Artykuł metodologiczny

Przygotowanie wielofunkcyjnych mikrokapsułek na bazie jedwabiu wypełnionych plazmidami DNA kodującymi aptamery RNA i ryboprzełączniki

DOI:

10.3791/62854

⸱

8 października 2021

 ,  ,  , 
1UES Inc., 2711th Human Performance Wing, Airman Systems Directorate, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson AFB, 3Materials and Manufacturing Directorate, Wright-Patterson AFB

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje tworzenie wytrzymałych i biokompatybilnych mikrokapsułek z DNA jako multipleksowane biosensory in vitro zdolne do śledzenia kilku ligandów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadzamy protokół do przygotowania mikrokapsułek fibroiny jedwabnej z DNA za pomocą metody składania warstwa po warstwie (LbL) na protektorowych rdzeniach sferycznych. Po adsorpcji warstwy podstawowej i plazmidów DNA, tworzenie wytrzymałych mikrokapsułek było ułatwione poprzez indukcję β-arkuszy w strukturze drugorzędowej jedwabiu podczas ostrego odwodnienia pojedynczej warstwy jedwabiu. W związku z tym nawarstwianie zaszło poprzez wielokrotne wiązania wodorowe i oddziaływania hydrofobowe. Po adsorpcji wielowarstwowych powłok, struktury rdzeń-powłoka mogą być dalej funkcjonalizowane za pomocą nanocząstek złota (AuNPs) i/lub przeciwciał (IgG) do wykorzystania do teledetekcji i/lub celowanego dostarczania. Dostosowanie kilku kluczowych parametrów podczas sekwencyjnego osadzania kluczowych makrocząsteczek na rdzeniach krzemionkowych, takich jak obecność startera polimerowego, stężenie DNA i białka jedwabiu, a także liczba zaadsorbowanych warstw, zaowocowało biokompatybilnymi, obciążonymi DNA mikrokapsułkami o zmiennej przepuszczalności i ładunkach DNA. Po rozpuszczeniu rdzeni krzemionkowych, protokół wykazał tworzenie się pustych i wytrzymałych mikrokapsułek z plazmidami DNA unieruchomionymi na wewnętrznej powierzchni błony kapsułki. Stworzenie selektywnie przepuszczalnej, biokompatybilnej błony między plazmidami DNA a środowiskiem zewnętrznym pozwoliło zachować DNA podczas długotrwałego przechowywania i odegrało ważną rolę w poprawie odpowiedzi wyjściowej plazmidów ograniczonych przestrzennie. Aktywność matryc DNA i ich dostępność badano podczas reakcji transkrypcji i translacji in vitro (systemy bezkomórkowe). Plazmidy DNA kodujące aptamery i ryboprzełączniki zapalające RNA zostały z powodzeniem aktywowane za pomocą odpowiednich analitów, co uwidoczniono podczas lokalizacji znakowanych fluorescencyjnie transkryptów RNA lub białka GFPa1 w błonach otoczki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziedzina biologii syntetycznej oferuje unikalne możliwości rozwijania zdolności wykrywania poprzez wykorzystanie naturalnych mechanizmów wyewoluowanych przez mikroorganizmy do monitorowania ich środowiska i potencjalnych zagrożeń. Co ważne, te mechanizmy wykrywania są zwykle powiązane z reakcją, która chroni te mikroorganizmy przed szkodliwym narażeniem, regulując ekspresję genów w celu złagodzenia negatywnych skutków lub zapobieżenia spożyciu materiałów toksycznych. Podjęto znaczne wysiłki w celu zmodyfikowania tych mikroorganizmów w celu stworzenia czujników całokomórkowych wykorzystujących te naturalne reakcje, ale przekierowujących je w celu rozpoznawania nowych celów i/lub wytwarzania mierzalnego sygnału, który można zmierzyć w celu ilościowego określenia (zwykle fluorescencji)1,2. Obecnie obawy związane ze stosowaniem mikroorganizmów modyfikowanych genetycznie (GMO), zwłaszcza podczas ich uwalniania do środowiska lub ciała ludzkiego, z powodu wycieku całych komórek lub części ich materiału genetycznego, nawet jeśli są zamknięte w matrycy polimerowej, sugerują, że potrzebne są alternatywne sposoby wykorzystania tych podejść do wykrywania3.

Skutecznym podejściem do wykorzystania korzyści płynących z wykrywania opartego na mikroorganizmach bez obaw o wdrożenie GMO jest użycie systemów transkrypcji/translacji in vitro (IVTT). Z praktycznego punktu widzenia, systemy IVTT składają się z mieszaniny zawierającej większość składników komórek w stanie aktywnym, która została "wyekstrahowana" z komórek za pomocą różnych środków, w tym sonikacji, bicia perełkami lub innych4. Produktem końcowym tego procesu jest biochemiczna mieszanina reakcyjna, już zoptymalizowana pod kątem transkrypcji i translacji, która może być wykorzystana do testowania różnych czujników w formacie "otwartego naczynia", bez ograniczeń związanych z użyciem całych komórek (dyfuzja błonowa, wydajność transformacji, toksyczność komórek itp.). Co ważne, różne komponenty czujnika mogą być dodawane ilościowo, a ich działanie badane za pomocą różnych technik optycznych i spektrometrycznych, jak pokazaliśmy5. Zauważono, że wydajność systemów IVTT może być niespójna; Jednak ostatnie badania wykazały podejścia mające na celu standaryzację ich przygotowania i charakteryzacji, co jest bardzo pomocne podczas badania ich wydajności w projektowaniu czujników6. Ostatnio zademonstrowano wiele przykładów systemów IVTT wykorzystujących do tworzenia testów opartych na papierze poprzez liofilizację ich składników w matrycach papierowych, w tym wykrywanie jonów metali ciężkich, leków, elementów czujników kworum i innych7,8,9. Ekscytującym obszarem zastosowań czujników opartych na IVTT jest ich zastosowanie w aplikacjach czujnikowych w różnych typach środowisk, w tym w glebie, wodzie i ludzkim ciele. Aby wdrożyć te systemy IVTT w tych trudnych środowiskach, należy wdrożyć podejście hermetyzacji, które ograniczy komponenty IVTT i ochroni je przed degradacją.

Najczęstsze metody enkapsulacji dla systemów IVTT obejmują użycie kapsułek lipidowych, miceli, polimeromów i innych ściśle zamkniętych mikropojemników10,11,12. Jedną z wad tego podejścia jest konieczność włączenia pasywnych lub aktywnych mechanizmów transportu materiałów do i z kontenerów, aby umożliwić komunikację ze środowiskiem zewnętrznym i zapewnić możliwości wykrywania. Aby przezwyciężyć niektóre z tych problemów, w niniejszym badaniu opisano metodę, która zapewnia proste, ale skuteczne podejście do hermetyzacji materiałów kodujących dla różnych projektów czujników, które mają być wyrażone w systemach IVTT. Podejście to opiera się na zastosowaniu osadzania biopolimeru warstwa po warstwie (LbL) w obecności interesujących plazmidów w celu stworzenia pustych mikrokapsułek o wysokiej porowatości, co pozwala chronionemu materiałowi genetycznemu na interakcję z różnymi składnikami wybranego IVTT. Badanie wykazało, że kapsułkowane plazmidy mogą kierować transkrypcją i translacją, gdy są aktywowane w tej matrycy polimerowej, jak pokazano w odpowiedzi kodowanego plazmidem aptameru i ryboprzełącznika na odpowiadające im cele. Dodatkowo ta powłoka LbL chroni plazmidy przez wiele miesięcy bez żadnych specjalnych warunków przechowywania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa wektora plazmidowego.

  1. Skonstruuj wektor plazmidowy (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) poprzez amplifikację sekwencji kodującej ryboprzełącznika teofiliny (ThyRS) sprzężonego z GFPa1 z wektora pJ201:23976-RS-GFPa1 (zaprojektowanego i stworzonego przez DNA2.0) i insercję do wektora ekspresyjnego E. coli, pSAL13. Użyj starterów do przodu (5'-CGTGGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATG-3') i do tyłu (5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3') w celu amplifikacji sekwencji kodującej ThyRS sprzężonej z GFPa1 i przeprowadź reakcję PCR w objętości 50 μl przy użyciu polimerazy DNA zgodnie z protokołem producenta14.
  2. Przygotuj 1% żel agarozowy z 0,5 g agarozy, 50 ml buforu TAE (40 mM octanu tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) i 3 μl barwienia DNA.
  3. Zmieszać 5 μl podwielokrotności produktu amplifikowanego PCR z 5 μl wody wolnej od RNaz/DNaz i 2 μl 6x barwnika ładującego żel i przeanalizować za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Załaduj drabinkę DNA (0,1-10,0 kb) jako odniesienie. Uruchom żel pod napięciem 120 V, aż linia barwnika prawie dotrze do dna żelu.
  4. Wizualizacja fragmentów DNA za pomocą systemu obrazowania z transiluminatorem UV, aby sprawdzić prawidłowy rozmiar DNA15.
  5. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z protokołem producenta16.
  6. Trawić produkt PCR i wektor ekspresyjny pSAL enzymami restrykcyjnymi KpnI i BlpI w reakcji 15 μL, zawierającej 10 μL produktu PCR lub wektora plazmidowego (stężenie 20-50 ng/μL), 1,5 μL 10x buforu enzymatycznego, 1 μL każdego enzymu i 1,5 μL wody wolnej od RNazy/DNaz, w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
  7. Dodać 3 μl 6x barwnika ładującego żel do mieszaniny reakcyjnej i oddzielić strawione fragmenty od 1% żelu agarozowego, jak opisano w krokach 1.3-1.5.
  8. Oczyść fragmenty DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta16.
  9. Zlikulować strawiony produkt PCR do strawionego linearyzowanego wektora plazmidowego, pSAL, przy użyciu ligazy DNA T4 i uzupełnionego buforu ligazy w reakcji 10 μl zawierającej 3-20 fmol strawionego wektora, 9-60 fmol strawionego produktu PCR, 2 μl buforu ligazy, 1 μl (1 jednostka) ligazy DNA T4 i wody wolnej od DNaz / RNaz. Inkubować reakcję ligacji w temperaturze 25 °C przez 3 godziny
    UWAGA: Upewnij się, że całkowita zawartość DNA w mieszaninie reakcyjnej wynosi 0,01-0,1 μg.
  10. Przekształć kompetentne komórki E. coli DH5α za pomocą 10 ng mieszaniny reakcji ligacji zgodnie z protokołem producenta17.
  11. Hodować przekształcone komórki w temperaturze 37 °C przez noc na płytkach z agarem LB uzupełnionymi ampicyliną (100 μg/ml).
  12. Pobrać 3-4 kolonie bakteryjne z płytki i aseptycznie przenieść każdą z nich do 5 ml pożywki LB uzupełnionej ampicyliną (100 μg/ml). Hodować kultury przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 225 obr./min.
  13. Osadzać nocne kultury przez odwirowanie przy 11 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  14. Użyj zestawu do oczyszczania, aby oczyścić plazmidy zgodnie z protokołem producenta16.
  15. Zweryfikować sekwencje oczyszczonych plazmidów za pomocą sekwencjonowania DNA. Mapa plazmidu i sekwencja wynikowego konstruktu (pSALv-RS-GFPa1) są pokazane na Rysunek 1.

2. Oczyszczanie DNA na dużą skalę.

  1. Przekształć wektor plazmidowy pSALv-RS-GFPa1 (3,4 kb) (kodujący ryboprzełącznik teofilinowy sprzężony z genem reporterowym GFPa1) lub pET28c-F30-2xBroccoli (5,4 kb) (kodujący aptamier brokułów) w kompetentne komórki E. coli DH5α zgodnie z protokołem producenta17.
  2. Hoduj przekształcone komórki w temperaturze 37 °C przez noc na płytkach LB-agar uzupełnionych ampicyliną (100 μg/ml) dla komórek transformowanych za pomocą pSALv-RS-GFPa1 lub kanamycyny (50 μg/mL) dla komórek przekształconych za pomocą pET28c-F30-2x Brokuły.
  3. Pobrać 3-4 kolonie bakteryjne z płytki i aseptycznie przenieść każdą kolonię do 5 ml pożywki LB uzupełnionej odpowiednim antybiotykiem (100 μg/ml ampicyliny lub 50 μg/ml kanamycyny). Hodować kultury przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 225 obr./min.
  4. Użyć 3 ml kultury przez noc do zaszczepienia w 150 ml LB uzupełnionego odpowiednim antybiotykiem (100 μg/ml ampicyliny lub 50 μg/ml kanamycyny) i hodować kultury przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 225 obr./min.
  5. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze ≥3400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Użyj zestawu do oczyszczania, aby oczyścić plazmidy zgodnie z protokołem producenta16.
  7. Eluuj DNA za pomocą 0,5 ml czystej wody wolnej od DNazy/RNaz. Zmierzyć stężenie DNA i przygotować 1 ml roztworów podstawowych DNA (100 ng/μl). Probówki z DNA należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.

3. Ekstrakcja fibroiny jedwabiu i przygotowanie materiałów wyjściowych.

  1. Przygotować wodny roztwór odtworzonego białka fibroiny jedwabiu (SF) z kokonów jedwabników Bombyx mori zgodnie z procedurą opisaną szczegółowo w innym miejscu, aby uwzględnić 10% roztworu Silk-LiBr18.
  2. Oznaczyć końcowe stężenie wodnego roztworu SF. Odpipetować 0,5 ml roztworu jedwabiu na szalkę Petriego o średnicy 60 mm, pozostawić do wyschnięcia w temperaturze 60 °C i zmierzyć wagę suchej folii jedwabnej. Podziel suchą masę przez 0,5 ml, aby obliczyć procent masy na objętość.
  3. Rozcieńczyć stężony roztwór jedwabiu wodą destylowaną wolną od DNaz/RNaz, powoli dodając wodę za pomocą pipety serologicznej, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mg/ml. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.
  4. Przygotuj znakowaną fluorescencyjnie fibroinę jedwabiu za pomocą zestawu do znakowania przeciwciał. Użyj 1 ml roztworu fibroiny jedwabiu o stężeniu 2 mg/ml, aby połączyć N-końcowe grupy α-aminowe białka z barwnikiem pochodną aktywowaną estrem NHS zgodnie z protokołem producenta19.
  5. Przygotować 50 ml roztworu wodnego polietylenoiminy (PEI) o stężeniu 6 mg/ml, dostosować pH do 4 za pomocą HCl (1 M). Przefiltrować roztwór przez sterylną membranę 0,2 μm. Przechowywanie jest możliwe w warunkach otoczenia przez wiele miesięcy.
  6. Przygotuj rdzenie SiO2. Odpipetować 300 μl cząstek SiO2 do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml. Przemyć mikrocząstki dwukrotnie 1 ml wody wolnej od DNaz/RNaz przez odwirowanie przy 0,2 x g przez 1 min.

4. Wykonaj osadzanie warstwa po warstwie pierwszej, plazmidów DNA i warstw jedwabiu.

  1. Aby nałożyć warstwę pierwotną PEI na mikrocząstki SiO2, dodaj 1 ml roztworu PEI do odwirowanego granulatu z kroku 3.6 i mieszaj mieszaninę w warunkach otoczenia w termomikserze z prędkością 800 obr./min przez 15 min. Przemyj cząstki czterokrotnie 1 ml wody dejonizowanej wolnej od DNaz/RNaz przez odwirowanie w stężeniu 0,2 x g przez 1 min.
  2. Aby przeprowadzić osadzanie warstwy DNA, należy dodać 1 ml wodnego roztworu plazmidów DNA z kroku 2.7 do mikrocząstek przygotowanych PEI i delikatnie mieszać mieszaninę w temperaturze 4 °C na termomikserze przy 800 obr./min przez 15 min. Aby przygotować mikrokapsułki o różnych ładunkach DNA, dostosuj stężenie plazmidów DNA od 50-200 ng/μl za pomocą wody destylowanej wolnej od DNazy/RNaz i użyj 1 ml tych roztworów do zdeponowania DNA. Zebrać mikrocząstki przez odwirowanie w stężeniu 0,2 x g przez 1 min.
  3. Oznacz probówki dla plazmidów DNA kodujących ryboprzełącznik teofiliny sprzężony z GFPa1 jako ThyRS-GFPa1 i plazmidy DNA kodujące aptamer brokułów jako BrocApt.
    UWAGA: Probówki do mikrowirówek z DNA należy przechowywać na lodzie.
  4. Ostrożnie usunąć supernatant i przemyć mikrocząstki czterokrotnie 1 ml wody destylowanej wolnej od DNazy/RNaz, za każdym razem odrzucając supernatant po odwirowaniu w stężeniu 0,2 x g przez 1 min. Wszystkie doświadczenia należy wykonywać w temperaturze pokojowej (RT), chyba że określono inaczej.
  5. W celu osadzenia warstwy fibroiny jedwabiu dodać 1 ml odtworzonego wodnego roztworu SF z kroku 3.3 do mikrocząstek zaadsorbowanych przez DNA, delikatnie zwirować i mieszać mieszaninę w temperaturze 10 °C na termomikserze przy prędkości 750 obr./min przez 15 min. Zebrać mikrocząstki przez odwirowanie w temperaturze 0,2 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant, a następnie przemyć je raz 1 ml wody destylowanej wolnej od DNaz/RNaz. Powtórzyć wirowanie i wyrzucić supernatant.
    UWAGA: Podczas eksperymentu trzymaj roztwór jedwabiu na lodzie, aby uniknąć żelowania wywołanego temperaturą.
  6. Stopniowo traktuj cząstki metanolem, aby wywołać tworzenie β-arkusza w strukturze białka jedwabiu. Najpierw dodaj 0,5 ml wody destylowanej DNazy/RNazy, przekręć rurkę mikrowirówki, a następnie dodaj 0,5 ml 100% metanolu. Delikatnie potrząsaj cząstkami na termomikserze w temperaturze 10 °C przez 5 minut. Zebrać cząstki przez odwirowanie w stężeniu 0,2 x g przez 1 min. Usunąć supernatant.
  7. Potraktuj cząstki metanolem, aby ułatwić tworzenie β arkuszy i zapewnić silną fizyczną adsorpcję warstwy jedwabiu. Dodaj 1 ml 100% metanolu. Delikatnie potrząsaj cząstkami na termomikserze z prędkością 750 obr./min przez 10 minut w temperaturze 10 °C.
  8. Zebrać cząstki przez odwirowanie w temperaturze 0,2 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i przemyć je dwukrotnie 1 ml wody destylowanej wolnej od DNaz/RNaz za każdym razem, odrzucając supernatant i delikatnie wirując przed następnym wirowaniem.
  9. Powtórz kroki 4.5-4.8 20 razy, aby uzyskać jedwabne wielowarstwowe struktury rdzenia-skorupy. Do ostatniego etapu osadzania użyj znakowanego fluorescencyjnie jedwabiu z kroku 3.4 (Silk-DyLight550, 1 mL).
  10. Wykonaj ostatni etap prania i trzymaj mikrocząsteczki w 1 ml wody destylowanej wolnej od DNaz/RNaz w warunkach otoczenia.
    UWAGA: Aby uniknąć agregacji cząstek podczas osadzania warstw jedwabiu, należy przeprowadzić oględziny zawiesiny cząstek i pipetować ją w górę iw dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml, aby zapewnić jednorodny rozkład cząstek.
  11. Oblicz liczbę kopii plazmidu DNA zamkniętego w każdej mikrokapsułce, NDNA za pomocą równania 1:
    figure-protocol-1 (1)
    Gdzie N = 6,769 × 1011 - liczba rdzeni SiO2 używanych do enkapsulacji. Obliczyć to na podstawie krzywej wzorcowej dla znanych stężeń cząstek krzemionki przy użyciu seryjnych rozcieńczeń i absorpcji A320 przy λ = 320 nm;
    C- początkowe stężenie DNA użyte do adsorpcji
    V- objętość DNA użytego do adsorpcji
    0,8- Wydajność adsorpcji DNA na rdzeniach
    Mw- Masa cząsteczkowa plazmidu DNA
    NA- liczba Avogadro (6.022 × 1023)

5. Rozpuszczanie rdzeni w celu uzyskania mikrokapsułek z jedwabiu.

  1. Przygotować 8% roztwór kwasu fluorowodorowego (HF) o pH 5,5, rozcieńczając roztwór podstawowy (48%) wodą destylowaną. Zaopatrz się w probówkę wirówkową o pojemności 50 ml. Ostrożnie odpipetować 5 ml HF i dodać 25 ml wody destylowanej, aby uzyskać 8% roztwór HF.
    UWAGA: HF jest silnie kwasem i może powodować poważne oparzenia tkanek. Należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z HF i stosowania go w eksperymentach. Przestrzegaj Standardowej Procedury Operacyjnej (SOP) w celu prawidłowego użytkowania i obchodzenia się z HF opracowanym przez organizację, aby uniknąć niepożądanych wypadków związanych z rozlaniem. Nie używaj szklanych pojemników do rozcieńczania kwasu HF. Użyj kaptura chemicznego, aby wykonać ten krok protokołu.
  2. Rozpuść rdzenie SiO2, dodając 1,5 ml 8% roztworu HF do granulowanych mikrocząstek typu rdzeń-powłoka z kroku 4.10. Delikatnie odwirować i pozostawić rdzenie do rozpuszczenia przez noc w warunkach otoczenia, delikatnie potrząsając przy 450 obr./min.
    UWAGA: Aby uniknąć rozlania HF, użyj taśmy do szczepienia, aby uszczelnić probówkę mikrowirówki. Użyj kaptura chemicznego, aby wykonać ten krok protokołu.
  3. Przygotować szklaną zlewkę o pojemności 2 litrów wypełnioną 2 litrami wody dejonizowanej. Przenieść roztwór mikrokapsułek do urządzeń do dializy (50 kDa MWCO) i dializować je z wodą dejonizowaną z powtarzaną wymianą wody co 3 godziny przez następne 3 dni.
    UWAGA: Zebrać supernatant podczas pierwszych trzech wymian wody i wyrzucić roztwór zgodnie z ustalonym protokołem dla odpadów niebezpiecznych.
  4. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przenieś zawiesinę z urządzeń do dializy do nowych probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml w celu zebrania mikrokapsułek.
    UWAGA: Wodne roztwory mikrokapsułek należy przechowywać w warunkach otoczenia przez kilka lat.

6. Obrazowanie mikrokapsułek fibroiny jedwabiu za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM).

  1. Wykonaj barwienie DNA za pomocą barwnika DNA.
    1. Przenieś 300 μl pustych mikrokapsułek fibroiny jedwabiu do świeżej probówki do mikrowirówki o pojemności 1 ml. Dodać 500 μl wody destylowanej wolnej od RNaz/DNaz.
    2. Dodać 5 μl barwnika barwiącego DNA, krótko wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, chroniąc przed światłem.
    3. Przeprowadzić cztery etapy płukania przez odwirowanie w stężeniu 0,1 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C za każdym razem, ostrożnie usuwając 400 μl supernatantu i uzupełniając go 400 μl wody destylowanej wolnej od RNazy/DNaz.
  2. Wykonaj obrazowanie jedwabnych kapsułek na odwróconych systemach konfokalnych wyposażonych w trzy główne lasery (405 nm, 488 nm, 561 nm) przy użyciu 100-krotnego obiektywu zanurzeniowego w oleju (NA 1,49). Przenieść 100 μl próbki kapsułki do pojedynczego dołka z 8-dołkowymi szkiełkami szklanymi, pozostawić kapsułki do osadzenia się na 20-30 minut przed obrazowaniem.
    UWAGA: Barwniki są bardzo wrażliwe na fotowybielanie. Próbki należy zabezpieczyć, przykrywając szkiełka folią aluminiową.

7. Oszacowanie przepuszczalności pustych mikrokapsułek metodą odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO).

  1. Przygotować po 2 ml znakowanych FITC roztworów fluoroforu dekstranu (20 μM, diH2O) o różnejwilgotności M (4 kDa, 20 kDa, 40 kDa, 70 kDa, 150 kDa, 250 kDa, 500 kDa i 2 MDa).
  2. Odpipetować 100 μl zawiesiny kapsułek do pojedynczego dołka szklanego szkiełka z komorą. Przeanalizuj każdy projekt mikrokapsułki (stężenie PEI, liczbę ładunku plazmidów DNA, stężenie fibroiny jedwabiu i liczbę warstw) osobno.
  3. Do każdej studzienki dodaj 300 μl specyficznego roztworu fluoroforu, zaczynając od najniższego Mw do najwyższego, tak aby każdy studzienka odpowiadała specyficznemu roztworowi fluoroforu. Mieszać pipetując w górę i w dół i pozostawić mieszaninę do inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aż dyfuzja roztworów fluoroforów osiągnie równowagę.
  4. Przenieś szkiełko do konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM) i zobrazuj każdy dołek za pomocą 100-krotnego obiektywu zanurzonego w oleju przy wzbudzeniu λ = 488 nm.
    1. Zidentyfikuj obszar zainteresowania, dostosowując płaszczyznę ogniskowej, aby upewnić się, że kapsułki pojawiają się w postaci okręgów o największej średnicy. Dzieje się tak zwykle podczas oglądania próbek bliżej dna studni, gdy kapsułki osadzają się pod wpływem grawitacji.
    2. Zbierz kilka obrazów próbek mikrokapsułek, przesuwając szkiełko w kierunku XY. Przechwytuj obrazy, aby uwzględnić do 100-150 kapsułek na każdą próbkę.
    3. Użyj oprogramowania ImageJ, aby przeanalizować przepuszczalność membrany kapsułki w każdym roztworze fluoroforuM, porównując intensywność fluorescencji wewnątrz i na zewnątrz kapsułek. W tym celu narysuj obszar zainteresowania (ROI) w formie koła, aby obrysować obwód kapsułki i kliknij Analizuj / Zmierz, aby zmierzyć intensywność fluorescencji wewnątrz. Uporządkuj dane w tabeli w arkuszu kalkulacyjnym. Wykonaj tę operację dla każdej mikrokapsułki, co daje w sumie 200-300 kapsułek.
    4. Oceń intensywność fluorescencji zewnętrznej w ten sam sposób, określając ROI i mierząc intensywność z dala od kapsułek. Wykonaj 3-5 pomiarów do analizy statystycznej.
    5. Aby przeprowadzić analizę statystyczną, porównaj intensywność fluorescencji wewnątrz i na zewnątrz kapsułek za pomocą sparowanego testu t (p < 0,05).
    6. Skorzystaj z tabeli przeliczeniowej 2, aby oszacować przepuszczalność mikrokapsułek na podstawie promieni hydrodynamicznych dla FITC-Dekstranu o zmiennym Mw.

8. Aktywacja in vitro syntetycznego teofilinowego ryboprzełącznika w mikrokapsułkach jedwabiu

  1. Przygotować 1 ml roztworu podstawowego teofiliny (100 mM, DMSO). Przygotuj system ekstraktu E. coli S30 do okrągłego DNA, rozmrażając składniki na lodzie przez 40 minut.
  2. Otrzymać 0,5 ml probówki wirówkowej wolnej od DNaz/RNaz. Przeprowadzić reakcję transkrypcji/translacji in vitro, połączyć składniki bezkomórkowe z próbką mikrokapsułek w następującej kolejności (całkowita objętość 50 μl): premiks S30 bez aminokwasów (20 μL); Ekstrakt S30, okrągły (15 μl); kompletna mieszanina aminokwasów (5 μL); puste mikrokapsułki zawierające plazmidy ThyRS-GFPa1 z kroku 4.10 (9 μL); i teofilina, 100 mM DMSO (1 μL).
    UWAGA: Po dodaniu wszystkich składników należy na krótko zawirować probówkę i pobrać próbkę podczas krótkiego wirowania w temperaturze 0,2 × g przez kilka sekund.
  3. Inkubować probówkę w temperaturze 30 °C przez 4 godziny i sprawdzić fluorescencję na czytniku płytek, stosując wzbudzenie przy λ = 488 nm i emisję dla filtra GFP/FITC (510 nm ± 20 nm).
  4. Obrazuj kapsułki w dowolnym systemie LCSM za pomocą laserów 488 nm i 561 nm. Uzyskaj najlepszą jakość obrazów za pomocą 100-krotnego obiektywu zanurzeniowego z olejkiem i 8-dołkowych szkiełek podstawowych.

9. Aktywacja in vitro aptameru brokułów w mikrokapsułkach jedwabiu

  1. Przygotować 1 ml roztworu podstawowego barwnika DFHBI-1T (30 μM, diH2O). Przygotować zestaw do reakcji systemu bezkomórkowego PURE (synteza białek przy użyciu elementów rekombinowanych), rozmrażając składniki na lodzie przez 40 minut.
  2. Otrzymać 0,5 ml probówki wirówkowej wolnej od DNaz/RNaz. Przeprowadzić reakcję transkrypcji in vitro, łącząc bezkomórkowe składniki reakcji z próbką mikrokapsułek w następującej kolejności (50 μl objętości całkowitej): roztwór A (20 μl); roztwór B (15 μl); puste mikrokapsułki zawierające plazmidy BrocApt z kroku 4.10 (14 μL); i barwnik DFHBI-1T (1 μL).
    UWAGA: Po dodaniu wszystkich składników należy na krótko zawirować probówkę i pobrać próbkę podczas krótkiego wirowania w temperaturze 0,2 × g przez kilka sekund.
  3. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 6 godzin i sprawdzić fluorescencję na czytniku płytek, stosując wzbudzenie przy λex = 470 nm i emisję przy λem = 510 nm ± 20 nm.
  4. Obrazuj kapsułki w dowolnym systemie LCSM za pomocą laserów 488 nm i 561 nm. Uzyskaj najlepszą jakość obrazów dzięki 100-krotnemu obiektywowi zanurzeniowemu w oleju i 8-dołkowym szkiełkom podstawowym z komorą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj badanie dotyczy funkcjonalności szablonów DNA kodujących różne projekty czujników (dwa rodzaje regulowanych przez RNA elementów transkrypcji/translacji) po enkapsulacji w kapsułkach z białka jedwabiu. Mikrokapsułki przygotowano za pomocą szablonowego montażu warstwa po warstwie (LbL) kluczowych elementów: warstwy podstawowej, plazmidów DNA kodujących projekty czujników i biopolimeru fibroiny jedwabiu (Rysunek 2). Osadzanie makrocząsteczek w sposób warstwowy pozwala na kontrolowanie przepuszczaln...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z tym protokołem można przygotować selektywnie przepuszczalne mikrokapsułki hydrożelowe z różnymi typami czujników kodowanych DNA. Jedną z charakterystycznych cech podejścia LbL jest możliwość dostosowania złożoności mikrokapsułek podczas składania od dołu do góry, które zwykle rozpoczyna się od adsorpcji gatunków molekularnych na matrycach ofiarnych. Poprzez staranne dostosowanie stężeń początkowych składników, warunków pH i liczby warstw, można przygotować mikrokapsułki o różnych parametrach obciążenia DNA, fun...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poglądy i opinie przedstawione w niniejszym dokumencie są poglądami autorów i niekoniecznie reprezentują poglądy Departamentu Obrony lub jego Komponentów

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant LRIR 16RH3003J z Biura Badań Naukowych Sił Powietrznych, a także program Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S&T Priorities (ARAP) Biura Podsekretarza Obrony Stanów Zjednoczonych ds. Badań i Inżynierii.

Sekwencja wektora plazmidowego dla ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) została hojnie dostarczona przez Dr. J. Gallivana. Kokony jedwabników z Bombyx mori zostały hojnie podarowane przez dr D.L. Kaplana z Tufts University, MA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroksybenzylideno)-2-metylo-1-(2,2,2-trifluoroetylo)-1H-imidazol-5(4 H)-on (DFHBI-1T)LucernaDFHBI-1T
5x T4 Lufor ligazy DNAThermoFisher Scientific46300-018
6x Niebieski żel Ładowanie BarwnikNew England BioLabsB7021S
96-dołkowe, czarne okrągłeCorning3601
AgarozaSigma-AldrichA9539BioReagent, do biologii molekularnej, sól
sodowa ampicylinySigma-AldrichA0166BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych
Enzymy restrykcyjne BlpINew England BioLabsR0585S Corning Jednorazowy
filtr/systemy przechowywaniapróżniowego FisherScientific09-761-1
Odczynnik DMSOSigma-Aldrich472301ACS, ≥ 99.9%
Plazmid DNA, pET28c-F30-2x Brokuły (5.4 kb), BrocApt.AddgenePlasmid #66788
Zestaw do znakowania przeciwciał DyLightTM550 (Invitrogen)ThermoFisher Scientific84530
E. coli S30 do okrągłego DNAStożkoweL1020
Falcon, 15 mlFisherScientific14-959-53A
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon, 50 ml14-432-22
Probówki do mikrowirówek Fisherbrand, 1,5 mlFisherScientific05-408-129
Kwas fluorowodorowy, odczynnik HFSigma-Aldrich695068ACS, 48%
siarczan kanamycynySigma-Aldrich60615mieszanina Kanamycyny A (główny składnik) oraz enzymów restrykcyjnych Kanamycyny B i C
KpnINew England BioLabsR0142S
Płytka agarowa LB uzupełniona 100 &mikro; g/ml ampicylinySigma-AldrichL5667wstępnie wylane płytki agarowe z 100 &mikro; g/ml ampicylina
LB płytka agarowa uzupełniona 50 &mikro; g / ml kanamycynySigma-AldrichL0543wstępnie wylane płytki agarowe z 50 &mikro; g/ml bulion kanamycyny
LB (klasa Lennoxa)Sigma-AldrichL3022
Bromek litu, LiBrSigma-Aldrich213225ReagentPlus, ≥ 99%
Maksymalna wydajność DH5-α kompetentny szczep E. coliThermoFisher Scientific18258012
MetanolMilliporeSigma322415bezwodny, 99,8%
MilliQ-waterEMD MilliPoreMilli-Q Referencyjny system oczyszczania wody
MinElute PCR Zestaw do oczyszczaniaQiagen28004
Chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N′-etylokarbodimidu, EDCSigma-AldrichE1769
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem)ThermoFisher Scientific100100231x PBS, pH 7,4
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England BiolabsM0530S
Polietylenomenimina, rozgałęzionaSigma-Aldrich408727średnia Mw ~ 25 000
Zestaw do syntezy białek in vitro PURExpress NewEngland BioLabsE6800S
QIAEX II Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen20021
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen  27104
Drabina DNA z 2 kłódami (0,1-10,0 kb)New England BioLabsN0469S
SiO? Mikrosfery krzemionkowe, 4,0 i mikro; mPolysciences, Inc.24331-1510% roztwór wodny
Kasety dializacyjne Slide-A-Lyzer G2, 3,5 tys. MWCO, 15 mlThermoFisher Scientific87724
Węglan sodu, Na?CO?Sigma-Aldrich222321odczynnik ACS, bezwodny, ≥ 99,5%, proszek
Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Urządzenia do dializyFisherScientific08-607-008Spectrum G235058
SYBR Bezpieczne barwienie żelowe DNAThermoFisher ScientificS33102
Ligaza DNA T4 (5 U/&mikro; L)ThermoFisher ScientificEL0011
TheophyllineSigma-AldrichT1633bezwodny, ≥ 99%, proszek
Bufor Tris Acetate-EDTA (bufor TAE)Sigma-AldrichT6025Zawiera 40 mM Tris-octan i 1 mM EDTA, pH 8,3.
UltraPure Woda destylowana bez DNaz/RNazFisherScientific10-977-023
Zestaw ZymoPURE II Plasmid MaxiPrepZymoResearchD4202
o niskiej EEO Proszek lub kryształy , System ekstraktu probówki wirówkowe Promega

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).
  2. Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N. Riboswitch-based reversible dual-color sensor. ACS Synthetic Biology. 6 (5), 766-781 (2017).
  3. König, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns. Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).
  4. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).
  5. Chushak, Y., et al. Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems. RNA Biology. , 1-12 (2021).
  6. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
  7. Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
  8. Grӓwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLoS One. 14 (3), 0210940(2019).
  9. Lin, X., et al. Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems. RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).
  10. Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes. Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).
  11. Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027(2018).
  12. Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).
  13. Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus. Scientific Reports. 4, 5469(2014).
  14. Frey, B. Amplification of Genomic DNA by PCR. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine. Reischl, U. 13, Humana Press. Totowa, NJ. 143-156 (1998).
  15. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).
  16. Zhou, Y., et al. Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits. Scientific Reports. 8, 12870(2018).
  17. Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5α-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), 0137466(2015).
  18. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
  19. Drachuk, I., et al. Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells. ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).
  20. Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability. Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).
  21. Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).
  22. Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).
  23. Zhao, S., et al. The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald. ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).
  24. Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research. APL Bioengineering. 5, 031504(2021).
  25. Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy. Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).
  26. Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans. Scientific Reports. 8, 7046(2018).
  27. Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
  28. Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction. Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).
  29. Ge, X., Luo, D., Xu, J. Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions. PLoS One. 6 (12), 28707(2011).
  30. Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays. Nature Communications. 11, 1283(2020).
  31. Chen, X., et al. Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs. Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Silk MicrocapsulesLayer by Layer AssemblySilk FibroinConfocal MicroscopyIn Vitro TranscriptionTargeted DeliveryMicrocapsule Permeability

Powiązane artykuły