Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Summary

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Abstract

Podczas rozwoju organizmu wielokomórkowego, pojedyncza zapłodniona komórka dzieli się i daje początek wielu tkankom o różnych funkcjach. Morogeneza tkanek idzie w parze ze zmianami molekularnymi i strukturalnymi na poziomie pojedynczej komórki, które powodują zmiany subkomórkowych właściwości mechanicznych. W rezultacie, nawet w tej samej komórce, różne organelle i przedziały w różny sposób opierają się naprężeniom mechanicznym; a szlaki mechanotransdukcji mogą aktywnie regulować ich właściwości mechaniczne. Zdolność komórki do przystosowania się do mikrośrodowiska niszy tkankowej wynika zatem częściowo ze zdolności do wyczuwania i reagowania na naprężenia mechaniczne. Niedawno zaproponowaliśmy nowy paradygmat mechanosensacji, w którym deformacja i pozycjonowanie jądra umożliwia komórce ocenę fizycznego środowiska 3D i wyposaża komórkę w zmysł propriocepcji w celu dekodowania zmian w kształcie komórki. W tym artykule opisujemy nową metodę pomiaru sił i właściwości materiałów, które kształtują jądro komórkowe wewnątrz żywych komórek, na przykładzie komórek przylegających i komórek zamkniętych mechanicznie. Pomiary mogą być wykonywane nieinwazyjnie za pomocą pułapek optycznych wewnątrz komórek, a siły są bezpośrednio dostępne dzięki wykrywaniu pędu światła bez kalibracji. Pozwala to na pomiar mechaniki jądra niezależnie od deformacji powierzchni komórki i umożliwia rozbiór szlaków mechanotransdukcji eksteroceptywnej i interoceptywnej. Co ważne, eksperyment z pułapką można połączyć z mikroskopią optyczną w celu zbadania odpowiedzi komórkowej i dynamiki subkomórkowej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego cytoszkieletu, jonów wapnia lub morfologii jądrowej. Przedstawiona metoda jest prosta w zastosowaniu, kompatybilna z komercyjnymi rozwiązaniami do pomiaru siły i może być łatwo rozszerzona o badanie mechaniki innych przedziałów subkomórkowych, np. mitochondriów, włókien stresowych i endosomów.

Introduction

Morfogeneza tkanek to złożony proces, w którym sygnały biochemiczne i siły fizyczne są czasowo koordynowane. W rozwijającym się zarodku gradienty biochemicznych czynników sygnalizacyjnych dyktują specyfikację losu i zapewniają prawidłowe wzorcowanie tkankowe^1,2. Jednocześnie siły wewnętrzne i zewnętrzne odgrywają rolę w budowaniu architektury embrionu^3,4. Wpływ mechaniki kory komórkowej w tym kontekście był szeroko badany^5,6. Ścisłe powiązanie między procesami mechanochemicznymi podczas morfogenezy opiera się na właściwościach pojedynczych komórek do wyczuwania i reagowania na siły mechaniczne w mikrośrodowisku tkanek. Komórki dekodują w ten sposób sygnały mechaniczne poprzez obecność wrażliwych na siłę elementów subkomórkowych i molekularnych, które przekształcają informacje mechaniczne w określone szlaki sygnałowe kontrolujące zachowanie komórki, los komórki i mechanikę komórki.

Cechą charakterystyczną procesów rozwojowych jest to, że komórki organizują się w grupy, aby budować struktury wielokomórkowe. W związku z tym pojedyncze komórki rzadko przegrupowują się i poruszają samodzielnie, ale są powiązane w ścisłym socjotopie, w którym wykazują zachowania zbiorowe, takie jak migracja nadkomórkowa⁷, (nie)zagłuszające przejścia^8,9 lub zagęszczenie blastocysty¹⁰. Siły mechaniczne generowane wewnątrz i między komórkami służą jako ważne wskazówki do instruowania zbiorowej dynamiki komórki^7,11. Ale nawet gdy komórki poruszają się samotnie, takie jak komórki progenitorowe, które przeciskają się między arkuszami tkanek lub wąskimi niszami tkankowymi, doświadczają rozległych anizotropowych sił mechanicznych podczas poruszania się w trójwymiarowym środowisku. Te mechaniczne naprężenia na komórkach mają poważne konsekwencje dla zachowania komórek^12,13. Zbadano kilka mechanizmów, które zbiegają się w jądrze jako główny element mechanotransdukcji^14,15, jako pasywny lub aktywny element mechaniczny podczas migracji w gęstym środowisku tkankowym 3D^15,16.

Niedawno zaproponowaliśmy mechanizm, który wyposaża komórki do pomiaru deformacji kształtu przy użyciu jądra jako elastycznego wewnątrzkomórkowego mechano-miernika¹². Jądro, będące największą organellą w komórce, ulega dużym deformacjom, gdy komórki polaryzują się, migrują lub zmieniają swój kształt pod wpływem mechanicznego rozciągania, uwięzienia lub stresu osmotycznego^16,17,18,19. Odkryliśmy, że rozciąganie otoczki jądrowej wraz z wewnątrzkomórkowym pozycjonowaniem jądra dostarcza komórkom informacji na temat wielkości i rodzaju deformacji komórki (takiej jak kompresja komórki w porównaniu z obrzękiem komórki). Rozciąganie jądra jest związane z rozwijaniem wewnętrznej błony jądrowej (INM), która promuje zależną od wapnia aktywność lipazy cPLA2 (cytozolowej fosfolipazy A2) w INM, a następnie uwalnianie kwasu arachidonowego (AA) i szybką aktywację miozyny II w korze komórkowej. Prowadzi to do zwiększonej kurczliwości komórek i migracji komórek ameboidalnych powyżej progu kurczliwości kory mózgowej⁶. Mechanowrażliwa reakcja na deformację komórki zachodzi w czasie krótszym niż minuta i jest odwracalna po uwolnieniu w zamknięciu, co sugeruje, że jądro działa jak tensometr dla propriocepcji komórkowej, regulując adaptacyjne zachowanie komórki w warunkach stresu mechanicznego. Wykazano, że ten mechanowrażliwy szlak jest aktywny w progenitorowych komórkach macierzystych pochodzących z zarodków danio pręgowanego, zarówno w komórkach pluripotencjalnych, jak i zaangażowanych w linię¹² i jest konserwatywny w różnych gatunkach i liniach komórkowych²⁰.

Oprócz właściwości jądrowych jako mechanosensora komórkowego, architektura jądrowa i mechanika są wewnętrznie regulowane podczas rozwoju i w odpowiedzi na specyfikację losu komórki²¹, stąd dostrajanie komórkowej mechano-czułości^22,23. Konsekwencją może być zmiana podatności jądrowej, która pozwala na zmiany morfologiczne i przejścia ze stanu przedmigracyjnego do migracyjnego i odwrotnie⁸.

Zastosowano kilka technik pomiaru mechaniki jądra komórkowego, takich jak mikroskopia sił atomowych^24,25, aspiracja mikropipety^26,27, technologia mikroprzepływowa²⁸ oraz mikroigły²⁹. Jednak wiele z tych technik jest inwazyjnych w tym sensie, że cała komórka musi zostać zdeformowana, co ogranicza pomiar właściwości mechanicznych i zależnych od siły reakcji samego jądra. Aby uniknąć jednoczesnej deformacji powierzchni komórki i jej mechanowrażliwej kory komórkowej³⁰, izolowane jądra badano w różnych kontekstach^31,32. Nie można jednak wykluczyć, że izolacja jądrowa wiąże się ze zmianą właściwości mechanicznych jądra i ich regulacją (odniesienie²⁴ i własne niepublikowane obserwacje).

Pęsety optyczne (OTs) to wszechstronna technologia, która pozwoliła na mnóstwo eksperymentów w mechanobiologii komórkowej i odegrała kluczową rolę w naszym zrozumieniu, w jaki sposób maszyny molekularne przekształcają energię chemiczną w mechaniczną^33,34. Pęseta optyczna wykorzystuje ściśle skupioną wiązkę laserową do wywierania sił optycznych na cząstki dielektryczne, które mają współczynnik załamania światła wyższy niż otaczające je medium³³. Siły te mogą być rzędu setek pikoniutonów i skutkować efektywnym uwięzieniem cząstki w ognisku pułapki laserowej, umożliwiając manipulację uwięzioną cząstką w trzech wymiarach. Wykorzystanie światła ma ważną zaletę, ponieważ pomiar można wykonać w sposób nieinwazyjny wewnątrz żywych komórek. Manipulacje optyczne są dodatkowo ograniczone do skupienia wiązki laserowej na pułapce. W związku z tym manipulacja może być wykonywana bez stymulacji otaczających błon komórkowych i nie zaburza kory aktynowej ani procesów mechanowrażliwych na błonie plazmatycznej, takich jak zależna od siły aktywacja kanałów jonowych.

Trudność podejścia pęsety optycznej polega na precyzyjnym określeniu sił przyłożonych do mikrosfery przy użyciu klasycznych metod, które polegają na pośredniej kalibracji siły opartej na twierdzeniu o ekwipartycji lub użyciu zdefiniowanych sił oporu Stokesa do pomiaru siły ucieczki zależnej od mocy lasera³⁵. Chociaż metody te są proste do wdrożenia w eksperymencie in vitro, zwykle nie można ich przełożyć na środowisko komórkowe. Do tej dziedziny wprowadzono kilka strategii, które opierają się na bezpośredniej kalibracji siły, wywodzącej się z pierwszych zasad zachowania pędu^36,37. W przeciwieństwie do innych podejść do spektroskopii sił, pomiary siły są wyprowadzane z lokalnej wymiany pędu światła z dowolnie ukształtowaną uwięzioną cząstką^38,39. W naszym układzie eksperymentalnym zmiany pędu światła wynikające z sił optycznych są mierzone bezpośrednio, bez potrzeby kalibracji pułapki in situ^40,41,42,43. W ten sposób pomiary stają się możliwe w lepkim środowisku, takim jak wnętrze komórki, a nawet w tkance, a siły można łatwo określić ilościowo aż do poziomu pN.

W tym protokole opisujemy test do mechanicznego manipulowania wewnątrzkomórkowymi organellami lub strukturami i ilościowej oceny ich właściwości mechanicznych za pomocą pęsety optycznej. Układ ten jest zintegrowany z mikroskopem fluorescencyjnym z wirującym dyskiem, co umożliwia równoległe obrazowanie zachowania komórek lub dynamiki wewnątrzkomórkowej. Test pozwala na scharakteryzowanie właściwości mechanicznych określonych przedziałów komórkowych, takich jak jądro, przy jednoczesnym badaniu możliwej mechanoodpowiedzi i aktywacji molekularnych szlaków sygnałowych w wyniku samej deformacji. Co więcej, optyczne uwięzienie wstrzykniętych mikrogranulek w komórkach pozwala na zwiększenie siły wgniecenia dzięki znacznie wyższemu współczynnikowi załamania światła kulki polistyrenowej (n = 1,59) w porównaniu z wewnętrznym kontrastem refrakcyjnym 44 jądra (n ~ 1,35) w porównaniu z cytoplazmą (n ~ 1,38). Przedstawiona strategia może być łatwo zaadaptowana do badania innych struktur i organelli wewnątrzkomórkowych, a także innych podejść obejmujących aktywną mikroreologię, wykorzystanie wielu pułapek optycznych do jednoczesnego badania tych samych/różnych struktur subkomórkowych oraz pomiary ukierunkowane na mechanobiologię komórki w żywym zarodku.

Protocol

Wszystkie użyte protokoły zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (PRBB-IACUEC) i wdrożone zgodnie z krajowymi i europejskimi przepisami. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami 3R. Danio pręgowany (Danio rerio) utrzymywano zgodnie z wcześniejszym opisem.

1. Przygotowanie izolowanych pierwotnych komórek macierzystych progenitorowych danio pręgowanego

1. Preparat z mikropipet i agarozy
   UWAGA: Aby zapoznać się z pełnym protokołem mikroiniekcji zarodków danio pręgowanego, zobacz reference⁴⁵.
   1. Za pomocą ściągacza do mikropipet pociągnij szklaną kapilarnę o średnicy 1,0 mm, aby uzyskać dwie igły⁴⁵. Niewykorzystane igły należy przechowywać na szalce Petriego o średnicy 150 mm przymocowanej do poduszki z ciastoliny lub w pierścieniu z taśmą laboratoryjną wywróconą na lewą stronę, aby chronić cienką końcówkę przed uszkodzeniem podczas transportu.
   2. Rozpuść 1% ultraczystej agarozy w E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM_MgSO4) w standardowej kuchence mikrofalowej / laboratoryjnej przez 10 sekund. Podgrzewaj mieszaninę wielokrotnie przez krótki czas (kilka sekund), aż agaroza się rozpuści.
   3. Gdy agaroza całkowicie się rozpuści, pozwól jej krótko ostygnąć, a następnie przelej ją do 10 cm szalki Petriego. Powoli dodawaj trójkątną formę do mikroiniekcji (patrz Tabela materiałów) na wierzchu agarozy, unikając pojawienia się pęcherzyków. Nie popychaj formy, upewniając się, że pozostaje na powierzchni agarozy.
   4. Gdy agaroza całkowicie zastygnie, usuń trójkątną formę bardzo powoli, wywierając delikatną siłę, aby uniknąć pęknięć agarozy. Płytkę można przechowywać do góry nogami w temperaturze 4 °C przez 2-4 tygodnie.
   5. Na 30 minut przed mikroiniekcją wyjąć płytkę z lodówki i dodać E3 podgrzany do temperatury 28 °C, aby ustabilizował się w temperaturze pokojowej.
2. Przygotowanie mieszanki iniekcyjnej
   1. Aby przygotować mieszaninę do wstrzykiwań, należy rozcieńczyć 1 μm mikrogranulki (polistyrenowe, niefluorescencyjne) w stosunku 1:5 w wodzie wolnej od RNazy.
   2. Przygotować mRNA do przejściowej ekspresji markerów fluorescencyjnych lub ekspresji rekombinowanych konstruktów genowych i/lub jednoczesnego wstrzyknięcia morfolino w pożądanym stężeniu.
      UWAGA: Typowa mieszanina iniekcyjna do jednoczesnego wstrzykiwania mikrogranulek wraz ze 100 pg mRNA na zarodek w celu znakowania np. jądra z H2A-mCherry to: 1 μL kulek + 1 μL mRNA (stężenie podstawowe wynosi 1 μg/μL) + 2,5 μL wody wolnej od RNA + 0,5 μL czerwieni fenolowej (roztwór podstawowy 0,5%, czerwień fenolowa nie jest obowiązkowa; Służy do lepszej wizualizacji wstrzykniętej kropli, ale nieoznakowana kropla iniekcyjna jest również widoczna dla doświadczonego eksperymentatora). Wstrzyknięcie RNA może być również przydatne do selekcji wstrzykniętych zarodków. Mikrogranulki fluorescencyjne mogą być wstrzykiwane zamiast niefluorescencyjnych, aby je uwidocznić.
3. Ładowanie i kalibracja igły do mikroiniekcji
   1. Włącz mikrowtryskiwacz za pomocą opcji Time-Gated. To ustawienie jest bardzo ważne dla prawidłowej kalibracji objętości wtrysku. Ustaw czas bramkowania na około 500 ms.
   2. Załadować 3 μl mieszaniny iniekcyjnej do igły za pomocą pipety z mikroładowarką.
   3. Włóż igłę do mikromanipulatora i szczelnie zamknij. Sprawdź, czy mikromanipulator znajduje się w dobrej pozycji i ma wystarczającą swobodę, aby poruszać się w kierunku x-y na płytce wtryskowej.
   4. Zmierz wielkość kropli za pomocą szkiełka mikrometrycznego (5 mm/100 działek) z kroplą oleju mineralnego na górze⁴⁵ i wyrzuć kroplę mieszanki iniekcyjnej bezpośrednio do oleju mineralnego.
   5. Przytnij igłę ostrymi kleszczami pod ostrym kątem, aby uzyskać ostrą, spiczastą końcówkę. Dostosuj wielkość kropli do 0,1 mm, co odpowiada 0,5 nL wtryskiwanego materiału.
      UWAGA: Jeśli przez przecięcie igły objętość ta zostanie przekroczona, zaleca się ponowne wykonanie procedury kalibracji z nową igłą. Czas bramkowania mikrowtryskiwacza można nieznacznie dostosować, aby dopasować go do objętości kropli; Jednak krótki czas bramkowania odpowiada dużej średnicy igły, co potencjalnie uszkadza zarodki.
4. Mikroiniekcja zarodków danio pręgowanego w stadium jednokomórkowym
   1. Zebrać zarodki danio pręgowanego wkrótce po zapłodnieniu w celu mikroiniekcji mieszanki kulek bezpośrednio do zarodka jednokomórkowego (zygoty) przed wystąpieniem pierwszego podziału komórkowego.
      UWAGA: Zapewnia to prawidłowe rozmieszczenie mikrosfer i wystarczająco wysoką wydajność izolowanych blastomerów z co najmniej jedną mikrosferą na komórkę w późniejszych stadiach rozwojowych, w których przeprowadza się eksperymenty (stadium blastuli-gasstruli). Eksperymenty z wcięciami można nadal wykonywać, jeśli w komórce znajdują się dwie kule, ale komórki, które nie mają koralików, powinny być wykluczone (nawet jeśli możliwe jest wcięcie bez kul). W tym protokole użyto szczepów AB typu dzikiego, ale można użyć dowolnego innego szczepu, np. TL.
   2. Umieść zarodki jednokomórkowe (zygotę) w wstępnie podgrzanej trójkątnej formie 1% agarozy, jak pokazano na Rysunek 1A, używając plastikowej pipety Pasteura.
   3. Usuń dodatkowe podłoże za pomocą tej samej pipety, aby zapobiec unoszeniu się zarodków w pobliżu. Delikatnie wepchnij zarodki do trójkątnej formy za pomocą szczoteczki. Zachowaj trochę miejsca między zarodkami, aby ułatwić prawidłową orientację (Ryc. 1B).
   4. Delikatnie wyrównaj zarodki za pomocą szczoteczki, tak aby zarodki były zorientowane bocznie, przy czym jedna komórka zygoty była wyraźnie widoczna, jak pokazano na Rysunek 1B. Idealna orientacja do mikroiniekcji jest osiągana, gdy jedna komórka zarodka jest skierowana w kierunku igły (wstrzyknięcie przez zwierzęcy biegun zarodka) lub w przeciwny sposób zwrócona w stronę komórki żółtkowej (wstrzyknięcie przez biegun roślinny zarodka), jak pokazano na Rysunek 1C.
   5. Przytrzymaj naczynie jedną ręką, a drugą ręką ustaw końcówkę igły za pomocą sterownika mikromanipulatora. Opuść końcówkę igły w kierunku zarodków.
   6. Przebić kosmówkę i wprowadzić igłę do jednokomórkowego zarodka, monitorując procedurę za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Upewnij się, że igła jest prawidłowo umieszczona, a po wstrzyknięciu we właściwym miejscu, w którym wstrzyknięta kropla jest pokazana, jak pokazano na rysunku Rysunek 1C.
   7. Powtórz dla wszystkich zarodków: przesuń igłę w górę, przesuń szalkę z zarodkami, aż następny zarodek zostanie wyśrodkowany, opuść igłę i wstrzyknij ją.
   8. Po wstrzyknięciu całego zestawu zarodków usuń zarodki z formy agarozowej/szalki Petriego, przepłukując trochę E3 i umieść je na nowej szalce Petriego za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Zaleca się umieszczenie wystarczającej ilości podłoża na płytce iniekcyjnej, aby uniknąć wysuszenia zarodków podczas procedury mikroiniekcji.
   9. Powtarzaj procedurę, aż do wstrzyknięcia żądanej liczby zarodków. Zarodki muszą znajdować się w jednym stadium komórkowym, aby zapewnić maksymalne i jednorodne rozsiewanie kulek.
      UWAGA: Ta procedura jest zoptymalizowana dla wczesnych zarodków blastuli i prawdopodobnie musi zostać zoptymalizowana, jeśli mają być badane różne etapy rozwoju.
   10. Umieść wstrzyknięte zarodki w inkubatorze w temperaturze 28-31 °C na około 4 godziny lub do pożądanego etapu (Rysunek 1D) przed przystąpieniem do protokołu pierwotnej hodowli komórek.
       UWAGA: Opcjonalnie pozwól zarodkom rozwinąć się poza stadium blastuli (lub pożądany punkt czasowy pomiaru), aby zapewnić przeżycie i wykluczyć artefakty toksyczności. W stadiach larwalnych zamontuj znieczulone larwy z trikainą w 0,75% agarozie i zobrazuj rozmieszczenie mikrosfer w różnych tkankach. Aby przygotować roztwór podstawowy, wymieszać: 400 mg proszku tricainy w 97,9 ml wody destylowanej, około 2,1 ml 1 M zasady TRIS (pH 9) i dostosować do pH 7. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C. Aby użyć tricainy jako środka znieczulającego, rozcieńczyć 4,2 ml roztworu podstawowego w 100 ml pożywki jajowej (lub pożądanej pożywki); w tym przypadku użyto E3. Szczegółowe informacje można znaleźć na stronie reference⁴⁶.

2. Przygotowanie i barwienie pojedynczych komórek

1. Umieść zarodki w stadium kulistym (4 hpf, godziny po zapłodnieniu) w szklanym naczyniu za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Wybierz zarodki, które są dodatnie dla sygnału wstrzykniętych kulek i które wyrażają białko fluorescencyjne w przypadku wstrzyknięcia mRNA. Niektóre zarodki mogą wykazywać wysokie skupiska koralików i można je wykluczyć.
   1. Ręcznie dekorionuj zarodki za pomocą kleszczy. Przenieść około 10-15 zarodków do pojemników reakcyjnych o pojemności 1,5 ml za pomocą szklanej pipety Pasteura.
      UWAGA: Kiedy zarodki są zdekorionowane, przyczepiają się do plastiku i wymagane jest użycie szklanych naczyń. Jako alternatywę dla szklanej płytki można użyć plastikowej szalki Petriego z cienką warstwą 1% agarozy. Ręczna dechorionacja powinna być preferowana zamiast enzymatycznego leczenia Pronazą, aby zapobiec proteolitycznym uszkodzeniom białek powierzchniowych komórek i potencjalnym zmianom właściwości mechanicznych komórek i tkanek, zapobiegając wydłużonemu czasowi rekonwalescencji⁴⁷.
2. Usunąć pożywkę E3 i dodać 500 μl wstępnie podgrzanej, niezależnej od CO₂ pożywki do hodowli tkankowej (DMEM-F12; z L-glutaminą i 15 mM HEPES, bez wodorowęglanu sodu i czerwieni fenolowej uzupełnionej 10 jednostkami penicyliny i 10 mg/l streptomycyny).
   UWAGA: Nie używaj pożywek zależnych od CO₂, chyba że używany jest inkubator mikroskopowy. Stosowanie np. RPMI w warunkach buforowania węglanowego powoduje zmiany pH pożywki i może wpływać na przeżycie komórek. Innym kluczowym aspektem jest unikanie pożywek hodowlanych zawierających surowicę. Surowica może zawierać kwas lizofosfatydowy (LPA), silny aktywator szlaku Rho/ROCK, zdolny do kontrolowania kurczliwości i ruchliwości komórek w progenitorowych komórkach macierzystych⁶. Osmolarność podłoża powinna być utrzymywana na poziomie 300 mOsm, aby uniknąć wyzwań osmotycznych, które mogłyby zakłócać morfologię jądra lub mechanikę¹².
3. Ręcznie oddziel komórki, delikatnie potrząsając rurką. Upewnij się, że zawartość probówki stanie się mętna i nie będzie widocznych dla oka dużych kawałków. Unikaj tworzenia się pęcherzyków, aby zminimalizować uszkodzenia i utratę komórek.
4. Wirować przy 200 x g przez 3 min. Granulka musi być wyraźnie widoczna.
5. Usuń supernatant i wykonaj jedną z czynności opisanych poniżej.
   1. Jeśli barwienie nie jest potrzebne, dodaj 500 μl DMEM. Delikatnie zawiesić za pomocą pipety o pojemności 200 μl, kierując strumień cieczy na granulkę. Nie wywieraj nadmiernej siły ścinającej na ogniwa. Pienienie wskazuje na uszkodzenie komórek.
   2. W celu znakowania jądra barwnikami DNA, takimi jak Hoechst, zmieszaj 0,5 μl DNA-Hoechst (zapas 2 mg / ml) w 1 000 μl DMEM, aby uzyskać 1 μg / ml końcowego stężenia. Dodać 500 μl tego roztworu barwiącego do komórek i delikatnie zawiesić. Inkubować przez 7 minut w ciemności.
   3. Aby zabarwić komórki fluorescencyjnym chemicznym wskaźnikiem wapnia Calbryte-520, dodaj Calbryte-520 do stężenia 5 μM w DMEM. Inkubować przez 20 minut w ciemności.
      UWAGA: Protokoły wskazane w krokach 2.5.2 i 2.5.3 zostały zoptymalizowane dla tych konkretnych produktów. Inne barwienie można wykonać przy użyciu protokołów wskazanych przez producenta.
6. Ponownie odwirować przy użyciu tych samych ustawień, co w kroku 2.4; usunąć supernatant i delikatnie zawiesić komórki (aby uniknąć tworzenia się klastrów) w 50 μl DMEM dla próbek w zawiesinie lub 20 μl DMEM dla komórek w zamknięciu.

3. Przygotowanie optycznych komór pułapkowych z wykorzystaniem odstępów polidimetylosiloksanu (PDMS)

UWAGA: Pomiary siły optycznej oparte na wykrywaniu pędu światła wymagają przechwycenia całego światła wychodzącego z pułapek optycznych⁴⁰. Aby zapewnić solidność niezmienniczego współczynnika kalibracji α (pN/V), rozkład światła w tylnej płaszczyźnie ogniskowej (BFP) czujnika siły optycznej musi być dokładnie odpowiadający pędowi fotonu. Określa to odległość od powierzchni soczewki zbierającej do płaszczyzny pułapki do około 2 mm, co jest maksymalną wysokością optycznych komór pułapkowych.

1. Powłoka wirowa PDMS naczyń ze szklanym dnem #1.5.
   UWAGA: Poniższy przepis dotyczy około 40 potraw. Powstała mikrokomora będzie miała różne wysokości w zależności od tego, czy eksperymenty mają być przeprowadzane na zawieszonych czy ograniczonych komórkach (Rysunek 1D).
   1. Wymieszaj 9 ml polimeru bazowego PDMS i 1 ml utwardzacza PDMS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Aktywnie wymieszaj oba produkty, aby zapewnić prawidłowe rozprowadzenie utwardzacza.
   2. Odgazuj mieszaninę, aby uniknąć pęcherzyków za pomocą pompy próżniowej. Umieść stożkową rurkę w butelce próżniowej i opróżnij komorę. Poczekaj, aż w mieszaninie nie będzie żadnych pęcherzyków.
      UWAGA: Powoli otwieraj odkurzacz, aby zapobiec pienieniu się i rozlaniu PDMS z rurki falcon.
   3. Umieść naczynie ze szklanym dnem na uchwycie do powlekania wirówką (Rysunek 2A). Bądź delikatny, aby nie zadrapać, nie pozostawić odcisków palców ani nie zabrudzić naczynia. Chroń skrzynkę wirówki przed wyciekami PDMS folią aluminiową.
   4. W przypadku komór OT do eksperymentów na komórkach w zawiesinie, dodać około 250 μl mieszaniny PDMS na środek dolnego naczynia i wirować z prędkością 750 obr./min przez 1 min. Wysokość warstwy PDMS będzie wynosić około 50 μm⁴⁸.
   5. W przypadku komór OT do eksperymentów na zamkniętych komórkach dodaj niewielką kroplę PDMS (około 50 μL) i wiruj z prędkością 4000 obr./min przez 5 minut. Wysokość warstwy PDMS będzie wynosić około 10 μm. Szczegółowy protokół dotyczący uzyskiwania różnych grubości PDMS można znaleźć w reference⁴⁸.
   6. Utwardzać naczynia ze szklanym dnem pokryte PDMS w temperaturze 70 °C przez 1 godzinę.
   7. Wytnij skalpelem kwadrat o wymiarach 1 x 1 cm na warstwę PDMS i odklej go pęsetą (Rysunek 2C). W przypadku zamkniętych komórek należy przepłukać szczątki PDMS izopropanolem.
2. Powłoka komory do eksperymentów z lekko przyczepionymi komórkami w zawiesinie
   1. Dodać 100 μl konkanawaliny A (ConA) w stężeniu 0,5 mg/ml, aby pokryć całą powierzchnię kwadratowej jamy i pozostawić do inkubacji przez 30 min.
      UWAGA: ConA to lektyna, która wiąże się z cukrami na powierzchni komórek i łączy poszczególne komórki na powierzchni szkła nakrywkowego.
   2. Usuń kroplę ConA i ostrożnie spłucz powierzchnię podłożem DMEM, nie rysując powierzchni poddanej działaniu ConA.
   3. Dodać 30 μl wcześniej przygotowanej próbki (krok 2.6) do studzienki i delikatnie zawiesić ponownie, aby pozbyć się wszelkich skupisk komórek.
   4. Zamknij wnękę, delikatnie umieszczając szkło nakrywkowe #1.5 o wymiarach 22 x 22 mm na wierzchu obrzeży PDMS (unikaj nagłego opadnięcia, jeśli to możliwe, użyj kleszczy, Rysunek 2B,C).
      UWAGA: Każda grubość szkiełka nakrywkowego będzie odpowiednia dla górnej szklanej pokrywy (soczewka zbierająca ma odległość roboczą 2 mm).
3. Przygotowanie komory do eksperymentów z komórkami w zamknięciu
   1. Umieść 10 μl kropli roztworu zawierającego komórki (krok 2.6) do kwadratowej wnęki (Rysunek 2B).
   2. Bardzo delikatnie należy pokryć próbkę szkłem nakrywkowym o wymiarach 22 x 22 mm, tak aby kropla rozlała się po całym obszarze i nie zaobserwowano pęcherzyków. Również w tym przypadku wygodnie jest użyć kleszczy, jak pokazano na rysunku Rysunek 2C, aby zapobiec nagłemu opadnięciu szkła nakrywkowego.

4. Alternatywne opcje dla rozstawu komór OT

UWAGA: Te kroki można wykonać, jeśli nie jest dostępny żaden warsztat mikrofabrykacyjny lub powlekarka wirowa.

1. Przygotowanie komory do eksperymentów z komórkami w zawiesinie
   UWAGA: W przypadku, gdy nie jest dostępna powlekarka wirowa, można wykonać przekładkę przy użyciu zwykłej, dwustronnej taśmy klejącej (o wysokości około 100 μm).
   1. Wytnij kawałek dwustronnej taśmy klejącej z kwadratowym otworem o wymiarach około 10 cm x 10 cm pośrodku (takie same wymiary jak w PDMS, Rysunek 2B).
   2. Usuń jedną z warstw ochronnych taśmy, odklejając ją i umieść odkrytą stronę taśmy na środku naczynia ze szklanym dnem #1.5 H. Delikatnie dociśnij, aby cała powierzchnia przykleiła się do szkła, unikając pęcherzyków powietrza, a następnie usuń pozostałą warstwę ochronną taśmy, odklejając ją.
   3. Postępuj zgodnie z instrukcjami w kroku 3.2.
2. Przygotowanie komory do eksperymentów z komórkami w zamknięciu
   UWAGA: Aby precyzyjnie ograniczyć komórki, monodyspersyjne mikrocząstki o znanej średnicy mogą być używane jako przekładki między dwoma szkłami nakrywkowymi.
   1. Dodać 10 μm kulek polistyrenowych do zawieszonych komórek w stężeniu 10⁴ kulek/μl.
   2. Umieścić 10 μl kropli roztworu zawierającego komórki i kulki na szkle nakrywkowym o wymiarach 22 x 60 mm.
   3. Bardzo delikatnie umieść próbkę z kolejnym szkłem nakrywkowym o wymiarach 22 x 60 mm, tak aby kropla rozprzestrzeniła się na całym obszarze i nie zaobserwowano pęcherzyków. Aby delikatnie ustawić górną szklankę nakrywkową (unikaj jej gwałtownego upadku), wygodnie jest użyć kleszczyków.
   4. Ze względu na to, że próbka może wyschnąć, zaleca się szybkie wykonanie przygotowania.

5. Ustawianie pułapki optycznej do pomiarów wewnątrzkomórkowych

UWAGA: Poniższe kroki są zoptymalizowane dla komercyjnej platformy pęsety optycznej, składającej się z modułu mikromanipulacji optycznej opartego na ugięciu akustyczno-optycznym (AOD) oraz czujnika siły optycznej opartego na bezpośrednim wykrywaniu zmian pędu światła (Rysunek 2, odniesienie^12,40,49). Szczegóły i elementy optyczne zestawu można znaleźć w Rysunek 2F. Aby zaobserwować deformację wywołaną siłą podczas manipulacji pęsetą optyczną, mikroskop konfokalny Nipkow z wirującym dyskiem jest sprzężony z lewym portem odwróconego mikroskopu w celu dwukolorowego obrazowania fluorescencyjnego. Nie tracąc ogólności, protokół ten może być stosowany z dowolnym dynamicznym systemem OT wyposażonym w bezpośrednie pomiary siły oparte na detekcji pędu światła. Dostępne są szczegółowe procedury krok po kroku umożliwiające konstruowanie domowych optycznych pułapek gradientowych do zastosowań in vivo⁵⁰. Te oparte na modulacji AOD wyróżniają się ewentualnymi eksperymentami z wieloma pułapkami i szybkimi pomiarami^51,52. W literaturze istnieje kilka protokołów do konstruowania instrumentu opartego na lekkim pędzie^36,39,40,53, a także można zastosować dowolną inną metodę obrazowania (kontrast interferencji różnicowej, fluorescencja szerokopolowa itp.).

1. Uruchomienie pęsety optycznej
   1. W celu optymalizacji stabilności mocy wyjściowej należy włączyć laser ze znacznie dużą mocą (np. 3 W) co najmniej 30 minut przed eksperymentem.
   2. Włącz moduł elektroniczny optycznych jednostek mikromanipulacji i pomiaru siły.
      UWAGA: Stosuj wszystkie laserowe środki bezpieczeństwa i używaj wyłącznie sprzętu zatwierdzonego przez radę instytucji. Nigdy nie używaj okularów mikroskopu optycznego, gdy laser jest włączony. Zawsze używaj zatwierdzonych okularów ochronnych w podczerwieni (OD7 w zakresie 950-1080 nm), blokuj światło lasera IR za pomocą migawki w porcie epifluorescencji 2 i nie uruchamiaj oprogramowania pułapkowania optycznego, dopóki nie zakończysz ustawiania czujnika siły optycznej po kroku 5.3. Ogólnie rzecz biorąc, nie należy używać próbki o wysokim współczynniku odbicia, ponieważ odbicie wsteczne może spowodować uszkodzenie lasera.
   3. Kontroluj moc pułapki za pomocą obracającego się HWP (Rysunek 2F) przy wejściu do optycznego modułu mikromanipulacji.
      UWAGA: Komercyjny moduł mikromanipulacji optycznej używany w tym protokole już zawiera tę funkcję. W przypadku domowych systemów pułapkowania optycznego należy zintegrować to narzędzie do kontroli mocy, aby można było stosować wyższe i bardziej stabilne moce lasera.
2. Do kalibracji należy użyć pustej mikrokomory
   1. Wytnij kwadrat o wymiarach 1 x 1 cm na dwustronnej taśmie klejącej i przymocuj go do szkiełka mikroskopowego o grubości 1 mm.
   2. Dodaj wodę do kwadratu i zamknij go od góry szklanką nakrywkową #1.5 (22 x 22 mm). Zaleca się dodanie nieco większej objętości wody, np. 30-40 μL, aby uniknąć pęcherzyków wewnątrz zakrytej komory. Delikatnie wytrzyj komorę kalibracyjną w przypadku wylania się z niej wody.
3. Ustawienie optycznego czujnika siły
   1. Umieść kroplę wody na obiektywie 60x/1,2 zanurzenia w wodzie. Umieść komorę kalibracyjną na stoliku tak, aby szkło nakrywkowe #1.5 było skierowane w stronę obiektywu. Skoncentruj się na dolnej powierzchni, gdzie ostatecznie znajdą się próbki komórek.
   2. Dodaj kroplę olejku immersyjnego na górny szklany szkiełko pokrywające próbkę (Rysunek 2D). Ostrożnie opuść soczewkę zbiorczą czujnika siły, aż zetknie się z kroplą oleju.
      UWAGA: Kropla musi być na tyle duża, aby pokrywała całą soczewkę, która zbiera światło laserowe wydobywające się z pułapek. Zwykle 200 μl wystarcza do pokrycia całej powierzchni i zapewnienia stabilnego kontaktu zanurzeniowego. Zachowaj ostrożność i unikaj przepełniania, ponieważ może to spowodować wyciek do próbki.
   3. Postępując zgodnie z protokołem producenta dotyczącym wyrównania czujnika siły optycznej, spójrz na przykładowy obraz płaszczyzny na kamerze pomocniczej, która zostanie użyta do ustawienia OT (AUX, Rysunek 2F). Bardzo delikatnie opuść czujnik siły optycznej, aż zatrzymanie pola (FS, Rysunek 2F-G) pojawi się sprzężone na płaszczyźnie próbki. Zapewni to prawidłowe bezpośrednie pomiary siły na podstawie niezmienniczej detekcji zmian pędu światła⁴⁰.
      UWAGA: Zamknij FS na tyle, aby jego obraz stał się mniejszy niż pole view (FOV), a tym samym widoczny. Zachowaj szczególną ostrożność i nie dociskaj soczewki zbierającej czujnika siły optycznej do próbki. Położenie pionowe czujnika siły optycznej można alternatywnie określić na podstawie analizy rozkładu światła pułapkującego w BFP dla stożków świetlnych o zdefiniowanej aperturze numerycznej (NA).
   4. Upewnij się, że w kropli oleju nie ma pęcherzyków powietrza; mogą one bezpośrednio wpływać na pomiary siły. Aby sprawdzić, czy nie ma pęcherzyków powietrza, umieść soczewkę Bertrand na miejscu (BL, Rysunek 2G) i obserwuj ścieżkę obrazowania przez okular. Jeśli widoczne są jakiekolwiek zabrudzenia lub pęcherzyki powietrza lub potrzebna jest większa ilość oleju (rysunek S1A), wyczyść soczewkę i komorę bezpyłową chusteczką do soczewek i powtórz procedurę w krokach 5.3.2 i 5.3.3. Niezakłócona ścieżka optyczna jest pokazana na rysunku S1B.
   5. Za pomocą bocznych umieszczonych na uchwycie optycznego czujnika siły, wyśrodkuj FS w polu widzenia. Aby uzyskać dokładność, otwórz FS tak, aby prawie wypełniał pole widzenia widoczne na kamerze pomocniczej (AUX, Rysunek 2F).

6. Optymalizacja pęsety optycznej

UWAGA: Bezpośredni pomiar siły opiera się wyłącznie na zmianie pędu światła wynikającej z siły wywieranej na uwięzioną cząstkę, a zatem, w przeciwieństwie do metod pośrednich, sztywność pułapki nie musi być kalibrowana przed każdym eksperymentem. Specyficzna dla przyrządu konwersja współczynnika ugięcia/siły (α; pN/V, reference⁴¹) jest kalibrowana przez producenta i dlatego jest niezmiennicza w eksperymencie. Jednak ze względu na to, że plamka lasera jest manipulowana na obszarze 70 μm x 70 μm, kroki 6,2-6,5 mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia optymalnego pułapkowania i stabilności mocy. Poniższe kroki są dostarczane w oprogramowaniu producenta, dzięki czemu OT są optymalizowane w obszarze roboczym w sposób półautomatyczny.

1. Uruchom oprogramowanie OTs i oprogramowanie do akwizycji dla AUX kamery.
2. Odejmij początkową linię bazową napięcia, klikając krok Krok 1: Przesunięcie elektroniki w podmenu Kalibracja systemu w oprogramowaniu do sterowania pęsetą optyczną.
3. Aby wykonać spłaszczanie mocy pułapki w całym obszarze roboczym OT, ustaw moc pułapki na połowę jej maksimum, odpowiednio obracając HWP. Nie zmieniaj mocy pułapki poprzez zmianę wyjścia lasera, ale za pomocą obracającego się HWP (Rysunek 2F). Kliknij Krok 2: Moc, aby zainicjować automatyczną procedurę spłaszczania mocy pułapki.
   UWAGA: Jest to krytyczny krok w celu skompensowania zmian mocy pułapki w obszarze roboczym OT (rysunek S1D). Udana procedura zmniejsza zmienność mocy pułapki do 2% w całym obszarze roboczym OT i zbiega się po 2 minutach.
4. Aby przeprowadzić kalibrację pozycji pułapki, wyjmij filtr podczerwieni, tak aby światło z lasera było widoczne w kamerze. Znajdź plamkę podczerwieni, ustawiając płaszczyznę obrazu skupioną na dolnej powierzchni mikrokomory. Uzyskaj najmniejszy możliwy punkt podczerwieni, dostrajając płaszczyznę obrazu (położenie obiektywu) i kontrast histogramu w oprogramowaniu do akwizycji AUX kamery. W razie potrzeby zmniejsz moc pułapki optycznej, obracając HWP (Rysunek 2F). Kliknij Krok 3: Pozycja, aby rozpocząć automatyczną procedurę lub kalibrację pozycjonowania pułapki.
   UWAGA: Ta procedura umożliwia dokładne dopasowanie współrzędnych pozycji OT w AUX kamery do kątów skrętu AOD. Udana procedura generuje mapowanie kąta do pozycji w ciągu kilku sekund.
5. Kompensacja pędu początkowego
   UWAGA: Ruch pułapki optycznej w poprzek próbki powoduje zmiany w rozkładzie światła i pędu w BFP (Rysunek S1E, F). Prowadzi to do niezależnych od siły zmian sygnału związanych z położeniem lasera nad obszarem roboczym, nawet jeśli moc pułapki została spłaszczona, jak w kroku 6.3. Konsekwencją jest zmiana linii bazowej siły spowodowana położeniem (niezależna od rzeczywistej siły działającej na optycznie uwięziony ścieg), która musi być skorygowana przed każdym eksperymentem.
   1. Ustaw moc pułapki, która zostanie użyta w eksperymentach, obracając HWP (Rysunek 2F).
   2. Kliknij opcję Przesunięcie globalne w podmenu Narzędzia. Spowoduje to otwarcie asystenta anulowania przesunięcia w oprogramowaniu pęsety optycznej, które koryguje początkową linię bazową pędu.
   3. Kliknij Offset | Skompensuj, aby skorygować początkowy pęd wariantu pozycji.
      UWAGA: Jeśli żadna modyfikacja nie wpłynie na tor optyczny w ciągu trwających tygodni, mapy spłaszczania mocy pułapki (krok 6.3) i pozycji (krok 6.4) pozostaną niezmienne. Dlatego zalecamy, aby zawsze używać tej samej kombinacji elementów optycznych (zwierciadeł dichroicznych, filtrów itp.), które mogą wpływać na ścieżkę pułapki laserowej lub przeprowadzić nową procedurę spłaszczania mocy pułapki. Jeśli chodzi o początkową kompensację pędu (krok 6.5), producent platformy OTs zapewnia kalibrację w locie, którą należy zmieniać dla każdej nowej mocy pułapki i sesji eksperymentalnej. Kroki 6.3 i 6.4 należy wykonać na pustym szkiełku kalibracyjnym opisanym w kroku 5.2. W próbce zawierającej komórki lub inne obiekty, krok 6.5 powinien być przeprowadzony w stanie wolnym od obiektów, które mogą wpływać na rozpraszanie światła w obszarze roboczym OT.
6. Opcjonalnie można wyłapać mikrosferę i przesuwać pułapkę ze znaną prędkością, jednocześnie rejestrując sygnał siły. Na przykład ustaw pułapkę tak, aby wykonywała oscylację trójkątną: zarejestrowany sygnał siły będzie sygnałem kwadratowym.
   UWAGA: Wartość siły powinna rosnąć liniowo wraz z prędkością, zgodnie z siłą oporu działającą na stopkę. Ten test służy jako pozytywna kontrola, czy pomiary siły są wykonywane prawidłowo³⁸. Alternatywnie, czujnik siły optycznej może być użyty do uzyskania sztywności pułapki optycznej, κ [pN/μm] oraz współczynnika kalibracji położenia, β [μm/V], z analizy widma mocy³⁵. Przy prawidłowym ustawieniu niezmienny współczynnik kalibracji podany przez producenta wynosi α = κ·β [pN/V].
   1. Zainicjuj odczyt siły w czasie rzeczywistym, klikając Wykres 1 w podmenu Miary w oprogramowaniu producenta. Zapewni to odczyt aktualnej siły i mocy pułapki optycznej.
   2. Otwórz okno dialogowe Parametry oscylacji z podmenu Narzędzia. Ustaw kształt fali trójkątnej w pierścieniach selektora Kształt i Typ. Jako przykład ustaw amplitudę 10 μm i częstotliwość 3 Hz. Spowoduje to powstanie siły lepkości około 1 pN na mikrokulkę o średnicy 1 μm³⁸.
   3. W oknie AUX kamery kliknij prawym przyciskiem myszy mikrokulkę i wybierz Rozpocznij oscylację. Odczyt siły stanie się sygnałem siły kwadratowej z płaskowyżami na poziomie ±1 pN.
   4. Kliknij prawym przyciskiem myszy mikrokulkę i wybierz Zatrzymaj oscylację.

7. Mikroskopia konfokalna z wirującym dyskiem

1. Włącz mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem i akcesoria, zintegrowane silniki laserowe i kamery akwizycyjne.
2. Uruchom oprogramowanie do obrazowania.
3. Ustawić kanały obrazowania do barwienia Hoechst jądra i GFP dla błony komórkowej plazmatycznej.
   1. Aktywuj linie laserów wzbudzających 405 nm i 488 nm.
   2. Dodaj wielopasmowy dichroik, aby odbić wzbudzenie do próbki i umożliwić przejście emitowanego światła do kamer.
   3. Podziel emisję fluorescencji za pomocą zwierciadła dichroicznego o długości fali 500 nm.
   4. Użyj filtrów emisyjnych DAPI/BFP (~445 nm) i GFP (~521 nm) odpowiednio przed dwiema kamerami akwizycyjnymi. Patrz Rysunek 2F,G.
   5. Ustaw czas ekspozycji na 100 ms dla każdego kanału.
   6. Ustaw emisję lasera tak, aby uzyskać moc 5 mW na płaszczyźnie próbki. Aby zmierzyć moc, użyj komercyjnego miernika mocy.
4. Ustaw protokół obrazowania. Aby uniknąć przesiąkania widmowego z kanału Hoechsta do kanału GFP, oba barwniki muszą być obrazowane sekwencyjnie.
   UWAGA: Jeśli istnieje synchronizacja sprzętowa między AD-ami pułapki optycznej a akwizycją kamery, upewnij się, że polaryzacja wyzwalania jest ustawiona prawidłowo. W razie wątpliwości skonsultuj się z kierownikiem placówki lub producentem mikroskopu.

8. Przeprowadzanie eksperymentów z wgłębieniami jądra

UWAGA: Zawsze wyłączaj pułapki optyczne - zarówno za pomocą oprogramowania, jak i zamykając migawkę na porcie epifluorescencji 2 - podczas podnoszenia modułu czujnika siły i zmiany próbki. W przeciwnym razie może dojść do poważnego uszkodzenia elementów optycznych i eksperymentatora. Uważaj na odległość boczną między uchwytem soczewki a dolną krawędzią czaszy podczas szukania komórek, aby uniknąć uderzenia soczewki w scenę/miskę hodowlaną (Rysunek 2).

1. Umieść próbkę w mikroskopie i postępuj zgodnie z krokiem 5.3 niniejszego protokołu.
2. Korzystając z obracającego się HWP (Rysunek 2F), ustaw moc pułapki na 200 mW jako wartość początkową, jeśli sztywność badanego jądra lub struktury wewnątrzkomórkowej nie jest znana. Przesunąć obszar roboczy OT (za pomocą stolika mikroskopu) do miejsca wolnego od komórek w celu skompensowania początkowej linii bazowej pędu w kroku 6.5.
   UWAGA: W zależności od sztywności struktury subkomórkowej, wartość mocy pułapki należy dostosować do niższych lub wyższych wartości, aby uzyskać podobną głębokość wcięcia.
3. Korzystając ze sterownika oprogramowania stolika mikroskopu, poszukaj komórki z jednym lub dwoma koralikami za pomocą mikroskopii w jasnym polu (Rysunek 3A).
4. Określ trajektorię zalewki.
   1. Otwórz okno dialogowe Trajektoria w podmenu Narzędzia i wybierz opcję Przemieszczenie w pierścieniu selektora Typ trajektorii.
   2. W arkuszu numerycznym zapisz przemieszczenie i czas każdego kolejnego kroku trajektorii. Oto dwa przykłady.
   3. W eksperymencie relaksacji naprężeń zaprogramuj obciążenia trapezowe, jak pokazano na rysunku Rysunek 3B. W tabeli S1 zastosowano dwa wgłębienia trapezowe o długości przesuwu 5 μm; prędkość 5 μm/s; Czas oczekiwania przed wycofaniem: 10 s.
   4. W przypadku powtarzalnego eksperymentu z wgłębieniem ze stałą prędkością, aby uzyskać trójkątną rutynę bez czasu przebywania na jądrze, należy ustawić amplitudę trajektorii, np. 5 μm, oraz czas kroku, np. 2 s, dla prędkości 2,5 μm/s. W tabeli S2 jest ona stosowana osiem razy z tą samą prędkością.
      UWAGA: Wartości te należy określić dla każdego typu komórki i eksperymentu, ale poniższe parametry procedury trapezowej oddają najważniejszą dynamikę w przedstawionym tutaj eksperymencie. Czas oczekiwania powinien być wystarczający, aby jądro wykazało całkowite rozluźnienie naprężeń po wgłębieniu
5. Pułapkowanie mikrosfery
   1. Ustaw płaszczyznę obrazu nieco powyżej ściegu za pomocą sterownika oprogramowania stolika mikroskopu.
   2. Aktywuj pułapki za pomocą oprogramowania OTs i kliknij koralik w oknie obrazowania AUX kamery (skalibrowany zgodnie z krokiem 6.4). Pomyślne uwięzienie koralika przez pułapkę optyczną znacznie zmniejszy ruch koralika.
   3. Kliknij i przeciągnij koralik w poprzek cytoplazmy i umieść go w odległości ~2 μm od otoczki jądrowej (Rysunek 3A). Upewnij się, że trajektoria jest ustawiona tak, aby wgłębienie ściegu było prostopadłe do błony jądrowej.
6. Opcjonalnie, jeśli jest to potrzebne do pomiarów położenia ściegu względem pułapki, zeskanuj pułapkę w poprzek ściegu, aby określić sztywność zalewki, k [pN/μm]⁵⁴, tym samym Δx_bead = -F/k (patrz Dyskusja). Moduł mikromanipulacji optycznej zastosowany w tym protokole ma wbudowaną procedurę do tego celu.
   1. Otwórz okno dialogowe Particle Scan (Skanowanie cząstek) w podmenu Tools (Narzędzia).
   2. Wybierz pułapkę, którą chcesz przeskanować, a następnie opcję High Frequency (Wysoka częstotliwość) jako metodę skanowania. Wybierz kierunek (x lub y) trajektorii wgłębienia dla pomiaru skanowania ściegu.
   3. Pojawi się okno z pomiarem sztywności zalewkowania. Przeciągnij dwa kursory na wykresie, aby zaznaczyć liniowy obszar zalewkowania odpowiadający F = -kx. Dopasowanie liniowe do wybranej porcji danych zostanie odświeżone automatycznie.
      UWAGA: Ustaw początkową pozycję koralika daleko od błony komórkowej (~5 μm), ponieważ ugięcia światła-pędu na granicy środkowo-komórkowej wpływają na adekwatność pomiarów siły. Jeśli jądro znajduje się zbyt blisko błony komórkowej, spróbuj wciąć jądro z przeciwnego miejsca. Wyrzuć komórkę, jeśli nie jest to możliwe.
7. Rozpocznij akwizycję obrazu, klikając przycisk akwizycji w oprogramowaniu do obrazowania.
8. Rozpocznij zapisywanie danych pomiaru pozycji i siły pułapki, klikając na Dane | Zapisz w czasie rzeczywistym okno odczytu siły (otwarte jak w kroku 6.6.1).
   UWAGA: Pułapka optyczna jest wyposażona w wejście wyzwalające, które można podłączyć do wyjścia czasowego kamery. W ten sposób dane dotyczące obrazu i siły są synchronizowane sprzętowo, a elektronika jest w stanie odwzorować cykle pułapki z liczbą klatek obrazów podczas akwizycji.
9. Zainicjuj poprzednio załadowaną trajektorię, klikając prawym przyciskiem myszy na ściegu i wybierając Rozpocznij trajektorię.
10. Poczekaj, aż trajektoria się zakończy, a system się ustabilizuje.
11. Zatrzymaj zapisywanie danych pomiaru siły pułapki. Pojawi się okno dialogowe zapisywania danych.
    UWAGA: Aby zoptymalizować przechowywanie danych, dane można zdziesiątkować, wybierając parametr dziesiątkujący w tym oknie dialogowym (10, 100 lub 1000).
12. Zatrzymaj akwizycję obrazu i narysuj wyniki w wybranym przez użytkownika oprogramowaniu do przetwarzania końcowego.
13. Jeśli mikrosfera zostanie utracona podczas rutyny i nie można wciąć jądra (rysunek S2), odrzuć pomiar i zwiększ moc. Należy pamiętać, że krok 6.5 należy powtórzyć. W naszych rękach co najmniej 95% rutyn udaje się wykonać bez utraty koralika z pułapki.

Results

Mikroiniekcja koralików pułapkowych:
Mikrosfery wstrzyknięte do jednokomórkowego zarodka danio pręgowanego rozprzestrzeniają się po całej czapeczce zwierzęcia podczas morfogenezy. Aby uzyskać bardziej przejrzystą wizualizację, powtórzyliśmy protokół iniekcji za pomocą czerwonych fluorescencyjnych mikrogranulek i wykonaliśmy obrazy wolumetryczne naszym mikroskopem konfokalnym na różnych etapach rozwoju. W Rysunek 4A-D, wstrzyknięte koraliki są wizualizowane w cytoplazmie progenitorowych komórek macierzystych in vivo przy 5 hfp. Później pojawiły się mikrosfery rozsiane po całym zarodku przy 24 hpf (Ryc. 4E). Zarodki w obu stadiach rozwijały się normalnie, a wskaźniki przeżycia były porównywalne z zarodkami kontrolnymi bez wstrzyknięć lub z imitacją wstrzykniętych (patrz ryc. S3). Jest to zgodne z innymi badaniami, które donoszą o niezakłóconej przeżywalności danio pręgowanego z zastrzykiem koralików do 5 dni po zapłodnieniu⁵⁵.

Nasz mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem jest kompatybilny z wielokanałowym mikroskopem fluorescencyjnym. W Rysunek 5A, pokazujemy izolowane komórki macierzyste z jednym lub dwoma koralikami w cytoplazmie. Wiele znaczników fluorescencyjnych może być używanych do badania różnych aspektów komórki (Rysunek 5B). Morfologię jądrową można śledzić za pomocą barwnika Hoechst lub za pomocą ekspresji mRNA H2A::mCherry, podczas gdy wewnętrzna błona jądrowa może być analizowana za pomocą Lap2b-eGFP¹². Dynamikę kory aktomiozyny, jak również wewnątrzkomórkowy poziom wapnia, można zaobserwować za pomocą odpowiednio inkubacji linii transgenicznej My12.1::eGFP ⁵⁶ i Calbryte-520. Opisany tutaj protokół ma na celu porównanie mechaniki jądra komórkowego unieruchomionych komórek typu dzikiego na podłożach adhezyjnych (później nazywanych zawiesiną) i w mechanicznym zamknięciu. Wyizolowane komórki macierzyste zamknięte w mikrokomorach o wysokości 10 μm wykazywały częściowe rozwinięcie wewnętrznej błony jądrowej (INM) i późniejszy wzrost kurczliwości aktomiozyny¹². W Rysunek 5C, pokazane są zamknięte komórki z jednym lub dwoma koralikami w cytoplazmie. Udane uwięzienie będzie widoczne dzięki spłaszczonym, rozszerzonym komórkom o szerszym przekroju jądra. Błona jądrowa jest dalej rozwijana w zamkniętych komórkach i powinna wydawać się wygładzona w porównaniu z komórkami w zawiesinie (Rysunek 5C).

Analiza czasu siły i siły-deformacji
Analiza uzyskanych wyników jest silnie uzależniona od badanego okazu i interesującego nas pytania, a co za tym idzie, nie można ich tutaj uogólniać. Na przykład powszechnym sposobem analizowania pomiaru wcięć jest wyodrębnienie modułu Younga poprzez dopasowanie zmodyfikowanego modelu Hertza do danych o sile wcięcia⁵⁷. Założenie takiego zabiegu wymaga jednak starannej oceny i nie zawsze może być właściwie uzasadnione (np. badana struktura jest izotropowa, jednorodna, o sprężystości liniowej i wgłębieniach mniejszych niż promień ściegu). W związku z tym bierzemy pod uwagę tylko pomiary niezależne od modelu, które pozwalają na porównanie mechanicznego zachowania badanej konstrukcji między różnymi scenariuszami eksperymentalnymi.

Jako punkt wyjścia, pomiar nachylenia krzywej siła-przemieszczenie na pewnej głębokości wgłębienia dostarcza miary niezależnej od modelu sztywności strukturalnej⁵⁸ jądra. Wartość tę można następnie zebrać z wielu próbek i porównać między różnymi ustawieniami eksperymentalnymi i zaburzeniami próbki.

Pomiar wcięcia
W kolejnych wierszach skupimy się na mechanicznej odpowiedzi jądra komórkowego podczas deformacji komórki w zamknięciu. Eksperymenty w kroku 8 tego protokołu zazwyczaj prowadzą do pików siły do 200 pN dla głębokości wgłębień około 2-3 μm. Jednak wartości te mogą być znacznie różne, w zależności od typu komórki i warunków eksperymentalnych, przy czym bardziej miękkie jądra prowadzą do mniejszej siły dla danego wgłębienia. W związku z tym konieczne jest dokładne zmierzenie deformacji jądrowej wraz z siłą, w celu dokładnej charakterystyki mechanicznej jądra komórkowego. W tej sekcji uzyskamy sztywność jądra komórki na podstawie reprezentatywnych pomiarów wgłębień siły.

W Rysunek 6 pokazujemy deformacje dystalnej i proksymalnej strony jądra w zawieszonej i ograniczonej komórce. Można zaobserwować bogate zachowanie mechaniczne. W typowej komórce zawieszonej na podłożu adhezyjnym jądro było silnie wgniecione przez koralik, ale także nieznacznie przemieszczone w wyniku powtarzających się zdarzeń pchania. Zmierzyliśmy wgłębienie koralików w jądrze, analizując kimografy uzyskane z obrazowania fluorescencyjnego jąder komórkowych barwionych Hoechstem. Kimografy zostały łatwo obliczone za pomocą wtyczki Multi Kymograph Fidżi wzdłuż kierunku wcięcia (Rysunek 6A,B) i zaimportowane do Matlaba (wersja 2021, Mathworks) w celu dalszego przetwarzania. Do profilu intensywności surowej dopasowano funkcję krokową w celu śledzenia krawędzi granicznych jądra wzdłuż trajektorii procedury wgłębienia. Jak widać, zawiera on dokładne informacje na temat zmiany kształtu jądra (Rysunek 6 i Rysunek S2). Użyliśmy następującej krzywej podwójnej sigmoidalnej jako analitycznej wersji funkcji krokowej:

(Równanie 1)

Tutaj x₁ i x₂ oznaczają dystalne i proksymalne krawędzie jądra, podczas gdy A i B to maksymalne i tło szarości kanału niebieskiego (barwnik Hoechsta) obrazu (Rysunek 6B). Uwzględniono szerokość krawędzi (e₀ = 0,25 mm). Podczas gdy wcięta, proksymalna krawędź jądra (x₂) podążała za trajektorią zastosowaną przez procedurę pułapki optycznej po kontakcie mikrosfera-jądro, przeciwna, dystalna krawędź (x₁) wykazuje dynamikę relaksacji zgodnie z oczekiwaniami dla materiału lepkosprężystego, takiego jak cytoplazma (Rysunek 6D). W przeciwieństwie do tego, jądra w komórkach zamkniętych w mikrokomorach o wysokości 10 μm nie wykazują takiego zachowania translokacji jądra po wcięciu w komórce (Rysunek 6B,D). Pokazano również w Rysunek 6D, tylne krawędzie jąder pozostają niezmienione przez koralik napierający od strony proksymalnej, najprawdopodobniej z powodu silniejszych sił wynikających ze kurczliwości komórek i tarcia działającego przeciwko sile wgłębienia. W celu uzyskania prawidłowej głębokości odkształcenia, przemieszczenie x1 zostało odjęte od wciętej miary x2: Δx = x₂ - x₁ (patrz też Rysunek 6D).

Wymuś analizę danych
Siła powodująca deformację jądrową została zmierzona na podstawie zmiany pędu światła pochodzącego z optycznie uwięzionej mikrokulki (Rysunek 7A). Siła występująca przy zastosowaniu trajektorii trapezowych (krok 8.4.3, Rysunek 7B) początkowo rosła liniowo, dopóki pułapka nie przestała się poruszać, ale potem rozluźniła się do wartości w stanie ustalonym. To zachowanie wskazywało na materiał lepkosprężysty wykazujący moduły strat i magazynowania. Zaraz po wgnieceniu siła osiągnęła wartość szczytową, F_p, po której nastąpiła relaksacja naprężeń (Rysunek 7C):

(Równanie 2)

gdzie F₀ to zmagazynowana siła dla komponentu sprężystego, a f(t) to bezwymiarowa funkcja relaksacyjna. Przeanalizowaliśmy to zachowanie na trzy sposoby:

1. Biorąc pod uwagę standardową bryłę liniową z wykładniczą relaksacją naprężeń, tj. f(t) = ^e-t/τ, schematycznie przedstawioną w Rysunek 7C.

2. Używanie ogólnego, dwuwykładniczego rozpadu:
F(t) = A + B₁ ^e-t/τ₁ + B₂ ^e-t/τ₂.

3. Korzystanie z prawa potęgowego, po którym następuje wykładniczy spadek⁵⁹:
f(t) = ^{t-p e-t/τ}, dopasowany do klasy Rysunek 7C.

Chociaż dopasowanie dla modelu 1 można przeprowadzić prosto, zalecamy oszacowanie początkowych przypuszczeń dla (τ₁, τ₂) i (p, τ) odpowiednio dla modeli 2 i 3. Można to zrobić, odpowiednio, dopasowując linie do danych w skalach logarytmicznych i liniowych (Rysunek 7D, po lewej) i logarytmicznych w stosunku do logarytmicznych (Figura 7D, po prawej). Tabela S3 podsumowuje wyniki dla analizowanego przykładu w Rysunek 7. W następnej sekcji rozważymy połączenie prawa potęgowego i prawa wykładniczego w celu scharakteryzowania mechaniki jądra komórkowego.

Stosunek siły przemieszczenia
Podobnie, opisany układ eksperymentalny może być wykorzystany do uzyskania relacji siła-przemieszczenie wielu zdarzeń wgłębienia. Wykonując procedury trójkątne (krok 8.4.4, Rysunek 8A), można powiązać siłę z odkształceniem i wykreślić krzywą siła-wcięcie. Przykładowy wynik jest pokazany w Rysunek 8B, w którym płaska linia bazowa płynnie zmieniała nachylenie, gdy koralik zetknął się z jądrem. Zidentyfikowanie prawdziwego punktu kontaktowego w zaszumionych danych jest wyzwaniem i należy zadbać o to, aby sprawdzić, czy obszar kontaktu jest dopasowany do modeli elastycznych⁶⁰. W tym konkretnym eksperymencie można było również zaobserwować, że kolejne wgłębienia skutkują krzywymi z głębszymi punktami kontaktu, co wskazuje na zbyt powolne odzyskiwanie kształtu jądra po wycofaniu koralików i zmianę cyklu histeretycznego zdefiniowanego przez właściwości lepkosprężystego materiału jądra ( Rysunek 8C). W związku z tym badacz powinien być świadomy, czy tak się dzieje i włączyć to do procesu analitycznego lub ograniczyć liczbę kolejnych pomiarów tak, aby efekt ten nie modyfikował pomiaru.

Mechanika jądra w komórkach w zawiesinie i pod zamknięciem 10 μm
Powyższe podejście wykorzystano do analizy dynamiki relaksacji naprężeń jądra w komórkach zawieszonych na podłożach adhezyjnych i komórkach zamkniętych. Nasze wyniki pokazują, że uwięzienie powoduje rozszerzenie rzutowanego obszaru (Rysunek 9A), ale nieznaczną zmianę sztywności jądrowej (Rysunek 9B). Zmierzyliśmy podobną relaksację przy τ = 6,08 ± 1,1 s (nieograniczony) i τ = 4,00 ± 0,6 s (uwięzienie), co wskazuje na szybkie rozpraszanie lepkosprężyste, po którym następuje zmagazynowana wartość siły, która odpowiada modułowi sprężystości jądra. W celu uwzględnienia różnic eksperymentalnych, które mogą być wytwarzane przez różne warunki początkowe w procedurach wcięć, zmierzone siły magazynowane zostały znormalizowane do głębokości wcięcia, jako . Ten parametr uwzględnia sztywność jądra i opisuje siłę lub naprężenie niezbędne dla określonego wcięcia. Uzyskaliśmy podobną sztywność w zamknięciu i w nieograniczonych komórkach: = 20,1 ± 12,6 pN/μm i = 24,6 ± 13,6 pN/μm (średnia ± odchylenie standardowe).

Rysunek 1: Mikroiniekcja zarodków danio pręgowanego w stadium jednokomórkowym (zygoty). (A) Płytka iniekcyjna: do iniekcji używana jest płytka iniekcyjna o kształcie trójkąta. Płytka wykonana jest z 1% ultraczystej agarozy w E3 (pożywka Egg's). Widok z góry i z boku jest pokazany po prawej stronie. (B) Umiejscowienie zarodków: delikatnie ustawić zarodki za pomocą szczoteczki i ustawić je w taki sposób, aby jednokomórka była dobrze widoczna i łatwo dostępna za pomocą igły. Sugerujemy zorientowanie zarodków tak, aby komórka znajdowała się po przeciwnej stronie igły, jak pokazano na szkicu. (C) Procedura wstrzyknięcia do zarodka w stadium jednokomórkowym: przekłuć igłą kosmówkę otaczającą zarodek i pojedynczą komórkę. Należy upewnić się, że końcówka igły znajduje się wewnątrz ogniwa i zwolnić ciśnienie do wstrzyknięcia. (D) Inkubować zarodki w temperaturze 28–31 °C, aż rozwiną się do stadium blastuli (kuli) (4 hpf). Wykonać protokół izolacji komórek i barwienia komórek (etap 2) oraz przygotować optyczną komorę pułapkową z wyizolowanymi komórkami w zawiesinie i/lub zamknięciu w połączeniu z odpowiednią powłoką powierzchniową podłoża (krok 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przygotowanie pęsety optycznej. (A) Powlekanie warstw PDMS o określonej wysokości na szklanych dnach. Spadek PDMS rozłoży się równomiernie dzięki sile odśrodkowej. (B) Przygotowanie komory na próbkę z warstwy PDMS. 1: wytnij kwadrat skalpelem, 2: pokryj wewnętrzną studzienkę konkanawaliną A (ConA), umyj i nasień komórki; 3: Przykryj szkiełkiem szklanym lub szkiełkiem nakrywkowym, aby uszczelnić studnię. (C) Zdjęcie kwadratowego cięcia skalpelem i usuwania PDMS za pomocą kleszczy. (D) Zamontowanie soczewki zbiorczej czujnika siły optycznej nad komorą pułapki. Kropla olejku immersyjnego służy jako medium immersyjne między soczewką zbierającą a górną szklaną pokrywą. Schemat nie do skalowania. Zachowaj ostrożność podczas opuszczania soczewki zbierającej, aby nie dotknąć szklanej pokrywy naczynia na próbkę. (E) Zdjęcie jednostki wykrywania siły mającej kontakt z próbką. (F) Schemat układu doświadczalnego. Moduł mikromanipulacji optycznej wykorzystuje wiązkę lasera o fali ciągłej (5W, λ = 1064 nm) z regulacją mocy poprzez płytkę półfalową (HWP) i rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej (BS). Po modulacji parą AOD, jest on sprzężony z górnym portem epifluorescencji mikroskopu odwróconego. Wiązka laserowa jest następnie odbijana przez krótkoprzepustowe zwierciadło dichroiczne o długości fali 950 nm (IR-DM), co pozwala na transmisję wzbudzenia i emisji fluorescencji. Laser pułapkujący jest kierowany do tylnego, epifluorescencyjnego portu mikroskopu (górna wieżyczka). OT są tworzone w płaszczyźnie ogniskowej soczewki obiektywu zanurzonego w wodzie (60x, NA = 1,2). Czujnik siły optycznej jest poddawany przez wieżyczkę mikroskopu i przechwytuje światło laserowe wychodzące z OT za pomocą soczewki olejowej o wysokiej NA. Jednocześnie czujnik siły umożliwia oświetlenie w jasnym polu. Jednostka konfokalna z wirującym dyskiem jest sprzężona z lewym portem. Jest wyposażony w dwa zintegrowane silniki laserowe (ILE), które sterują siedmioma laserami wzbudzającymi fluorescencję oraz dwie kamery sCMOS podświetlane od tyłu, umożliwiające równoległe obrazowanie podwójnego fluoroforu Abb: TI, Transilluminator; FS, zatrzymanie w polu; AOD, deflektor akustooptyczny; HWP, płyta półfalowa; CAM, kamera (G) Fotografia urządzenia do pułapkowania optycznego. Czerwone kółko oznacza soczewkę Bertranda, którą można ręcznie przełączyć na tor optyczny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wybór odpowiednich próbek i parametrów. (A) Reprezentatywny obraz izolowanej komórki macierzystej progenitora danio pręgowanego z pojedynczą mikrosferą umieszczoną wystarczająco blisko jądra, aby przeprowadzić eksperyment z wgłębieniem. Podziałka = 10 μm. (B) Przykładowa trajektoria pułapki; głębokość wgłębienia 5 μm; prędkość wgłębiania = 5 μm/s; czas relaksu 10 s. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Lokalizacja mikrokulek w zarodkach danio pręgowanego podczas rozwoju. 0,5 nL czerwonych kulek fluorescencyjnych o wielkości 1 μm wstrzykuje się razem z mRNA GPI-GFP (100 pg/zarodek, błona plazmatyczna) do zarodków WT w celu wizualizacji lokalizacji kulek. (A-D) Dystrybucja mikrosfery 5 godzin po wstrzyknięciu do wnętrza zarodka osadzonego w 0,75% agarozie. (A) Obraz jasnego pola i fluorescencji. Koraliki są jednorodnie rozproszone w tkance zarodka, jak widać na mikrofotografii konfokalnej. (B) Maksymalna projekcja konfokalnej fluorescencji z-stack. Koraliki są oznaczone kolorami od fioletowego do żółtego zgodnie z ich pozycją Z w stosie obrazów. Fioletowy/purpurowy odpowiada najbardziej zewnętrznym koralikom/komórkom (EVL; warstwa otaczająca nabłonek; lub progenitorowe komórki macierzyste znajdujące się blisko powierzchni EVL), żółty odpowiada wewnętrznym koralikom (głębokim komórkom progenitorowym), jak pokazano na szkicu po prawej. (C) Cięcie i maksymalny rzut podstosu (B) odpowiadającego obszarowi w pomarańczowym polu: duża część głębokich komórek zawiera 1-2 koraliki. (D) Cięcie i maksymalny rzut pod-stosu (B) odpowiadającego karmazynowemu polu: niektóre ogniwa EVL zawierają 1-2 koraliki. (E) Obraz w jasnym polu i maksymalna projekcja stosu z zarodka o sile 24 hpf zamontowanego w 0,75% agarozie i znieczulonego trikainą. Zarodki były wstępnie inkubowane z tricainą przez 15 minut. Od lewej do prawej: mikrosfery (średnica 1 μm), GPI-GFP i nakładanie się obrazów. Koraliki rozmieszczone są na całym ciele zarodka. Wymiar skali wskazany w każdym panelu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wyizolowane komórki macierzyste progenitora danio pręgowanego z różnymi etykietami. (A) Obraz z mikroskopii światła transmisyjnego komórek zawiesinowych z 1 (góra) lub 2 (dół) wstrzyknięte kulki. Cyjanowe strzałki wskazują koraliki. (B) Fluorescencyjne obrazy konfokalne komórek zawiesinowych o różnych zabarwieniach. U góry po lewej: Lap2b-eGFP (wewnętrzna błona jądrowa, 80 pg/zarodek) i H2A-mCherry. U góry po prawej: GPI-GFP (błona plazmatyczna, 100 pg/zarodek) i DNA-Hoechst (barwione zgodnie z opisem w sekcji 2). U dołu po lewej: MyI12.1-eGFP (linia transgeniczna) i DNA-Hoechst. U dołu po prawej: Calbryte488 i DNA-Hoechst (barwione zgodnie z opisem w sekcji 2). (C) Obraz z mikroskopii światła transmisyjnego zamkniętych komórek z 1 (góra) lub 2 (dół) wstrzykniętymi kulkami. Cyjanowe strzałki wskazują koraliki. Podziałka liniowa = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Szacowanie deformacji jądrowej na podstawie filmów z wirującego dysku. (A,B) Upływ czasu eksperymentu z wgłębieniem jądra w (A) komórce zawieszonej i (B) komórce zamkniętej. Podziałka 10 μm. Reprezentatywne migawki jąder znakowanych Hoechstem są pokazane 5 s przed, w trakcie i 5 s po wcięciu za pomocą optycznie uwięzionej mikrosfery (biały grot strzałki). Kimografy wzdłuż segmentu wcięcia (czerwona linia, prawy panel). x₁ i x₂ są dystalnymi i proksymalnymi (blisko koralika) granicami jądra podczas eksperymentu z wgłębieniami uzyskanymi z dopasowania profilu intensywności do równania 1. (C) Profile intensywności wzdłuż segmentu wcięcia dla trzech różnych ramek (przed, w trakcie i po wcięciu) i dopasowane do równania 1 w celu oceny dystalnego (x₁) i proksymalnego x₂ położenia krawędzi jądra. (D) Reprezentatywne trajektorie x₁ (t) na niebiesko i x₂ (t) na pomarańczowo podczas eksperymentu z wgłębieniem zawieszonych i ograniczonych komórek (10 μm). Zacienione obszary wskazują wcięcie, odległość między x₁ a x₂ wskazuje średnicę jądra. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Wymuś przetwarzanie sygnału. (A) Schemat optycznie uwięzionej mikrosfery deformującej jądro komórkowe po wciśnięciu. Membrana jądrowa i siły optyczne są oznaczone czarnymi strzałkami. Zmiana pędu wiązki jest wskazywana przez zieloną strzałkę P_out. (B) Trajektoria pułapki (na górze) i siła (na dole) doświadczana przez optycznie uwięzioną mikrosferę podczas powtarzanego eksperymentu z wgłębieniem jądrowym. (C) Zanik relaksacji siły po osiągnięciu szczytu siły na maksymalnej głębokości wgłębienia. Wstawka przedstawia schemat standardowej bryły liniowej, której dynamika jest zbliżona do obserwacji fenomenologicznych w tym miejscu. (D) Po lewej: logarytm znormalizowanej siły w funkcji czasu. Zacienione obszary wskazują część danych użytą do dopasowania podwójnego rozkładu wykładniczego (czerwone linie). Po prawej: logarytm siły znormalizowanej w funkcji logarytmu czasu. Zacieniony obszar wskazuje część danych używaną do dopasowania do prawa potęgowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Procedura wymuszania wcięć z trójkątnymi przemieszczeniami pułapek. (A) Reprezentatywna trajektoria x₁(t) w kolorze niebieskim i x₂(t) w kolorze bursztynowym podczas eksperymentu z trójkątnym wgłębieniem wykonanym na komórce na wysokości 10 μm. U góry: Pozycja pułapki. Środek: Analiza kształtu jądra. Odległość między x₁ a x₂ wskazuje średnicę jądra. Dół: Sygnał siły. (B) Siła kontra pozycja pułapki przez osiem kolejnych wgłębień. (C) Rozwój rozproszenia, wyprowadzony z histerezy między częścią zbliżeniową i wycofania krzywej f-d, jądra dla każdego kolejnego zdarzenia wgłębienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9. Właściwości jądrowe komórek w zawiesinie (powierzchnia adhezyjna) i uwięzieniu przed układami trapezowymi. (A) Obszar rzutowany z komórek w zawiesinie i w zamknięciu poniżej 10 μm. pasek reprezentuje medianę. (B) Sztywność jądrowa komórek w zawiesinie i w zamknięciu. pasek reprezentuje medianę. Wartości P wyprowadzone z testu Kruskala-Wallisa przy użyciu MatLab. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Trajektoria trapezowa zdefiniowana przez oprogramowanie pęsety optycznej. Pierwszy (drugi) rząd to odległość x (y), na którą pułapka zostanie przemieszczona liniowo. W trzecim wierszu czas trwania danego kroku jest ustawiany w sekundach. Trajektoria ta składa się z siedmiu punktów i odpowiada trapezowi obciążonemu dwukrotnie względem jądra w Rysunek 7B. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 2: Trójkątna trajektoria zdefiniowana przez oprogramowanie pęsety optycznej. Analogicznie do Tabeli 2, trajektoria ta składa się z 16 punktów, odpowiadających ośmiu przypadkom wgłębień na głębokości 5 μm i prędkości 2,5 μm/s. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 3: Parametry dopasowania do danych w Rysunek 7. IG: wstępne przypuszczenie. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Rysunek uzupełniający S1: Wyrównanie czujnika siły optycznej i kompensacja linii bazowej pędu. (A) Zatrzymanie pola zobrazowane na kamerze pomocniczej (AUX, Rysunek 2) przez obiektyw Bertranda. W olejku immersyjnym pojawia się pęcherzyk powietrza, który nie jest widoczny przez okular. (B) Czysta ścieżka optyczna. Aby uzyskać dokładne wyrównanie, otwórz ogranicznik pola i ustaw go tak, aby pokrywał się ze stożkiem świetlnym NA = 1,2. (C) Obraz płaszczyzny próbki. Czerwony kwadrat oznacza obszar roboczy OT. Pasek skali: 20 μm. (D) Moc pułapki mierzona w poprzek pola widzenia, wzdłuż białych podwójnych strzałek wskazanych w C. Kolor czerwony oznacza zmianę mocy pułapki, gdy nie jest stosowana żadna korekta. Na niebiesko moc pułapki została skorygowana na całym polu widzenia. (E) Składowa X linii bazowej pędu biegnąca w tym samym zakresie. Na czerwono, nieskorygowany ślad. Na niebiesko ślad został skorygowany o moc pułapki. Na zielono zaznaczono ślad skorygowany o linię bazową pędu przy użyciu globalnej kompensacji przesunięcia w oprogramowaniu producenta. (F) Tak samo jak w E, dla składnika Y. Należy pamiętać, że podczas normalnej pracy zacienione komponenty są używane do pomiarów mechaniki i siły, np. składowa siły x podczas ruchu wzdłuż współrzędnej x i składowa siły y podczas ruchu wzdłuż osi y. Po wprowadzeniu wszystkich poprawek uzyskuje się szum RMSD <0,5 pN. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Nieudana procedura z powodu słabych pułapek. (A) Kymograf pokazujący wgłębienie jądra z nieudanej procedury. Widoczne są tylko krótkie, przejściowe deformacje spowodowane wydostaniem się ściegu z pułapki. Co ważne, laser pułapkujący nadal porusza się bez koralika, aby zakończyć predefiniowaną trajektorię (zielona przerywana linia). Podziałka = 10 μm. (B) Góra: Pozycja pułapki w funkcji czasu. Środek: Wynik śledzenia krawędzi wciętej bliższej i dalszej krawędzi jądra. Należy zauważyć, że dystalna krawędź nie porusza się bez wgłębienia, jak to często obserwuje się w przypadku zakończonych procedur na izolowanych komórkach na podłożach adhezyjnych. Dół: Siła w funkcji czasu pokazująca utratę mikrosfery wskazywaną przez zmniejszenie szumu termicznego i nagły spadek siły do zera. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S3: Przeżywalność wstrzykniętych zarodków. Zarodki, którym wstrzyknięto kulki 1 μm i 100 pg/zarodek mRNA w stężeniach określonych w protokole, porównano z zarodkami bez wstrzyknięcia i nie wykazano istotnych różnic po 24 godzinach od zapłodnienia. Średnia i odchylenie standardowe z trzech niezależnych doświadczeń z N > 21 zarodkami na warunek dla każdego doświadczenia. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

W tym protokole opisujemy unikalną metodę badania właściwości mechanicznych jądra komórkowego wewnątrz żywych komórek. W przeciwieństwie do innych technik spektroskopii sił, nieinwazyjne pułapkowanie optyczne pozwoliło nam oddzielić udział błony komórkowej i cytoszkieletu od sztywności jądra komórki. Co ważne, mikromanipulacja optyczna jest kompatybilna z mikroskopią multimodalną, co pozwoli eksperymentatorowi badać różne procesy zachodzące w mechanobiologii jądrowej komórki. Jako reprezentatywny wynik zastosowaliśmy barwienie DNA-Hoechst do pomiaru deformacji jądra po wgłębieniu wykonanym siłami rzędu kilkuset pikoNewtonów.

Potencjalne zastosowania naszej metody poza przykładami opisanymi w niniejszym protokole
Możliwość wydobycia ilościowych informacji mechanicznych z pomiarów wewnątrz żywych komórek bez zewnętrznych zakłóceń otwiera mnóstwo bezprecedensowych możliwości, które dopiero zaczynają być eksplorowane. W ten sposób prezentowany protokół naszej platformy do mikromanipulacji optycznej można rozszerzyć o bardziej złożone eksperymenty o dużej wszechstronności. Deflektory akustyczno-optyczne (AOD) mogą generować wiele pułapek optycznych do synchronicznych pomiarów siły w różnych lokalizacjach komórek, a także mogą być wykorzystywane do aktywnej mikroreologii w szerokim zakresie częstotliwości^51,61. Jak już wspomniano, reakcja siły na wgłębienie może pokonać maksymalną siłę pułapki, prowadząc do ucieczki stopki z pułapki optycznej. W takim przypadku można skonfigurować sprzężenie zwrotne siły z AOD w celu zaciśnięcia siły optycznej. Podsumowując, wiele podejść mikroreologicznych, takich jak relaksacja naprężeń opisana w tym protokole, ale także aktywna mikroreologia lub podatność pełzania, można eksperymentalnie uzyskać za pomocą tej platformy i dokładnie przeanalizować za pomocą nowatorskich pakietów oprogramowania 61,62,63,64,65. Co więcej, zastosowanie sił nie ogranicza się do jądra, ale w zasadzie może być przeprowadzone w celu pomiaru różnych struktur wewnątrzkomórkowych i w złożonych tkankach, jak wykazano w przypadku zatrzymywania przepływających czerwonych krwinek w nienaruszonych naczyniach krwionośnych^66,67 lub zatrzymywania i deformowania chloroplastów i mitochondriów⁶⁸. Kalibracja światła-pędu jest niezależna od kształtu i rozmiaru uwięzionego obiektu, umożliwiając w ten sposób bezpośrednie pomiary siły na dowolnej sondzie siły o dowolnym kształcie^38,39. Zastosowanie iniekcji mikrosfer pozwoliło na przyłożenie dużych sił do jądra przy stosunkowo niskiej mocy lasera w porównaniu z bezpośrednią manipulacją strukturami komórkowymi 69,70,71. Jednakże, biorąc pod uwagę wystarczająco dużą różnicę współczynnika załamania światła, nie jest konieczna zewnętrzna sonda siły, a organellami wewnątrzkomórkowymi można manipulować bezpośrednio bez wstrzykiwanych kulek (niepublikowane obserwacje i odniesienie⁷⁰).

Potencjalne modyfikacje naszej metody w celu rozszerzenia aplikacji
W zależności od eksperymentu można wstrzykiwać mikrogranulki o różnych rozmiarach, ale należy wykonać odpowiednie kontrole. Na przykład, aby badać komórki na późniejszych etapach, można wstrzykiwać mniejsze kulki. Zmniejszy to maksymalną siłę, jaką może wywierać pułapka optyczna (jak pokazano w odnośniku⁵⁵). Większe kulki mogą być wstrzykiwane w celu wywarcia większych sił, ale mogą one wpływać na rozwój zarodka w zależności od ich wielkości lub etapu zainteresowania. W eksperymentach, w których wstrzyknięcie mikrogranulek nie jest opcją, różne organelle wykazujące różnice w współczynnikach załamania światła w porównaniu z cytoplazmą mogą być nadal manipulowane optycznie, powodując powstawanie sił optycznych mierzalnych na podstawie zmian pędu światła⁴². Jak wspomniano powyżej, metody te zostały zastosowane przez Bambardekara i wsp. do deformacji połączeń komórka-komórka w zarodku Drosophila⁷⁰. Podobnie, jądro komórki ma niższy współczynnik załamania światła niż otaczający je ośrodek⁴⁴, co pozwala na wgłębienie bez kulek (niepublikowane obserwacje i odniesienie⁷²), mimo że z mniejszą siłą zatrzymywania. W ten sposób jądro nie może być łatwo uwięzione i ucieka z pułapki.

Przekładka PDMS z powłoką spinową jest wytwarzana wygodną i szybką metodą, ale może być poza zasięgiem laboratoriów bez dostępu do zakładu mikro-/nanoprodukcyjnego lub laboratoriów inżynieryjnych. W ten sposób przekładkę można łatwo zmontować z taśmy laboratoryjnej lub parafilmu (krok 4). Protokół można również dostosować poprzez produkcję kanałów mikroprzepływowych, które automatyzują dostarczanie pojedynczych komórek do predefiniowanych dołków pomiarowych lub do komory o określonej wysokości w celu oszacowania efektu uwięzienia w tej samej próbce. Jednakże takie urządzenia mikroprzepływowe muszą być zaprojektowane w taki sposób, aby mieściły się w przestrzeni między obiektywem mikroskopu a soczewką zbierającą czujnika siły optycznej, wynoszącej około 2 mm (patrz krok 3). Należy pamiętać, że czujnik siły optycznej musi być umieszczony na odpowiedniej wysokości, aby żadne aberracje optyczne wynikające z rozogniskowania nie wpływały na pomiar pędu fotonów.

Inne modyfikacje mogą obejmować zmianę reporterów biologicznych. Odkryliśmy, że fluorescencja Hoechst spektralnie krwawi do kanału GFP, a zatem faworyzujemy połączenie z histonem znakowanym mCherry jako markerem jądrowym do jednoczesnego pomiaru w dwóch kanałach fluorescencyjnych. Alternatywnie, deformację jądrową można łatwo śledzić za pomocą etykiety ukierunkowanej na wewnętrzną błonę jądrową, takiej jak Lap2b-GFP (rysunek 2).

Wgłębienie w jądrze komórkowym było rzędu 2-3 mikronów, co mogliśmy dokładnie zmierzyć za pomocą analizy obrazu mikroskopii konfokalnej z ograniczonym dyfrakcją. W przypadku sztywniejszych jąder lub mniejszych sił, wgłębienie będzie ledwo mierzalne przy użyciu tego podejścia. Jednak pęseta optyczna kalibrowana siłą bezwzględną może być również skalibrowana do pomiarów położenia uwięzionego koralika in situ przy użyciu interferometrii BFP z dokładnością nanometryczną⁵¹. Korzystając z tego podejścia, sygnał napięciowy i czujnik siły optycznej mogą być przełożone na położenie uwięzionej sondy za pomocą parametru β [nm/V], podczas gdy parametr niezmienny α [pN/V] daje wartości siły poprzez wspomnianą wcześniej kalibrację światła i pędu⁴¹ (szczegóły poniżej).

Rozwiązywanie problemów
Odkryliśmy, że podczas eksperymentu mogą wystąpić następujące wyzwania:

Nie tworzy się stabilna pułapka, a mikrosfera łatwo się wydostaje
Jakiekolwiek zabrudzenia na obiektywie mikroskopu lub nieprawidłowo ustawiony kołnierz korekcyjny mogą doprowadzić do awarii stabilnej pułapki. Jeśli nie zostanie znalezione natychmiastowe rozwiązanie, zmierz funkcję rozproszenia punktowego soczewki obiektywu. Jeśli badana próbka znajduje się głęboko w optycznie gęstej tkance, ognisko lasera może doświadczyć poważnych aberracji optycznych, co prowadzi do niestabilnego uwięzienia (efekt ten jest zwykle znikomy w izolowanych komórkach, ale staje się bardziej widoczny w grubszych tkankach). W przypadku wysokiej sztywności siła przywracająca jądra może przekroczyć siłę ucieczki pułapki, tak że mikrosfera zostanie utracona, a procedura wgłębiania zakończy się niepowodzeniem. Początkowo krawędź błony jądrowej bliższa pułapce optycznej jest prawie nie wcięta (ryc. S2A). Kiedy tak się dzieje, laser pułapkujący nie jest już narażony na siłę i ruchy Browna, co prowadzi do spadku siły do zera i zmniejszenia szumu sygnału (rysunek S2B). W takim przypadku moc lasera można zwiększyć, aby uzyskać silniejszą pułapkę, można zmniejszyć amplitudę trapezoidalnej trajektorii wpychającej koralik do jądra lub ustawić początkową pozycję uwięzionej mikrokulki dalej od jądra.

Komórka porusza się podczas stymulacji
Jeśli komórki nie są wystarczająco połączone, optyczna pułapka gradientowa przesunie komórki podczas wykonywania procedury wgłębiania wewnątrzkomórkowego, tak że siły i podstawowa mechanika jądra są sztuczne. Aby zapobiec przemieszczaniu się całej komórki, zalecamy zwiększenie stężenia cząsteczek adhezyjnych komórek na powierzchni, np. ConA.

Kompensacja pędu początkowego
Jeśli początkowa procedura kompensacji pędu nie jest dostępna na platformie OT (krok 6.5), należy skorygować sztuczny, niezależny od siły sygnał linii podstawowej. Jest to widoczne jako nachylenie na krzywej siły nawet przy braku uwięzionego ściegu (rysunek S1E). Aby wykonać korektę, tę samą trajektorię należy wykonać bez koralika, na zewnątrz komórki w dokładnie tej samej pozycji. W tym celu odsuń komórkę od pułapki za pomocą elementu sterującego stołu montażowego. Jako odniesienie, przesunięcie siły zmienia się o 5 pN w poprzek pola widzenia przy 200 mW w naszym systemie; W związku z tym staje się to nieistotne dla krótkich trajektorii. Alternatywnie można użyć stolika do skanowania piezoelektrycznego do przesuwania komórek na próbce, pozostawiając stałą pozycję lasera.

Kluczowe etapy przedstawionego protokołu
Mikrosfery powinny być wstrzykiwane w odpowiednim, 1-komórkowym stadium, aby zapewnić maksymalne rozprowadzenie na zarodku. Koraliki nie powinny być fluorescencyjne, aby światło nie przedostawało się do kanałów fluorescencyjnych używanych do obrazowania. Dla przykładu, nawet typowe czerwono-fluorescencyjne kulki są wyraźnie widoczne w niebieskim kanale używanym do obrazowania jądra komórkowego po barwieniu Hoechsta ze względu na ich jasność (wzbudzenie: 405 nm; emisja: 445 nm). Stabilne przymocowanie komórki do podłoża ma kluczowe znaczenie dla zapobieżenia bocznemu przemieszczeniu podczas rutynowego wgłębiania. Jeśli komórka porusza się podczas rutyny, siły są niedoszacowane. Jeśli zdarza się to często, zoptymalizuj protokół załączników. W przypadku komórek hodowli tkankowej inne białka adhezyjne komórek, takie jak fibronektyna, kolagen lub poli-L-lizyna, prowadzą do zadowalającego przyłączenia (obserwacje niepublikowane). Podczas uwięzienia komórki są poddawane nagłemu i silnemu obciążeniu mechanicznemu. Może to spowodować uszkodzenie komórek i często eksperymentator napotka pęknięte komórki, jeśli procedura nie zostanie przeprowadzona ostrożnie. Ponadto, jeśli wysokość uwięzienia jest zbyt mała, wszystkie komórki będą cierpieć z powodu pęknięcia obwiedni jądrowej lub nieodwracalnego uszkodzenia. Aby je złagodzić, należy wolniej opuszczać górne szkiełko nakrywkowe i/lub zwiększać odstępy między szkiełkami nakrywkowymi.

Ograniczenia techniki i sugestie ich pokonania
Wyraźnym ograniczeniem tej techniki jest przenikanie światła laserowego do głębokich odcinków tkanki, co prowadzi do aberracji i niestabilnego wychwytywania. Tak więc dolna granica głębokości penetracji zależy od czystości próbki, korekcji aberracji, którą można zastosować⁷³ oraz zastosowanej mocy lasera. Należy wziąć pod uwagę, że większa moc lasera prowadzi do wzbudzenia termicznego próbki w pobliżu mikrosfery. Jednak ogrzewanie próbki pochodzące od plamki lasera o długości fali 1064 nm jest zminimalizowane, aby uniknąć prawdopodobnego stresu związanego z ciepłem na naszych próbkach biologicznych⁷⁴.

Kolejnym ograniczeniem jest maksymalna siła, jaką można zmierzyć. Mimo że bezpośrednia detekcja pędu światła umożliwia pomiary siły znacznie wykraczające poza liniowy reżim odpowiedzi pułapki optycznej^40,41, maksymalna przyłożona siła jest rzędu kilkuset pikontonów. Jest to ograniczone mocą lasera i wynikającym z tego progiem uszkodzenia miękkiego materiału biologicznego oraz różnicami współczynnika załamania światła, które zwykle nie są większe niż 0,1 lub 0,3⁴⁴. Zaproponowano kilka metod zwiększania granicy wykrywalności siły, np. przy użyciu światła strukturalnego⁷⁵, mikrosfer z powłoką antyrefleksyjną⁷⁶, cząstek o wysokim współczynniku załamania światła⁷⁷ lub wysoce domieszkowanych kropek kwantowych⁷⁸.

OT mogą być używane do pomiarów położenia w skali nanometrowej za pomocą interferometrii BFP, tak aby położenie kulki w pułapce wynosiło Δx = βS_x, gdzie S_x jest sygnałem napięciowym czujnika, a β [μm/V] można kalibrować w locie zgodnie z różnymi protokołami^35,54. W przypadku optycznego czujnika siły można udowodnić, że niezmienniczy współczynnik konwersji napięcia na siłę α [pN/V] bezpośrednio odnosi się do β i sztywności pułapki, k [pN/μm], do α = kβ ³⁷) W eksperymentach z przemieszczeniami ściegów, które są zbyt małe, aby można je było wykryć za pomocą obrazowania optycznego, strategia ta może być wykorzystana do uzupełnienia pomiarów siły o wykrywanie małego położenia. Przykładem może być zastosowanie przedstawionych tu procedur eksperymentalnych do bardzo sztywnych jąder, dla których siły o rozsądnych mocach lasera (200-500 mW) nie są wystarczające do wywołania wystarczająco dużych wartości wgłębień. W takim przypadku stopka musi zetknąć się z jądrem, a sztywność pułapki musi zostać skalibrowana przed pomiarem (krok 8.6). Wcięcie d jądra w funkcji siły można pośrednio określić jako:

d = x_pułapka - F/k

gdzie pułapka x jest pozycją pułapki. W odróżnieniu od niezmienniczego współczynnika świetlno-pędznego α [pN/V], współczynnik β [μm/V] musi być kalibrowany przed każdym eksperymentem, ponieważ zależy od wielu lokalnych zmiennych określających dynamikę pułapki, takich jak rozmiar cząstek, rozmiar plamki pułapki optycznej i względne współczynniki załamania.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Okulary nakrywkowe 22 mm	Ted Pella	260148
#1.5 22x60 mm Okulary nakrywkowe	Ted Pella	260152
#1.5H naczynia ze szklanym dnem	Willco	GWST-5040
Koraliki 10 um	Supelco	72986
szklane 1 mm	Aparat Harvard	30-0020 GC100F-15
Polistyren 1-um mikrogranulki	Sigma	89904
1-um czerwono-fluorescencyjne koraliki	ThermoFisher	F8816
Agar	Kamery ThermoFisher	16500500
Aqcuisition sCMOS	Andor	Sona-4BV11-UNI
Kamera pomocnicza (Rysunek 3, AUX)	Blackfly,	FLIR BFS-U3-200S6M-C
Calbryte 520	AAT Bioquest	520 AM
Wirówka	Eppendorf	5453000011
Concanavalin A	Sigma	C5275
DMEM	Sigma	D2906
DNA-Hoechst	ThermoFisher	33342
Podwójna taśma klejąca	Biesse Adesivi
E3	5 mM NaCl. 0,17 mM KCl. 0,33 mM CaCl2. 0,33 mM MgSO4
Eclipse Ti2	Kleszcze Nikon
	Narzędzia do nauki	11252-20
GPI-GFP
H2A-mCh
Oprogramowanie do akwizycji obrazu	Fusion-Andor
Immersion Oil	Cargille	Typ B: 16484
Ochrona przed podczerwienią gogle	Thorlabs	LG1
Lap2b-eGFP
Pipeta z mikroładowarką	Eppendorf	GELoader
Microinjector	World Precision Instruments	SYS-PV820
MicroManager 2.0
Prowadnica mikroukośna	ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 działek
Olej mineralny	Sigma	M3616
Zmotoryzowany stolik	ASI
Ściągacz igieł	Sutter instrument Co.	Model P-97
Platforma pęsety optycznej	Oprogramowanie Impetux Optics	Sensocell
OTs (LightAce)	Impetux Optics
PDMS	Sigma	Sylgard 184
PDMS Utwardzacz	Sigma	Sylgard 184
Oprogramowanie do przetwarzania końcowego (Matlab)	Mathworks
Woda wolna od RNA	Thermofisher	AM9937
Krótkoprzepustowe zwierciadło dichroiczne (Rysunek 3, IR-F)	Semrock	FF01-950/SP-25
	Specjalistyczne systemy powlekania	Spincoat G3P-8
Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem	Andor	DragonFly 502
Mikroskop stereoskopowy	Leica M80
Trójkątna forma mikroiniekcyjna	Adaptacyjne narzędzia naukowe	TU1
Piekarnik uniwersalny	Memmert	UNB 200
Obiektyw do zanurzenia w wodzie	Nikon	MRD07602