Artykuł metodologiczny

Przygotowanie wielofunkcyjnych mikrokapsułek na bazie jedwabiu wypełnionych plazmidami DNA kodującymi aptamery RNA i ryboprzełączniki

DOI:

10.3791/62854

⸱

8 października 2021

 ,  ,  , 
1UES Inc., 2711th Human Performance Wing, Airman Systems Directorate, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson AFB, 3Materials and Manufacturing Directorate, Wright-Patterson AFB

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje tworzenie wytrzymałych i biokompatybilnych mikrokapsułek z DNA jako multipleksowane biosensory in vitro zdolne do śledzenia kilku ligandów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadzamy protokół do przygotowania mikrokapsułek fibroiny jedwabnej z DNA za pomocą metody składania warstwa po warstwie (LbL) na protektorowych rdzeniach sferycznych. Po adsorpcji warstwy podstawowej i plazmidów DNA, tworzenie wytrzymałych mikrokapsułek było ułatwione poprzez indukcję β-arkuszy w strukturze drugorzędowej jedwabiu podczas ostrego odwodnienia pojedynczej warstwy jedwabiu. W związku z tym nawarstwianie zaszło poprzez wielokrotne wiązania wodorowe i oddziaływania hydrofobowe. Po adsorpcji wielowarstwowych powłok, struktury rdzeń-powłoka mogą być dalej funkcjonalizowane za pomocą nanocząstek złota (AuNPs) i/lub przeciwciał (IgG) do wykorzystania do teledetekcji i/lub celowanego dostarczania. Dostosowanie kilku kluczowych parametrów podczas sekwencyjnego osadzania kluczowych makrocząsteczek na rdzeniach krzemionkowych, takich jak obecność startera polimerowego, stężenie DNA i białka jedwabiu, a także liczba zaadsorbowanych warstw, zaowocowało biokompatybilnymi, obciążonymi DNA mikrokapsułkami o zmiennej przepuszczalności i ładunkach DNA. Po rozpuszczeniu rdzeni krzemionkowych, protokół wykazał tworzenie się pustych i wytrzymałych mikrokapsułek z plazmidami DNA unieruchomionymi na wewnętrznej powierzchni błony kapsułki. Stworzenie selektywnie przepuszczalnej, biokompatybilnej błony między plazmidami DNA a środowiskiem zewnętrznym pozwoliło zachować DNA podczas długotrwałego przechowywania i odegrało ważną rolę w poprawie odpowiedzi wyjściowej plazmidów ograniczonych przestrzennie. Aktywność matryc DNA i ich dostępność badano podczas reakcji transkrypcji i translacji in vitro (systemy bezkomórkowe). Plazmidy DNA kodujące aptamery i ryboprzełączniki zapalające RNA zostały z powodzeniem aktywowane za pomocą odpowiednich analitów, co uwidoczniono podczas lokalizacji znakowanych fluorescencyjnie transkryptów RNA lub białka GFPa1 w błonach otoczki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziedzina biologii syntetycznej oferuje unikalne możliwości rozwijania zdolności wykrywania poprzez wykorzystanie naturalnych mechanizmów wyewoluowanych przez mikroorganizmy do monitorowania ich środowiska i potencjalnych zagrożeń. Co ważne, te mechanizmy wykrywania są zwykle powiązane z reakcją, która chroni te mikroorganizmy przed szkodliwym narażeniem, regulując ekspresję genów w celu złagodzenia negatywnych skutków lub zapobieżenia spożyciu materiałów toksycznych. Podjęto znaczne wysiłki w celu zmodyfikowania tych mikroorganizmów w celu stworzenia czujników całokomórkowych wykorzystujących te naturalne reakcje, ale przekierowujących je w celu rozpoznawania nowych ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa wektora plazmidowego.

  1. Skonstruuj wektor plazmidowy (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) poprzez amplifikację sekwencji kodującej ryboprzełącznika teofiliny (ThyRS) sprzężonego z GFPa1 z wektora pJ201:23976-RS-GFPa1 (zaprojektowanego i stworzonego przez DNA2.0) i insercję do wektora ekspresyjnego E. coli, pSAL13. Użyj starterów do przodu (5'-CGTGGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATG-3') i do tyłu (5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3') w celu amplifikacji sekwencji kodującej ThyRS sprzężonej z GFPa1 i przeprowadź reakcję PCR w objętości 50 μl przy użyciu polimerazy DNA zgodnie z protokołem producenta14.
  2. Pr....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj badanie dotyczy funkcjonalności szablonów DNA kodujących różne projekty czujników (dwa rodzaje regulowanych przez RNA elementów transkrypcji/translacji) po enkapsulacji w kapsułkach z białka jedwabiu. Mikrokapsułki przygotowano za pomocą szablonowego montażu warstwa po warstwie (LbL) kluczowych elementów: warstwy podstawowej, plazmidów DNA kodujących projekty czujników i biopolimeru fibroiny jedwabiu (Rysunek 2). Osadzanie makrocząsteczek w sposób warstwowy pozwala na kontrolowanie przepuszczaln.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z tym protokołem można przygotować selektywnie przepuszczalne mikrokapsułki hydrożelowe z różnymi typami czujników kodowanych DNA. Jedną z charakterystycznych cech podejścia LbL jest możliwość dostosowania złożoności mikrokapsułek podczas składania od dołu do góry, które zwykle rozpoczyna się od adsorpcji gatunków molekularnych na matrycach ofiarnych. Poprzez staranne dostosowanie stężeń początkowych składników, warunków pH i liczby warstw, można przygotować mikrokapsułki o różnych parametrach obciążenia DNA, fun.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poglądy i opinie przedstawione w niniejszym dokumencie są poglądami autorów i niekoniecznie reprezentują poglądy Departamentu Obrony lub jego Komponentów

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant LRIR 16RH3003J z Biura Badań Naukowych Sił Powietrznych, a także program Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S&T Priorities (ARAP) Biura Podsekretarza Obrony Stanów Zjednoczonych ds. Badań i Inżynierii.

Sekwencja wektora plazmidowego dla ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) została hojnie dostarczona przez Dr. J. Gallivana. Kokony jedwabników z Bombyx mori zostały hojnie podarowane przez dr D.L. Kaplana z Tufts University, MA.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroksybenzylideno)-2-metylo-1-(2,2,2-trifluoroetylo)-1H-imidazol-5(4 H)-on (DFHBI-1T)LucernaDFHBI-1T
5x T4 Lufor ligazy DNAThermoFisher Scientific46300-018
6x Niebieski żel Ładowanie BarwnikNew England BioLabsB7021S
96-dołkowe, czarne okrągłeCorning3601
AgarozaSigma-AldrichA9539BioReagent, do biologii molekularnej, sól
sodowa ampicylinySigma-AldrichA0166BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych
Enzymy restrykcyjne BlpINew England BioLabsR0585S Corning Jednorazowy
filtr/systemy przechowywaniapróżniowego FisherScientific09-761-1
Odczynnik DMSOSigma-Aldrich472301ACS, ≥ 99.9%
Plazmid DNA, pET28c-F30-2x Brokuły (5.4 kb), BrocApt.AddgenePlasmid #66788
Zestaw do znakowania przeciwciał DyLightTM550 (Invitrogen)ThermoFisher Scientific84530
E. coli S30 do okrągłego DNAStożkoweL1020
Falcon, 15 mlFisherScientific14-959-53A
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon, 50 ml14-432-22
Probówki do mikrowirówek Fisherbrand, 1,5 mlFisherScientific05-408-129
Kwas fluorowodorowy, odczynnik HFSigma-Aldrich695068ACS, 48%
siarczan kanamycynySigma-Aldrich60615mieszanina Kanamycyny A (główny składnik) oraz enzymów restrykcyjnych Kanamycyny B i C
KpnINew England BioLabsR0142S
Płytka agarowa LB uzupełniona 100 &mikro; g/ml ampicylinySigma-AldrichL5667wstępnie wylane płytki agarowe z 100 &mikro; g/ml ampicylina
LB płytka agarowa uzupełniona 50 &mikro; g / ml kanamycynySigma-AldrichL0543wstępnie wylane płytki agarowe z 50 &mikro; g/ml bulion kanamycyny
LB (klasa Lennoxa)Sigma-AldrichL3022
Bromek litu, LiBrSigma-Aldrich213225ReagentPlus, ≥ 99%
Maksymalna wydajność DH5-α kompetentny szczep E. coliThermoFisher Scientific18258012
MetanolMilliporeSigma322415bezwodny, 99,8%
MilliQ-waterEMD MilliPoreMilli-Q Referencyjny system oczyszczania wody
MinElute PCR Zestaw do oczyszczaniaQiagen28004
Chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N′-etylokarbodimidu, EDCSigma-AldrichE1769
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem)ThermoFisher Scientific100100231x PBS, pH 7,4
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England BiolabsM0530S
Polietylenomenimina, rozgałęzionaSigma-Aldrich408727średnia Mw ~ 25 000
Zestaw do syntezy białek in vitro PURExpress NewEngland BioLabsE6800S
QIAEX II Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen20021
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen  27104
Drabina DNA z 2 kłódami (0,1-10,0 kb)New England BioLabsN0469S
SiO? Mikrosfery krzemionkowe, 4,0 i mikro; mPolysciences, Inc.24331-1510% roztwór wodny
Kasety dializacyjne Slide-A-Lyzer G2, 3,5 tys. MWCO, 15 mlThermoFisher Scientific87724
Węglan sodu, Na?CO?Sigma-Aldrich222321odczynnik ACS, bezwodny, ≥ 99,5%, proszek
Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Urządzenia do dializyFisherScientific08-607-008Spectrum G235058
SYBR Bezpieczne barwienie żelowe DNAThermoFisher ScientificS33102
Ligaza DNA T4 (5 U/&mikro; L)ThermoFisher ScientificEL0011
TheophyllineSigma-AldrichT1633bezwodny, ≥ 99%, proszek
Bufor Tris Acetate-EDTA (bufor TAE)Sigma-AldrichT6025Zawiera 40 mM Tris-octan i 1 mM EDTA, pH 8,3.
UltraPure Woda destylowana bez DNaz/RNazFisherScientific10-977-023
Zestaw ZymoPURE II Plasmid MaxiPrepZymoResearchD4202
o niskiej EEO Proszek lub kryształy , System ekstraktu probówki wirówkowe Promega

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).
  2. Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Silk MicrocapsulesDNA PlasmidsLayer by Layer AssemblySilk FibroinRNA AptamersRiboswitchesConfocal MicroscopyIn Vitro TranscriptionTargeted DeliveryMicrocapsule Permeability

Powiązane artykuły