Artykuł metodologiczny

Bezwzględna ocena ilościowa pirofosforanów inozytolu za pomocą elektroforezy kapilarnej Spektrometria mas z jonizacją elektrorozpylania

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62847

⸱

13 sierpnia 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Organic Chemistry, University of Freiburg, 2Medical Research Council, Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano procedurę elektroforezy kapilarnej, spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania do bezwzględnego oznaczania ilościowego pirofosforanów inozytolu z ekstraktów komórkowych ssaków.

Streszczenie

Pirofosforany inozytolu (PP-InsPs) to ważna grupa wewnątrzkomórkowych cząsteczek sygnałowych. Cząsteczki te, pochodzące z fosforanów inozytolu (InsP), charakteryzują się obecnością co najmniej jednej wysokoenergetycznej cząstki pirofosforanowej na pierścieniu mio-inozytolu. Występują one powszechnie u eukariontów i działają jako przekaźniki metaboliczne badające homeostazę fosforanów, wrażliwość na insulinę i ładunek energii komórkowej. Ze względu na brak chromoforu w tych metabolitach, bardzo dużą gęstość ładunku i niską liczebność, ich analiza wymaga radioaktywnego znacznika, a co za tym idzie, jest zawiła i kosztowna. W tym miejscu w badaniu przedstawiono szczegółowy protokół wykonywania bezwzględnego i wysokoprzepustowego oznaczania ilościowego pirofosforanów inozytolu z komórek ssaków za pomocą elektroforezy kapilarnej z jonizacją elektrorozpylaną spektrometrii mas (CE-ESI-MS). Metoda ta umożliwia czułe profilowanie wszystkich biologicznie istotnych gatunków PP-InsP w komórkach ssaków, umożliwiając wyjściową separację regioizomerów. Przedstawiono bezwzględne stężenia komórkowe PP-InsP, w tym mniejszych izomerów, oraz monitorowanie ich zmian czasowych w komórkach HCT116 w kilku warunkach eksperymentalnych.

Wprowadzenie

Od czasu pierwszego odkrycia pirofosforanów mio-inozytolu (PP-InsPs) w 1993 roku1,2, poczyniono znaczne postępy w wyjaśnianiu ich biosyntezy, obrotu i funkcji3. Pirofosforany inozytolu występują wszechobecnie w komórkach eukariotycznych4 i służą jako metaboliczne cząsteczki sygnałowe krytycznie zaangażowane np. w homeostazę fosforanów5,6, insulina sensitivity7, oscylacje wapnia8,9, transport pęcherzykowy10, apoptoza11, naprawa DNA12, immune signalling13, i inne. Mnogość ważnych procesów pod kontrolą pirofosforanów inozytolu wymaga głębszego zrozumienia ich obfitości komórkowej, fluktuacji i lokalizacji.

Chociaż InsP i PP-InsP przyciągały uwagę różnych dyscyplin, analiza ich obfitości jest rutynowo przeprowadzana przy użyciu metody opracowanej w latach 80-tych, polegającej na znakowaniu komórek trytiowanym inozytolem, rozpuszczaniu wyekstrahowanych PP-InsP za pomocą silnej chromatografii anionowymiennej Sax-HPLC z późniejszym zliczaniem scyntylacyjnym. Nowsze metody oparte na spektrometrii mas nadal stoją przed poważnymi wyzwaniami: pirofosforany inozytolu z maksymalnie ośmioma jednostkami fosforanowymi zawierają estry fosforanowe i bezwodniki, co prowadzi do znacznego ładunku ujemnego i potencjalnej utraty fosforanów podczas jonizacji. U ssaków występują cztery główne typy PP-InsP (Rysunek 1): 1,5-(PP)2-InsP 4 (lub 1,5-InsP8), 5-PP-InsP5 (lub 5-InsP7), 1-PP-InsP5 (lub 1-InsP7) i 5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 (lub 5-PP-InsP4)3,14. Fizjologiczne poziomy PP-InsP mieszczą się zazwyczaj w zakresie od nano- do niskomikromolowych, przy czym 5-PP-InsP5 jest najliczniejszy ze stężeniami komórkowymi 0,5 - 5 μM. Uważa się, że 1,5-(PP)2-InsP 4 i 1-PP-InsP5 stanowią do około 10% puli 5-PP-InsP5 i pozostają trudne do wyśledzenia w wielu komórkach15. 5-PP-InsP4 z wolną grupą OH jest jeszcze mniej obfity i zwykle staje się wykrywalny tylko wtedy, gdy hydrolazy fosforanowe są hamowane fluorkiem sodu (NaF)16.

Wysoka gęstość ładunku PP-InsP utrudnia ich separację, a występowanie regioizomerów PP-InsP dodatkowo komplikuje te wysiłki. W rezultacie, większość eksperymentów opierała się na oznaczaniu ilościowym poprzez metaboliczne znakowanie radioaktywne komórek przy użyciu [3H]-inozytolu, ponieważ tło z matrycy jest wykluczone i osiąga się wysoką czułość17,18. Metoda ta jest jednak kosztowna, czasochłonna i nie pozwala na prawidłowe rozróżnienie pokrewnych regioizomerów PP-InsP. Co więcej, znakowanie [3H]-inozytolem nie uwzględnia endogennej syntezy inozytolu z glukozy. Metoda oparta na elektroforezie w żelu poliakrylamidowym (PAGE) jest szeroko stosowaną, niedrogą alternatywą, ale ograniczoną czułością19,20,21,22. Opublikowano inne podejścia unikające znakowania radioaktywnego, w tym chromatografię jonową, po której następuje detekcja UV po derywatyzacji kolumnowej23, chromatografia oddziaływań hydrofilowych (HILIC)24 lub słaba wymiana anionów (WAX) sprzężona ze spektrometrią mas (MS)25. Nie dorównują one jednak (jeszcze) klasycznemu protokołowi [3H]-inozytolowi SAX-HPLC.

Niedawno, spektrometria mas z jonizacją elektrorozpylania metodą elektroforezy kapilarnej (CE-ESI-MS) została wprowadzona jako transformacyjna strategia analizy metabolizmu InsPs i PP-InsP, spełniająca wszystkie wymagania omówione powyżej16. W połączeniu z aktualną, najnowocześniejszą ekstrakcją InsP kwasem nadchlorowym, a następnie wzbogaceniem w kulki dwutlenku tytanu26, projekt CE-ESI-MS odniósł sukces we wszystkich testowanych do tej pory organizmach, od drożdży po rośliny i ssaki. Z łatwością udało się osiągnąć jednoczesne profilowanie InsP i PP-InsP, w tym wszystkich możliwych regioizomerów. Wzorce wewnętrzne znakowane stabilnymi izotopami (SIL) umożliwiły szybkie i precyzyjne bezwzględne oznaczanie ilościowe, niezależnie od efektów matrycy. Ponieważ stwardnienie rozsiane może wychwytywać izotopowe różnice masowe, CE-ESI-MS może być również stosowany do badania podzielonych na przedziały szlaków syntezy komórkowej InsP i PP-InsP, np. poprzez karmienie komórek [13C6]-mio-inozytolem lub [13C6]-D-glukozą.

Opisany tutaj jest szczegółowy protokół krok po kroku do bezwzględnego oznaczania ilościowego PP-InsP i InsP z komórek ssaków przez CE-ESI-MS. Oprócz głównego izomeru 5-PP-InsP5, w tym badaniu oznaczono również ilościowo 1,5-(PP)2-InsP 4 i 1-PP-InsP5, pomimo ich mniejszej liczebności. Badane są dwie linie komórkowe HCT116 z różnych laboratoriów (NIH, UCL) i potwierdzono, że komórki HCT116UCL zawierają 7-krotnie wyższe poziomy 1,5-(PP)2-InsP 4 niż znalezione w HCT116NIH, podczas gdy stężenia 5-PP-InsP5 są porównywalne. Ponadto synteza 1-PP-InsP5 w HCT116UCL nie jest istotnie zwiększona. Ilościowo badany jest również wzrost poziomów PP-InsP poprzez blokowanie ich defosforylacji za pomocą fluorku sodu.

Protokół

1. Konfiguracja systemu CE-ESI-MS

  1. Skonfiguruj system CE-ESI-MS składający się z komercyjnego systemu CE i potrójnego kwadrupolowego tandemowego spektrometru masowego, wyposażonego w źródło jonizacji elektronrozpylania (ESI) Agilent Jet Stream (AJS). Wymagany jest zestaw opryskiwacza CE-ESI-MS i izokratyczna pompa LC (chromatografia cieczowa).
  2. Podłącz rozdzielacz przepływu w osłonie 1:100 (dołączony do zestawu opryskiwacza CE-MS) i wylot pompy izokratycznej LC.
  3. Upewnij się, że fiolka wlotowa systemu CE znajduje się na tej samej wysokości co końcówka rozpylacza analizatora masy.
  4. Wykorzystaj stację roboczą MassHunter (wersja 10.1) lub porównywalne oprogramowanie MS do sterowania całym systemem oraz do akwizycji i analizy danych.

2. Przygotowanie bufora, kapilary i systemu CE-MS

  1. Przygotować bufor do pracy CE: Dostosować pH 40 mM octanu amonu do 9,0 za pomocą wodorotlenku amonu. Zalecana jest kolba miarowa o pojemności 250 ml. Przefiltruj 250 ml buforu za pomocą filtrów membranowych o wielkości porów 0,2 μm. Upewnij się, że używasz wyłącznie ultraczystej wody dejonizowanej i odczynników klasy MS.
    UWAGA: Ten bufor może być przechowywany w temperaturze pokojowej przez 2-3 tygodnie lub przez kilka miesięcy w lodówce.
  2. Przygotuj płyn do osłony: Wymieszaj 100 ml ultraczystej wody i 100 ml izopropanolu klasy LC-MS w butelce o pojemności 250 ml. Zmieniaj płyn do osłonki co najmniej raz w tygodniu. Dodaj odniesienie masy do cieczy osłonowej przy użyciu spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości.
  3. Zainstalować płyn do osłony: Przedmuchiwać z prędkością 5 ml/min przez 5 minut i ustawić natężenie przepływu na 1 ml/min (10 μl/min do opryskiwacza CE-MS). Ciśnienie pompy będzie wynosić ok. 180 bar. Upewnij się, że rurka do recyklingu łączy się z powrotem z butelką z płynem w osłonie, aby ponownie użyć rozpuszczalnika.
  4. Przygotowanie kapilary: Kup kapilarnę CE-MS (średnica wewnętrzna 50 μm i średnica zewnętrzna 365 μM o długości 125 cm) z okienkiem wykrywania promieniowania UV. Użytkownik może również nabyć znacznie tańsze kapilary krzemionkowe z topioną sztabką u wyspecjalizowanych dystrybutorów. Wytnij kapilatę o długości 100 cm. Prawidłowo odetnij oba końce kapilar za pomocą noża do kolumn kapilarnych z obrotowym ostrzem diamentowym i usuń zapalniczką 2-3 cm powłoki poliimidowej z obu końców. Oczyść powierzchnię kapilary izopropanolem.
  5. Zainstaluj kapilarę: Dopasuj kapilarnę do kasety CE-MS. Kliknij przycisk Zmień kasetę i zainstaluj kasetę w urządzeniu CE. Koniec wlotowy kapilary znajduje się około 2 mm niżej niż elektroda. Upewnij się, że koniec wlotowy znajduje się niżej niż powierzchnia próbki podczas procesu wstrzykiwania.
  6. Aktywuj kapilarę: Przed pierwszym użyciem przepłukać kapilę 1 M NaOH, następnie wodą przez 10 minut i buforem CE przez 15 min.
  7. Włóż końcówkę kapilary do opryskiwacza CE-MS: Delikatnie włóż kapilę do opryskiwacza CE-MS i upewnij się, że końcówka kapilarna wystaje około 0.1 mm z końcówki opryskiwacza. Upewnij się, że dokonałeś precyzyjnej regulacji końcówki wylotu kapilary za pomocą szkła powiększającego i regulacyjnej w opryskiwaczu. Włóż opryskiwacz z powrotem do źródła jonów i unikaj dotykania regulacyjnej. Podczas wykonywania tej operacji MS jest w trybie czuwania.
  8. Sprawdź spray ESI: Sprawdź stabilność opryskiwacza ESI w trybie pełnego skanowania. Wahania elektroferogramów jonów całkowitych muszą mieścić się w granicach 5%.
  9. Wykonaj test z wzorcami InsP: Zastosuj mieszaninę 2 μM InsP 3-InsP8 (skorygowanych ilościowo 31P NMR15,27) dla prób z wtryskiem przy 50 mbar przez 10 s (10 nL). Ustawić szczegółowe parametry ESI i MS, jak pokazano w tabeli 1. Prąd CE wynosi ok. 26 μA. Szerokość piku wynosi około 0,4-0,5 min. Upewnij się, że stosunek sygnału do szumu osiąga co najmniej 400.

3. Ekstrakcja rozpuszczalnych fosforanów inozytolu z komórek ssaków

UWAGA: Komórki HCT116NIH były miłym prezentem od Stephena Shearsa28. KomórkiUCL HCT116 pochodziły z klasy Lab26.

  1. Komórki wysiewające
    1. Hodowla komórek HCT116NIH lub HCT116UCL w kolbach T75 w temperaturze 37 °C w atmosferze CO2 o wysokiej wilgotności 5% (zwanej dalej warunkami standardowymi) w zmodyfikowanym pożywce orła (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
    2. Przemyć kultury podstawowe HCT116NIH i HCT116UCL solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) (5 ml) i inkubować komórki z kwasem trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) (3 ml, 0,25%) w standardowych warunkach, aż do całkowitego odłączenia. Zmniejsz aktywność trypsyny, dodając pożywkę (7 ml), zbierz komórki do probówki wirówkowej i odwiruj (200 x g, 3 min).
    3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce (10 ml). Policz komórki i określ żywotność poprzez wykluczenie błękitu trypanowego.
    4. Wysiewaj komórki (6 milionów komórek HCT116 na test) do naczynia o średnicy 150 mm i dostosuj łącznie 20 ml pożywki do hodowli komórkowych. Przed wysiewem należy wymieszać pożywkę i komórki w probówce wirówkowej, aby uzyskać równomierne rozmieszczenie komórek w naczyniu. Przygotuj równoległe danie, gdy wymagana jest normalizacja według liczby komórek.
    5. Hodować komórki w standardowych warunkach przez 72 godziny. Komórki osiągną około 80%-90% konfluencji.
  2. Modulacja poziomu fosforanu inozytolu za pomocą NaF i pobieranie komórek
    1. Zabieg NaF: Dodać NaF (10 mM) na 1 godzinę przed zbiorem do pożywki. Wymieszać pożywkę, obracając płytkę/pipetując i inkubować komórki przez 60 minut w normalnych warunkach.
    2. Po poddaniu działaniu NaF należy usunąć pożywkę z komórek i umieścić komórki na lodzie.
    3. Umyj komórki dwukrotnie PBS (5 ml, 4 °C) i całkowicie wyjmij PBS z naczynia.
    4. Dodać kwas nadchlorowy (PA) (1 ml, 1 M, 4 °C). Upewnij się, że pokryłeś całą powierzchnię PA (komórki zmienią kolor na biały, gdy białka się wytrącą). Inkubować komórki przez 10 minut na stole uchylnym w temperaturze 4 °C.
    5. Zebrać PA do probówki wirówkowej i usunąć zanieczyszczenia przez odwirowanie (17 000 x g, 5 min, 4 °C). Dodaj supernatant do przygotowanych kulek TiO2 w celu ściągnięcia InsP.
    6. Umyj naczynie poekstrakcyjne dwukrotnie PBS (5 ml, r.t.) w celu odkwaszenia; całkowicie usuń PBS z naczynia.
    7. Rozpuścić białka na płytce przez dodanie buforu do lizy komórek (1,5 ml, r.t.; 0,1% dodecylosiarczanu sodu [SDS] w 0,1 M NaOH). Inkubuj naczynie przez 15 minut na uchylnym stole w temperaturze r.t. Przenieść lizat komórkowy do probówki wirówkowej i odwirować (17 000 x g, 5 min, 4 °C). Przechowywać supernatant w temperaturze -80 °C do czasu oznaczenia stężenia białka za pomocą testu białka DC przy użyciu albuminy surowicy bydlęcej jako wzorca kalibracyjnego (zwykle jedna szalka o średnicy 150 mm zawiera około 10 mg białka).
    8. Oznaczanie liczby komórek z szalek równoległych: Zebrać komórki z naczynia równoległego za pomocą trypsyny, jak opisano w kroku 3.1.2 (użyć 5 ml trypsyny-EDTA na szalkę o średnicy 150 mm) i usunąć pożywkę. Ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS (5 ml), odpowiednio wymieszać i policzyć komórki. Wykonaj ten krok tuż przed zbiorem poprzez bezpośrednie hartowanie, aby uzyskać reprezentatywną liczbę komórek. Dodatkowo należy zmierzyć objętość komórek odpowiednią metodą (np. za pomocą maszyny wielofunkcyjnej).
  3. TiO2 Wzbogacanie fosforanów inozytolu
    UWAGA: Aby uniknąć kwaśnego rozkładu związków ufosforylowanych, należy wykonać wszystkie etapy wzbogacania aż do elucji na lodzie i schłodzić wszystkie odczynniki do temperatury 4 °C. Skróć czas ekstrakcji do minimum (1,5-2 h). Wykonaj wszystkie etapy ekstrakcji za pomocą 1 M PA.
    1. Przygotowanie kulek: Przemyć2 kulki TiO (5 mg na próbkę) za pomocą ddH2O (1 ml) i odwirować (3 500 x g, 1 min, 4 °C). Usuń ddH2O i umyj kulki PA (1 ml). Usunąć PA przez odwirowanie (3 500 x g, 1 min, 4 °C). Zawiesić kulki w PA (50 μl na próbkę).
    2. Dodać sklarowany nad osadem zawierający związki ufosforylowane (porównać ppkt 3.2, krok 3.2.5) do zawiesiny kulek, odwirować, a następnie obracać próbkę przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Odwirować próbkę (3 500 x g, 1 min, 4 °C) i odrzucić supernatant. Umyć kulki PA (500 μl) i odwirować (3 500 x g, 1 min, 4 °C). Wyrzucić supernatant i powtórzyć etap mycia.
    4. Dodać NH4OH (200 μL, 3%) do kulek i ponownie zawiesić. Obracać próbkę przez 5 minut w temperaturze rt.
    5. Odwirować próbkę (3 500 x g, 1 min) i przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej.
    6. Powtórzyć etapy elucji 3.3.4 i 3.3.5 i połączyć eluenty. Wyrzuć koraliki.
    7. Odwirować połączone eluenty (17 000 x g, 1 min, 4 °C) w celu usunięcia wszelkich nierozpuszczalnych pozostałości.
    8. Całkowicie wysuszyć supernatant w odparowywaniu próżniowym (70 min, 60 °C, V-AQ). Dodać ddH2O (50 μL) do suszonych ekstraktów zawierających InsPs. Wirować, aby wymieszać próbkę aż do całkowitego rozpuszczenia. Przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C do czasu analizy CE-ESI-MS.

4. Wykonywanie przebiegów CE-ESI-MS

  1. Przygotować mieszaninę wzorców wewnętrznych zawierającą 40 μM [13C6]1,5-(PP)2-InsP 4, 80 μM [13C6]5-PP-InsP5, 80 μM [13C6]1-PP-InsP5, 400 μM [13C6]InsP6 i 400 μM [13C6]Ins(1,3,4,5,6)P5. Oznaczyć stężenia roztworów SIL IS za pomocą ilościowego 31P i 1H NMR, przy pomocy certyfikowanego wzorca odniesienia, tj. kwasu fosfooctowego.
    UWAGA: Wszystkie powyższe wzorce wewnętrzne SIL (IS) o czystości wyższej niż 96% zostały zsyntetyzowane i dostarczone przez Fiedler group15,27. Podobnie jak w przypadku nukleotydów, te IS mogą przenosić wiele krystalicznych cząsteczek wody i różne przeciwjony. Zamiast ważenia substancji i obliczania stężenia, zaleca się oznaczanie stężenia 13C6 roztworów wzorcowych za pomocą ilościowego 31P NMR.
  2. Zmieszać 10 μl próbki z 0,5 μl mieszaniny wzorców wewnętrznych w fiolce z próbką CE. 2 μM [13C6]1,5-(PP)2-InsP 4, 4 μM [13C6]5-PP-InsP5, 4 μM [13C6]1-PP-InsP5, 20 μM [13C6]InsP6, i 20 μM [13C6]Ins(1,3,4,5,6)P5 są końcowymi stężeniami wewnątrz próbek.
  3. Korzystając z systemu uzupełniania, kliknij przycisk Zmień butelkę, umieść przygotowane 250 ml buforu do biegania CE w butelce z elektrolitem i kliknij Wyczyść probówki. Przechowywać igłę do uzupełniania w fiolce z wodą.
  4. Ustaw parametry ESI i MS, jak pokazano w tabeli 1. Zoptymalizuj parametry źródła za pomocą Optymalizatora Źródła z mieszaniną wzorców polifosforanu inozytolu. Uzyskaj ustawienia monitorowania wielu reakcji (MRM) za pomocą Masshunter Optimizer ze wszystkimi standardami. Dostosuj ustawienia ESI i MS/MS dla różnych instrumentacji.
  5. Wykonaj przebieg dla ekstraktów InsP i sprawdź wynik (Rysunek 2). Ustaw sekwencję, gdy jest więcej próbek.
  6. Niech MS będzie w trybie czuwania po pomiarach. Nie wyłączaj pompy LC. Przepływ cieczy osłonkowej chroni igłę opryskiwacza. Wymień opryskiwacz CE-ESI-MS na opryskiwacz LC-ESI-MS, gdy nie ma dopływu płynu do osłony.

5. Analiza danych

  1. Otwórz oprogramowanie do analizy ilościowej (dla QQQ), utwórz partię dla wszystkich próbek.
  2. Utwórz nową metodę na podstawie uzyskanych danych MRM. Ustaw [13C6]InsP jako wzorce wewnętrzne - (ISTD). Sprawdź konfigurację związku MRM, konfigurację czasu przechowywania, konfigurację ISTD, konfigurację koncentracji i konfigurację kwalifikatora. Przekaż walidację i zakończ, aby zastosować metodę do bieżącej partii. Zapisz metodę.
  3. Sprawdź, czy każdy pik w partii jest prawidłowo zintegrowany; w przeciwnym razie należy ręcznie zintegrować pik.
  4. Wyeksportuj wyniki do arkusza kalkulacyjnego. Przeprowadzić ocenę ilościową (piro)fosforanów inozytolu, porównując reakcję piku analitu z odpowiednią reakcją szczytową SIL IS o znanych stężeniach. Teoretyczne i eksperymentalne krzywe kalibracyjne przedstawiono w tabeli 2 dla 5-PP-InsP5, InsP6 i Ins(1,3,4,5,6)P5 o zakresie liniowym.
    UWAGA: Warunkiem wstępnym zastosowania teoretycznej krzywej kalibracyjnej jest zastosowanie wysokiej jakości wzorca izotopowego docelowych analitów o wiarygodnym stężeniu. Oceń zakres liniowy. Krzywa kalibracyjna jest niezbędna do bezwzględnej oceny ilościowej, gdy pełne uzyskanie wyżej wymienionych wzorców izotopowych jest niepraktyczne.
  5. Na podstawie zmierzonego stężenia w roztworze ekstraktu InsP i jego objętości obliczyć ilości bezwzględne. Ponadto znormalizuj ilość według liczby komórek lub zawartości białka. Oblicz stężenie komórkowe na podstawie liczby komórek i średniej objętości komórek HCT116 (1,68 fL).

Wyniki

Wyniki przedstawione w tym miejscu mają na celu zilustrowanie potencjału analizy CE-ESI-MS. Raportowane dane opisują technicznie bezbłędny przebieg analizy CE-ESI-MS. Po pierwsze, przedstawiono mieszaninę wzorców pirofosforanów inozytolu (Rycina 1) oraz ekstrakt z komórek ssaków (Rycina 2). Po drugie, przedstawiono porównanie dwóch linii komórkowych HCT116 (Rycina 3) oraz komórek HCT116 traktowanych NaF (Rycina 4).

Wyekstrahowane elektroferogramy jonowe (EIEs) standardów (piro)fosforanów inozytolu o stężeniu 2 µM przedstawiono na Rysunku 1. Wstawiono schemat metabolizmu pirofosforanów inozytolu u ssaków wraz z ich uproszczonymi strukturami. Cztery pirofosforany inozytolu występujące u ssaków: 1,5-(PP)2-InsP4, 5-PP-InsP5, 1-PP-InsP5 oraz 5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 są dobrze rozdzielone przy użyciu opisanego poziomu. Analiza CE-ESI-MS linii HCT116UCL przedstawiona jest na Rysunku 2. Dzięki zastosowaniu wewnętrznych standardów znakowanych stabilnymi izotopami (SIL), można łatwo przeprowadzić kwantyfikację absolutną, porównując odpowiedź sygnału z dodanym standardem SIL o znanym stężeniu. Wyświetlono zintegrowane EIEs fosforanów inozytolu od InsP5 do (PP)2-InsP4 oraz niezintegrowane EIEs ich wzorców izotopowych. Wartości RSD dla wszystkich analitów z sześciu powtórzeń technicznych mieszczą się w granicach 4%. Na podstawie zmierzonego stężenia i objętości ekstraktów można obliczyć ilość analitów. Biorąc pod uwagę liczbę komórek i objętość komórki lub zawartość białka, końcowym wynikiem takiej analizy jest zazwyczaj absolutne stężenie komórkowe (µM) lub ilość znormalizowana względem zawartości białka (pmol/mg protein).

Zgodnie z wcześniejszym badaniem, dwie linie zróżnicowanych komórek HCT116 wykazują różnice w poziomach InsP8; komórki HCT116UCL zawierają 6-krotnie wyższe poziomy InsP8 niż komórki HCT116NIH29. Przy zastosowaniu metody CE-MS można było łatwo określić ilość 1,5-(PP)2-InsP4 w komórkach HCT116NIH (Rycina 3), a komórki HCT116UCL zawierają 7-krotnie wyższe poziomy InsP8 niż komórki HCT116NIH. Ponadto znaczącej akumulacji 1,5-(PP)2-InsP4 w komórkach HCT116UCL towarzyszy istotny wzrost poziomu 1-PP-InsP5, co zostało przedstawione ilościowo na Rycini 3.

Poziomy PP-InsPs wzrastają poprzez hamowanie ich defosforylacji przy użyciu fluorku sodu. Analiza CE-ESI-MS komórek HCT116NIH traktowanych NaF wykazała wzrost poziomu -5-PP-InsP5 wraz z redukcją InsP6 i pojawieniem się 5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 (Rysunek 4). Ponadto zauważalny jest wzrost poziomu InsP8, podczas gdy 1-PP-InsP5 ulega w pewnym stopniu zmniejszeniu. 1-PP-InsP5 nie jest całkowicie nieobecny w komórkach HCT116NIH traktowanych NaF, lecz znajduje się głównie poniżej granicy detekcji lub oznaczalności.

Wykres chromatograficzny ze szlakami fosforanów inozytolu; struktury chemiczne i identyfikacja piku.
Rycina 1: Typowe elektroforeogramy wyekstrahowanych jonów (EIEs) wzorców (piro)fosforanów inozytolu w analizie CE-ESI-MS z wykorzystaniem opisanego protokołu. Stężenie każdego anality wynosi 2 µM. Wstrzyknięta objętość próbki wynosi ok. 10 nL przy wtrysku pod ciśnieniem 50 mbar przez 10 s. Wstawki przedstawiają metabolizm pirofosforanów inozytolu u ssaków. IPPK: kinaza 2 inozytolopentakisfosforanu, IP6K: kinaza inozytolheksakisfosforanu, PPIP5K: kinaza difosfoinozytolopentakisfosforanu, DIPP1: difosfoinozytolopolifosforan fosfohydrolaza 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza HPLC fosforanów inozytolu, chromatogram i wyniki na wykresie słupkowym, badanie stężenia w komórkach.
Rycina 2: Reprezentatywny profil InsP komórek HCT116UCL. (A) EIE głównych (piro)fosforanów inozytolu w HCT116NIH oraz dodanych SIL IS: 2 µM [13C6]1,5-(PP)2-InsP4 (1), 4 µM [13C6]5-PP-InsP5 (2), 4 µM [13C6]1-PP-InsP5 (3), 20 µM [13C6]InsP6 (4) oraz 20 µM [13C6]Ins(1,3,4,5,6)P5 (5). Wstawki przedstawiają sześć powtórzeń technicznych analizy InsP metodą CE-ESI-MS, dane przedstawiono jako średnie ± SD. (B) Stężenie komórkowe PP-InsPs i InsPs w ludzkich liniach komórkowych HCT116UCL oraz (C) ilość PP-InsPs i InsPs znormalizowana względem zawartości białka. Dane są średnimi ± SEM z trzech niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Piki chromatograficzne 1,5-(PP)_2-InsP_4, 5-PP-InsP_5, 1-PP-InsP_5; porównanie wykresów analitycznych.
Rysunek 3: Zmienność poziomów InsP8 pomiędzy dwiema zróżnicowanymi liniami komórek HCT116. (A)EIE pirofosforanów inozytolu w komórkachHCT116UCL i HCT116NIH. InsP8 w HCT116UCL jest wyraźnie bardziej obfity niż w HCT116NIH. (B) Stosunek pirofosforanów inozytolu do InsP6 (%) w obu liniach komórek HCT116. Komórki HCT116UCL zawierają 7-krotnie wyższe poziomy InsP8 w porównaniu do HCT116NIH, podczas gdy poziomy 5-PP-InsP5 są jednakowe. Dane przedstawiają średnie ± SEM z trzech niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres chromatograficzny HCT116 NaF; analiza pików; wykresy słupkowe; poziomy białek; ilościowe oznaczanie fosforanów.
Rycina 4: Poziomy inozytolo(piro)fosforanów w komórkach HCT116NIH po zastosowaniu NaF. (A) EIE inozytolo(piro)fosforanów w komórkach HCT116NIH po traktowaniu fluorkiem sodu (NaF, 10 mM). Poziomy inozytolopirofosforanów, w tym 1,5-(PP)2-InsP4, 5-PP-InsP5 oraz 5-PP-Ins(1,3,4,6)P4, wzrastają w wyniku zablokowania ich defosforylacji za pomocą NaF. (B) Poziomy inozytolo(piro)fosforanów (ilości znormalizowane względem zawartości białka) w nietraktowanych i traktowanych NaF komórkach HCT116NIH. Dane przedstawiają średnie ± SEM z trzech niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Ustawienia parametrów CE-ESI-MS. Parametry źródła oraz parametry iFunnel zostały zoptymalizowane za pomocą Source and iFunnel Optimizer. Ustawienia parametrów MSM dla (piro)fosforanów inozytolu zostały zoptymalizowane za pomocą MassHunter Optimizer. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Teoretyczne i eksperymentalne równanie regresji. Stężenia [13C6]5-PP-InsP5, [13C6]InsP6 oraz [13C6]Ins (1, 3, 4, 5, 6)P5 wynoszą odpowiednio 4 µM, 20 µM i 20 µM. Dla równania regresji stężenie 5-PP-InsP5 wynosi 0,04 µM, 0,1 µM, 0,2 µM, 0,4 µM, 1 µM, 2 µM, 4 µM, 8 µM, 16 µM, 24 µM. Stężenie InsP6 oraz Ins (1, 3, 4, 5, 6)P5 wynosi 0,2 µM, 0,5 µM, 1 µM, 2 µM, 5 µM, 10 µM, 20 µM, 40 µM, 80 µM, 120 µM. x to stężenie, y to (Area InsP)12C/(Area InsP)13C. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Przedstawiono tutaj praktyczną i czułą metodę ilościowego oznaczania wysoce naładowanych pirofosforanów inozytolu w komórkach ssaków. Łącząc to podejście analityczne z aktualną, najnowocześniejszą ekstrakcją InsP kwasem nadchlorowym, a następnie wzbogacaniem za pomocą TiO2, analiza CE-ESI-MS ma niespotykane dotąd zalety. Pod względem przepustowości, czułości, stabilności, bezwzględnej kwantyfikacji, identyfikacji izomerów i zależności od matrycy, metoda ta wyróżnia się na tle innych podejść. Protokół ten ma zastosowanie do komórek ssaków, ale w rzeczywistości ta strategia odnosi sukces w wielu różnych próbkach (np. drożdżach, roślinach, pasożytach, tkankach myszy itp.).

Zastosowany protokół ekstrakcji w pełni odzyskuje PP-InsP i InsP6 z ekstraktów z komórek ssaków16,19. Będzie również ekstrahować wiele innych metabolitów anionowych, w szczególności gatunków zawierających fosforany, np. fosforany cukru i nukleotydy. Konieczna byłaby ocena odzysku i rozkładu analitów użytkownika za pomocą tego protokołu.

Ogólnie rzecz biorąc, system CE-ESI-MS działa płynnie i może pomieścić około 200 próbek tygodniowo przy użyciu tego protokołu. Jednak w przeciwieństwie do HPLC, CE przez długi czas była uważana za metodę dla ekspertów i wyspecjalizowanych osób, co ograniczało jej rynek i ograniczało jej zastosowanie. W związku z tym urządzenie CE-ESI-MS jest zwykle nieobecne na wydziałach analitycznych. Osoby, które chcą przeprowadzić analizę CE-ESI-MS, prawdopodobnie nie mają doświadczenia w CE i spędzą więcej czasu na rozwiązywaniu problemów. W tym miejscu wyróżniono krytyczne kroki. Przede wszystkim jakość cięcia kapilarnego. Czułość i stabilność sprayu ESI opiera się głównie na pierwszorzędnym cięciu kapilarnym. Po drugie, koniec wylotu kapilary powinien znajdować się dokładnie 0,1 mm od końcówki opryskiwacza. Igła opryskiwacza i kapilara CE powinny znajdować się w kierunku osiowym. Jakość sprayu ESI ma kluczowe znaczenie dla oceny ilościowej; W celu oceny powtarzalności należy przeprowadzić badania techniczne.

Zgodnie z opisanym protokołem granica oznaczalności (LOQ) dla PP-InsP wynosi 40 nM przy wstrzyknięciu przy 50 mbar przez 10 s (10 nL). Istnieje kilka podejść do dalszego zwiększenia czułości metody. Po pierwsze, wstrzyknięcie przy ciśnieniu 100 mbar przez 20 s (40 nL) nadal zapewni dobry kształt piku i wystarczającą rozdzielczość dla regioizomerów 5-PP-InsP5 i 1-PP-InsP5. Po drugie, ekstrakty InsP można rozpuścić w mniejszej ilości wody. Po trzecie, czas przebywania można wydłużyć, stosując mniej przejść MRM do oznaczania ilościowego. Ponadto źródło jonów CE-MS wykorzystujące bardzo niski przepływ cieczy w osłonie znacznie zwiększyłoby czułość.

Bufor pracujący CE o pH 9 zapewnia najlepszą rozdzielczość między InsP6 a InsP8. Przy wzroście pH do 9,7 rozdzielczość wśród InsP 3-InsP 6 znacznie się poprawi. Ze względu na doskonałą rozdzielczość, zalecana jest krótsza długość kapilary wynosząca 72 cm w celu dalszego zwiększenia przepustowości. Poza tym wyższa temperatura kasety CE wynosząca 40 °C zmniejsza lepkość wodnego buforu elektroforetycznego i przyspiesza jego ruch pod wpływem EOF. Zgodnie z różnymi wymaganiami badawczymi, modyfikacje tej metody mogą jeszcze bardziej ułatwić analizę InsPs i PP-InsP. W związku z tym opisane protokoły CE-ESI-MS mają potencjał, aby otworzyć nowe możliwości badawcze w tej wieloaspektowej rodzinie cząsteczek sygnałowych.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ten projekt otrzymał dofinansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji (umowa o grant nr 864246, dla HJJ). DQ dziękuje za wsparcie finansowe ze strony Brigitte-Schlieben-Lange-Programm. AS jest wspierany przez grant programu MRC MR/T028904/1.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały
1,5 ml probówki do mikrowirówekGreiner Bio-One616201-15
cm Probówki do mikrowirówekThermo Fisher168381-2,0
ml ProbówkiGreiner Bio-One
623201-50 mlGreiner Bio-One
227261-96-dołkowe płytkiThermo Fisher260836do oznaczania białek DC
CE topiona krzemionka kapilarnaCS Chromatografia10518050 &mikro; M i.d. 360 & mikro; M o.d.
Końcówki do pipetStarlabI1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-370010 mL, 1000 µ L, 200 i mikro; L, 10 i mikro; L końcówki do pipet
Pipety serologiczneTPP94550, 94525, 94010, 9400550 mL, 25, mL, 10 mL, 5 ml Pipety serologiczne
Kolby T75TPP90076-
Chemikalia i odczynniki
NaOHAppliChemA6829,0500granulki wodorotlenku sodu do biologii molekularnej, do przygotowania komórek bufor do lizy
0,25% trypsyna-EDTAGibco25200056-octan
amonuThermo Fisher1677373klasa HPLC
BSAThermo Fisher23209wzorzec albuminy (2,0 mg / ml) do przygotowania krzywej wzorcowej
Test białka DCBiorad5000116odczynników do oznaczania białek DC
DMEMGibco41966029wysoka glukoza, pirogronian
FBSGibco10270106, 10500064 (inaktywowany termicznie)10270106 dla HCT116UCL, 10500064 dla HCT116NIH
IsopropanolCarl RothAE73.299,95% LC-MS klasa
NH4OH, 10%Carl Roth6756.1do przygotowania 3% NH4OH
PBSGibco10010015-Kwas
nadchlorowy, 70%Carl Roth9216.1do przygotowania 1 M kwasu nadchlorowego
SDSSERVA20760.02do przygotowania buforu do lizy komórek
Fluorek soduSigma AldrichS7920-TiO
2 kulkiGL Sciences5020-750005 µ m wielkość cząstek
Roztwór błękitu trypanowegoGibco15250061niebieska plama trypanowa (0,4%)
Ultraczysta (typ 1) wodaMilli-Qmodel ZRQSVP3WW: System oczyszczania wody Direct-Q 3 UV
Sprzęt
Waga analitycznaMettler Toledo30105893model: XPE26; do ważenia kulek ( 5-6 mg na próbkę)
Automatyczny licznik komórekLogos BiosystemsL40002model: LUNA-II Automatyczna
wirówka stołowaHettich1401model: UNIVERSAL 320
Wirówka stołowa z chłodzeniemVWR521-1647Pmodel: System Microstar 17R
CEAgilentG7100A-CE
/MSAgilentG1603A-CE
/MSAgilentG1607A-Szkiełka
do liczenia komórekLogos BiosystemsL12001Szkiełka do liczenia komórek LUNA
Parownik odśrodkowyEppendorf5305000304model: Koncentrator plus kompletny system
Źródło ESIAgilentAJS ESI-Super
Support FilmNisshin EM Co. Ltd, Tokyo647
Inkubator nawilżanyBinder9040-0088model: CB E6.1, do hodowli komórek ssaków
Pojemnik na lód-powinien zapewniać wystarczająco dużo miejsca na próbki, naczynia itp.
Izokratyczny system LCAgilentG7110B 1260 Iso Model pompy: Infinity II System czwartorzędowy
MSDAgilentG6495Cpotrójny kwadrupol
Czytnik wielopłytkowyModel 30086375 Tecan: SPARK 10 M
Napełniacz do pipetThermo Fisher10072332do pipet serologicznych
PipetyMarka705884, 705880, 705878, 705872, 705870różne pipety
RotatorLabnetH5500model: Mini LabRoller Rotator
Shortix kapilarny nóż kolumnowySGTS0020-Wytrząsarka
do probówek (mieszalnik wirowy)Carl RothHXH6.1model: Rotilabo-Mini Vortex
Stół uchylnyLabnetS0600model: EDURO MiniMix Mikser nutujący
Łaźnia wodnaThermo Model FisherFSGPD05: Isotemp GPD 05
Software
MassHunterWorkstation AgilentVersion 10.1-MassHunter
Workstation LC/MS Data AcquisitionAgilentVersion 10.1-MassHunter
Workstation OptimizerAgilentVersion 10.1-
Stacja robocza MassHunter Analiza jakościowaAgilentWersja 10.0-QQQ
Analiza ilościowaAgilentWersja 10.1-
wirówkowe pakiet z licznikiem komórek Zestaw adapterów Zestaw opryskiwacza

Bibliografia

  1. Stephens, L., et al. The detection, purification, structural characterization, and metabolism of diphosphoinositol pentakisphosphate(s) and bisdiphosphoinositol tetrakisphosphate(s). The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 4009-4015 (1993).
  2. Menniti, F. S., Miller, R. N., Putney, J. W. Jr, Shears, S. B. Turnover of inositol polyphosphate pyrophosphates in pancreatoma cells. The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 3850-3856 (1993).
  3. Shears, S. B. Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates. Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).
  4. Irvine, R. F., Schell, M. J. Back in the water: the return of the inositol phosphates. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (5), 327-338 (2001).
  5. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  6. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  7. Chakraborty, A., et al. Inositol pyrophosphates inhibit Akt signaling, thereby regulating insulin sensitivity and weight gain. Cell. 143 (6), 897-910 (2010).
  8. Bittner, T., et al. Photolysis of caged inositol pyrophosphate InsP8 directly modulates intracellular Ca2+ oscillations and controls C2AB domain localization. Journal of the American Chemical Society. 142 (24), (2020).
  9. Hauke, S., et al. Photolysis of cell-permeant caged inositol pyrophosphates controls oscillations of cytosolic calcium in a β-cell line. Chemical Science. 10 (9), 2687-2692 (2019).
  10. Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14206-14211 (2002).
  11. Koldobskiy, M. A., et al. p53-mediated apoptosis requires inositol hexakisphosphate kinase-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (49), 20947(2010).
  12. Rao, F., et al. Inositol hexakisphosphate kinase-1 mediates assembly/disassembly of the CRL4-signalosome complex to regulate DNA repair and cell death. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16005(2014).
  13. Williams, S. P., Gillaspy, G. E., Perera, I. Y. Biosynthesis and possible functions of inositol pyrophosphates in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 67(2015).
  14. Wilson, M. S. C., Livermore, T. M., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates: between signalling and metabolism. The Biochemical Journal. 452 (3), 369-379 (2013).
  15. Harmel, R. K., et al. Harnessing 13C-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR. Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).
  16. Qiu, D., et al. Analysis of inositol phosphate metabolism by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nature Communications. 11 (1), 6035(2020).
  17. Azevedo, C., Saiardi, A. Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast. Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).
  18. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of radioactive labelling to elucidate inositol polyphosphate signalling. Phosphate Labeling and Sensing in Chemical Biology. , 67-87 (2017).
  19. Wilson, M. S. C., Bulley, S. J., Pisani, F., Irvine, R. F., Saiardi, A. A novel method for the purification of inositol phosphates from biological samples reveals that no phytate is present in human plasma or urine. Open Biology. 5 (3), 150014(2015).
  20. Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis. PloS One. 4 (5), 5580(2009).
  21. Dong, J., et al. Inositol pyrophosphate InsP8 acts as an intracellular phosphate signal in arabidopsis. Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).
  22. Riemer, E., et al. ITPK1 is an InsP6/ADP phosphotransferase that controls systemic phosphate homeostasis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2020).
  23. Whitfield, H., et al. An ATP-responsive metabolic cassette comprised of inositol tris/tetrakisphosphate kinase 1 (ITPK1) and inositol pentakisphosphate 2-kinase (IPK1) buffers diphosphosphoinositol phosphate levels. The Biochemical Journal. 477 (14), 2621-2638 (2020).
  24. Ito, M., et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. Journal of chromatography. A. 1573, 87-97 (2018).
  25. Mantilla, B. S., Amaral, L. D. D., Jessen, H. J., Docampo, R. the inositol pyrophosphate biosynthetic pathway of Trypanosoma cruzi. ACS Chemical Biology. 16 (2), 283-292 (2021).
  26. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Inositol phosphates purification using titanium dioxide beads. Bio-Protocol. 8 (15), 2959(2018).
  27. Puschmann, R., Harmel, R. K., Fiedler, D. Scalable chemoenzymatic synthesis of inositol pyrophosphates. Biochemistry. 58 (38), 3927-3932 (2019).
  28. Gu, C., et al. KO of 5-InsP7 kinase activity transforms the HCT116 colon cancer cell line into a hypermetabolic, growth-inhibited phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 11968-11973 (2017).
  29. Gu, C., Wilson, M. S. C., Jessen, H. J., Saiardi, A., Shears, S. B. Inositol Pyrophosphate Profiling of Two HCT116 Cell Lines Uncovers Variation in InsP8 Levels. PloS One. 11 (10), 0165286(2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metabolizm fosforan w inozytolumonitorowanie wielu reakcjistandardy wewn trznest enie kom rkowekom rki HCT116
Bezwzględna ocena ilościowa pirofosforanów inozytolu za pomocą elektroforezy kapilarnej Spektrometria mas z jonizacją elektrorozpylania
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.