Kwantyfikacja konkurencji międzybakteryjnej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego pojedynczych komórek

Summary

Ten manuskrypt opisuje metodę wykorzystania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej komórki do wizualizacji i ilościowego określenia konkurencji bakterii w kokulturze.

Abstract

Konkurencja międzybakteryjna może bezpośrednio wpływać na strukturę i funkcję mikrobiomów. W niniejszej pracy opisano podejście do mikroskopii fluorescencyjnej, które można wykorzystać do wizualizacji i ilościowego określenia konkurencyjnych interakcji między różnymi szczepami bakterii na poziomie pojedynczej komórki. Opisany tutaj protokół zawiera metody zaawansowanych podejść do przygotowywania preparatów zarówno na pionowych, jak i odwróconych mikroskopach epifluorescencyjnych, techniki obrazowania żywych komórek i poklatkowego oraz ilościową analizę obrazu przy użyciu oprogramowania FIJI o otwartym kodzie źródłowym. Podejście przedstawione w tym manuskrypcie przedstawia ilościowe określenie interakcji konkurencyjnych między symbiotycznymi populacjami Vibrio fischeri poprzez pomiar zmiany obszaru w czasie dla dwóch równocześnie wykutych szczepów, które wyrażają różne białka fluorescencyjne ze stabilnych plazmidów. Opisano alternatywne metody optymalizacji tego protokołu w systemach modeli bakteryjnych, które wymagają różnych warunków wzrostu. Chociaż opisany tutaj test wykorzystuje warunki zoptymalizowane dla V. fischeri, podejście to jest wysoce powtarzalne i można je łatwo dostosować do badania konkurencji między kulturowymi izolatami z różnych mikrobiomów.

Introduction

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego określania konkurencji bakteryjnej na poziomie pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Struktura i funkcja zbiorowisk drobnoustrojów jest często kształtowana przez konkurencyjne interakcje między drobnoustrojami, a w wielu przypadkach scharakteryzowanie tych interakcji wymaga obserwacji różnych szczepów bakteryjnych w kopolimeracji1^,2,3^,4,5,6,7,8. Tradycyjnie, konkurencja bakteryjna jest określana ilościowo na poziomie populacji poprzez zliczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) szczepów inhibitorowych i docelowych przed i po okresie komonety^2,9. Mechanizmy konkurencji mikrobiologicznej są szeroko rozpowszechnione wśród bakterii i mogą opierać się na dyfuzji lub kontakcie komórka-komórka w celu zahamowania komórek docelowych^{10,11,12,13,14,15,16,17,18,19}.

Chociaż szczepy bakteryjne są często obserwowane w kopulacji na poziomie populacji, ten manuskrypt przedstawia test do ilościowego oznaczania konkurencji bakteryjnej na pojedynczych komórkach. Ponadto praca ta zawiera sugestie dotyczące dostosowania protokołu do stosowania z innymi gatunkami bakterii. Chociaż konkretne techniki opisane w tym artykule są wykorzystywane do badania zależnej od kontaktu konkurencji wewnątrzgatunkowej między szczepami symbiotycznej bakterii Vibrio fischeri^20,21,22, można je dostosować do konkurencji między wieloma organizmami. Ten artykuł zawiera instrukcje dotyczące ustawiania szkiełek podstawowych zarówno w mikroskopach pionowych, jak i odwróconych, a cała analiza jest opisana przy użyciu oprogramowania typu open source FIJI²³, dzięki czemu metoda może być używana przez badaczy z dostępem do różnych konfiguracji obrazowania i programów analitycznych. Biorąc pod uwagę znaczenie badania konkurencji mikrobiologicznej zarówno na poziomie populacji, jak i pojedynczych komórek, metoda ta będzie cennym źródłem dla naukowców do ilościowego określenia interakcji konkurencyjnych, szczególnie tych, którzy nie mają dostępu do zastrzeżonego oprogramowania analitycznego.

Protocol

1. Optymalizacja szczepów bakteryjnych

1. Wybierz dwa szczepy bakteryjne do testów konkurencji bakterii jednokomórkowych. W tym przypadku stosuje się dwa szczepy V. fischeri: szczep docelowy (ES114²⁴) i szczep inhibitorowy (MJ11²⁵), o którym wiadomo, że zabija szczep docelowy za pomocą systemu wydzielania typu VI na chromosomie II (T6SS2)¹, który jest mechanizmem zabijania zależnym od kontaktu.
2. Określ odpowiednie kontrolki dla eksperymentu. W tym przykładzie odpowiednią kontrolą jest inkubacja zarówno szczepów inhibitorów typu dzikiego, jak i zmutowanych inhibitorów T6SS ze szczepem docelowym w celu ilościowego określenia efektu zabijania za pośrednictwem T6SS.
   UWAGA: Dodatkowe kontrole mogą obejmować szczep docelowy, który wyraża niezbędne geny odporności, aby zapobiec zabijaniu zależnemu od T6SS lub zmutowany szczep inhibitora wykazujący ekspresję dzikich kopii zmutowanych genów w trans w celu przywrócenia aktywności T6SS¹.
3. Jeśli to możliwe, przekształć szczepy ze stabilnymi plazmidami kodującymi geny dla różnych białek fluorescencyjnych (np. GFP lub RFP), aby wizualnie rozróżnić typy szczepów pod mikroskopem. W tym przypadku szczep inhibitora jest oznaczony plazmidem kodującym GFP (pVSV102), a szczep docelowy jest oznaczony plazmidem kodującym dsRed (pVSV208)²⁶.
   UWAGA: Jeśli nie jest możliwe użycie stabilnych plazmidów, znaczniki fluorescencyjne mogą zostać wprowadzone do chromosomu bakteryjnego w celu wizualizacji^27,28.
4. Podczas początkowego okresu optymalizacji należy zobrazować kultury klonalne oznaczonych szczepów pod każdym z filtrów fluorescencyjnych, które zostaną użyte podczas eksperymentu, aby upewnić się, że komórki są widoczne tylko w zamierzonym kanale. Na przykład upewnij się, że szczep oznaczony GFP jest widoczny tylko w kanale FITC.

2. Przygotowanie podkładki agarozowej

1. Przygotować roztwór agarozy w doniczce, rozpuszczając 2% niskotopliwej agarozy (w/v) w mPBS. Podgrzej krótko roztwór w kuchence mikrofalowej i wiruj, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Utrzymuj ten roztwór w cieple, umieszczając go w łaźni wodnej o temperaturze 55°C, aż będzie gotowy do użycia. Zobacz sekcję Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji na temat przygotowania płatków agarozowych.
   UWAGA: W tym przypadku mPBS został przygotowany przez dodanie 20 g/L NaCl do standardowego 1x PBS.
2. Owiń kawałek taśmy laboratoryjnej wokół szklanego szkiełka pięć razy. Powtórz ten proces po raz drugi na tym samym szkiełku, tak aby odległość między dwoma kawałkami taśmy była nieco mniejsza niż szerokość szkiełka nakrywkowego (Rysunek 1A). Na przykład, jeśli używasz szkiełek nakrywkowych²⁵ mm2, kawałki taśmy powinny być oddalone od siebie o około 20 mm.
   UWAGA: Chociaż liczbę owijania taśmy wokół prowadnicy można modyfikować, aby dostosować grubość podkładki agarozowej, ważne jest, aby warstwy taśmy miały tę samą wysokość po obu stronach prowadnicy, aby podkładka agarozowa pozostała płaska.
3. Odpipetować ciepły roztwór agarozy między dwoma kawałkami taśmy i natychmiast przykryć szkiełkiem nakrywkowym, tak aby spoczywał na kawałkach taśmy. Zapewni to, że powierzchnia podkładki agarozowej pozostanie płaska. Objętość roztworu agarozy odpipetowana na tym etapie powinna być wystarczająca, aby szkiełko nakrywkowe zetknęło się z cieczą i wypchnęło wszelkie pęcherzyki w roztworze agarozy. Do tego konkretnego zestawu wystarczy 200 μl ciepłej agarozy.
4. Pozostawić podkładkę agarozową do zestalenia się w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę przed testem koinkubacji. Krok 2.2 spowoduje wytworzenie podkładki agarozowej o średnicy około 20 mm².
5. Pokrój tę podkładkę agarozową żyletką na cztery, 5 mm² podkładki do użycia do obrazowania.
   UWAGA: Płatki agarozowe można przygotować do tygodnia przed eksperymentem i przechowywać w temperaturze 4°C na pustej, sterylnej płytce Petriego zamkniętej parafilmem, aby zapobiec wysuszeniu.

3. Przygotuj szczepy do wspólnej inkubacji

1. Usunąć każdy szczep do użycia w teście koinkubacji z zapasów w temperaturze -80 °C na płytki agarowe LBS uzupełnione odpowiednimi antybiotykami i inkubować przez noc w temperaturze 24 °C. W tym przykładzie stosuje się trzy szczepy: szczep inhibitora typu dzikiego, mutant układu wydzielania typu VI i szczep docelowy.
2. Następnego dnia rozpocznij hodowle przez noc w duplikacie biologicznym, wybierając dwie kolonie z każdego szczepu i ponownie zawieszając je w pożywce LBS uzupełnionej odpowiednimi antybiotykami i inkubuj przez noc w temperaturze 24°C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
3. Następnego ranka subkultura biologiczna replikuje się w stosunku 1:1000 do świeżej pożywki LBS bez antybiotyków i inkubuje w temperaturze 24 °C z wytrząsaniem przez 4-5 godzin lub do momentu, gdy komórki osiągną OD₆₀₀ ~ 1,5,
   UWAGA: Czas wykonania kroków 3.1, 3.2 i 3.3 może wymagać optymalizacji dla różnych gatunków bakterii, ponieważ ich tempo wzrostu może się znacznie różnić. W tym teście komórki miały znajdować się w środkowej fazie logarytmicznej na początku testu komonety.

4. Coincubate szczepy bakteryjne

1. Zaczynając od kultur mid-log z kroku 3.3, zmierzyć i zapisać gęstość optyczną przy 600 nm (OD₆₀₀) dla wszystkich próbek.
2. Normalizować każdą próbkę do OD₆₀₀ = 1,0, co odpowiada około 10⁹ jtk/ml dla V. fischeri, rozcieńczając kulturę pożywką LBS.
3. Wymieszaj dwa konkurujące ze sobą szczepy w stosunku 1:1 w zależności od objętości, dodając 30 μl każdego znormalizowanego szczepu do oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować kulturę mieszanego szczepu przez 1-2 s.
   UWAGA: W niektórych przypadkach właściwe może być mieszanie kokultur w różnych proporcjach. Na przykład, gdy jedna odmiana rośnie znacznie szybciej niż druga, może być konieczne rozpoczęcie wolniej rosnącej odmiany z przewagą liczebną, aby obserwować konkurencję. Optymalizacja może być również wymagana, jeśli OD₆₀₀ nie odpowiada podobnym jtk/ml dla obu szczepów.
4. Powtórzyć krok 4.3 dla każdej kontrpróby biologicznej i poddania działaniu substancji. W przedstawionym przykładzie spowoduje to powstanie w sumie czterech probówek ze szczepem mieszanym: dwóch kontrprób biologicznych ze szczepem inhibitora typu dzikiego zmieszanym ze szczepem docelowym i dwóch powtórzeń biologicznych ze zmutowanym szczepem systemu wydzielania typu VI zmieszanym ze szczepem docelowym.
5. Aby upewnić się, że konkurujące ze sobą komórki są wystarczająco gęste do zależnego od kontaktu zabijania w kopolimeryzacji na podkładce agarowej, należy zagęścić każdą mieszaną kulturę 3-krotnie, odwirowując zmieszaną kulturę w standardowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml przez 1 minutę przy 21 130 x g, odrzucając supernatant i ponownie zawieszając każdą osadkę w pożywce o pojemności 20 μl LBS. Powtórz te czynności dla każdej próbki.
   UWAGA: Niektóre komórki bakteryjne są wrażliwe na uszkodzenia przez wirowanie przy wysokim rcf; W takich przypadkach mieszaną kulturę można odwirowywać przez 3 minuty przy 4600 x G²⁹. Dodatkowo, przy ilościowym określaniu konkurencji zależnej od kontaktu, ważne jest, aby zapewnić wystarczającą gęstość komórek na szkiełku, aby obserwować zabijanie. W tym artykule "zatłoczone" zabiegi, w których obserwuje się zabijanie, miały około 10 komórek/20^μm2_; Więcej informacji można znaleźć w sekcji Dyskusja.

5. Ustawienia slajdów

1. W przypadku korzystania z mikroskopu pionowego umieść podkładkę agarozową o średnicy ~5 mm² na standardowym szkiełku podstawowym o średnicy 1 mm. Umieść 2 μl mieszanej kultury na podkładce agarozowej i umieść szkiełko nakrywkowe #1,5 (25 mm²) na miejscu. Zobacz Rysunek 1B dla przykładu.
2. Używając mikroskopu odwróconego, umieść 2 μl mieszanej kultury na dnie #1.5 szkiełka nakrywkowego szalki Petriego o średnicy 35 mm i umieść podkładkę agarozową ~5 mm² nad miejscem inkubacji. Umieść okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm na waciku agarozowym. Zobacz Rysunek 1C dla przykładu.
3. Powtórz krok 5.1 lub 5.2, w zależności od użytej konfiguracji mikroskopu, dla pozostałych trzech mieszanych kultur, w wyniku czego zostaną zobrazowane cztery szkiełka lub szalki.
4. Pozwól szkiełkom usiąść na blacie przez około 5 minut przed przejściem do kroku 6. Pozwala to komórkom osiąść na podkładce agarowej i eliminuje ruch podczas procesu obrazowania.

6. Mikroskopia fluorescencyjna

1. Zacznij od skupienia się na komórkach za pomocą światła białego (kontrast fazowy lub DIC), aby zminimalizować efekty wybielania fotograficznego. W oparciu o średnią wielkość pojedynczej komórki bakteryjnej użyj obiektywu olejowego 60x lub 100x.
2. Dostosuj czas ekspozycji i ustawienia akwizycji dla każdego kanału, tak aby komórki były widoczne w odpowiednim kanale przy minimalnym wykrywaniu tła.
   UWAGA: Właściwe jest stosowanie różnych czasów ekspozycji dla różnych kanałów, ale ten sam czas ekspozycji powinien być stosowany we wszystkich kontrpróbach biologicznych i poddanych działaniu substancji dla danego kanału.
3. Dla każdej próbki wybierz co najmniej pięć pól widzenia (FOV) i uzyskaj obrazy w każdym odpowiednim kanale, korzystając z ustawień akwizycji z kroku 6.2 (patrz przykłady w Rysunek 2). Zapisz punkty XY z każdego pola widzenia, aby można było zobrazować to samo pole widzenia w ostatnim punkcie czasowym. Obrazowanie tego samego pola widzenia w każdym punkcie czasowym jest konieczne do określenia proporcji obszaru zajmowanego przez komórki docelowe lub inhibitorowe podczas etapów analizy.
   UWAGA: W tym przykładzie fluorescencja GFP jest wykrywana za pomocą filtra o długości fali wzbudzenia 467 - 498 nm i filtra emisyjnego 513 - 556 nm i jest fałszywie zabarwiona na zielono. Fluorescencja dsRed jest wykrywana za pomocą filtra o długości fali wzbudzenia 542 - 582 nm i filtra emisyjnego 603 - 678 nm i jest fałszywie zabarwiona w kolorze magenta.
4. Po 2 godzinach powtórzyć krok 6.3 dla każdej próbki, używając wcześniej zapisanych punktów XY (rys. 2).
   UWAGA: Czas wykonywania kolejnych obrazów może wymagać optymalizacji dla organizmów o różnym tempie wzrostu lub mechanizmach konkurencyjnych.

7. Analiza obrazu na FIDŻI

1. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie do przetwarzania obrazu FIJI, postępując zgodnie z instrukcjami znajdującymi się tutaj: https://imagej.net/Fiji/Downloads
2. Otwórz FIDŻI i zaimportuj pliki obrazów do analizy.
   UWAGA: W większości przypadków . Pliki TIFF będą używane do analizy obrazu, chociaż niektóre programy do pozyskiwania obrazów będą eksportowane przy użyciu zastrzeżonych typów plików. FIDŻI rozpoznaje większość zastrzeżonych typów plików, a obrazy można importować i analizować w następujący sposób.
3. Dla każdego obrazu uzyskanego w krokach 6.3 i 6.4 przekonwertuj obraz na skalę szarości, oddziel kanały i zacznij od progowania (Ctrl + Shift + T) i utworzenia maski binarnej wstępnie przetworzonego obrazu (Rysunek 3A,B).
   UWAGA: W tym przypadku używane są domyślne ustawienia progów na FIDŻI. W niektórych przypadkach może być konieczna zmiana tych ustawień, w takim przypadku te same ustawienia powinny być używane dla wszystkich obrazów w danym eksperymencie.
4. Ustawianie skali na obrazie (Analizuj | Ustaw skalę) przy użyciu odpowiednich wartości dla mikroskopii setup²³.
5. Ustawianie pomiarów (Analizuj | Ustaw pomiary) i wybierz Obszar.
   UWAGA: Można dodać inne pomiary, jeśli są one odpowiednie dla eksperymentu. Dla przykładowej analizy przedstawionej tutaj wymagany jest tylko pomiar powierzchni obiektu.
6. Analizowanie cząstek (Analizowanie | Analizuj cząstki) przy użyciu ustawień domyślnych (Rysunek 3C). Jeśli w próbce znajdują się zanieczyszczenia, może być konieczne dostosowanie rozmiaru lub kołowości w celu odfiltrowania cząstek niebędących komórkami. Wybierz pozycję Pokaż | Kontury tak, aby wynik tej analizy zawierał ponumerowany kontur wszystkich analizowanych cząstek (Rysunek 3D).
   UWAGA: Porównanie konturu w Figure 3D z początkowym obrazem jest szczególnie ważne na etapie optymalizacji, aby upewnić się, że (1) wszystkie komórki są analizowane i (2) że wszelkie zanieczyszczenia są wyłączone z analizy.
7. Wyeksportuj pomiary z kroku 7.4 (Rysunek 3E) do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy i wykresów.
8. Powtórz kroki od 7.1 do 7.5 dla wszystkich kanałów i obrazów uzyskanych podczas eksperymentu.

8. Obliczanie procentu początkowego obszaru docelowego w czasie

1. Dla każdego pola widzenia analizowanego w sekcji 7 upewnij się, że eksportowany plik zawiera indywidualny pomiar powierzchni dla każdej cząstki, która była analizowana. Zaczynając od kanału fluorescencyjnego szczepu docelowego, oblicz sumę powierzchni cząstek dla każdego indywidualnego pola widzenia. W przypadku dwóch kontrprób biologicznych z pięcioma polami widzenia każdy, powinno to skutkować sumą dziesięciu obszarów na leczenie w każdym punkcie czasowym.
2. Oblicz procent początkowego obszaru docelowego w czasie dla każdego pola widzenia, korzystając z następującego równania: ()
3. Powtórz to obliczenie dla wszystkich zabiegów i narysuj na wykresie procent początkowego obszaru docelowego (wynik równania z kroku 8.2) dla każdego zabiegu (Rysunek 4A).
4. Określ, czy dla każdego leczenia występuje wzrost netto populacji docelowej (wskazujący na wzrost), spadek netto populacji docelowej (wskazujący na zgon) lub brak zmian (wskazujący na brak wzrostu lub zgonu).
   UWAGA: Procent początkowego obszaru docelowego z wartościami większymi niż 100 oznacza wzrost celu netto, a wartości niższe niż 100 oznaczają śmierć celu netto. Odsetek początkowych wartości docelowych, które pozostają na poziomie 100, wskazuje na brak zmiany netto w populacji docelowej. Zapoznaj się z dyskusją, aby zapoznać się z sugerowanymi eksperymentami uzupełniającymi.

9. Obliczanie procentu początkowego obszaru inhibitora w czasie

1. Powtórz kroki od 8.1 do 8.3, tym razem używając pomiarów pobranych z kanału fluorescencyjnego szczepu inhibitora w sekcji 7 (Rysunek 4B).
2. Określ, czy nastąpił wzrost netto populacji inhibitorów (wzrost), spadek netto populacji inhibitorów (zgon), czy brak zmian dla każdego leczenia. Wartości większe niż 100 wskazują na wzrost netto inhibitora, a wartości niższe niż 100 wskazują na śmierć netto inhibitora.

Results

Aby zobrazować i określić ilościowo konkurencyjne interakcje między bakteriami na poziomie pojedynczej komórki, opracowano i zoptymalizowano protokół dla V. fischeri, modyfikując nasz dobrze znany test oparty na CFU^1,2. Metoda ta wykorzystuje stabilne plazmidy kodujące GFP i dsRed do wizualnego rozróżnienia różnych szczepów V. fischeri. Konkurencyjny wynik tych interakcji można określić ilościowo, analizując obrazy uzyskane z tego testu przy użyciu oprogramowania FIJI o otwartym kodzie źródłowym. Jako przykład przeprowadzono następujący eksperyment z użyciem izolatów V. fischeri. Szczep inhibitora zawierał plazmid, który koduje GFP, a szczep docelowy zawierał plazmid, który koduje dsRed. Biorąc pod uwagę, że T6SS2 kodowany przez inhibitor jest zależnym od kontaktu mechanizmem zabijania, uwzględniono zabiegi, w których komórki były albo stłoczone (wysoki kontakt komórka-komórka), albo rozproszone (niski kontakt komórka-komórka) na szkiełku, aby podkreślić wpływ konfiguracji eksperymentalnej na końcowe wyniki tego testu. W próbkach konkurujące ze sobą szczepy zmieszano w stosunku 1:1 i inkubowano na podkładce agarozowej przez 2 godziny, a następnie wykonano zarówno początkowe, jak i końcowe (2 godziny) obrazy. Jako kontrolę, zmutowany szczep T6SS2 był również inkubowany ze szczepem docelowym zarówno w warunkach zatłoczenia, jak i rozproszenia. Kultury każdego szczepu zostały przygotowane i połączone w kolekcję, jak opisano powyżej, a preparaty zostały przygotowane, jak pokazano na Rysunek 1.

Rysunek 2 pokazuje reprezentatywne obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej każdego eksperymentalnego leczenia z tym samym polem widzenia zobrazowanym w początkowym i końcowym punkcie czasowym. W przypadku każdego leczenia inhibitor typu dzikiego lub zmutowany szczep T6SS zawierający plazmid kodujący GFP mieszano w stosunku 1:1 ze szczepem docelowym zawierającym plazmid kodujący dsRed. Podczas 2-godzinnego okresu komonetyzacji z tym eksperymentalnym układem, rosnące komórki V. fischeri mogą przejść przez 1-2 podziały (Rysunek 2; szare strzałki). W Rysunek 2A, kontakt komórka-komórka został wymuszony między celem a inhibitorem poprzez zagęszczenie mieszanej kultury przed zauważeniem na szkiełku. Obserwuje się, że wiele komórek docelowych zaokrągla się i/lub znika w ciągu 2 godzin, co jest zgodne z komórkami docelowymi eliminowanymi przez inhibitor (Rysunek 2; białe strzałki). Zobacz sekcję Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji na temat interpretowania komórek docelowych, zaokrąglania lub lizy. W Rysunek 2B, ta sama monetakubacja została zauważona na szkiełku, tym razem bez koncentracji mieszanej kultury, tak aby komórki pozostały rozproszone i był minimalny kontakt między szczepami na szkiełku. W tym przypadku nie obserwuje się, aby komórki docelowe znikały lub zaokrąglały się, co sugeruje, że szczep docelowy nie został zahamowany w tym leczeniu. Rysunek 2C i Rysunek 2D pokazuje te same zatłoczone i rozproszone zabiegi opisane powyżej, tym razem z użyciem mutanta T6SS jako szczepu inhibitora. Nie zaobserwowano, aby komórki docelowe znikały lub zaokrąglały się, gdy były inkubowane z mutantem T6SS w warunkach zatłoczenia lub rozproszenia, co ponownie sugeruje, że cel nie był hamowany w żadnym z zabiegów.

Rysunek 3 pokazuje proces analizy FIJI używany do ilościowego określenia konkurencji w tym protokole. Wybrano reprezentatywny obraz z kanału docelowego (Rysunek 3A) i utworzono maskę binarną przy użyciu domyślnych ustawień progu w FIJI (Rysunek 3B). Skala obrazu została ustawiona odpowiednio do tej konfiguracji mikroskopowej. Cząstki analizowano za pomocą parametru size = 0 - infinity, parametru circularity = 0,00 - 1,00 i wybrano opcję Show Outlines (Rysunek 3C). Wyniki tej analizy cząstek są pokazane zarówno jako ponumerowany kontur każdej cząstki (Rysunek 3D), jak i jako tabela z kolumnami dla liczby cząstek, nazwy pliku (etykiety) i obszaru cząstki w μm² (obszar) (Rysunek 3E).

W Rysunek 4, dane uzyskane z Rysunek 3E jest wykresowany i analizowany. W Rysunek 4A, procent początkowego obszaru docelowego w końcowym punkcie czasowym jest przedstawiony dla każdego zabiegu zgodnie z krokiem 8.2. Jeżeli odsetek początkowego obszaru docelowego jest większy niż 100, oznacza to wzrost netto wartości docelowej (tj. wzrost) i obserwuje się ją w warunkach, w których populacja docelowa nie jest znacząco zahamowana. Jeśli jednak odsetek początkowego obszaru docelowego jest mniejszy niż 100, wynik ten wskazuje na spadek netto wartości docelowej (tj. śmierć) i jest obserwowany w warunkach, w których populacja docelowa jest znacznie zahamowana. Gdy cel został połączony z inhibitorem typu dzikiego w zatłoczonych warunkach, dane pokazują spadek netto obszaru docelowego. W przeciwieństwie do tego, gdy cel był inkubowany z inhibitorem typu dzikiego w warunkach dyspersji lub mutantem T6SS w warunkach zatłoczenia lub rozproszenia, dane pokazują wzrost netto obszaru docelowego. Procent początkowego obszaru docelowego, gdy cel był inkubowany z inhibitorem typu dzikiego w zatłoczonych warunkach, był poniżej 100 i znacznie niższy niż we wszystkich innych zabiegach, zgodnie z jednoczynnikową ANOVA, po której nastąpił test wielokrotnych porównań Tukeya we wszystkich terapiach (p < 0,0001). Dane te wskazują, że śmierć komórki docelowej jest zależna od funkcjonalnego T6SS w inhibitorze i podkreślają znaczenie konfiguracji eksperymentalnej, która umożliwia wystarczający kontakt komórka-komórka, w celu wykrycia śmierci komórki w wyniku mechanizmu zabijania zależnego od kontaktu.

Rysunek 4B przedstawia procent początkowego obszaru inhibitora w końcowym punkcie czasowym dla każdego zabiegu. W tym przykładzie zaobserwowano wzrost netto szczepu inhibitora we wszystkich terapiach. Jednak procent początkowego obszaru inhibitora był znacznie wyższy, gdy inhibitor typu dzikiego był inkubowany z celem w zatłoczonych warunkach w porównaniu ze wszystkimi innymi terapiami, zgodnie z jednoczynnikową ANOVA, po której nastąpił test wielokrotnych porównań Tukeya we wszystkich terapiach (p < 0,0001). Początkowo uznaliśmy, że wzrost netto obszaru inhibitora może być spowodowany wzrostem dostępnej przestrzeni, w którą można się rozrosnąć w miarę eliminacji komórek docelowych. Jednak tego samego wzrostu inhibitora nie zaobserwowano w leczeniu dyspersyjnym, w którym komórki inhibitorowe miały miejsce na wzrost od początku komonety. Alternatywnie, wynik ten może sugerować, że składniki odżywcze uwalniane z komórek docelowych lizujących pozwalają na większy wzrost populacji inhibitora. Podsumowując, wyniki te sugerują, że szczep inhibitora eliminuje cel w sposób zależny od T6SS tylko wtedy, gdy wysoki kontakt komórka-komórka jest wymuszany przez stłoczenie komórek na szkiełku.

Rysunek 1: Przygotowanie podkładki agarozowej i ustawienie preparatu do testów coincubation. (A) Ustawienie do przygotowania 2% padów agarozowych. Pięć warstw taśmy laboratoryjnej (zielonej) jest owiniętych wokół szkiełka nakrywkowego w dwóch punktach oddalonych od siebie o około 20 mm. Następnie, ciepła 2% agaroza w mPBS (żółta) jest pipetowana między kawałkami taśmy i natychmiast przykrywana szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 25^mm2 i pozostawiana do zestalenia się na co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Użyj żyletki, aby pociąć podkładkę agarozową na ~5 mm² kawałki i użyj pęsety, aby przenieść podkładkę na nowy szkiełko w celu obrazowania. (B) Podczas obrazowania pod mikroskopem pionowym umieścić waft agarozowy o średnicy 5 mm² bezpośrednio na szkiełku podstawowym, następnie na mieszanej kulturze (niebieskiej) i okrągłym szkiełku nakrywkowym #1,5 o średnicy 12 mm. (C) Podczas obrazowania pod mikroskopem odwróconym, należy umieścić wymieszaną kulturę bezpośrednio na dnie szkiełka nakrywkowego #1,5 szalki Petriego o średnicy 35 mm, i umieścić podkładkę agarozową na wierzchu kultury, a następnie drugie okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm, aby spłaszczyć płatek agarozowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Obrazy poklatkowe miejsc coincubation w warunkach zatłoczenia lub rozproszenia. (A) Reprezentatywne obrazy w początkowych i końcowych punktach czasowych, gdzie mieszana kultura inhibitora typu docelowego i dzikiego była skoncentrowana 3x przed zauważeniem na szkiełku, aby wymusić kontakt komórka-komórka między szczepami. Białe strzałki w kanale TRITC wskazują przykłady komórek docelowych, które zaokrąglają się lub ulegają lizie w trakcie trwania eksperymentu. (B) Reprezentatywne obrazy, na których zauważono mieszaną kulturę inhibitora typu docelowego i dzikiego bez koncentracji, tak że komórki są rozproszone, a kontakt komórka-komórka między szczepami jest minimalny. Szare strzałki w kanałach FITC i TRITC wskazują przykłady podziału komórek w trakcie trwania eksperymentu. (C) Reprezentatywne obrazy, w których mieszana kultura celu ^{i mutanta} T6SS była skoncentrowana 3x przed zauważeniem na szkiełku, aby wymusić kontakt komórka-komórka między szczepami. (D) Reprezentatywne obrazy, w których mieszana kultura celu ^{i mutanta} T6SS- została zauważona bez koncentracji, tak że komórki są rozproszone i jest minimalny kontakt komórka-komórka między szczepami. Paski skali = 5 μm i są spójne na wszystkich obrazach; Kanał TRITC jest w kolorze fałszywie purpurowym, kanał FITC jest w kolorze fałszywie zielonym. Dekonwolucja została wykonana na wszystkich obrazach; Tło zostało odjęte, a jasność/kontrast dostosowano równomiernie na wszystkich obrazach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przebieg analizy FIDŻI. (A) Reprezentatywny obraz do analizy. Ten przepływ pracy jest powtarzany dla obu kanałów we wszystkich polach widoku i próbkach. Paski skali = 5 μm i są spójne na wszystkich obrazach; Kanał TRITC jest w kolorze fałszywie purpurowym, kanał FITC jest w kolorze fałszywie zielonym. (B) Maska binarna utworzona przez progowanie obrazu przy użyciu ustawień domyślnych na FIDŻI. (C) Przykład ustawień do analizy cząstek użytych w tym manuskrypcie. Zakres rozmiarów = 0 - nieskończoność μm²; cyrkularność = 0,00 - 1,00; pokaż = kontury. (D) Kontur cząstek utworzony jako wynik analizy cząstek w (C). Kontur cząstek w (D) powinien być porównany z oryginalnym obrazem (A), aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały uchwycone w analizie cząstek. (E) Tabela wyników utworzona jako wynik analizy cząstek w (C). Numer obiektu (kolumna 1) odpowiada pojedynczym cząstkom (jednej lub więcej komórkom) obrysowanym i oznaczonym na czerwono w panelu (D). Etykieta = nazwa pliku analizowanego obrazu; Powierzchnia = całkowita powierzchnia cząstek w μm². Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przykładowe dane do oceny, czy szczep docelowy jest zahamowany. Procent początkowej powierzchni w końcowych punktach czasowych dla szczepu docelowego (A) i szczepu inhibitora (B), przy różnych początkowych gęstościach komórek. Gęstość szkiełka wskazuje albo początkową gęstość komórek, która jest stłoczona (wysoki kontakt komórek między szczepami), albo bardziej rozproszoną (niski kontakt komórek między szczepami), jak opisano w Rysunek 2. Genotyp inhibitora wskazuje, że szczep typu dzikiego lub zmutowany T6SS (T6SS^-) był inkubowany ze szczepem docelowym. Gwiazdki wskazują na istotną różnicę w % zmiany porównującej wszystkie terapie (jednoczynnikowa ANOVA, a następnie test wielokrotnych porównań Tukeya porównujący wszystkie terapie; (p < 0,0001). Linia przerywana oznacza brak zmiany netto powierzchni odkształcenia między początkowym a końcowym punktem czasu; Zmiana procentowa > 100 oznacza wzrost netto (tj. wzrost), a zmiana % < 100 oznacza spadek netto (tj. śmierć komórki). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Opisany powyżej protokół stanowi potężne narzędzie do ilościowego określania i charakteryzowania konkurencji międzybakteryjnej na poziomie pojedynczej komórki. Ten test, który został opracowany przez modyfikację naszego testu konkurencji opartego na CFU na płytkach agarowych ^1,2, pozwolił na wizualizację konkurencji pojedynczych komórek wśród izolatów V. fischeri i przedstawiono sugestie dotyczące optymalizacji metody dla szerokiej gamy systemów i konfiguracji mikroskopowych. Chociaż opisana tutaj metoda została zoptymalizowana dla symbionta V. fischeri, można ją łatwo zmodyfikować, aby pomieścić wiele różnorodnych, zdolnych do hodowli drobnoustrojów. Ważne jest, aby pamiętać, że mechanizmy konkurencyjne mogą być regulowane przez dowolną liczbę zmiennych środowiskowych, w tym temperaturę, zasolenie i lepkość 30,31,32,33,34. Wcześniejsze prace potwierdziły, że V. fischeri konkuruje przy użyciu zależnego od kontaktu systemu wydzielania typu VI, który jest aktywny na powierzchni³⁰, co sprawia, że warunki opisane w tym teście są odpowiednie do badania konkurencji między przykładowymi szczepami. Ważne jest również, aby wziąć pod uwagę początkową gęstość komórek na szkiełku podczas ilościowego określania konkurencji bakteryjnej. Biorąc pod uwagę, że kontakt między komórkami docelowymi i inhibitorowymi jest często wymagany do zamieszkania, mieszana hodowla powinna być skoncentrowana w taki sposób, aby kontakt komórka-komórka był zmaksymalizowany, a komórki pozostały w jednej płaszczyźnie na szkiełku. Hodowle komórkowe powinny być hodowane do podobnej gęstości optycznej (faza mid-log), a następnie skoncentrowane w celu wymuszenia kontaktu, a nie po prostu hodowanie kultur do wyższej gęstości optycznej ze względu na fizjologiczne zmiany komórek w różnych fazach wzrostu. W innych systemach może zaistnieć potrzeba modyfikacji warunków hodowli i konfiguracji eksperymentalnej, aby zapewnić, że mechanizm konkurencji jest aktywny i może być wykryty w warunkach coincubacji.

Podkładki agarozowe użyte w tym teście zapewniają kilka korzyści: zapewniają stabilizację, dzięki czemu komórki nie poruszają się swobodnie, i zapobiegają wysychaniu kultury w trakcie eksperymentu. Dodatkowo, jeśli do eksperymentu wymagane są induktory chemiczne, takie jak izopropylo-β-D-tiogalaktozyd (IPTG), można je łatwo dodać do roztworu agarozy. Należy jednak pamiętać, że preparat agarozy prawdopodobnie będzie musiał zostać dostosowany do różnych systemów. W opisanym powyżej przykładzie podkładkę agarozową przygotowano przez rozpuszczenie 2% agarozy (w/v) w 20 psu mPBS, co jest standardowym zasoleniem stosowanym w pożywce wzrostowej V. fischeri . Co więcej, w niektórych przypadkach może być konieczne dodanie źródła węgla do podkładki agarozowej, aby komórki mogły rosnąć i konkurować przez dłuższe eksperymenty. W takim przypadku mPBS w płatkach agarozowych można zastąpić dowolnym podłożem wzrostowym, chociaż składniki odżywcze w pożywce wzrostowej mogą wiązać się z kompromisem w postaci dodatkowej fluorescencji tła.

Bez zastrzeżonego oprogramowania do analizy obrazu może być bardzo trudno uzyskać liczbę pojedynczych komórek, gdy kontakt komórka-komórka jest wysoki, co, jak pokazujemy tutaj, jest wymagane do zaobserwowania zabijania zależnego od kontaktu. Test ten został zaprojektowany w celu zapewnienia alternatywnej metody oznaczania ilościowego, która nie opiera się na liczbie pojedynczych komórek. Zamiast tego całkowita powierzchnia komórek dla każdego kanału fluorescencyjnego jest wykorzystywana do ilościowego określenia zakresu zabijania między współkumulowanymi szczepami. Ponieważ ta metoda opiera się na obszarze, a nie na liczbie pojedynczych komórek, domyślne ustawienia progów są zwykle wystarczające do określenia całkowitego obszaru komórki. Dokładność progowania można zweryfikować, dzieląc całkowitą powierzchnię obiektu dla reprezentatywnego pola widzenia przez średnią wielkość komórki dla organizmu modelowego i porównując tę szacowaną liczbę komórek z ręcznym liczeniem komórek dla tego samego obrazu.

W przypadku jednoczesności między jednym inhibitorem a jednym szczepem docelowym (niezabójczym) przewiduje się wzrost netto inhibitora. Jak widać na rycinie 4, wzrost inhibitora może być znacznie wyższy w leczeniu, w którym obserwuje się zabijanie, w porównaniu z leczeniem, w którym nie obserwuje się zabijania, być może dlatego, że składniki odżywcze uwalniane przez lizę komórek docelowych umożliwiają szybszy wzrost szczepu inhibitora. W pokazanym tutaj przykładzie obserwuje się śmierć netto celu, ponieważ konkurencja za pośrednictwem T6SS powoduje lizę komórek docelowych, w której cel jest fizycznie eliminowany. Należy jednak zauważyć, że nie wszystkie mechanizmy konkurencyjne prowadzą do fizycznej eliminacji komórek docelowych. Jeśli cel jest obezwładniony przez toksynę, która powoduje zahamowanie wzrostu, opisany tutaj protokół może spowodować, że widoczna populacja docelowa pozostanie stabilna w czasie, ponieważ komórki docelowe już nie rosną, ale także nie ulegają lizie. W takim przypadku właściwe byłoby porównanie wyników tego testu z badaniami uzupełniającymi dotyczącymi żywotności komórek docelowych, takimi jak posiew dla jednostek tworzących kolonie (CFU) lub poprzez przeprowadzenie testów żywych martwych przez barwienie jodkiem propidyny lub zielenią SYTOX^35,36.

W porównaniu z testami komonetkulacyjnymi, które opierają się na liczbie CFU, test ten umożliwia obserwację i ilościowe określenie struktury przestrzennej konkurencji między szczepami oraz śledzenie zmian w morfologii komórek docelowych w czasie. Na przykład wiadomo, że komórki inhibitorowe, które zabijają za pomocą T6SS, kodują białka domeny LysM, które degradują docelową ścianę komórkową, powodując początkowe zaokrąglenie komórek, a następnie lizę¹³, co zaobserwowaliśmy w przykładzie pokazanym na rysunku 2A. Co więcej, protokół ten może być używany do śledzenia konkurencji w wysokiej rozdzielczości w bardzo krótkich skalach czasowych. W przedstawionym przykładzie obserwuje się znaczne zmniejszenie obszaru docelowego już po dwóch godzinach, gdy komórki są stłoczone, a kontakt komórka-komórka jest wymuszony między szczepami (ryc. 4). Opisana tu analiza obrazu mogłaby być również przeprowadzona za pomocą mikroskopii konfokalnej, co umożliwiłoby badanie konkurencji bakterii in vivo lub w złożonych biofilmach, bez zaburzania przestrzennego rozkładu współinkubowanych szczepów.

Podsumowując, opisany tutaj test ma na celu zapewnienie dostępnego i łatwego do modyfikacji podejścia do wizualizacji i ilościowego określania konkurencji bakterii na poziomie pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta może być stosowana do różnych izolatów bakteryjnych i może być stosowana do wizualizacji konkurencji bakteryjnej nawet w złożonych środowiskach, takich jak matryca gospodarza lub biofilmu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Probówka mikrowirówkowa 1,5 ml	Fisher	05-408-129
Pipeta
10 uL Pipeta
uL Pipeta jednokanałowa 20 uL Pipeta
			jednokanałowa 200 uL
Agaroza	Fisher	BP165-25	Niskotopliwy agaroza
Kalkulator
Cellvis 35 mm Naczynie	Fisher	NC0409658	#1.5 szklane dno pokrywy
Chloramfenikol	Sigma	C0378	(20 mg/ml w etanolu); końcowe stężenie w pożywce (2 μ g /mL LBS)
DAPI Barwnik kwasem nukleinowym	Fisher	EN62248	opcjonalnie (jeśli nie używasz stabilnych plazmidów)
Oprogramowanie do analizy obrazu FIJI	ImageJ	https://imagej.net/Fiji/Downloads	oprogramowanie open source
Okulary ochronne Fisherbrand: Koła	Fisher	12-545-81P	#1.5 szkło nakrywkowe;
Siarczan Kanamycyny	Fisher	BP906-5	bulion (100 mg/ml w wodzie, sterylizacja filtra); stężenie końcowe w pożywkach (1 μ g / mL LBS)
Bibułka do czyszczenia soczewek	Fisher	S24530
Parafilm	Fisher	13-374-12
Płytki Petriego	Fisher	FB0875713	sterylne z pokrywką
Żyletki	Fisher	S65921
Kuwety półmikro
SYBR Zielony barwnik kwasu nukleinowego	Fisher	S7563	opcjonalnie (jeśli nie używasz stabilnych plazmidów)
Thermo Scientific Gold Seal Zwykłe szkiełka mikroskopowe	Fisher	12-518-100B
Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Szkło osłonowe	Fisher	22-050-235	#1,5, 25 mm2
Type F Olejek immersyjny	Fisher	NC0297589
Pionowy lub odwrócony mikroskop fluorescencyjny z kamerą i oprogramowaniem			Obrazy w tym artykule zostały uzyskane za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego TI-2 firmy Nikon wyposażonego w kamerę ORCA-Fusion Digital CMOS przy użyciu oprogramowania NIS-Elements.
		wodna
LBS pożywka
1M Tris Buffer (pH ~7,5)			50 ml 1 M bufor podstawowy (62 mL HCl, 938 ml wody DI, 121 g Trizma Base)
Agar Technical	Fisher	DF0812-17-9	15 g (Dodaj tylko na płytki)
DI woda			950 ml
chlorku sodu	Fisher	S640-3	20 g
Trypton	Fisher	BP97265	10 g
Ekstrakt drożdżowy	Fisher	BP9727-2	5 g
mPBS (morski PBS)			fizjologiczna buforowana fosforanem z dodatkiem soli morskich; używana do wyrobu padu agarozowego
10X PBS	Fisher
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS1-160P	Dostosuj stężenie do odpowiedniego zasolenia; Zastosowano tutaj 20 psu
Sterylne filtry próżniowe	Fisher	SCGVU01RE	Służy do filtrowania-sterylizacji mPBS
		próżniowa	Służy do filtrowania-sterylizacji mPBS