Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie wielofunkcyjnych mikrokapsułek na bazie jedwabiu wypełnionych plazmidami DNA kodującymi aptamery RNA i ryboprzełączniki

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62854

⸱

8 października 2021

 ,  ,  , 
1UES Inc., 2711th Human Performance Wing, Airman Systems Directorate, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson AFB, 3Materials and Manufacturing Directorate, Wright-Patterson AFB

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisuje tworzenie wytrzymałych i biokompatybilnych mikrokapsułek z DNA jako multipleksowane biosensory in vitro zdolne do śledzenia kilku ligandów.

Streszczenie

Wprowadzamy protokół do przygotowania mikrokapsułek fibroiny jedwabnej z DNA za pomocą metody składania warstwa po warstwie (LbL) na protektorowych rdzeniach sferycznych. Po adsorpcji warstwy podstawowej i plazmidów DNA, tworzenie wytrzymałych mikrokapsułek było ułatwione poprzez indukcję β-arkuszy w strukturze drugorzędowej jedwabiu podczas ostrego odwodnienia pojedynczej warstwy jedwabiu. W związku z tym nawarstwianie zaszło poprzez wielokrotne wiązania wodorowe i oddziaływania hydrofobowe. Po adsorpcji wielowarstwowych powłok, struktury rdzeń-powłoka mogą być dalej funkcjonalizowane za pomocą nanocząstek złota (AuNPs) i/lub przeciwciał (IgG) do wykorzystania do teledetekcji i/lub celowanego dostarczania. Dostosowanie kilku kluczowych parametrów podczas sekwencyjnego osadzania kluczowych makrocząsteczek na rdzeniach krzemionkowych, takich jak obecność startera polimerowego, stężenie DNA i białka jedwabiu, a także liczba zaadsorbowanych warstw, zaowocowało biokompatybilnymi, obciążonymi DNA mikrokapsułkami o zmiennej przepuszczalności i ładunkach DNA. Po rozpuszczeniu rdzeni krzemionkowych, protokół wykazał tworzenie się pustych i wytrzymałych mikrokapsułek z plazmidami DNA unieruchomionymi na wewnętrznej powierzchni błony kapsułki. Stworzenie selektywnie przepuszczalnej, biokompatybilnej błony między plazmidami DNA a środowiskiem zewnętrznym pozwoliło zachować DNA podczas długotrwałego przechowywania i odegrało ważną rolę w poprawie odpowiedzi wyjściowej plazmidów ograniczonych przestrzennie. Aktywność matryc DNA i ich dostępność badano podczas reakcji transkrypcji i translacji in vitro (systemy bezkomórkowe). Plazmidy DNA kodujące aptamery i ryboprzełączniki zapalające RNA zostały z powodzeniem aktywowane za pomocą odpowiednich analitów, co uwidoczniono podczas lokalizacji znakowanych fluorescencyjnie transkryptów RNA lub białka GFPa1 w błonach otoczki.

Wprowadzenie

Dziedzina biologii syntetycznej oferuje unikalne możliwości rozwijania zdolności wykrywania poprzez wykorzystanie naturalnych mechanizmów wyewoluowanych przez mikroorganizmy do monitorowania ich środowiska i potencjalnych zagrożeń. Co ważne, te mechanizmy wykrywania są zwykle powiązane z reakcją, która chroni te mikroorganizmy przed szkodliwym narażeniem, regulując ekspresję genów w celu złagodzenia negatywnych skutków lub zapobieżenia spożyciu materiałów toksycznych. Podjęto znaczne wysiłki w celu zmodyfikowania tych mikroorganizmów w celu stworzenia czujników całokomórkowych wykorzystujących te naturalne reakcje, ale przekierowujących je w celu rozpoznawania nowych celów i/lub wytwarzania mierzalnego sygnału, który można zmierzyć w celu ilościowego określenia (zwykle fluorescencji)1,2. Obecnie obawy związane ze stosowaniem mikroorganizmów modyfikowanych genetycznie (GMO), zwłaszcza podczas ich uwalniania do środowiska lub ciała ludzkiego, z powodu wycieku całych komórek lub części ich materiału genetycznego, nawet jeśli są zamknięte w matrycy polimerowej, sugerują, że potrzebne są alternatywne sposoby wykorzystania tych podejść do wykrywania3.

Skutecznym podejściem do wykorzystania korzyści płynących z wykrywania opartego na mikroorganizmach bez obaw o wdrożenie GMO jest użycie systemów transkrypcji/translacji in vitro (IVTT). Z praktycznego punktu widzenia, systemy IVTT składają się z mieszaniny zawierającej większość składników komórek w stanie aktywnym, która została "wyekstrahowana" z komórek za pomocą różnych środków, w tym sonikacji, bicia perełkami lub innych4. Produktem końcowym tego procesu jest biochemiczna mieszanina reakcyjna, już zoptymalizowana pod kątem transkrypcji i translacji, która może być wykorzystana do testowania różnych czujników w formacie "otwartego naczynia", bez ograniczeń związanych z użyciem całych komórek (dyfuzja błonowa, wydajność transformacji, toksyczność komórek itp.). Co ważne, różne komponenty czujnika mogą być dodawane ilościowo, a ich działanie badane za pomocą różnych technik optycznych i spektrometrycznych, jak pokazaliśmy5. Zauważono, że wydajność systemów IVTT może być niespójna; Jednak ostatnie badania wykazały podejścia mające na celu standaryzację ich przygotowania i charakteryzacji, co jest bardzo pomocne podczas badania ich wydajności w projektowaniu czujników6. Ostatnio zademonstrowano wiele przykładów systemów IVTT wykorzystujących do tworzenia testów opartych na papierze poprzez liofilizację ich składników w matrycach papierowych, w tym wykrywanie jonów metali ciężkich, leków, elementów czujników kworum i innych7,8,9. Ekscytującym obszarem zastosowań czujników opartych na IVTT jest ich zastosowanie w aplikacjach czujnikowych w różnych typach środowisk, w tym w glebie, wodzie i ludzkim ciele. Aby wdrożyć te systemy IVTT w tych trudnych środowiskach, należy wdrożyć podejście hermetyzacji, które ograniczy komponenty IVTT i ochroni je przed degradacją.

Najczęstsze metody enkapsulacji dla systemów IVTT obejmują użycie kapsułek lipidowych, miceli, polimeromów i innych ściśle zamkniętych mikropojemników10,11,12. Jedną z wad tego podejścia jest konieczność włączenia pasywnych lub aktywnych mechanizmów transportu materiałów do i z kontenerów, aby umożliwić komunikację ze środowiskiem zewnętrznym i zapewnić możliwości wykrywania. Aby przezwyciężyć niektóre z tych problemów, w niniejszym badaniu opisano metodę, która zapewnia proste, ale skuteczne podejście do hermetyzacji materiałów kodujących dla różnych projektów czujników, które mają być wyrażone w systemach IVTT. Podejście to opiera się na zastosowaniu osadzania biopolimeru warstwa po warstwie (LbL) w obecności interesujących plazmidów w celu stworzenia pustych mikrokapsułek o wysokiej porowatości, co pozwala chronionemu materiałowi genetycznemu na interakcję z różnymi składnikami wybranego IVTT. Badanie wykazało, że kapsułkowane plazmidy mogą kierować transkrypcją i translacją, gdy są aktywowane w tej matrycy polimerowej, jak pokazano w odpowiedzi kodowanego plazmidem aptameru i ryboprzełącznika na odpowiadające im cele. Dodatkowo ta powłoka LbL chroni plazmidy przez wiele miesięcy bez żadnych specjalnych warunków przechowywania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Konstrukcja wektora plazmidowego.

  1. Skonstruować wektor plazmidowy (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) poprzez amplifikację sekwencji kodującej ryboprzełącznik teofiliny (ThyRS) sprzężony z GFPa1 z wektora pJ201:23976-RS-GFPa1 (zaprojektowanego i stworzonego przez DNA2.0) i wstawienie go do wektora ekspresyjnego E. coli, pSAL13. Do amplifikacji sekwencji kodującej ThyRS sprzężonego z GFPa1 należy użyć starterów forward (5'-CGTGGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATG-3') i reverse (5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3'), a reakcję PCR przeprowadzić w objętości 50 µL z użyciem polimerazy DNA zgodnie z protokołem producenta14.
  2. Przygotować 1% żel agarozy z 0,5 g agarozy, 50 mL buforu TAE (40 mM octanu trisu, 1 mM EDTA, pH 8,0) i 3 µL barwnika do DNA.
  3. Zmieszać 5 µL aliquoty produktu amplifikowanego metodą PCR z 5 µL wody wolnej od RNazy/DNazy oraz 2 µL 6x barwnika do ładowania żelu i przeanalizować za pomocą elektroforezy w żelu agarozy. Jako referencję nałożyć drabinę DNA (0,1-10,0 kb). Prowadzić elektroforezę przy 120 V, aż linia barwnika prawie dotrze do dolnej krawędzi żelu.
  4. Wizualizować fragmenty DNA za pomocą systemu obrazowania z transiluminatorem UV, aby sprawdzić poprawność wielkości DNA15.
  5. Oczyścić produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania produktów PCR zgodnie z protokołem producenta16.
  6. Przetrawić produkt PCR i wektor ekspresyjny pSAL enzymami restrykcyjnymi KpnI i BlpI w reakcji o objętości 15 µL, zawierającej 10 µL produktu PCR lub wektora plazmidowego (stężenie 20-50 ng/µL), 1,5 µL 10x buforu enzymatycznego, 1 µL każdego z enzymów oraz 1,5 µL wody wolnej od RNazy/DNazy, w temperaturze 37 °C przez 2 h.
  7. Dodać 3 µL 6x barwnika do ładowania żelu do mieszaniny reakcyjnej i rozdzielić przetrawione fragmenty na 1% żelu agarozy zgodnie z opisem w krokach 1.3-1.5.
  8. Oczyścić fragmenty DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu zgodnie z protokołem producenta16.
  9. Ligować przetrawiony produkt PCR do przetrawionego zlinearyzowanego wektora plazmidowego pSAL z użyciem ligazy T4 DNA i uzupełnionego buforu do ligacji w reakcji o objętości 10 µL zawierającej 3-20 fmol przetrawionego wektora, 9-60 fmol przetrawionego produktu PCR, 2 µL buforu do ligacji, 1 µL (1 jednostka) ligazy T4 DNA oraz wody wolnej od DNazy/RNazy. Inkubować reakcję ligacji w temperaturze 25 °C przez 3 h.
    UWAGA: Należy upewnić się, że całkowita zawartość DNA w mieszaninie reakcyjnej wynosi 0,01-0,1 µg.
  10. Przetransformować kompetentne komórki E. coli DH5α ilością 10 ng mieszaniny reakcyjnej ligacji zgodnie z protokołem producenta17.
  11. Hodować przetransformowane komórki w temperaturze 37 °C przez noc na płytkach z agarem LB z dodatkiem ampicyliny (100 µg/mL).
  12. Wybrać 3-4 kolonie bakteryjne z płytki i aseptycznie przenieść każdą z nich do 5 mL pożywki LB z dodatkiem ampicyliny (100 µg/mL). Hodować kultury przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze wytrząsowym przy 225 rpm.
  13. Odwirować kultury nocne w temperaturze pokojowej przy 11 x g przez 3 min.
  14. Użyć zestawu do oczyszczania w celu wyizolowania plazmidów zgodnie z protokołem producenta16.
  15. Zweryfikować sekwencje oczyszczonych plazmidów poprzez sekwencjonowanie DNA. Mapa plazmidu i sekwencja otrzymanego konstruktu (pSALv-RS-GFPa1) przedstawione są na Rysunku 1.

2. Wielkoskalowa puryfikacja DNA.

  1. Przeprowadzić transformację wektora plazmidowego pSALv-RS-GFPa1 (3,4 kb) (kodującego ryboswitch teofiliny sprzężony z genem reporterowym GFPa1) lub pET28c-F30-2xBroccoli (5,4 kb) (kodującego aptamer Broccoli) do kompetentnych komórek E. coli DH5α zgodnie z protokołem producenta17.
  2. Hodować transformowane komórki przez noc w temperaturze 37 °C na płytkach z agarem LB z dodatkiem ampicyliny (100 µg/mL) dla komórek transformowanych pSALv-RS-GFPa1 lub kanamycyny (50 µg/mL) dla komórek transformowanych pET28c-F30-2x Broccoli.
  3. Wybrać 3-4 kolonie bakteryjne z płytki i aseptycznie przenieść każdą kolonię do 5 mL pożywki LB z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku (100 µg/mL ampicyliny lub 50 µg/mL kanamycyny). Hodować kultury przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze wytrząsowym przy 225 rpm.
  4. Wykorzystać 3 mL kultury nocnej do zaszczepienia 150 mL pożywki LB z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku (100 µg/mL ampicyliny lub 50 µg/mL kanamycyny) i hodować kultury przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze wytrząsowym przy 225 rpm.
  5. Osadzić komórki poprzez wirowanie przy ≥3400 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  6. Oczyścić plazmidy przy użyciu zestawu do puryfikacji zgodnie z protokołem producenta16.
  7. Eluować DNA przy użyciu 0,5 mL czystej wody wolnej od DNazy/RNazy. Zmierzyć stężenie DNA i przygotować 1 mL roztworów zapasowych DNA (100 ng/µL). Przechowywać probówki z DNA w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.

3. Ekstrakcja fibroiny jedwabiu i przygotowanie materiałów wyjściowych.

  1. Przygotować wodny roztwór zrekonstytuowanego białka fibroiny jedwabnej (SF) z kokonów jedwabnika Bombyx mori zgodnie z procedurą opisaną szczegółowo w innym źródle, aby uzyskać 10% roztworu jedwabiu w LiBr18.
  2. Wyznaczyć końcowe stężenie wodnego roztworu SF. Odmierzyć pipetą 0,5 mL roztworu jedwabiu do szalki Petriego o średnicy 60 mm, pozostawić do wyschnięcia w temperaturze 60 °C i zmierzyć wagę suchej błony jedwabnej. Podzielić suchą wagę przez 0,5 mL, aby obliczyć procentową zawartość masy w objętości.
  3. Rozcieńczyć skoncentrowany roztwór jedwabiu wodą destylowaną wolną od DNazy/RNazy, powoli dodając wodę za pomocą pipety serologicznej, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mg/mL. Roztwór przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.
  4. Przygotować fluorescencyjnie znakowaną fibroinę jedwabną przy użyciu zestawu do znakowania przeciwciał. Użyć 1 mL roztworu fibroiny jedwabnej o stężeniu 2 mg/mL, aby sprzęgnąć α-grupy aminowe N-końca białka z pochodną barwnika aktywowaną estrem NHS zgodnie z protokołem producenta19.
  5. Przygotować 50 mL wodnego roztworu glikolożywicy (PEI) o stężeniu 6 mg/mL, dostosować pH do wartości 4 za pomocą HCl (1 M). Przefiltrować roztwór przez sterylną membranę 0,2 µm. Przechowywanie jest możliwe w warunkach otoczenia przez kilka miesięcy.
  6. Przygotować rdzenie SiO2. Odmierzyć pipetą 300 µL cząsteczek SiO2 do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL. Przemyć mikrocząsteczki dwukrotnie 1 mL wody wolnej od DNazy/RNazy poprzez wirowanie przy 0,2 x g przez 1 min.

4. Przeprowadź osadzanie warstwa po warstwie (Layer-by-Layer) warstwy wstępnej, plazmidów DNA oraz warstw jedwabiu.

  1. Aby nanieść warstwę gruntującą PEI na mikrocząsteczki SiO2, dodać 1 mL roztworu PEI do osadu z etapu 3.6 i mieszać mieszaninę w warunkach otoczenia na termomikserze przy 800 rpm przez 15 min. Przemyć cząsteczki czterokrotnie 1 mL wody dejonizowanej wolnej od DNazy/RNazy poprzez wirowanie przy 0.2 x g przez 1 min.
  2. Aby przeprowadzić nanoszenie warstwy DNA, dodać 1 mL wodnego roztworu plazmidów DNA z etapu 2.7 do mikrocząsteczek zagruntowanych PEI i delikatnie mieszać mieszaninę w temperaturze 4 °C na termomikserze przy 800 rpm przez 15 min. Aby przygotować mikrokapsułki z różną zawartością DNA, dostosować stężenie plazmidów DNA w zakresie 50-200 ng/µL za pomocą destylowanej wody wolnej od DNazy/RNazy i użyć 1 mL tych roztworów do nanoszenia DNA. Zebrać mikrocząsteczki poprzez wirowanie przy 0.2 x g przez 1 min.
  3. Oznaczyć probówki z plazmidami DNA kodującymi ryboszalter teofiliny sprzężony z GFPa1 jako ThyRS-GFPa1 oraz plazmidami DNA kodującymi aptamer Broccoli jako BrocApt.
    UWAGA: Probówki do mikrowirowania z DNA przechowywać w lodzie.
  4. Ostrożnie usunąć nadsącz i przemyć mikrocząsteczki czterokrotnie 1 mL destylowanej wody wolnej od DNazy/RNazy, za każdym razem odrzucając nadsącz po wirowaniu przy 0.2 x g przez 1 min. Wszystkie eksperymenty przeprowadzać w temperaturze pokojowej (RT), chyba że zaznaczono inaczej.
  5. Aby przeprowadzić nanoszenie warstwy fibroiny jedwabnej, dodać 1 mL zrekonstytuowanego wodnego roztworu SF z etapu 3.3 do mikrocząsteczek z zaadsorbowanym DNA, delikatnie wymieszać na wirówce typu vortex i mieszać mieszaninę w temperaturze 10 °C na termomikserze przy 750 rpm przez 15 min. Zebrać mikrocząsteczki poprzez wirowanie przy 0.2 x g przez 1 min w temperaturze 4 °C, usunąć nadsącz, a następnie przemyć je raz 1 mL destylowanej wody wolnej od DNazy/RNazy. Powtórzyć wirowanie i odrzucić nadsącz.
    UWAGA: Podczas eksperymentu przechowywać roztwór jedwabiu w lodzie, aby uniknąć żelowania wywołanego temperaturą.
  6. Stopniowo traktować cząsteczki metanolem, aby wywołać tworzenie się struktur β-kartki w strukturze białka jedwabiu. Najpierw dodać 0.5 mL destylowanej wody wolnej od DNazy/RNazy, wymieszać probówkę do mikrowirowania na vortexie, a następnie dodać 0.5 mL 100% metanolu. Delikatnie wstrząsać cząsteczkami na termomikserze w 10 °C przez 5 min. Zebrać cząsteczki poprzez wirowanie przy 0.2 x g przez 1 min. Usunąć nadsącz.
  7. Traktować cząsteczki metanolem, aby wspomóc tworzenie się struktur β-kartki i zapewnić silną adsorpcję fizyczną warstwy jedwabiu. Dodać 1 mL 100% metanolu. Delikatnie wstrząsać cząsteczkami na termomikserze przy 750 rpm przez 10 min w 10 °C.
  8. Zebrać cząsteczki poprzez wirowanie przy 0.2 x g przez 1 min w 4 °C i przemyć je dwukrotnie 1 mL destylowanej wody wolnej od DNazy/RNazy, za każdym razem odrzucając nadsącz i delikatnie mieszając na vortexie przed kolejnym wirowaniem.
  9. Powtórzyć etapy 4.5-4.8 20 razy, aby uzyskać wielowarstwowe struktury typu rdzeń-powłoka z jedwabiu. W ostatnim kroku nanoszenia użyć jedwabiu znakowanego fluorescencyjnie z etapu 3.4 (Silk-DyLight550, 1 mL).
  10. Przeprowadzić ostatni etap płukania i przechowywać mikrocząsteczki w 1 mL destylowanej wody wolnej od DNazy/RNazy w warunkach otoczenia.
    UWAGA: Aby uniknąć agregacji cząsteczek podczas nanoszenia warstw jedwabiu, przeprowadzić kontrolę wizualną zawiesiny cząsteczek i pipetować ją w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety 1 mL, aby zapewnić jednorodne rozprzestrzenienie cząsteczek.
  11. Obliczyć liczbę kopii plazmidów DNA zamkniętych w każdej mikrokapsułce, NDNA, korzystając z równania 1:
    Równanie kwantyfikacji DNA do obliczenia masy cząsteczkowej; symbol badania chemicznego. (1)
    Gdzie N = 6.769 × 1011 - liczba rdzeni SiO2 użytych do enkapsulacji. Obliczyć ją z krzywej wzorcowej dla znanych stężeń cząsteczek krzemionki, stosując rozcieńczenia szeregowe i absorbancję A320 przy λ = 320 nm;
    C- początkowe stężenie DNA użytego do adsorpcji
    V- objętość DNA użytego do adsorpcji
    0.8- wydajność adsorpcji DNA na rdzeniach
    Mw- masa cząsteczkowa plazmidu DNA
    NA- liczba Avogadra (6.022 × 1023)

5. Rozpuszczanie rdzeni w celu uzyskania mikrokapsułek jedwabnych.

  1. Przygotuj 8% roztwór kwasu fluorowodorowego (HF) o pH 5,5, rozcieńczając roztwór zakładowy (48%) wodą destylowaną. Pobierz probówkę wirówkową o objętości 50 mL. Ostrożnie odmierz pipetą 5 mL HF i dodaj 25 mL wody destylowanej, aby otrzymać 8% roztwór HF.
    UWAGA: HF jest kwasem silnie korozyjnym i może powodować ciężkie oparzenia tkanek. Podczas obchodzenia się z HF i jego stosowania w eksperymentach należy zachować szczególną ostrożność. Należy przestrzegać Standardowej Procedury Operacyjnej (SOP) dotyczącej właściwego użytkowania i obchodzenia się z HF, opracowanej przez organizację, aby uniknąć przypadkowego rozlania. Do rozcieńczania kwasu HF nie należy używać naczyń szklanych. Ten krok protokołu należy wykonywać w dygestorium chemicznym.
  2. Rozpuść rdzenie SiO2, dodając 1,5 mL 8% roztworu HF do sypkich mikrocząsteczek typu rdzeń-powłoka z kroku 4.10. Delikatnie wymieszaj w wibratorze (vortex) i pozostaw rdzenie do rozpuszczenia przez noc w warunkach otoczenia, delikatnie wstrząsając z prędkością 450 rpm.
    UWAGA: Aby zapobiec wyciekowi HF, użyj taśmy graftingowej do uszczelnienia probówki mikrocentryfugowej. Ten krok protokołu należy wykonywać w dygestorium chemicznym.
  3. Przygotuj zlew szklany o pojemności 2 L wypełniony 2 L wody dejonizowanej. Przenieś roztwór mikrokapsułek do urządzeń do dializy (MWCO 50 kDa) i dializuj je przeciwko wodzie dejonizowanej, wymieniając wodę co 3 h przez kolejne 3 dni.
    UWAGA: Zbierz nadsącz podczas pierwszych trzech wymian wody i zutylizuj roztwór zgodnie z ustalonym protokołem dla niebezpiecznych odpadów materiałowych.
  4. Użyj pipety 1 mL, aby przenieść zawiesinę z urządzeń do dializy do nowych probówek mikrocentryfugowych o pojemności 2 mL w celu zebrania mikrokapsułek.
    UWAGA: Wodne roztwory mikrokapsułek można przechowywać w warunkach otoczenia przez kilka lat.

6. Obrazowanie mikrokapsułek z fibroiny jedwabnej przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego (CLSM).

  1. Przeprowadź barwienie DNA przy użyciu barwnika do DNA.
    1. Przenieś 300 µL pustych mikrokapsułek z fibroiny jedwabnej do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1 mL. Dodaj 500 µL destylowanej wody wolnej od RNazy/DNazy.
    2. Dodaj 5 µL barwnika do barwienia DNA, krótko wymieszaj w wortexie i inkubuj w RT przez 2 h, chroniąc przed światłem.
    3. Wykonaj cztery etapy płukania poprzez wirowanie przy 0,1 x g przez 20 min w 4 °C w każdym cyklu, ostrożnie usuwając 400 µL supernatantu i uzupełniając go o 400 µL destylowanej wody wolnej od RNazy/DNazy.
  2. Wykonaj obrazowanie kapsułek jedwabnych na odwróconych systemach konfokalnych wyposażonych w trzy główne lasery (405 nm, 488 nm, 561 nm), używając obiektywu imersyjnego olejowego 100x (NA 1,49). Przenieś 100 µL próbki kapsułek do pojedynczej studni szklanych szkiełek z 8 komorami, pozwalając kapsułkom osadzić się przez 20-30 min przed obrazowaniem.
    UWAGA: Barwniki są bardzo wrażliwe na fotoblaknięcie. Chroń próbki, przykrywając szkiełka folią aluminiową.

7. Oznaczanie przepuszczalności pustych mikrokapsułek metodą granicy odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO).

  1. Przygotuj po 2 mL roztworów fluoroforu z dekstranu znakowanego FITC (20 µM, diH2O) o różnych Mw (4 kDa, 20 kDa, 40 kDa, 70 kDa, 150 kDa, 250 kDa, 500 kDa oraz 2 MDa).
  2. Pipetuj 100 µL zawiesiny kapsułek do pojedynczej studni komorowego szkiełka przedmiotowego. Analizuj osobno każdy wariant mikrokapsułek (stężenie PEI, liczbę załadowanych plazmidów DNA, stężenie fibroiny jedwabnej oraz liczbę warstw).
  3. Do każdej studni dodaj 300 µL odpowiedniego roztworu fluoroforu, zaczynając od najniższej Mw aż do najwyższej, tak aby każda studnia odpowiadała konkretnemu roztworowi fluoroforu. Wymieszaj poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie inkubuj mieszaninę przez 1 h w RT, aż dyfuzja roztworów fluoroforu osiągnie stan równowagi.
  4. Przenieś szkiełko do konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego (CLSM) i obrazuj każdą studnię przy użyciu obiektywu olejowego 100x przy λ wzbudzenia = 488 nm.
    1. Zidentyfikuj obszar zainteresowania, regulując płaszczyznę ogniskowania tak, aby kapsułki miały postać okręgów o największej średnicy. Dzieje się to zazwyczaj podczas oglądania próbek bliżej dna studni, gdzie kapsułki osadzają się pod wpływem grawitacji.
    2. Zebierz kilka obrazów próbek mikrokapsułek, przesuwając szkiełko w kierunku XY. Wykonaj zdjęcia tak, aby objęły od 100 do 150 kapsułek dla każdej próbki.
    3. Użyj oprogramowania ImageJ do analizy przepuszczalności błony kapsułek w każdym roztworze fluoroforu o danej Mw, porównując intensywność fluorescencji wewnątrz i na zewnątrz kapsułek. W tym celu narysuj obszar zainteresowania (ROI) w formie okręgu, aby obrysować obwód kapsułki, i kliknij Analyze/ Measure, aby zmierzyć intensywność fluorescencji wewnątrz. Wprowadź dane do arkusza kalkulacyjnego. Powtórz tę operację dla każdej mikrokapsułki, łącznie dla 200-300 kapsułek.
    4. Oceń intensywność fluorescencji na zewnątrz w ten sam sposób, wyznaczając ROI i mierząc intensywność w oddaleniu od kapsułek. Wykonaj 3-5 pomiarów do analizy statystycznej.
    5. Aby przeprowadzić analizę statystyczną, porównaj intensywności fluorescencji wewnątrz i na zewnątrz kapsułek za pomocą sparowanego testu t (p < 0,05).
    6. Użyj tabeli przeliczeniowej Tabela 2, aby oszacować przepuszczalność mikrokapsułek na podstawie promieni hydrodynamicznych dla FITC-Dekstranu o zmiennej Mw.

8. In vitro aktywacja syntetycznego ryboszacznika teofiliny w mikrokapsułkach jedwabnych

  1. Przygotować 1 mL roztworu zapasu teofiliny (100 mM, DMSO). Przygotować system ekstraktu S30 z E. coli dla kolistego DNA poprzez rozmrażanie składników na lodzie przez 40 min.
  2. Pobrać probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL, wolną od DNazy/RNazy. Przeprowadzić reakcję transkrypcji/translacji in vitro, łącząc składniki bezkomórkowe z próbką mikrokapsułek w następującej kolejności (objętość całkowita 50 µL): premiks S30 bez aminokwasów (20 µL); ekstrakt S30, kolisty (15 µL); kompletna mieszanina aminokwasów (5 µL); puste mikrokapsułki zawierające plazmidy ThyRS-GFPa1 z kroku 4.10 (9 µL) oraz teofilina, 100 mM DMSO (1 µL).
    UWAGA: Po dodaniu wszystkich składników krótko wymieszać próbkę w wortexie i zebrać ją podczas krótkiego wirowania przy 0,2 × g przez kilka sekund.
  3. Inkubować probówkę w temperaturze 30 °C przez 4 h, a następnie sprawdzić fluorescencję na czytniku płytek, stosując wzbudzenie przy λ = 488 nm i emisję dla filtra GFP/FITC (510 nm ± 20 nm).
  4. Wykonać obrazowanie kapsułek na dowolnym systemie LCSM przy użyciu laserów 488 nm i 561 nm. W celu uzyskania obrazów najwyższej jakości należy zastosować obiektyw imersyjny 100x oraz szkiełka przedmiotowe z 8 komorami.

9. Aktywacja aptameru brokułowego in vitro w mikrokapsułkach jedwabnych

  1. Przygotować 1 mL roztworu stokowego barwnika DFHBI-1T (30 µM, diH2O). Przygotować zestaw do reakcji bezkomórkowego systemu PURE (protein synthesis using recombinant elements), rozmrażając komponenty na lodzie przez 40 min.
  2. Wziąć probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL, wolną od DNazy/RNazy. Przeprowadzić reakcję transkrypcji in vitro, łącząc komponenty reakcji bezkomórkowej z próbką mikrokapsułek w następującej kolejności (objętość całkowita 50 µL): roztwór A (20 µL); roztwór B (15 µL); puste mikrokapsułki zawierające plazmidy BrocApt z kroku 4.10 (14 µL) oraz barwnik DFHBI-1T (1 µL).
    UWAGA: Po dodaniu wszystkich komponentów krótko wymieszać próbkę na wirówce typu vortex i zebrać ją podczas krótkiego wirowania przy 0,2 × g przez kilka sekund.
  3. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 6 h, a następnie zmierzyć fluorescencję na czytniku płytek, stosując wzbudzenie przy λex = 470 nm i emisję przy λem = 510 nm ± 20 nm.
  4. Wykonać obrazowanie kapsułek na dowolnym systemie LCSM, korzystając z laserów 488 nm i 561 nm. Aby uzyskać obrazy najwyższej jakości, należy użyć obiektywu imersyjnego 100x oraz szkiełek przedmiotowych z komorą 8-dołkową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym badaniu przeanalizowano funkcjonalność matryc DNA kodujących różne konstrukcje sensorów (dwa typy elementów transkrypcji/translacji regulowanych przez RNA) po enkapsulacji w kapsułkach z białka jedwabiu. Mikrokapsułki przygotowano za pomocą szablonowego montażu warstwa po warstwie (LbL) kluczowych komponentów: warstwy podstawowej, plazmidów DNA kodujących konstrukcje sensorów oraz biopolimeru fibroiny jedwabiu (Rysunek 2). Osadzanie makrocząsteczek w sposób warstwowy pozwala na ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zgodnie z tym protokołem można przygotować selektywnie przepuszczalne mikrokapsułki hydrożelowe z różnymi typami czujników kodowanych DNA. Jedną z charakterystycznych cech podejścia LbL jest możliwość dostosowania złożoności mikrokapsułek podczas składania od dołu do góry, które zwykle rozpoczyna się od adsorpcji gatunków molekularnych na matrycach ofiarnych. Poprzez staranne dostosowanie stężeń początkowych składników, warunków pH i liczby warstw, można przygotować mikrokapsułki o różnych parametrach obciążenia DNA, fun...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Poglądy i opinie przedstawione w niniejszym dokumencie są poglądami autorów i niekoniecznie reprezentują poglądy Departamentu Obrony lub jego Komponentów

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant LRIR 16RH3003J z Biura Badań Naukowych Sił Powietrznych, a także program Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S&T Priorities (ARAP) Biura Podsekretarza Obrony Stanów Zjednoczonych ds. Badań i Inżynierii.

Sekwencja wektora plazmidowego dla ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) została hojnie dostarczona przez Dr. J. Gallivana. Kokony jedwabników z Bombyx mori zostały hojnie podarowane przez dr D.L. Kaplana z Tufts University, MA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroksybenzylideno)-2-metylo-1-(2,2,2-trifluoroetylo)-1H-imidazol-5(4 H)-on (DFHBI-1T)LucernaDFHBI-1T
5x T4 Lufor ligazy DNAThermoFisher Scientific46300-018
6x Niebieski żel Ładowanie BarwnikNew England BioLabsB7021S
96-dołkowe, czarne okrągłeCorning3601
AgarozaSigma-AldrichA9539BioReagent, do biologii molekularnej, sól
sodowa ampicylinySigma-AldrichA0166BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych
Enzymy restrykcyjne BlpINew England BioLabsR0585S Corning Jednorazowy
filtr/systemy przechowywaniapróżniowego FisherScientific09-761-1
Odczynnik DMSOSigma-Aldrich472301ACS, ≥ 99.9%
Plazmid DNA, pET28c-F30-2x Brokuły (5.4 kb), BrocApt.AddgenePlasmid #66788
Zestaw do znakowania przeciwciał DyLightTM550 (Invitrogen)ThermoFisher Scientific84530
E. coli S30 do okrągłego DNAStożkoweL1020
Falcon, 15 mlFisherScientific14-959-53A
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon, 50 ml14-432-22
Probówki do mikrowirówek Fisherbrand, 1,5 mlFisherScientific05-408-129
Kwas fluorowodorowy, odczynnik HFSigma-Aldrich695068ACS, 48%
siarczan kanamycynySigma-Aldrich60615mieszanina Kanamycyny A (główny składnik) oraz enzymów restrykcyjnych Kanamycyny B i C
KpnINew England BioLabsR0142S
Płytka agarowa LB uzupełniona 100 &mikro; g/ml ampicylinySigma-AldrichL5667wstępnie wylane płytki agarowe z 100 &mikro; g/ml ampicylina
LB płytka agarowa uzupełniona 50 &mikro; g / ml kanamycynySigma-AldrichL0543wstępnie wylane płytki agarowe z 50 &mikro; g/ml bulion kanamycyny
LB (klasa Lennoxa)Sigma-AldrichL3022
Bromek litu, LiBrSigma-Aldrich213225ReagentPlus, ≥ 99%
Maksymalna wydajność DH5-α kompetentny szczep E. coliThermoFisher Scientific18258012
MetanolMilliporeSigma322415bezwodny, 99,8%
MilliQ-waterEMD MilliPoreMilli-Q Referencyjny system oczyszczania wody
MinElute PCR Zestaw do oczyszczaniaQiagen28004
Chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N′-etylokarbodimidu, EDCSigma-AldrichE1769
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem)ThermoFisher Scientific100100231x PBS, pH 7,4
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England BiolabsM0530S
Polietylenomenimina, rozgałęzionaSigma-Aldrich408727średnia Mw ~ 25 000
Zestaw do syntezy białek in vitro PURExpress NewEngland BioLabsE6800S
QIAEX II Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen20021
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen  27104
Drabina DNA z 2 kłódami (0,1-10,0 kb)New England BioLabsN0469S
SiO? Mikrosfery krzemionkowe, 4,0 i mikro; mPolysciences, Inc.24331-1510% roztwór wodny
Kasety dializacyjne Slide-A-Lyzer G2, 3,5 tys. MWCO, 15 mlThermoFisher Scientific87724
Węglan sodu, Na?CO?Sigma-Aldrich222321odczynnik ACS, bezwodny, ≥ 99,5%, proszek
Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Urządzenia do dializyFisherScientific08-607-008Spectrum G235058
SYBR Bezpieczne barwienie żelowe DNAThermoFisher ScientificS33102
Ligaza DNA T4 (5 U/&mikro; L)ThermoFisher ScientificEL0011
TheophyllineSigma-AldrichT1633bezwodny, ≥ 99%, proszek
Bufor Tris Acetate-EDTA (bufor TAE)Sigma-AldrichT6025Zawiera 40 mM Tris-octan i 1 mM EDTA, pH 8,3.
UltraPure Woda destylowana bez DNaz/RNazFisherScientific10-977-023
Zestaw ZymoPURE II Plasmid MaxiPrepZymoResearchD4202
o niskiej EEO Proszek lub kryształy , System ekstraktu probówki wirówkowe Promega

Bibliografia

  1. Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).
  2. Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N. Riboswitch-based reversible dual-color sensor. ACS Synthetic Biology. 6 (5), 766-781 (2017).
  3. König, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns. Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).
  4. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).
  5. Chushak, Y., et al. Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems. RNA Biology. , 1-12 (2021).
  6. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
  7. Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
  8. Grӓwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLoS One. 14 (3), 0210940(2019).
  9. Lin, X., et al. Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems. RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).
  10. Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes. Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).
  11. Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027(2018).
  12. Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).
  13. Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus. Scientific Reports. 4, 5469(2014).
  14. Frey, B. Amplification of Genomic DNA by PCR. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine. Reischl, U. 13, Humana Press. Totowa, NJ. 143-156 (1998).
  15. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).
  16. Zhou, Y., et al. Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits. Scientific Reports. 8, 12870(2018).
  17. Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5α-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), 0137466(2015).
  18. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
  19. Drachuk, I., et al. Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells. ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).
  20. Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability. Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).
  21. Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).
  22. Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).
  23. Zhao, S., et al. The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald. ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).
  24. Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research. APL Bioengineering. 5, 031504(2021).
  25. Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy. Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).
  26. Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans. Scientific Reports. 8, 7046(2018).
  27. Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
  28. Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction. Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).
  29. Ge, X., Luo, D., Xu, J. Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions. PLoS One. 6 (12), 28707(2011).
  30. Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays. Nature Communications. 11, 1283(2020).
  31. Chen, X., et al. Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs. Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Jedwabne mikrokapsu kimonta warstwa po warstwiefibroina jedwabiumikroskopia konfokalnatranskrypcja in vitrodostarczanie ukierunkowaneprzepuszczalno mikrokapsu ek
Przygotowanie wielofunkcyjnych mikrokapsułek na bazie jedwabiu wypełnionych plazmidami DNA kodującymi aptamery RNA i ryboprzełączniki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.