liu, Z., Macdonald, R. L., Kang, J. -Q. Heat induced temperature dysregulation and seizures in Dravet Syndrome/GEFS+ Gabrg2+/Q390X mice. Epilepsy Research. 134, 1-8 (2017).
Eun, B. -L., Abraham, J., Mlsna, L., Kim, M. J., Koh, S. Lipopolysaccharide potentiates hyperthermia-induced seizures. Brain and Behavior. 5, 00348(2015).
Miller, A. R., Hawkins, N. A., McCollom, C. E., Kearney, J. A. Mapping genetic modifiers of survival in a mouse model of Dravet syndrome. Genes Brain and Behavior. 13, 163-172 (2013).
Mistry, A. M., et al. Strain- and age-dependent hippocampal neuron sodium currents correlate with epilepsy severity in Dravet syndrome mice. Neurobiology of Disease. 65, 1-11 (2014).
Ogiwara, I., et al. Nav1.1 localizes to axons of parvalbumin-positive inhibitory interneurons: a circuit basis for epileptic seizures in mice carrying an Scn1a gene mutation. Journal of Neuroscience. 27, 5903-5914 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Modele epilepsji u myszy drgawki gor czkowe mutacje SCN1A temperatura progu drgawkowego komora grzewcza cyfrowy regulator temperatury skala Racine a test przesiewowy drgawek monitorowanie temperatury cia a

Behawioralne badanie przesiewowe napadów wywołanych ciepłem w mysich modelach padaczki